Summary

Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion

Published: September 14, 2019
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Summary

Wir beschreiben Protokolle zur Vorbereitung von Oozysten und zur Reinigung von Sporozoiten zur Untersuchung der Infektion von menschlichen Darm- und Atemwegsorganoiden durch Cryptosporidium parvum. Wir zeigen die Verfahren für die Mikroinjektion von Parasiten in das Darmorganoidlumen und die Immunfärbung von Organoiden. Schließlich beschreiben wir die Isolierung der erzeugten Oozysten von den Organoiden.

Abstract

Cryptosporidium parvum ist eine der Hauptursachen für menschliche Durchfallerkrankungen. Um die Pathologie des Parasiten zu verstehen und effiziente Medikamente zu entwickeln, ist ein In-vitro-Kultursystem erforderlich, das die Bedingungen im Wirt rekapituliert. Organoide, die den Geweben ihrer Herkunft sehr ähnlich sind, sind ideal für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen. Organoide sind dreidimensionale (3D) Gewebe-abgeleitete Strukturen, die aus adulten Stammzellen abgeleitet werden und über einen längeren Zeitraum in kulturgemäß wachsen, ohne eine genetische Aberration oder Transformation zu durchlaufen. Sie haben eine gut definierte Polarität mit apikalen und basolateralen Oberflächen. Organoide haben verschiedene Anwendungen in Medikamententests, Bio-Banking, und Krankheitsmodellierung und Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, wie man die Oozysten und Sporozoiten von Cryptosporidium für die Infektion menschlicher Darm- und Atemwegsorganoide vorbereitet. Wir zeigen dann, wie Mikroinjektion verwendet werden kann, um die Mikroben in das Organoidlumen zu injizieren. Es gibt drei Hauptmethoden, mit denen Organoide für Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien verwendet werden können: Mikroinjektion, mechanisches Scheren und Plattieren und durch die Herstellung von Monolayern. Die Mikroinjektion ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Parasitenvolumina und den direkten apikalen Seitenkontakt für die Mikroben. Wir liefern Details für ein optimales Wachstum von Organoiden für die Bildgebung oder Oozystenproduktion. Schließlich zeigen wir auch, wie die neu erzeugten Oozysten aus dem Organoid für die weitere Weiterverarbeitung und Analyse isoliert werden können.

Introduction

Die Entwicklung von Medikamenten oder Impfstoffen zur Behandlung und Vorbeugung von Cryptosporidium-Infektionen wurde durch das Fehlen von In-vitro-Systemen behindert, die die In-vivo-Situation beim Menschen genau nachahmen1,2. Viele der derzeit verfügbaren Systeme erlauben entweder nur eine kurzfristige Infektion (<5 Tage) oder unterstützen nicht den gesamten Lebenszyklus des Parasiten3,4. Andere Systeme, die die vollständige Entwicklung des Parasiten ermöglichen, basieren auf verewigten Zelllinien oder Krebszelllinien, die die physiologische Situation beim Menschen nicht getreu rekapitulieren5,6,7 . Organoide oder “Mini-Organe” sind 3D-Gewebe abgeleitete Strukturen, die in einer extrazellulären Matrix mit verschiedenen gewebespezifischen Wachstumsfaktoren ergänzt angebaut werden. Organoide wurden aus verschiedenen Organen und Geweben entwickelt. Sie sind genetisch stabil und rekapitulieren die meisten Funktionen der Organe ihrer Herkunft und können in der Kultur für längere Zeit erhalten werden. Wir haben eine Methode zur Infizierung menschlicher Darm- und Lungenorganoide mit Cryptosporidium entwickelt, die ein genaues In-vitro-Modell für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen bietet, die für die Darm- und Atemkryptosporidiose relevant sind8 ,9,10,11,12,13. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Kulturmodellen ist das Organoidsystem repräsentativ für reale Wirtparasiten-Wechselwirkungen, ermöglicht die Vollendung des Lebenszyklus, so dass alle Stadien des Parasiten-Lebenszyklus untersucht werden können, und hält die Parasitenausbreitung aufrecht. für bis zu 28 Tage10.

Cryptosporidium parvum ist ein apicomplexan Parasit, der das Epithel der Atemwege und Darmtrakt infiziert, verursacht längere Durchfallerkrankungen. Die resistente Umweltstufe ist die Oozyste, die in kontaminierten Lebensmitteln und Wasser gefunden wird14. Nach der Ein- oder Einatmung exzyst die Oozyste und setzt vier Sporozoiten frei, die sich an Epithelzellen anheften. Sporozoiten gleiten auf Wirtszellen und greifen Wirtszellrezeptoren an, aber der Parasit dringt nicht vollständig in die Zelle ein und scheint die Wirtszelle dazu zu bringen, sie zu verschlingen15. Der Parasit, der in einem intrazellulären, aber extrazytoplasmatischen Fach verinnerlicht wird, verbleibt an der apikalen Oberfläche der Zelle und replizieren sich innerhalb eines parasitophorischen Vakuols. Es durchläuft zwei Runden asexueller Fortpflanzung – ein Prozess, der Merogonie genannt wird. Während der Merogonie entwickeln typ I Meronts, die acht Merozoiten enthalten, die freigesetzt werden, um in neue Zellen einzudringen. Diese Merozoiten dringen in neue Zellen ein, um sich zu Typ-II-Meronten zu entwickeln, die vier Merozoiten enthalten. Diese Merozoiten infizieren bei ihrer Freigabe Zellen und entwickeln sich zu Makrogamonts und Mikrogamonen. Mikrogamete werden freigesetzt und befruchten die Makrogameten, die Zygoten produzieren, die zu Oozysten reifen. Reife Oozysten werden anschließend in das Lumen freigesetzt. Oozysten sind entweder dünnwandige, die sofort exzyst, um das Epithel neu zu infizieren, oder dick wandgebunden, die in die Umwelt freigesetzt werden, um den nächsten Wirt14zu infizieren. Alle Stadien des Cryptosporidium-Lebenszyklus wurden in dem zuvor von unserer Gruppe10entwickelten Organoid-Kultursystem identifiziert.

Da menschliche Organoide das menschliche Gewebe9,11,13originalgetreu replizieren und alle replizierenden Stadien von Cryptosporidium10unterstützen, sind sie das ideale Gewebekultursystem zum Studium Cryptosporidium Biologie und Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Infizierung von Organoiden mit Cryptosporidium-Oozysten und exzysierten Sporozoiten und zur Isolierung der neuen Oozysten, die in diesem Gewebekultursystem produziert werden.

Protocol

Die gesamte Gewebebehandlung und -resektion wurde im Rahmen der vom Institutional Review Board (IRB) zugelassenen Protokolle mit Zustimmung des Patienten durchgeführt. 1. Herstellung von C. parvum Oozysten zur Injektion HINWEIS: Cryptosporidium Oozysten wurden aus einer kommerziellen Quelle gekauft (siehe Tabelle der Materialien). Diese Oozysten werden in Kälbern produziert und in phosphatgepufferter Salin (PBS) mi…

Representative Results

Die hier vorgestellten Protokolle führen zur effizienten Reinigung von Oozysten und Sporozoiten (Abbildung 1A) bereit für die Mikroinjektion. Das Excystationsprotokoll führt zur Freisetzung von Sporozoiten von ca. 70–80% der Oozysten, daher ist es wichtig, die verbleibenden Oozysten und Schalen durch einen 3-m-Filter herauszufiltern. Die Filtration führt zu einer fast 100% Sporozoitreinigung (Abbildung 1B). Darüber hinaus trägt die Zugabe eines grünen F…

Discussion

Kultur von Cryptosporidium Parasiten in Darm- und Atemwegsorganoiden bietet ein genaues Modell, um Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen zu studieren10, hat aber auch viele andere Anwendungen. Zum Beispiel erfordern die aktuellen Methoden zur Auswahl und Verbreitung genetisch veränderter Cryptosporidium-Parasiten die Durchfahrt in Mäuse19, die keine Isolierung von Parasiten zulässt, die für eine In-vivo-Infektion wesentliche Modifikationen aufweisen. Organoi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Deborah A. Schaefer von der School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA, dass sie uns bei der Herstellung und Analyse von Oozysten geholfen hat. Wir danken auch Franceschi Microscopy and Imaging Center und D.L. Mullendore an der Washington State University für die TEM-Vorbereitung und Bildgebung von isolierten organoiden Oozysten.

D.D. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ALW, 863.14.002) und wurde von Marie-Curie-Stipendien der Europäischen Kommission unterstützt (Vorschlag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Die Zu diesen Ergebnissen führenden Forschungsarbeiten wurden vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des ERC Advanced Grant Agreement Nr. 67013 und des NIH NIAIH unter R21 AT009174 bis RMO gefördert. Diese Arbeit ist Teil des Oncode-Instituts, das zum Teil von der Niederländischen Krebsgesellschaft finanziert und durch ein Stipendium der Niederländischen Krebsgesellschaft finanziert wurde.

Materials

Basement membrane extract (extracellular matrix) amsbio 3533-010-02  
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) Waterborne, Inc A400FLR-1X Final Concentration = Use 2-3 drops/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads Waterborne, Inc IMS400-20  
Dynamag 15 rack Thermofisher Scientific 12301D  
Dynamag 2 rack Thermofisher Scientific 12321D  
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm EMD-Millipore TSTP02500  
Fast green dye SIGMA F7252-5G    
Femtojet 4i Microinjector Eppendorf 5252000013  
Glass capillaries of 1 mm diameter WPI TW100F-4  
Matrigel (extracellular matrix) Corning 356237  
Microfuge tube 1.5ml Eppendorf T9661-1000EA  
Micro-loader tips Eppendorf 612-7933  
Micropipette puller P-97 Shutter instrument P-97  
Normal donkey Serum Bio-Rad C06SB  
Penstrep Gibco 15140-122  
Sodium hypoclorite (use 5%) Clorox 50371478  
Super stick slides Waterborne, Inc S100-3  
Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder EMD-Millipore SX0002500  
Taurocholic acid sodium salt hydrate SIGMA T4009-5G  
Tween-20 Merck 8221840500  
Vectashield mounting agent Vector Labs H-1000  
Vortex Genie 2 Scientific industries, Inc SI0236  
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)     Final amount
DMEM Invitrogen 12634-010 500ml
Penstrep Gibco 15140-122 5ml of stock in 500ml DMEM
Glutamax Gibco 35050038 5ml of stock in 500ml DMEM
Hepes Gibco 15630056 5ml of stock in 500ml DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)     Final concentration
A83-01 Tocris 2939-50mg 0.5µM
Adv+++     make upto 100 ml
B27 Invitrogen 17504044 1X
EGF Peprotech AF-100-15 50ng/mL
Gastrin Tocris 3006-1mg 10 nM
NAC Sigma A9125-25G 1.25mM
NIC Sigma N0636-100G 10mM
Noggin CM In house*   10%
P38 inhibitor (SB202190) Sigma S7076-25 mg 10µM
PGE2 Tocris 2296/10 10 nM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1ml/500ml media
RSpoI CM In house*   20%
Wnt3a CM In house*   50%
In house* – cell lines will be provided upon request      
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)     To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)     Final concentration
Adv+++     make upto 100 ml
ALK-I A83-01 Tocris 2939-50mg 500nM
B27 Invitrogen 17504044 0.0763888889
FGF-10 Peprotech 100-26 100ng/ml
FGF-7 Peprotech 100-19 25ng/ml
N-Acetylcysteine Sigma A9125-25G 1.25mM
Nicotinamide Sigma N0636-100G 5mM
Noggin UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
p38 MAPK-I Sigma S7076-25 mg 1µM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1:500
RhoKI Y-27632 Abmole Bioscience M1817_100 mg 2.5µm
Rspo UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)     Final concentration
L-Glutathione reduced Sigma G4251-10MG 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Betaine Sigma 61962 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
L-Cysteine Sigma 168149-2.5G 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Linoleic acid Sigma L1376-10MG 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM
Taurine Sigma T0625-10MG 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Blocking buffer (for immunoflourescence staining)     Final concentration
Donkey/Goat serum Bio-Rad C06SB 2%
PBS Thermo-Fisher 70011044 Make upto 100ml
Tween 20 Merck P1379 0.1%
List of Antibodies used      
Alexa 568 goat anti-rabbit Invitrogen A-11011 Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo Waterborne, Inc A400FLK Dilution- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive Waterborne, Inc IMS400-20 Dilution-1:500
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306 Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674 Invitrogen A22287 Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155
Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). Upon request Upon request Dilution-1:500
Sporo-Glo Waterborne, Inc A600FLR-1X Dilution- 1:200

References

  1. Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
  2. Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
  3. Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
  4. Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
  5. Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
  6. DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
  7. Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
  8. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
  9. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
  15. Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
  16. Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
  17. O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
  18. Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
  19. Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
  20. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).

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Cite This Article
Dutta, D., Heo, I., O’Connor, R. Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection. J. Vis. Exp. (151), e59610, doi:10.3791/59610 (2019).

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