Human blastocyst biopsi och förglasning
Summary
Blastocystbiopsi och förglasning krävs för att effektivt genomföra preimplantatorisk genetisk testning. Ett tillvägagångssätt som innebär en sekventiell öppning av zona pellucida och hämtning av 7-8 trophectoderm-celler i dag 5-7 efter insemination begränsar både antalet manipulationer som krävs och embryots exponering för att under optimala miljöförhållanden.
Abstract
Blastocystbiopsi utförs för att erhålla en tillförlitlig genetisk diagnostik under IVF-cykler med preimplantatorisk genetisk testning. Sedan, det ideala arbetsflödet innebär en säker och effektiv förglasning protokoll, på grund av handläggningstiden för diagnostiska tekniker och att överföra de valda embryot (s) på en fysiologisk endometriet i en följande naturlig cykel. En biopsi metod som omfattar den sekventiella öppnandet av zona pellucida och hämtning av 5-10 trophectoderm celler (helst 7-8) begränsar både antalet manipulationer som krävs och exponeringen av embryot till suboptimala miljöförhållanden. Efter ordentlig träning, var tekniken reproducerbar mellan olika aktörer när det gäller tidpunkten för biopsi (~ 8 min, som sträcker sig 3-22 min baserat på antalet embryon till biopsi per maträtt), avgörande diagnoser erhålls (~ 97,5%) och levande födelsetalen efter förglasad-värmde euploid blastocyststadiet överföring (> 40%). Överlevnaden efter biopsi, förglasning och uppvärmningen var så hög som 99,8%. Den re-expansion på 1,5 h från uppvärmningen var så hög som 97%, till stor del beroende av tidpunkten mellan biopsi och förglasning (helst ≤ 30 min), blastocyststadiet morfologisk kvalitet och dag av biopsi. I allmänhet är det bättre att vitrify en kollapsad blastocyst; i icke-PGT-cykler kan därför laserassisterad konstgjord krympning utföras för att inducera embryokollaps före frysförvaring. Det mest lovande framtidsperspektivet är den icke-invasiva analysen av IVF-kulturmedierna efter blastocystkulturen som en förmodad källa till embryonala DNA. Detta potentiella Avant-Garde är dock fortfarande under utredning och ett tillförlitligt protokoll måste ändå definieras och valideras.
Introduction
Det huvudsakliga målet med modern mänsklig embryologi är att maximera antalet levande födda per stimulerad cykel och minska kostnader, tid och ansträngningar för att uppnå en graviditet. För att uppnå detta mål bör validerade metoder för embryoval användas för att identifiera reproduktivt kompetenta embryon inom en kohort som erhållits under en IVF-cykel. Enligt de senaste bevisen, blastocyststadiet kultur1 kombinerat med omfattande kromosomala tester och förglasad-värmda euploid Embryo Transfer (et) är den mest effektiva ramen för att öka IVF effektivitet2. Det är uppenbart att aneuploidi-tester kräver ett embryonala preparat, som för närvarande huvudsakligen representeras av få celler som hämtats från trophectoderm (te), det vill säga den del av blastocysten som ger ursprung till embryobilagor (t. ex. moderkakan) under graviditet . Bortom karyotypanalysen kan även enstaka genmutationer bedömas från en vävnads analys som en del av en klinisk strategi som kallas preimplantatorisk genetisk testning (PGT;-A för aneuploidier,-SR för strukturella kromosom rekonstruktioner,-M för monogena sjukdomar). Andra äggocyter/embryo biopsi metoder har teoretiserade och antas kliniskt under de senaste decennierna, nämligen Polar organ biopsi och biopsi biopsi. Deras användning minskar dock nuförtiden eftersom deras processuella nackdelar (t. ex. högre arbetsbörda och risk för reproduktionseffekter) och diagnostiska begränsningar (t. ex. problem med enstaka cell analyser) implicit hindrar en tillräcklig balans mellan kostnader, risker och förmåner (för en översyn se3).
I detta papper, en av de viktigaste protokollen för TE biopsi är grundligt beskrivs tillsammans med efterföljande förglasning, uppvärmning och förfaranden för överföring krävs. Arbetsflödet här som beskrivs är perfekt för en upptagen PGT-enhet.
Som redan beskrivits tidigare av vår grupp4,5, innebär förfarandet den sekventiella öppnandet av zona pellucida av fullt expanderade blastocyster och avlägsnande av några te celler (i genomsnitt 7-8). Jämfört med den dag 3 Laser-assisted kläcknings-baserade blastocyststadiet biopsi metod6, detta förfarande kan lindra det dagliga schemat för en IVF-enhet där känsliga förfaranden, såsom blastocyststadiet biopsi och förglasning, måste utföras i tid. Så snart blastocysten når sin fulla expansion, kan biopsi utföras genom att välja te celler att ta bort, vilket förhindrar risken för diskbråck av inre cellmassan (ICM), som annars skulle göra förfarandet utmanande. I litteraturen har även ett tredje protokoll med blastocystbiopsi beskrivits, vilket innebär att laser assisterad kläckning utförs när embryot redan har nått blastocyststadiet, några timmar före förfarandet5,7. Men detta tillvägagångssätt är mer tidskrävande och främst passar IVF-enheter som genomför TE biopsi i händerna på Limit erfarna operatörer och med utsikt över en måttlig-låg daglig arbetsbelastning.
Intracytoplasmatisk spermie injektion (ICSI)8 bör vara en konsoliderad teknik om syftet är att utföra genetiska analyser inom IVF. På samma sätt är ett lämpligt kultur system för att på ett säkert sätt skörda embryon till blastocyststadiet avgörande för genomförandet av strategin för TE-biopsi. Ett tillräckligt antal inkubatorer, liksom användningen av låg syre spänning är viktiga förutsättningar för detta ändamål, inte för att äventyra blastocysthastigheten9. Samtidigt, ett effektivt kryopreservation program behövs för att säkert hantera en PGT cykel. Under det senaste decenniet har genomförandet av förglasning ökat embryo Cryo-överlevnaden ända upp till > 99%10,11. Detta gav tillräckligt med tid för att utföra genetisk testning och skjuta embryoöverföring till följande menstruationscykeln, på en icke-stimulerad och förmodligen mer mottaglig endometriet12.
Både TE biopsi och förglasning är krävande uppgifter som kräver strikta färdigheter och deras effektivitet kan variera mellan oerfaren aktörer. En särskild utbildningsperiod förordas därför innan varje verksamhetsutövare ges möjlighet att utföra dessa förfaranden kliniskt. Dessutom bör bibehållandet av operatörernas kompetens bedömas regelbundet genom övervakning av nyckeltal (KPI) för kryopreservering och biopsiprocedurer. Varje IVF-klinik bör ställa interna nyckeltal i detta syfte, som måste approximera de som publicerats av internationella konsortium och/eller de resultat som publicerats av referenslaboratorier.
TE biopsi, förglasning-uppvärmningen och bevittnande förfaranden är validerade tekniker på vår enhet, som har standardiserats i alla inblandade aktörer som rapporterats i tre tidigare publikationer11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Endast väl erfarna skickliga embryologer som har avslutat sin träningsperiod bör utföra både TE biopsi och blastocyststadiet vitrifiering. Dessutom krävs ett vittne för att övervaka förfarandena och garantera en effektiv spårbarhet under i) förflyttning av biopsier blastocysten från biopsi skålen (kompletterande figur 1) till post-biopsi skålen (kompletterande figur 1 ), därefter till förglasnings plattan (kompletterande figur 1) och slutligen till förgl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG och RM samlade in uppgifterna och utarbetade manuskriptet. DC analyserade uppgifterna, utarbetade de representativa resultaten, utförde statistiken och reviderade manuskriptet. FMU och LR gav kritisk diskussion om resultaten och hela manuskriptet.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
