माइक्रोइंजेक्शन द्वारा 3 डी ऊतक व्युत्पन्न मानव ऑर्गनॉइड संस्कृति प्रणालियों में क्रिप्टोस्पोरिडियम संक्रमण का अध्ययन
Summary
हम क्रिप्टोस्पोरिडियम पार्वम द्वारा मानव आंतों और वायुमार्ग organoids के संक्रमण का अध्ययन करने के लिए oocysts तैयार करने और sporozoites शुद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन। हम आंतों organoid लुमेन और organoids के इम्यूनोस्टेनिंग में परजीवी के माइक्रोइंजेक्शन के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. अंत में, हम organoids से उत्पन्न oocysts के अलगाव का वर्णन.
Abstract
क्रिप्टोस्पोरिडियम पार्वम मानव दस्त रोग के प्रमुख कारणों में से एक है। परजीवी की विकृति को समझने और कुशल दवाओं को विकसित करने के लिए, एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली जो मेजबान में स्थितियों को फिर से दोहराती है, की आवश्यकता है। Organoids, जो बारीकी से अपने मूल के ऊतकों के समान, मेजबान परजीवी बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदर्श होते हैं. Organoids तीन आयामी (3 डी) ऊतक व्युत्पन्न संरचनाओं जो वयस्क स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं और किसी भी आनुवंशिक विपथन या परिवर्तन के दौर से गुजर के बिना समय की विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में विकसित कर रहे हैं. वे दोनों शीर्ष और basolateral सतहों के साथ अच्छी तरह से परिभाषित ध्रुवता है. Organoids दवा परीक्षण, जैव बैंकिंग, और रोग मॉडलिंग और मेजबान microbe बातचीत अध्ययन में विभिन्न अनुप्रयोगों है. यहाँ हम मानव आंतों और airway organoids को संक्रमित करने के लिए क्रिप्टोस्पोरिडियम के oocysts और sporozoites तैयार करने के लिए कैसे की एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। फिर हम यह प्रदर्शित करते हैं कि सूक्ष्मजीवको अंगाभ लुमेन में सूक्ष्मजीवों को इंजेक्ट करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग कैसे किया जा सकता है। वहाँ तीन प्रमुख तरीकों जिसके द्वारा organoids मेजबान microbe बातचीत अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-माइक्रोइंजेक्शन, यांत्रिक कतरनी और चढ़ाना, और मोनोलेयर बनाकर. माइक्रोइंजेक्शनिंग 3 डी संरचना के रखरखाव में सक्षम बनाता है और परजीवी मात्रा और रोगाणुओं के लिए प्रत्यक्ष शीर्ष पक्ष संपर्क के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। हम या तो इमेजिंग या oocyst उत्पादन के लिए organoids के इष्टतम विकास के लिए विवरण प्रदान करते हैं. अंत में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि कैसे नव उत्पन्न oocysts आगे बहाव प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए organoid से अलग किया जा सकता है.
Introduction
क्रिप्टोस्पोरिडियम संक्रमण के उपचार और रोकथाम के लिए दवाओं या टीकों का विकास इन विट्रो प्रणालियों की कमी के कारण बाधित हुआ है जो मनुष्यों में विवो स्थिति की ठीक तरह से नकल करते हैं1,2. वर्तमान में उपलब्ध प्रणालियों में से कई या तो केवल अल्पकालिक संक्रमण की अनुमति देते हैं (lt;5 दिन) या परजीवी3,4के पूर्ण जीवन चक्र का समर्थन नहीं करते . अन्य प्रणालियां जो परजीवी के पूर्ण विकास को सक्षम करती हैं, अमर कोशिका रेखाओं या कैंसर कोशिका रेखाओं पर आधारित होती हैं जो मनुष्यों में शारीरिक स्थिति को ईमानदारी से पुन: प्राप्त नहीं करती हैं5,6,7 . Organoids या ‘मिनी अंगों’ 3 डी ऊतक व्युत्पन्न संरचनाओं जो एक extracellular मैट्रिक्स विभिन्न ऊतक विशिष्ट विकास कारकों के साथ पूरक में बड़े हो रहे हैं. ऑर्गेनोइड्स को विभिन्न अंगों और ऊतकों से विकसित किया गया है। वे आनुवंशिक रूप से स्थिर हैं और अपने मूल के अंगों के अधिकांश कार्यों recapitulate, और समय की विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है. हमने क्रिप्टोस्पोरिडियम के साथ मानव आंतों और फेफड़ों के organoids को संक्रमित करने के लिए एक विधि विकसित की है जो आंतों और श्वसन क्रिप्टोस्पोरिडोसिस के लिए प्रासंगिक मेजबान-परजीवी बातचीत के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल में सटीक प्रदान करता है8 9,10,11,12,13. अन्य प्रकाशित संस्कृति मॉडल के विपरीत, organoid प्रणाली वास्तविक जीवन मेजबान परजीवी बातचीत के प्रतिनिधि है, जीवन चक्र के पूरा होने के लिए इतना है कि परजीवी जीवन चक्र के सभी चरणों का अध्ययन किया जा सकता है की अनुमति देता है, और परजीवी प्रसार बनाए रखता है 28 दिनों तक10के लिए |
क्रिप्टोस्पोरिडियम पार्वम एक ऐपीकॉम्प्लेन्चलियन परजीवी है जो श्वसन और आंतों के ट्रैक्ट के उपकला को संक्रमित करता है, जिससे लंबे समय तक दस्त रोग होता है। प्रतिरोधी पर्यावरण चरण oocyst है, दूषित भोजन और पानी में पाया14. एक बार ingested या साँस, oocyst excysts और चार sporozoites कि उपकला कोशिकाओं को देते हैं विज्ञप्ति. Sporozoites मेजबान कोशिकाओं पर सरकना और मेजबान सेल रिसेप्टर्स संलग्न है, लेकिन परजीवी पूरी तरह से सेल पर आक्रमण नहीं करता है, और यह15को घेरने के लिए मेजबान सेल प्रेरित करने के लिए प्रकट होता है. परजीवी, जो एक इंट्रासेल्यूलर लेकिन एक्स्ट्रासाइटोप्लाज्मिक डिब्बे के भीतर internalized है, कोशिका की शीर्ष सतह पर रहता है, एक परजीवी धानी के भीतर नकल. यह अलैंगिक प्रजनन के दो दौर से गुजरता है- एक प्रक्रिया जिसे मेरोफोनी कहा जाता है। मेरोजनी के दौरान, प्रकार मैं meronts विकसित जो आठ merozoites कि नई कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए जारी कर रहे हैं होते हैं. ये merozoites चार merozoites युक्त प्रकार द्वितीय meronts में विकसित करने के लिए नई कोशिकाओं पर आक्रमण। ये मेरोजोइट, जब जारी किए जाते हैं, कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं और मैक्रोगैमोंट और माइक्रोगामोंट में विकसित होते हैं। माइक्रोगेमेट्स जारी किए जाते हैं और ओसिस्टों में परिपक्व होने वाले युग्मनज का उत्पादन करने वाले मैक्रोगेम्स को उपजाऊ बनाते हैं। परिपक्व oocysts बाद में लुमेन में जारी कर रहे हैं. Oocysts या तो पतली दीवारों जो तुरंत उपकला को पुन: संक्रमित करने के लिए excyst हैं, या मोटी दीवारों जो पर्यावरण में जारी कर रहे हैं अगले मेजबान14को संक्रमित करने के लिए. क्रिप्टोस्पोरिडियम जीवन चक्र के सभी चरणों की पहचान हमारे समूह10द्वारा पहले विकसित organoid संस्कृति प्रणाली में की गई है .
चूंकि मानव organoids ईमानदारी से मानव ऊतकों को दोहराने9,11,13, और क्रिप्टोस्पोरिडियम10के सभी प्रतिकृति चरणों का समर्थन , वे आदर्श ऊतक संस्कृति प्रणाली का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं क्रिप्टोस्पोरिडियम जीव विज्ञान और मेजबान परजीवी बातचीत। यहाँ हम दोनों क्रिप्टोस्पोरिडियम oocysts और excysted sporozoites के साथ organoids को संक्रमित करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है, और इस ऊतक संस्कृति प्रणाली में उत्पादित नए oocysts अलग.
Protocol
Representative Results
Discussion
आंतों और वायुमार्ग organoids में क्रिप्टोस्पोरिडियम परजीवी की संस्कृति मेजबान परजीवी बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सटीक मॉडल प्रदान करता है10 लेकिन यह भी कई अन्य अनुप्रयोगों है. उदाहरण के लिए, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पशु और तुलनात्मक जैव चिकित्सा विज्ञान के स्कूल से डेबोरा ए शेफ़र के आभारी हैं, कृषि और जीवन विज्ञान के कॉलेज, एरिजोना विश्वविद्यालय, टक्सन, A$, संयुक्त राज्य अमेरिका के लिए हमें oocyst उत्पादन और विश्लेषण के साथ मदद करने के लिए. हम भी फ्रांसकी माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेंटर और डी.एल. Mullendore TEM तैयारी और अलग organoid oocysts के इमेजिंग के लिए वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी में धन्यवाद.
D.D. वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO-ALW, 016.Veni.171.015) से एक VENI अनुदान के प्राप्तकर्ता है. I.H. वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO-ALW, 863.14.002) से एक VENI अनुदान के प्राप्तकर्ता है और यूरोपीय आयोग से मैरी क्यूरी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (प्रस्ताव 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान ईआरसी उन्नत अनुदान समझौते संख्या 67013 के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से वित्त पोषण प्राप्त हुआ है और R21 AT009174 के तहत NIH NIAIH से RMO के लिए. यह काम Oncode संस्थान है, जो आंशिक रूप से डच कैंसर सोसायटी द्वारा वित्त पोषित है और डच कैंसर सोसायटी से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया का हिस्सा है.
Materials
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5ml | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500ml |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5ml of stock in 500ml DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5µM |
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1X |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1ml/500ml media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* – cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make upto 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25ng/ml |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make upto 100ml |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
