En analyse for kvantifisere protein-RNA binding i bakterier

Summary

I denne metoden, kvantifisere vi bindende affinitet av RNA bindende proteiner (RBPs) til beslektet og ikke-beslektet bindende områder ved hjelp av en enkel, Live, reporter analysen i bakterielle celler. Analysen er basert på undertrykkelse av et reporter gen.

Abstract

I initiering trinn av protein oversettelse, ribosom binder seg til initiering regionen av mRNA. Oversettelse initiering kan blokkeres ved binding av en RNA bindende protein (RBP) til initiering regionen av mRNA, som forstyrrer ribosom binding. I den presenterte metoden bruker vi dette blokkerende fenomenet for å kvantifisere bindings affinitet fra RBPs til deres beslektet og ikke-beslektet bindings områder. For å gjøre dette setter vi inn et test bindings område i startområdet for en reporter mRNA og induserer uttrykket av testen RBP. Når det gjelder RBP-RNA-binding, observerte vi en sigmoidal undertrykkelse av reporter uttrykket som en funksjon av RBP-konsentrasjon. Ved manglende affinitet eller svært lav affinitet mellom bindings stedet og RBP, ble det ikke observert signifikant undertrykkelse. Metoden er utført i levende bakterieceller, og krever ikke dyre eller sofistikerte maskiner. Det er nyttig for kvantifisere og sammenligne mellom bindende slektskap av ulike RBPs som er funksjonelle i bakterier til et sett av designet bindende nettsteder. Denne metoden kan være upassende for bindende områder med høy strukturell kompleksitet. Dette skyldes muligheten for undertrykkelse av ribosomal initiering av komplekse mRNA struktur i fravær av RBP, noe som vil resultere i lavere basal reporter genuttrykk, og dermed mindre Observer reporter undertrykkelse på RBP bindende.

Introduction

RNA bindende protein (RBP)-basert post-transcriptional regulering, spesielt karakterisering av samspillet mellom RBPs og RNA, har blitt studert grundig de siste ti årene. Det finnes flere eksempler på translational ned-regulering i bakterier som stammer fra RBPs hemme, eller direkte konkurrerer med, ribosom binding^1,2,3. Innen syntetisk biologi, RBP-RNA interaksjoner fremstår som et betydelig verktøy for utforming av transkripsjon-baserte genetiske kretser^4,5. Derfor er det en økning i etterspørselen etter karakterisering av slike RBP-RNA interaksjoner i en cellulær sammenheng.

De vanligste metodene for å studere protein-RNA interaksjoner er Elektroforetiske Mobility Shift-analysen (EMSA)⁶, som er begrenset til in vitro-innstillinger, og ulike trekk ned analyser⁷, inkludert klipp metoden^8,9 . Selv om slike metoder muliggjør oppdagelsen av de Novo RNA bindings stedene, lider de av ulemper som arbeidsintensive protokoller og dyre reaksjoner i dyp sekvensering, og kan kreve et spesifikt antistoff for RBP-pull-Down. På grunn av den mottakelige karakteren av RNA til sitt miljø, kan mange faktorer påvirke RBP-RNA-interaksjoner, med vekt på viktigheten av forhører RBP-RNA-binding i den cellulære konteksten. For eksempel har vi og andre demonstrert betydelige forskjeller mellom RNA-strukturene i vivo og in vitro^10,11.

Basert på tilnærmingen til en tidligere studie¹², har vi nylig demonstrert¹⁰ at når du plasserer pre-designede bindings steder for KAPSID RBPs fra bacteriophages ga¹³, MS2¹⁴, PP7¹⁵, og Qβ¹⁶ i Oversettelses initiering regionen av en reporter mRNA, er reporter uttrykk sterkt undertrykt. Vi presenterer en relativt enkel og kvantitativ metode, basert på dette undertrykkelse fenomenet, for å måle affinitet mellom RBPs og deres tilsvarende RNA bindings steds in vivo.

Protocol

1. system forberedelse Design av binding-site plasmider Utform bindings område kassetten som vist i figur 1. Hver minigene inneholder følgende deler (5 ‘ til 3 ‘): Eagl restriksjons område, ∼ 40 baser av 5 ‘ slutten av kanamycin (kan) motstands genet, pLac-Ara promoter, ribosom bindings sted (RBS), AUG av mCherry genet, en spacer (δ), en RBP bindende område, 80 baser av 5 ‘ end av mCherry genet, og en ApaLI restriksjon nettsted.Merk:</s…

Representative Results

Den presenterte metoden utnytter konkurransen mellom en RBP og ribosom for binding til mRNA molekylet (figur 1). Denne konkurransen gjenspeiles ved å redusere mCherry nivåer som en funksjon av økt produksjon av RBP-mCerulean, på grunn av økende konsentrasjoner av induser. I tilfelle av økende mCerulean fluorescens, uten vesentlige endringer i mCherry, en mangel på RBP binding er utledet. Representative resultater for både positiv og negativ belastning…

Discussion

Metoden beskrevet i denne artikkelen forenkler kvantitativ in vivo måling av RBP-RNA bindende affinitet i E. coli celler. Protokollen er relativt enkel og kan gjennomføres uten bruk av sofistikerte maskiner, og dataanalyse er grei. Videre er resultatene produseres umiddelbart, uten den relativt lange ventetiden knyttet til neste generasjons sekvensering (NGS) resultater.

En begrensning til denne metoden er at det fungerer bare i bakterielle celler. En tidligere studie<sup class="xre…

Materials

Ampicillin sodium salt	SIGMA	A9518
Magnesium sulfate (MgSO4)	ALFA AESAR	33337
48 plates	Axygen	P-5ML-48-C-S
8- lane plates	Axygen	RESMW8I
96-well plates	Axygen	P-DW-20-C
96-well plates for plate reader	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
Binding site sequences	Gen9 Inc. and Twist Bioscience		see Table 1
E. coli TOP10 cells	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
glycerol	BIO LAB	071205
incubator	TECAN	liconic incubator
Kanamycin solfate	SIGMA	K4000
KpnI- HF	NEB	R0142
ligase	NEB	B0202S
liquid-handling robotic system	TECAN	EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software	Mathworks
multi- pipette 8 lanes	Axygen	BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)	cayman	K40982552 019
PBS buffer	Biological Industries	020235A
platereader	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase	NEB	M0493
RBP seqeunces	Addgene	27121 & 40650	see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL)	BIO LAB	190305
SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281
Tryptone	BD	211705