Summary

En analyse for kvantifisere protein-RNA binding i bakterier

Published: June 12, 2019
doi:

Summary

I denne metoden, kvantifisere vi bindende affinitet av RNA bindende proteiner (RBPs) til beslektet og ikke-beslektet bindende områder ved hjelp av en enkel, Live, reporter analysen i bakterielle celler. Analysen er basert på undertrykkelse av et reporter gen.

Abstract

I initiering trinn av protein oversettelse, ribosom binder seg til initiering regionen av mRNA. Oversettelse initiering kan blokkeres ved binding av en RNA bindende protein (RBP) til initiering regionen av mRNA, som forstyrrer ribosom binding. I den presenterte metoden bruker vi dette blokkerende fenomenet for å kvantifisere bindings affinitet fra RBPs til deres beslektet og ikke-beslektet bindings områder. For å gjøre dette setter vi inn et test bindings område i startområdet for en reporter mRNA og induserer uttrykket av testen RBP. Når det gjelder RBP-RNA-binding, observerte vi en sigmoidal undertrykkelse av reporter uttrykket som en funksjon av RBP-konsentrasjon. Ved manglende affinitet eller svært lav affinitet mellom bindings stedet og RBP, ble det ikke observert signifikant undertrykkelse. Metoden er utført i levende bakterieceller, og krever ikke dyre eller sofistikerte maskiner. Det er nyttig for kvantifisere og sammenligne mellom bindende slektskap av ulike RBPs som er funksjonelle i bakterier til et sett av designet bindende nettsteder. Denne metoden kan være upassende for bindende områder med høy strukturell kompleksitet. Dette skyldes muligheten for undertrykkelse av ribosomal initiering av komplekse mRNA struktur i fravær av RBP, noe som vil resultere i lavere basal reporter genuttrykk, og dermed mindre Observer reporter undertrykkelse på RBP bindende.

Introduction

RNA bindende protein (RBP)-basert post-transcriptional regulering, spesielt karakterisering av samspillet mellom RBPs og RNA, har blitt studert grundig de siste ti årene. Det finnes flere eksempler på translational ned-regulering i bakterier som stammer fra RBPs hemme, eller direkte konkurrerer med, ribosom binding1,2,3. Innen syntetisk biologi, RBP-RNA interaksjoner fremstår som et betydelig verktøy for utforming av transkripsjon-baserte genetiske kretser4,5. Derfor er det en økning i etterspørselen etter karakterisering av slike RBP-RNA interaksjoner i en cellulær sammenheng.

De vanligste metodene for å studere protein-RNA interaksjoner er Elektroforetiske Mobility Shift-analysen (EMSA)6, som er begrenset til in vitro-innstillinger, og ulike trekk ned analyser7, inkludert klipp metoden8,9 . Selv om slike metoder muliggjør oppdagelsen av de Novo RNA bindings stedene, lider de av ulemper som arbeidsintensive protokoller og dyre reaksjoner i dyp sekvensering, og kan kreve et spesifikt antistoff for RBP-pull-Down. På grunn av den mottakelige karakteren av RNA til sitt miljø, kan mange faktorer påvirke RBP-RNA-interaksjoner, med vekt på viktigheten av forhører RBP-RNA-binding i den cellulære konteksten. For eksempel har vi og andre demonstrert betydelige forskjeller mellom RNA-strukturene i vivo og in vitro10,11.

Basert på tilnærmingen til en tidligere studie12, har vi nylig demonstrert10 at når du plasserer pre-designede bindings steder for KAPSID RBPs fra bacteriophages ga13, MS214, PP715, og Qβ16 i Oversettelses initiering regionen av en reporter mRNA, er reporter uttrykk sterkt undertrykt. Vi presenterer en relativt enkel og kvantitativ metode, basert på dette undertrykkelse fenomenet, for å måle affinitet mellom RBPs og deres tilsvarende RNA bindings steds in vivo.

Protocol

1. system forberedelse Design av binding-site plasmider Utform bindings område kassetten som vist i figur 1. Hver minigene inneholder følgende deler (5 ‘ til 3 ‘): Eagl restriksjons område, ∼ 40 baser av 5 ‘ slutten av kanamycin (kan) motstands genet, pLac-Ara promoter, ribosom bindings sted (RBS), AUG av mCherry genet, en spacer (δ), en RBP bindende område, 80 baser av 5 ‘ end av mCherry genet, og en ApaLI restriksjon nettsted.Merk:</s…

Representative Results

Den presenterte metoden utnytter konkurransen mellom en RBP og ribosom for binding til mRNA molekylet (figur 1). Denne konkurransen gjenspeiles ved å redusere mCherry nivåer som en funksjon av økt produksjon av RBP-mCerulean, på grunn av økende konsentrasjoner av induser. I tilfelle av økende mCerulean fluorescens, uten vesentlige endringer i mCherry, en mangel på RBP binding er utledet. Representative resultater for både positiv og negativ belastning…

Discussion

Metoden beskrevet i denne artikkelen forenkler kvantitativ in vivo måling av RBP-RNA bindende affinitet i E. coli celler. Protokollen er relativt enkel og kan gjennomføres uten bruk av sofistikerte maskiner, og dataanalyse er grei. Videre er resultatene produseres umiddelbart, uten den relativt lange ventetiden knyttet til neste generasjons sekvensering (NGS) resultater.

En begrensning til denne metoden er at det fungerer bare i bakterielle celler. En tidligere studie<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette prosjektet fikk støtte fra i-CORE program av planlegging og budsjettering komiteen og Israel Science Foundation (Grant no. 152/11), Marie Curie reintegrasjon Grant no. PCIG11-GA-2012-321675, og fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation program under innvilge avtale no. 664918-MRG-grammatikk.

Materials

Ampicillin sodium salt SIGMA A9518
Magnesium sulfate (MgSO4) ALFA AESAR 33337
48 plates Axygen P-5ML-48-C-S
8- lane plates Axygen RESMW8I
96-well plates Axygen P-DW-20-C
96-well plates for plate reader Perkin Elmer 6005029
ApaLI NEB R0507
Binding site sequences Gen9 Inc. and Twist Bioscience see Table 1
E. coli TOP10 cells Invitrogen C404006
Eagl-HF NEB R3505
glycerol BIO LAB 071205
incubator TECAN liconic incubator
Kanamycin solfate SIGMA K4000
KpnI- HF NEB R0142
ligase NEB B0202S
liquid-handling robotic system TECAN EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software Mathworks
multi- pipette 8 lanes Axygen BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) cayman K40982552 019
PBS buffer Biological Industries 020235A
platereader TECAN Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase NEB M0493
RBP seqeunces Addgene 27121 & 40650 see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL) BIO LAB 190305
SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9281
Tryptone BD 211705

References

  1. Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
  2. Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
  3. Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
  4. Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
  5. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
  6. Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
  7. Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
  8. Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  9. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  10. Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
  11. Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
  12. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  13. Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
  14. Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
  15. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  16. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
  17. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  18. . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
  19. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
  20. . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
  21. . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
  22. . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
  23. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  24. . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
  25. . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
  26. . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
  27. Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
  28. Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
  29. Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
  30. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
  31. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  32. Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
  33. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
  34. Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
  35. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
  36. Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).

Play Video

Cite This Article
Katz, N., Cohen, R., Atar, O., Goldberg, S., Amit, R. An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria. J. Vis. Exp. (148), e59611, doi:10.3791/59611 (2019).

View Video