Summary
نحن نقدم بروتوكولا لدراسة قواعد الترجمة mRNA في الخلايا المصابة بفيروس الإيدز باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي فحص المخبر. ويمكن استخدام الفحص لدراسة تنظيم الترجمة من قبل رابطه الدولالمستقلة-عناصر من mrna ، بما في ذلك 5 '-المنطقة غير المترجمة (utr) و 3 '-utr. يمكن أيضا فحص أوضاع بدء الترجمة المختلفة باستخدام هذه الطريقة.
Abstract
كل mrna الفيروسه الجدريه المنسوخة بعد الفيروسية الحمض النووي النسخ المتماثل لديه المحافظة علي التطور ، غير--templated 5 '--بولي (A) زعيم في 5 '-utr. لتشريح دور 5 '-بولي (A) الرائدة في الترجمة mrna اثناء العدوى الفيروسه الجدريه وضعنا في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي علي أساس الفحص الصحفي لوسيفيراز. هذا الفحص الصحفي يتكون من أربع خطوات أساسيه: (1) PCR لتضخيم قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. (2) في النسخ الأنبوبي لتوليد mRNA باستخدام T7 الجيش النيبالي الريبي البوليميريز; (3) الانتقال إلى إدخال في المختبر كتبت mRNA في الخلايا ؛ (4) الكشف عن نشاط لوسيفيراز كمؤشر للترجمة. فحص المخبر لوسيفيراز المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي وصفت هنا القضايا من النسخ المتماثل البلازميد في الخلايا المصابة poxvirus والنسخ خفي من البلازميد. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد تنظيم الترجمة من قبل عناصر رابطه الدولالمستقلة في mrna بما في ذلك 5 '-utr و 3 '-utr في أنظمه أخرى غير الخلايا المصابة بفيروسات. وعلاوة علي ذلك ، يمكن التحقيق في طرق مختلفه لبدء الترجمة مثل الاعتماد علي الغطاء ، والغطاء المستقل ، وأعاده البدء ، والبدء الداخلي باستخدام هذه الطريقة.
Introduction
وفقا ل العقيدة مركزيه, يتدفق معلومة وراثيه من [دنا] إلى [رنا] وبعد ذلك أخيرا إلى بروتين1,2. وينظم هذا التدفق من المعلومات الوراثية للغاية علي العديد من المستويات بما في ذلك mrna الترجمة3,4. ومن شان تطوير اختبارات المراسلين لقياس تنظيم التعبير الجيني ان ييسر فهم أليات التنظيمية المعنية بهذه العملية. هنا نحن وصف بروتوكول لدراسة mrna الترجمة باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش الريبي النيبالي القائم علي فحص المخبر لوسيفيراز في الخلايا المصابة poxvirus.
وتشمل الفيروسات العديد من مسببات الامراض البشرية والحيوانية خطيره جدا5. مثل جميع الفيروسات الأخرى ، poxvirusesات تعتمد حصرا علي آلات الخلية المضيفة لتخليق البروتين6،7،8. لتوليف بكفاءة البروتينات الفيروسية ، تطورت الفيروسات العديد من الاستراتيجيات لخطف آلات الخلوية الانتقالية لأعاده توجيهها لترجمه mrnas الفيروسية7،8. وتتمثل أحدي أليات الشائعة الاستخدام بواسطة الفيروسات في استعمال عناصر رابطه الدولالمستقلة في محاضرها. ومن الامثله البارزة علي ذلك الموقع الداخلي للدخول إلى الريبوسوم (المعهد الوطني للترجمة) ومحسن الترجمة المستقلة بالكاب (سايت)9و10و11. هذه العناصر cisجعل المستنسخات الفيروسية ميزه متعديه من خلال جذب آلات متعديه عبر أليات متنوعة12,13,14. أكثر من 100 الفيروسه الجدريه mrnas لديها تطور العنصر cis-بالوكالة بالانابه في 5 '-المنطقة غير المترجمة (5 '-utr): 5 '-بولي (a) زعيم في غاية 5 ' نهايات من هذه mrnas15,16. أطوال هذه 5 '-بولي (ا) القادة غير المتجانسة والتي تولدها الانزلاق من الحمض الريبي النيبالية المشفرة poxvirus خلال النسخ17,18. ونحن ، وغيرها ، اكتشفت مؤخرا ان الزعيم 5 '-بولي (A) يمنح ميزه الترجمة إلى mrna في الخلايا المصابة بفيروس فاكينيا (vacv) ، عضو تراجعي من poxviruses19،20.
في المختبر وقد تم تطويره في البداية لفهم دور 5 '-بولي (A) الرائدة في الترجمة في mrna التي كتبها الحمض الريبي النيبالي-المستندة إلى المخبر المخبري الفحص خلال العدوى الفيروسه الجدريه19,21. علي الرغم من ان التحاليل المستندة إلى الحمض النووي plasferase علي أساس الدنا وقد استخدمت علي نطاق واسع ، وهناك العديد من العيوب التي من شانها ان تعقد تفسير النتيجة في الخلايا المصابة poxvirus. أولا ، البلازميدات قادره علي تكرار في الخلايا المصابة VACV22. الثانية ، وغالبا ما يحدث النسخ خفي من البلازميد الحمض النووي18،23،24. الثالثة ، VACV المروج يحركها النسخ يولد بولي (A)-زعيم أطوال غير متجانسة مما يجعل من الصعب السيطرة علي بولي (A)-طول الزعيم في بعض التجارب18. في المختبر التي كتبها الجيش الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز بالتفاف هذه القضايا وتفسير البيانات واضحة.
هناك أربع خطوات رئيسيه في هذا الأسلوب: (1) تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) لتوليد قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. (2) في النسخ الأنبوبي لتوليد mRNA ؛ (3) النقل العابر لتسليم mRNA إلى الخلايا ؛ و (4) الكشف عن نشاط لوسيفيراز كمؤشر للترجمة (الشكل 1). الناتج PCR الفتحة يحتوي علي العناصر التالية في 5 ' إلى 3 ' الاتجاه: T7 المروج ، بولي (A) زعيم أو المطلوب 5 '-utr تسلسل ، اليراع لوسيفيراز فتح اطار القراءة (ORF) متبوعا بولي (a) الذيل. يستخدم PCR الاتساع كقالب لتوليف mRNA من خلال النسخ في المختبر باستخدام T7 البوليميرات. خلال النسخ في المختبر ، يتم تضمين m7G كاب أو غيرها من التناظرية غطاء في mrna توليفها حديثا. يتم نقل النصوص التي تمت تغطيتها إلى خلايا غير مصابه أو خاليه من العدوى. يتم جمع الخلية محلله في الوقت المطلوب بعد التحويل لقياس الانشطه لوسيفيراز التي تشير إلى إنتاج البروتين من mrna المحولة. ويمكن استخدام هذا الفحص الصحفي لدراسة تنظيم الترجمة من قبل رابطه الدولالمستقلة-عنصر الحاضر في 5 '-utr ، 3 '-utr أو مناطق أخرى من mrna. وعلاوة علي ذلك ، فان الفحص المستند إلى الحمض الريبي في المختبر يمكن استخدامه لدراسة أليات مختلفه لبدء الترجمة بما في ذلك البدء المعتمد علي الغطاء ، والبدء المستقل ، وأعاده البدء ، والبدء الداخلي مثل المعهد الوطني للدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR للنسخ في المختبر
- لاعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR ، تصميم الإشعال. عند تصميم الإشعال النظر في الخصائص الحاسمة مثل طول التمهيدي ، ودرجه الحرارة الصلب (Tm) ، GC المحتوي ، 3 ' نهاية مع G أو C الخ.
ملاحظه: تناقشت [أين دتيل] في هذا أدب25,26,27. - تصميم الإشعال لتوليد PCR السعه التي تحتوي علي العناصر التالية في 5 ' إلى 3 ' الاتجاه: T7-المروج ، بولي (a) زعيم ، اليراع لوسيفيراز ORF والذيل بولي (a) المشار اليها فيما يلي باسم T7_12A-fluc. تصميم الإشعال (إلى الامام والخلف) لتشمل جميع العناصر الاضافيه غير موجودة في قالب الحمض النووي (الشكل 2A).
ملاحظه: ويمكن الاطلاع علي تسلسل جميع العناصر في الجدول 1. - وتشمل العديد من النيوتيوديس اضافيه في التمهيدي إلى الامام (5 '-3 ')28، تليها T7 ، المروج ، بولي (A) زعيم أو المطلوب 5 '-utr تسلسل وما يقرب من 20 النيوتيودس ، وضبط علي أساس Tm، المقابلة لنهاية 5 ' من الجينات مراسل Orf. ضمان المنطقة المقابلة في التمهيدي مطابق لحبل الإحساس (+ حبلا) من الجينات.
ملاحظه: لفتره طويلة 5 '-UTR ، توليف اثنين من شظايا الحمض النووي: واحد مع T7 المروج تليها طويلة 5 '-UTR والثانية مع الجينات مراسل في ORF. الانضمام إلى هذه الأجزاء اثنين باستخدام ملحق التراكب PCR29. - تصميم عكس التمهيدي (5 '-3 ') لتشمل بولي (A) الذيل وحوالي 20 النيوتيوديس ، وضبط علي أساس Tm، المقابلة ل 3 ' نهاية الجينات مراسل في ORF. ضمان المنطقة المقابلة في التمهيدي مطابق لحبلا المضادة للشعور (-حبلا) من الجينات وفي الإطار وقف كودون موجودة قبل بولي (A) الذيل.
ملاحظه: يمكن تخصيص طول المطلوب من A في بولي (A) زعيم أو بولي (A) الذيل في الإشعال. علي سبيل المثال ، لأضافه 50 A في الذيل بولي (A) ، يجب ان يستتبع التمهيدي العكسي 50 T. المثل ، لأضافه 20 الف في بولي (A) زعيم ، يجب ان يستتبع التمهيدي إلى الامام 20 الف. - للمراقبة الداخلية ، وتصميم مجموعه أخرى من الإشعال التي تحتوي علي العناصر التالية في 5 ' إلى 3 ' الاتجاه: T7 المروج ، عشوائية 5 '-utr تسلسل الترميز التي تحتوي علي تسلسل kozak ، renilla لوسيفيراز ORF وبولي (a) الذيل المشار اليها فيما بعد إلى T7_ Kozak-Rluc.
- في أنبوب PCR ، أضافه الكواشف بالترتيب التالي: المياه الحرة dnase ، 2x عاليه الدقة الحمض النووي البوليميرات ، الإشعال ، وتسلسل أكد الحمض النووي قالب لوسيفيراز (الجدول 2).
ملاحظه: وينبغي تعديل مقادير المكونات الفردية في المخلوط وفقا لحجم التفاعل. - استخدام معيار 3-خطوه (التشبع ، الصلب ، تمديد) دوره PCR لتوليد قالب الحمض النووي كما هو مبين في الجدول 3.
ملاحظه: درجه الحرارة الصلب X درجه مئوية يعتمد علي مجموعه التمهيدي المستخدمة وتمديد الوقت T min تعتمد علي حجم السعه PCR والحمض النووي المستخدمة البوليميرات. - الكشف عن المنتج PCR عن طريق تشغيل 5-10 ٪ من رد فعل PCR في 1 ٪ اجنشا تريس خلات-أدتا (تاي) هلام الكهربائي (التي تحتوي علي 0.1 ميكروغرام/مل ايثيديوم بروميد) مع معيار الوزن الجزيئي المتاحة تجاريا. تصور الهلام تحت مصباح الاشعه فوق البنفسجية لتحديد حجم المنتج PCR.
- بعد تحديد الحجم الصحيح للمنتج PCR ، ~ 1.7 كيلوبايت لT7_12A و ~ 1.0 كيلوبايت لT7_Kozak ، تنقيه باستخدام مجموعه تنقيه PCR المتاحة تجاريا. Elute الحمض النووي باستخدام 100 μL النيوداز المياه الحرة (الشكل 2B).
- مره واحده تنقيه ، والتحقق من تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس طيفي وتحديد نسبه A260/A280 (~ 1.8-2.0 غير مقبول).
- تخزين الحمض النووي المنقي في-20 درجه مئوية أو استخدامها في النسخ المختبري علي الفور.
2. توليد mRNA بواسطة النسخ في المختبر
-
توليف الحمض الريبي النيبالي من المنتج PCR في المختبر ، وذلك باستخدام مجموعه النسخ في المختبر (الشكل3a).
ملاحظه: يتم استخدام T7_12A وقوالب الحمض النووي T7_Kozak-rluc لتوليف 12A-Fluc وكوزاك-Rluc mRNAs ، علي التوالي.- للقيام بذلك ، واتخاذ أنبوب الطرد المركزي الصغير وأضافه الكواشف في الترتيب التالي: DNase-RNase المياه الحرة ، العازلة NTP مزيج ، كاب التناظرية ، قالب PCR المنتج ، T7 الحمض الريبي النيبالي البلمره ميكس (الجدول 4).
ملاحظه: ويمكن أيضا ان تستخدم أنظمه السد الأخرى لغطاء الجيش النيبالي الريبي بالتتابع بعد في النسخ الأنبوبي بعد تعليمات الشركة المصنعة. - تخلط جيدا واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 2 ساعة.
- المضي قدما في تنقيه الجيش الريبي النيبالي توليفها باستخدام مجموعه تنقيه الحمض الريبي النيبالي.
- للقيام بذلك ، واتخاذ أنبوب الطرد المركزي الصغير وأضافه الكواشف في الترتيب التالي: DNase-RNase المياه الحرة ، العازلة NTP مزيج ، كاب التناظرية ، قالب PCR المنتج ، T7 الحمض الريبي النيبالي البلمره ميكس (الجدول 4).
- تشغيل الحمض الريبي النيبالي المنقي في 1.5 ٪ اجنشا تريس-borate-أدتا (TBE) هلام (التي تحتوي علي 0.5 ميكروغرام/مل ايثيديوم بروميد) للتحقق من RNA. تصور الهلام تحت مصباح الاشعه فوق البنفسجية (الشكل 3B).
- التحقق من تركيز الحمض الريبي النيبالي باستخدام مقياس طيفي وتحديد نسبه A260/A280 (~ 1.8-2.0 مقبول).
- Aliquot تنقيه الجيش النيبالي الريبي وتخزين في-80 درجه مئوية.
3. transfect mRNA إلى الخلايا
- البذور هيلا الخلايا في لوحه 24 بئر (ليكون تقريبا. ~ 80-90 ٪ متموج اليوم التالي) واحتضان بين عشيه وضحيها في حاضنه في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
- تصيب الخلايا هيلا مع فيروس فاكينيا (VACV) في تعدد العدوى (موي) من 5 أو الحفاظ علي خلايا هيلا غير المصابة للمقارنة.
ملاحظه: وزاره الداخلية هي عدد الجزيئات الفيروسية المعدية لكل خليه. - وزاره الداخلية x = {[(عدد الخلايا * x)/فيروس titer] * 1000} ميكرولتر من الفيروسات لكل 1 مل متوسطه.
-
بعد المطلوب h العدوى آخر (hpi) (في هذه التجربة في 10-12 hpi) ، transfect mrna (500 ng من إجمالي mrna لكل بئر من لوحات 24-حسنا) باستخدام كاشف الدهون الشحمية موجب كما هو مبين في الشكل 3c.
- لبئر واحده من 24 بئر لوحه ، مزيج 480 ng من 12a تسلسل تحمل اللوسيفيراز (12a-fluc) mrna و 20 نانوغرام من تسلسل kozak تحمل renilla لوسيفيراز (kozak-rluc) mrna في واحده أنبوب الطرد المركزي. في آخر أنبوب الطرد المركزي أضافه 1.1 μL من كاشف الدهون الحقن الشحمي.
- أضافه 55 μL من المتوسط المصل المخفض في كلا الأنبوبين. اخلطي وحضني في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق.
- بعد 5 دقائق من الحضانة ، أضافه 55 μl موجب الدهنية كاشف الدهون التي تحتوي علي انخفاض المصل المتوسطة في mrna التي تحتوي علي أنبوب.
- اخلطه برفق ولكن جيدا ، وحضن في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه.
- اثناء الحضانة ، وأزاله الخلية ثقافة المتوسطة وأضافه 400 μL من المصل المخفض متوسطه لكل بئر من لوحات 24-حسنا.
- بعد الحضانة ، أضافه 100 μL من الخليط قطره التساوي إلى بئر واحده من لوحات 24-حسنا.
4. قياس الانشطه Luciferase
- خمس ساعات بعد المشاركة في ترانسكشن من 12a-فلوك وكوزاك-رلوك mrna ، قياس النشاط لوسيفيراز باستخدام نظام الفحص لوسيفيراز قادره علي اجراء اختبارات مراسل اثنين (علي سبيل المثال ، المزدوج لوسيفيراز مراسل الفحص عده).
- أزاله المتوسطة المصل المنخفضة وlyse الخلايا عن طريق أضافه 150 μl 1x تحلل العازلة ، وهو مكون من عده الفحص لوسيفيراز.
- بعد 10 دقيقه الحضانة في درجه حرارة الغرفة ، وجمع محلله عن طريق تخريد الخلايا ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي.
- الطرد المركزي محلله في 12,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c إلى الحطام خليه بيليه.
- أضافه 30 μl من ماده طافي في الجدران مبهمه 96 لوحه الفحص الأبيض بشكل جيد مع أسفل الصلبة.
- قياس التلالؤ المزدوج باستخدام مجموعه المقايسة لوسيفيراز وقارئ لوحه متعددة الوضع الاناره.
- قم باجراء القياس باستخدام وظيفة الخواص الحركية (علي أساس كل بئر) باستخدام الإعدادات الموصوفة في الجدول 5.
ملاحظه: ويمكن أيضا ان تؤخذ القراءة باستخدام مقياس الاناره اليدوي. أضافه كميه متساوية من محلله والركيزة ل fluc في cuvette. انتظر لمده 2 ثانيه وقياس لمده 10 ليالي باستخدام مقياس الاناره. بعد قياس fluc ، سرعان ما تاخذ من كوفيت من مقياس الاناره وأضافه حجم متساو من الركيزة ل rluc يدويا. مره أخرى ، والانتظار لمده 2 ثانيه وقياس ل 10 ليالي باستخدام مقياس الاناره. - تصدير بيانات قراءه التلالؤ إلى تنسيق ملف مرغوب فيه.
- تحديد معدل الترجمة النسبية من 12A-فلوك mRNA في غير المصابين و VACV المصابة هيلا الخلايا عن طريق تقسيم قيمه فلوك عن طريق التحكم الداخلي قيمه Rluc.
ملاحظه: يظهر الشكل التكميلي 1 تحليل البيانات الاوليه خطوه بخطوه للحصول علي نشاط fluc النسبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخطوات الأربع من في المختبر التي كتبها الحمض النووي الريبي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز: PCR لتوليد قالب DNA للنسخ في المختبر ، في النسخ الأنبوبي لتوليد mrna ، نقل mrna ، وقياس لوسيفيراز ، يمكن ان ينظر اليه في الرسم التخطيطي ( الشكل 1). ويتضح تصميم الإشعال لكل من قوالب الحمض النووي (Fluc و Rluc) والمخطط العام لامتداد النتوء PCR في الرسم التخطيطي (الشكل 2 ا). بعد PCR ، تم الكشف عن المنتج PCR الحجم الصحيح من قبل تاي اجنشا هلام الكهربائي (الشكل 2B). فيما بعد, استعملت ال [بكر] منتوج كالقالب ان يجمع [رنا] في مختبره (شكل [3 ا]), اي يكون طهرت وركضت في [كن] هلام كهربائيه ان يتحقق الحجم (شكل [3 ب]). يتم تحويل mRNA المنقي والمتحقق منه إلى خلايا باستخدام كاشف الدهون الشحمية (الشكل 3C). وترد الإشعال المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 6.
وقد تم تطوير فحص المخبر المستند إلى الحمض الريبي في المختبر لفهم دور 5 '-بولي (A) زعيم في mrna الترجمة اثناء العدوى الفيروسه الجدريه. باستخدام هذا الفحص ، اختبرنا كفاءه الترجمة لل mRNA Fluc التي تحتوي علي 5 '-بولي (A) زعيم (12 nt) في الخلايا غير المصابة والمصابة VACV. تم تطبيع قيمه فلوك باستخدام قيمه Rluc في كل من الخلايا غير المصابة والمصابة VACV لتحديد النشاط Fluc النسبي (اي النشاط فلوك/Rluc النشاط) (الشكل 4A). التقسيم من [فلوك] ب [رلوك] تطبيع ال [ترنسفيكايشن] فعاليه و[رنا] استقرار في بئر خاصه. باستخدام هذا النهج التحليل ، قررنا ان 5 '-بولي (A) الزعيم الذي يحتوي علي mRNA لديه ميزه متعديه خلال العدوى VACV (الشكل 4B). الميزة في الخلايا المصابة لم يكن بسبب كفاءه النقل التفاضلية أو الاستقرار mRNA كما كان مستوي الحمض الريبي النيبالي مماثله في غير المصابين و VACV الخلايا المصابة 5 ح بعد mRNA ترانسفيكشن19.
الشكل 1: تخطيط الاجراء التجريبي. يستخدم PCR لتوليد قالب الحمض النووي مع العناصر المطلوبة. mrna ترميز الجينات مراسل لوسيفيراز يتم توليفها في المختبر باستخدام T7 الحمض الريبي النيبالي القائم علي نظام البلمره. وقد تمت المشاركة في النقل المشترك مع الخلايا المصابة بالعدوى أو غير المصابة بالفيروس (Rluc) من شركه "ريلوك" (Fluc). يتم قياس الانشطه لوسيفيراز باستخدام مقياس الاناره مع القدرة المزدوجة لوسيفيراز. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصميم التمهيدي وتضخيم الحمض النووي المستند إلى PCR. (ا) يتم توليف التمهيدي إلى الامام لتشمل تسلسل عشوائي 8nt ، T7 المروج تليها 5 '-utr المطلوب وجزء من 5 ' نهاية الجينات المراسل لوسيفيراز ، في حين ان التمهيدي العكسي يتضمن T-المسالك لتوليد بولي (A) الذيل و 3 ' نهاية الجينات المراسلة لوسيفيراز. بواسطة تمديد النتوء PCR باستخدام قالب البلازميد الذي يحتوي علي جين لوسيفيراز ، يتم إنشاء قالب الحمض النووي. (B) تم الكشف عن نطاق الحمض النووي من الحجم المرغوب فيه من تفاعل PCR باستخدام 1% اجنشا تاي هلام الكهربائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تركيب mRNA والنقل العابر. (ا) التخطيط للنسخ في المختبر. الحمض النووي تضخيمها PCR التي تحتوي علي الجينات لوسيفيراز المصب من 5 '-utr من الفائدة والمروج T7 يستخدم كقالب. يتم تعيين T7 الحمض الريبي النيبالية إلى المروج ويضيف ريبونكليوبوتيدس ، ويظهر باللون الأبيض ، من 5 ' إلى 3 ' الاتجاه. مره واحده mRNA هو 25-30 nt طويلة ، يتم أضافه m7G cap باستخدام التناظرية غطاء المضادة للخلف ، اركا. (B) عصابات RNA من في المختبر النسخ الكشف عن استخدام 1.5 ٪ الاغاروز tbe هلام الكهربائي. (ج) التخطيطي الذي يبين نقل المراسل mrna إلى الزنزانات. المتوسطة التي تحتوي اما علي المراسل mrna أو موجب كاشف الدهون في أنابيب منفصلة يسمح لتتوازن في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق. ثم يتم خلط الحلول تليها الحضانة في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه بعد ان يتم أضافه الحمض الريبي النيبالي/ترانسفيكشن خليط الكاشف إلى خلايا في لوحات الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: زيادة الكفاءة الانتقالية لل mRNA التي تحتوي علي زعيم 5 '-بولي (a). (ا) المزامير التي تحتوي علي القائد بولي (ا) في 5 '-utr و Rluc mrna مع تسلسل توافق الآراء kozak في 5 '-utr هي المشتركة في الخلايا. (ب) وكانت فلوك mrna مع 5 '-بولي (ا) الزعيم المقسمة في الخلايا غير المصابة وغير المصابة بالعدوى مع Rluc mrna. 5 hpi ، تم قياس النشاط لوسيفيراز باستخدام مقياس الاناره. Rluc تطبيع يتم تمثيل النشاط فلوج في الخلايا غير المصابة والمصابة VACV. تشير أشرطه الخطا إلى الانحرافات القياسية (SD) لثلاثه تكرارات علي الأقل. تم استخدام اختبار t للطالب لتحديد قيم P; ف-القيمة < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| عناصر | تسلسل |
| T7 المروج | تاتاكجاكتكاكتاتاجج |
| بولي (ا) زعيم | التي تتراوح من 3 إلى 51 |
| تسلسل كوزاك | GCCACC |
| بولي (A) الذيل | في الانجليزيه, الاسيويه...... |
الجدول 1: التسلسلات المستخدمة في الأسلوب – الجدول يحتوي علي تسلسل المروج T7, بولي (A) زعيم, تسلسل Kozak, بولي (A) الذيل.
| مكونات | حجم |
| المياه الحرة DNase: | 38 μL |
| 2X عاليه الدقة الحمض النووي بوليميريز ماستر ميكس: | 50 μL |
| التمهيدي الامامي (10 μM): | 4 ميكرولتر |
| التمهيدي العكسي (10 μM): | 4 ميكرولتر |
| قالب الحمض النووي luciferase (1-10 ng/μL): | 4 ميكرولتر |
| مجموع: | 100 μL |
| مصدر لقالب الحمض النووي فلوك هو pGL3 البلازميد | |
| مصدر لقالب الحمض النووي rluc هو prl-rluc البلازميد |
الجدول 2: رد فعل pcr- tانه النظام وحجم المكونات المضافة في رد فعل pcr.
| خطوه | درجه الحراره | الوقت | دوره |
| التشبع الاولي | 95 درجه مئوية | 2 دقيقه | (1x دوره) |
| تمسخ | 95 درجه مئوية: | 15 ثانيه | |
| الصلب | X درجه مئوية: | 30 ثانيه | (25x دوره) |
| ملحق | 72 درجه مئوية: | تي مين | |
| التمديد النهائي | 72 درجه مئوية: | 7 دقائق | (1x دوره) |
| عقد | 4 درجه مئوية: | ∞ |
الجدول 3: برنامج PCR – الخطوات الخاصة ببرنامج PCR مع درجه الحرارة والوقت والدورة.
| مكونات | حجم | |
| DNase-RNase المياه الحرة: | حتى 20 μL | |
| المخزن المؤقت NTP (20 مم لكل rNTP): | 2 μL | |
| غطاء تناظري (40 مم): | 4 μL | |
| قالب PCR المنتج (400 ng) *: | X μl | (PCR تركيز المنتج تعتمد) |
| T7-الحمض الريبي النيبالي البلمره ميكس: | 2 μL | |
| مجموع: | 20 μL | |
| * T7_12A وقالب T7_Kozak-Rluc المستخدمة لتوليف 12A-Fluc وكوزاك-Rluc mRNA ، علي التوالي. |
الجدول 4: رد فعل النسخ الأنبوبي – الترتيب وحجم المكونات المضافة لتفاعل النسخ في المختبر.
| الخطوات | الحجم/الوقت |
| حقن الركيزة المقايسة Luciferase (فلوك): | 30 μL |
| وقت الانتظار/الحضانة: | 2 ق |
| قياس التلالؤ (فلوك): | 10 ليالي |
| وقف & الركيزة Glo (Rluc): | 30 μL |
| وقت الانتظار/الحضانة: | 2 ق |
| قياس التلالؤ (رلوك): | 10 ليالي |
الجدول 5: إعدادات قياس Luciferase – الخطوات لقياس لوسيفيراز مع حجم الموصي بها أو الوقت.
| الاشعال | تسلسل |
| T7-12A-فلوك إلى الامام | أتكجاكجاتاتاكجاكتكاكتاتاججااااااااااا في الانجليزيه, الاسيويه |
| T7--12A--فلوك عكس | الشركة الانجليزيه الخاصة بالشركات الخاصة بالشركة |
| T7-كوزاك-رلوك فوروار | أتكجاكجاتاتاكجاكتكاكتاتاججاتكجتاجككاكك الشركة الانجليزيه |
| T7-Kozak-Rluc عكس | الكل التي تتتتلتتتتتنتتلتتلتتتتتكتت الشركة الانجليزيه |
الجدول 6: الإشعال – الإشعال المستخدمة في هذه الطريقة مع تسلسل كامل.
الشكل التكميلي 1: تحليل البيانات الاوليه -خطوات لتحليل البيانات الخام للحصول علي بيانات طبيعيه. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جميع الخطوات الاربعه الاساسيه هي حاسمه لنجاح في المختبر المستندة إلى الحمض الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتصميم التمهيدي ، وخاصه بالنسبة للتسلسل المروج T7. T7 [رنا] [بولمرس] يبدا نسخ من ال يؤكد اولي [غ] ([غ] [ز-5 '-UTR-أب-]) في T7 مروج يضيف قبل ال [5 '-utr] تسلسل. علي الرغم من ان بدء النسخ الموقع (خدمات التشغيل التقني) يبدا من G الاولي في 5 ' نهاية ، وانخفاض عدد من G في اقل من ثلاثه في T7 منطقه المروج انخفض العائد RNA/الناتج من النسخ في المختبر. خلال التجربة ، لاحظنا ان هلام تنقيه الحمض النووي المنتج لم يكن الأفضل للنسخ في المختبر كما كان كل من الغلة ونوعيه الجيش النيبالي الريبي اقل. ركضنا فقط 5-10 ٪ من رد فعل PCR في 1 ٪ اجبرز هلام الكهربائي لتحديد حجم وتنقيه بقية 90-95 ٪ ، وذلك باستخدام مجموعه تنقيه PCR ، لاستخدامها في النسخ في المختبر. في حاله التضخيم غير محدده من PCR ، ويوصي قطع الفرقة الحجم المطلوب من هلام واستخدام هلام المنقي جزء الحمض النووي. وبما ان العائد قد يكون منخفضا ، فاننا نقترح زيادة حجم التفاعل لرد فعل النسخ في المختبر. وعلي غرار الأساليب الأخرى المستندة إلى النقل ، قد يحفز الحمض النووي/RNA مسارات استشعار الدنا/الحمض النووي الريبي التي قد تقمع الترجمة علي الصعيد العالمي أو الانتقائي. ولذلك ، يجب ان تفسر البيانات مع تحذيرات ، علي الرغم من اننا لم تواجه مشاكل يحتمل ان تسببها هذه المسالة في تجاربنا.
والطريقة المقترحة مناسبه للاستخدام في نظم نموذجيه مختلفه مع بعض التعديلات مثل طريقه تسليم mRNA ، والرقابة الداخلية التي ستستخدم ، والوقت المناسب للترجمة ، واعداد العينات وتحليل البيانات. القيد الرئيسي لهذا الأسلوب هو انه هو المقايسة مراسل لاختبار بسرعة تنظيم الترجمة من قبل العناصر cis التي لا تعكس تماما الظروف الفسيولوجية. ولذلك ، ينبغي ان تدعم هذه الطريقة بتجارب تكميليه أخرى ، ان أمكن.
بالمقارنة مع تعديل الحمض النووي ، ادوار التعديلات RNA اقل فهما. ومع ذلك ، مع اكتشاف الانزيمات التي تكتب وتقرا وتمحو التعديلات RNA30،31،32،33،34،35، فمن الممكن الآن لدراسة تاثير من [رنا] تعديل في مورثه تعبير30,31,32,33,34,35. في المختبر المستندة إلى الحمض الريبي النيبالية التي تستند اليها الفحص الصحفي لوسيفيراز يمكن تعديلها لدمج مختلف الحمض الريبي النيبالي التعديلات وتستخدم لاختبار اثارها علي الترجمة rna. علي سبيل المثال ، يمكن ان تتضمن هذه الطريقة النظير المختلفة التي تحتوي علي تعديلات مختلفه30،31. أضافه إلى ذلك, يلحق [رنا] داخلية يعدل انزيم اثناء أو بعد في [فيبل] نسخ يستطيع من المحتمل أدمجت داخلية [رنا] تعديل. أضافه تعديل إلى الحد الأقصى 0 ، الغطاء 1 ، وتعديل الجيش الوطني النيبالي الداخلي سيوفر أداه لدراسة ادوار هذه التعديلات RNA في الترجمة.
وفي المختبر التي كتبها الحمض الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز لديه إمكانات كبيره وتطبيق واسع في فهم البيولوجيا الاساسيه حول الترجمة RNA. ويمكن دراسة أليات المختلفة للشروع في الترجمة ، بما في ذلك البدء المعتمد علي الغطاء ، والبدء المستقل ، وأعاده البدء ، والاستهلال الداخلي ، مثل المعهد الوطني للرصد والتقييم ، باستخدام هذه الطريقة. علي راس هذه المزايا ، يمكن استخدام هذا الفحص لاختبار تنظيم الترجمة من قبل عناصر رابطه الدولالمستقلة في 5 '-utr و 3 '-Utr في mrna. يستخدم البروتوكول الموصوف المنتج PCR ، الذي يوفر ميزه لتجنب الاستنساخ طويلة وبسرعة فحص اثار عناصر RNA علي الترجمة. للتقليل من الأخطاء المحتملة اثناء PCR ، يجب استخدام البوليميرات عاليه الدقة وعدد دوره PCR منخفضه. بدلا من ذلك ، إذا تم استخدام قالب في كثير من الأحيان ، المطلوب 5-' utr و لوسيفيراز ORF يمكن استنساخها في البلازميد كقالب من النسخ في المختبر. معا, البروتوكول يوحد النسخ والسد mRNA في رد فعل واحد ويستخدم النقل التقليدية والتحليل الذي يجعل في المختبر التي كتبها الحمض الريبي النيبالي المستندة إلى الفحص المخبري المخبر الكترونيه سهله الاستخدام, سريع, وطريقه مباشره لدراسة أليات الترجمة mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يرغب أصحاب البلاغ في إعلان اي مصلحه مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AI128406 www.nih.gov) إلى ZY وجزئيا من قبل مركز جونسون لأبحاث السرطان (http://cancer.k-state.edu) في شكل راتب الصيف طالب الدراسات العليا إلى PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
