Summary
Vi presenterar ett protokoll för att studera mRNA översättning förordning i poxvirus-infekterade celler använder in vitro-transkriberas RNA-baserade luciferas reporter assay. Analysen kan användas för att studera översättning förordning av CIS-element i en mRNA, inklusive 5 '-oöversatt region (utr) och 3 '-utr. Olika lägen för översättnings initiering kan också undersökas med den här metoden.
Abstract
Varje poxvirus mRNA transkriberas efter viral DNA-replikering har en evolutionärt bevaras, icke-templated 5 '-poly (A) ledare i 5 '-UTR. Att dissekera den roll som 5 '-poly (a) ledare i mRNA översättning under poxvirus infektion vi utvecklat en in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay. Denna reporter analys består av fyra centrala steg: (1) PCR att förstärka DNA-mall för in vitro-transkription; (2) in vitro-transkription för att generera mRNA med T7 RNA-polymeras; (3) transfektion för att introducera in vitro-transkriberad mRNA i celler; (4) detektion av luciferasaktivitet som indikator för översättningen. Den RNA-baserade luciferas reporter analysen beskrivs här kringgår frågor av Plasmid replikering i poxvirus-infekterade celler och kryptisk transkription från plasmid. Detta protokoll kan användas för att fastställa översättning reglering av CIS-element i en mRNA inklusive 5 '-utr och 3 '-utr i andra system än poxvirus-infekterade celler. Dessutom, olika former av översättning initiering som Cap-beroende, Cap-oberoende, återinsättande, och inre initiering kan undersökas med hjälp av denna metod.
Introduction
Enligt den centrala dogm, genetisk information flödar från DNA till RNA och sedan slutligen till protein1,2. Detta flöde av genetisk information är mycket reglerad på många nivåer inklusive mRNA översättning3,4. Utveckling av rapportörs analyser för att mäta reglering av gen uttryck kommer att under lätta förståelsen av regleringsmekanismer som är involverade i denna process. Här beskriver vi ett protokoll för att studera mRNA översättning med hjälp av en in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay i poxvirus-infekterade celler.
Poxviruses omfattar många mycket farliga mänskliga och animaliska patogener5. Liksom alla andra virus, poxviruses förlitar sig uteslutande på värd cell maskiner för protein syntes6,7,8. För att effektivt syntetisera virala proteiner, utvecklade virus många strategier för att kapa cellulära translationella maskiner för att omdirigera den för översättning av viral mrnas7,8. En vanlig anställd mekanism av virus är att använda CIS-verkande element i sina utskrifter. Anmärknings värda exempel är den inre ribosome ingångs plats (IRES) och Cap-oberoende översättning förstärkare (Cite)9,10,11. Dessa CIS-element gör virus avskrifter till en translationell fördel genom att attrahera translationella maskiner via olika mekanismer12,13,14. Över 100 poxvirus mrnas har en evolutionärt bevarade CIS-verkande elementet i 5 '-oöversatt region (5 '-utr): en 5 '-poly (a) ledare vid mycket 5 ' ändar av dessa mrnas15,16. Längderna av dessa 5 '-poly (a) ledare är heterogena och genereras av glidning av poxvirus-kodade RNA-polymeras under transkription17,18. Vi, och andra, upptäckte nyligen att 5 '-poly (a) ledaren ger en översättning fördel till en mRNA i celler infekterade med vaccinia virus (vacv), den prototypiska medlemmen av poxviruses19,20.
In vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen utvecklades ursprungligen för att förstå den roll som 5 '-poly (a) ledare i mRNA översättning under poxvirus infektion19,21. Även plasmid DNA-baserade luciferas reporter analyser har använts i stor utsträckning, det finns flera nack delar som kommer att komplicera resultatet tolkningen i poxvirus-infekterade celler. Först, plasmider kan replikera i VACV-infekterade celler22. För det andra sker kryptisk transkription ofta från plasmid DNA18,23,24. För det tredje, VACV promotor-driven transkription genererar poly (A)-ledare av heterogena längder vilket gör det svårt att kontrol lera poly (A)-ledare längd i vissa experiment18. En in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay kringgår dessa frågor och data tolkningen är okomplicerad.
Det finns fyra viktiga steg i denna metod: (1) polymeras kedje reaktion (PCR) för att generera DNA-mall för in vitro-transkription; 2. in vitro-transkription för att generera mRNA. (3) transfektion för att leverera mRNA till celler; och (4) detektion av luciferasaktivitet som indikator för översättning (figur 1). Den resulterande PCR-Amplikonen innehåller följande element i 5 ' till 3 ' riktning: T7-Promotorn, poly (a) ledare eller önskad 5 '-utr sekvens, Firefly luciferas öppen läsram (ORF) följt av en poly (a) svans. PCR-amplikon används som mall för att syntetisera mRNA genom in vitro-transkription med T7-polymeras. Under in vitro-transkription, m7G Cap eller andra Cap analog ingår i nyligen syntetiserade mRNA. De utjämnade avskrifter är transfekterade till oinfekterade eller vacv-infekterade celler. Cellen lysate samlas på önskad tid efter transfektion att mäta luciferas aktiviteter som indikerar protein produktion från transfekterade mRNA. Denna reporter analys kan användas för att studera översättning förordning av CIS-element som finns i 5 '-utr, 3 '-utr eller andra regioner i en mRNA. Vidare, in vitro transkriberas RNA-baserade analysen kan användas för att studera olika mekanismer för översättning initiering inklusive Cap-beroende initiering, Cap-oberoende initiering, återinsättande och inre initiering som IRES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av DNA mall genom PCR för in vitro- transkription
- För att förbereda DNA-mallen genom PCR, design primers. När designa primers överväga avgörande egenskaper som primer längd, glödgning temperatur (Tm), GC innehåll, 3 ' End med G eller C etc.
Anmärkning: Diskuteras i detalj i dessa litteratur25,26,27. - Design grund färger för att generera PCR-amplikon som innehåller följande element i 5 ' till 3 ' riktning: T7-Promotorn, poly (a) ledare, Firefly luciferas ORF och en poly (a) svans som härefter kallas T7_12A-Fluc. Design primers (framåt och bakåt) som omfattar alla ytterligare element som inte finns i mallens DNA (figur 2A).
Anmärkning: Sekvensen för alla element återfinns i tabell 1. - Inkludera flera extra nukleotider i framåt primer (5 '-3 ')28, följt av T7-Promotorn, poly (a) ledare eller önskad 5 '-utr sekvens och cirka 20 nukleotider, justera baserat på Tm, motsvarande 5 ' slutet av reportergenen s Orf. Se till att motsvarande region i primern är identisk med känslan strängen (+ sträng) av genen.
Anmärkning: För långa 5 '-UTR, syntetisera två DNA fragment: en med T7 Promotorn följt av lång 5 '-UTR och andra med reporter genen ' s ORF. Sammanfoga dessa två fragment med hjälp av överlappning förlängning PCR29. - Design Reverse primer (5 '-3 ') för att inkludera poly (A) svans och cirka 20 nukleotider, justera baserat på Tm, motsvarande 3 ' slutet av reportergenen ORF. Se till att motsvarande region i primern är identisk med anti-Sense strand (-strand) av genen och en in-Frame stopp kodon är närvarande före poly (A) svans.
Anmärkning: Den önskade längden av A: s i en poly (A) ledare eller poly (A) svans kan anpassas i primers. Till exempel, för att lägga till 50 A ' s i poly (A) svans, omvänd primer bör innebära 50 T:s. På samma sätt, för att lägga 20 A: s i poly (A) ledare, framåt primer bör innebära 20 A ' s. - För intern kontroll, designa en annan uppsättning primers som innehåller följande element i 5 ' till 3 ' riktning: T7 Promoter, en slumpmässig 5 '-utr kodning sekvens som innehåller Kozak sekvens, renilla luciferas ORF och poly (a) svans avses hädanefter som T7_ Kozak-Rluc.
- I ett PCR-rör, tillsätt reagenserna i följande ordning: DNase fritt vatten, 2x High-Fidelity DNA-polymeras, primers, och sekvens bekräftade luciferas mall DNA (tabell 2).
Anmärkning: Mängderna av de enskilda komponenterna i blandningen skall justeras efter reaktions volymen. - Använd en standardiserad PCR-cykel med tre steg (denaturering, glödgning, förlängning) för att generera en DNA-mall som visas i tabell 3.
Anmärkning: Glödgningstemperatur X ° c beror på vilken primer som används och Förlängnings tiden T min beror på PCR-amplikonstorleken och den använda DNA-polymerasen. - Detektera PCR-produkten genom att köra 5-10% av PCR-reaktionen i 1% AGA ros tris-acetat-EDTA (Tae) gelelektrofores (innehåll ande 0,1 μg/ml etidiumbromid) tillsammans med kommersiellt tillgänglig molekyl vikt standard. Visualisera gelen under en UV-belysning för att bestämma storleken på PCR-produkten.
- Efter bestämning av rätt storlek på PCR-produkten, ~ 1,7 KB för T7_12A-Fluc och ~ 1,0 KB för T7_Kozak-Rluc, rena den med hjälp av en kommersiellt tillgänglig PCR rening kit. Eluera DNA med 100 μL nukleasfritt vatten (figur 2b).
- När renat, kontrol lera koncentrationen av DNA med hjälp av en spektrofotometer och bestämma A260/A280 förhållandet (~ 1.8-2.0 är acceptabelt).
- Förvara renat DNA vid-20 ° c eller Använd omedelbart för in vitro-transkription.
2. generera mRNA genom in vitro transkription
-
Syntetisera RNA från PCR-produkten in vitro, med hjälp av en in vitro-transkription Kit (figur 3a).
Anmärkning: T7_12A-Fluc och T7_Kozak-RLUC DNA-mallar används för att syntetisera 12a-Fluc och Kozak-Rluc mRNAs, respektive.- För att göra detta, ta en mikrocentrifug röret och tillsätt reagenserna i följande ordning: DNase-RNase fritt vatten, NTP buffert mix, Cap analog, template PCR produkt, T7-RNA polymeras Mix (tabell 4).
Anmärkning: Andra tak system kan också användas för att begränsa RNA sekventiellt efter in vitro-transkription enligt tillverkarens instruktion. - Blanda grundligt och inkubera vid 37 ° c i 2 h.
- Fortsätt till rening av syntetiserade RNA med hjälp av en RNA rening kit.
- För att göra detta, ta en mikrocentrifug röret och tillsätt reagenserna i följande ordning: DNase-RNase fritt vatten, NTP buffert mix, Cap analog, template PCR produkt, T7-RNA polymeras Mix (tabell 4).
- Kör renat RNA i 1,5% AGA ros tris-borate-EDTA (TBE) gel (innehåll ande 0,5 μg/ml etidiumbromid) för att kontrol lera RNA. Visualisera gelen under UV-belysning (figur 3b).
- Kontrol lera koncentrationen av RNA med en spektrofotometer och bestämma A260/A280 förhållandet (~ 1.8-2.0 är acceptabelt).
- Alikvot av renat RNA och förvaras vid-80 ° c.
3. transfect mRNA till celler
- Frö hela celler i en 24-brunn tallrik (att vara ca. ~ 80-90% konfluenta nästa dag) och inkubera över natten i en inkubator vid 37 ° c med 5% co2.
- Infektera HeLa celler med vaccinia virus (VACV) på en multiplicity of Infection (MOI) av 5 eller hålla oinfekterade HeLa celler för jämförelse.
Anmärkning: MOI är antalet smittsamma virus partiklar per cell. - MOI av X = {[(antal celler * X)/virus titer] * 1000} μl virus per 1 mL medium.
-
Efter önskad h post infektion (HPI) (i detta experiment på 10-12 HPI), transfect mRNA (500 ng av totala mRNA per brunn av 24-well plattor) med hjälp av en katjoniska lipidtransfektion reagens som visas i figur 3c.
- För en brunn av en 24-brunn tallrik, blanda 480 ng av 12a sekvens lager Firefly luciferas (12a-Fluc) mRNA och 20 ng av Kozak sekvens med renilla luciferas (Kozak-rluc) mRNA i en mikrocentrifug röret. I ett annat mikrocentrifugerör tillsätt 1,1 μL katjonlipidtransfektionreagens.
- Tillsätt 55 μL reducerat serum medium i båda rören. Blanda och inkubera i rums temperatur i 5 min.
- Efter 5 min inkubation, tillsätt 55 μL katjoniska lipidtransfektionreagens innehåll ande reducerat serum medium i mRNA-innehåll ande tub.
- Blanda försiktigt men grundligt, och inkubera i rums temperatur i 15 min.
- Under inkubationen, ta bort cell odlings mediet och tillsätt 400 μL reducerat serum medium per brunn med 24-well-plattor.
- Tillsätt 100 μL av blandningen droppvis och jämnt i en brunn med 24-well-plattor efter inkubation.
4. mäta Luciferase aktiviteter
- Fem timmar efter co-transfektion av 12a-Fluc och Kozak-rluc mRNA, åtgärd luciferas aktivitet med hjälp av en luciferas assay system som kan utföra två reporter analyser (t. ex. Dual luciferas reporter assay Kit).
- Ta bort det reducerade serum mediet och lysera cellerna genom att tillsätta 150 μl 1x lyseringsbuffert, en komponent i luciferas assay kit.
- Efter 10 min inkubation vid rums temperatur, samla lysat genom att skrota cellerna och överföra till en mikrocentrifug röret.
- Centrifugera lysatet vid 12 000 x g i 10 min vid 4 ° c till pellets cell skräp.
- Tillsätt 30 μL supernatanten i ogenomskinlig-walled 96 väl vit analys platta med en solid botten.
- Mät den dubbla luminiscens med hjälp av luciferas assay kit och en multimode Plattläsare luminometer.
- Utför mätningen med kinetikfunktionen (per brunn) med hjälp av de inställningar som beskrivs i tabell 5.
Anmärkning: Läsningen kan även tas med manuell luminometer. Tillsätt en lika volym lysat och substrat för Fluc i en kyvetten. Vänta 2 s och mät för 10 s med luminometer. Efter Fluc-mätningen, ta snabbt ut kyvette från luminometer och tillsätt en lika stor volym av substratet för Rluc manuellt. Återigen, vänta 2 s och mäta för 10 s med luminometer. - Exportera luminiscens läsa data till ett önskvärt fil format.
- Bestäm relativa omräknings kursen från 12A-Fluc mRNA i oinfekterade och VACV infekterade HeLa celler genom att dividera Fluc värde genom intern kontroll Rluc värde.
Anmärkning: Kompletterande figur 1 visar steg-för-steg-analys av rå data för att få relativ Fluc aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fyra stegen i in vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter assay: PCR för att generera DNA mall för in vitro-transkription, in vitro-transkription för att generera mRNA, mRNA transfektion, och luciferas mätning, kan ses i Schematisk diagram ( Figur 1). Utformningen av primers för både DNA-mallar (Fluc och Rluc) och det allmänna systemet för överhäng förlängning PCR illustreras i den schematiska (figur 2A). Efter PCR upptäcktes den rätt stora PCR-produkten av Tae AGA ros gelelektrofores (figur 2b). Därefter används PCR-produkten som mall för att syntetisera RNA in vitro (figur 3a), som renas och körs i TBE-gelelektrofores för att kontrol lera storleken (figur 3b). Den renade och kontrollerade mRNA är transfekterade till celler med hjälp av katjoniska lipidtransfektion reagens (figur 3c). Primers som används i detta protokoll listas i tabell 6.
Den in vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen utvecklades för att förstå den roll som 5 '-poly (a) ledare i mRNA översättning under poxvirus infektion. Med hjälp av denna analys testade vi översättnings effektiviteten för en Fluc mRNA som innehåller en 5 '-poly (A) ledare (12 NT) i oinfekterade och VACV-infekterade celler. Fluc-värdet normaliserades med Rluc-värdet i både icke-infekterade och VACV-infekterade celler för att bestämma den relativa Fluc-aktiviteten (dvs. Fluc activity/Rluc-aktivitet) (figur 4a). Uppdelningen av Fluc av Rluc normaliserade transfection effektivitet och RNA stabilitet i en viss brunn. Med hjälp av denna analys metod, bestämde vi att en 5 '-poly (A) ledare som innehåller mRNA har en translationell fördel under VACV-infektion (figur 4b). Fördelen i infekterade celler berodde inte på differential transfektion effektivitet eller mRNA stabilitet som RNA-nivån var likartad i oinfekterade och VACV infekterade celler 5 h post mRNA transfection19.
Figur 1: schema över försöks förfarandet. PCR används för att generera en DNA-mall med de önskade elementen. mRNA kodning en luciferas reporter genen syntetiseras in vitro med ett T7 RNA-polymerase-baserade system. En Firefly luciferas (Fluc) mRNA är co-transfected med en renilla luciferas (rluc) mRNA i oinfekterade eller vacv-infekterade celler. Luciferas aktiviteter mäts med hjälp av en luminometer med dubbla luciferas kapacitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: primer-design och PCR-baserad DNA-förstärkning. (A) framåt primer syntetiseras till att omfatta en 8nt slumpmässig sekvens, T7 Promotorn följt av en önskad 5 '-utr och en del av 5 ' slutet av luciferas reportern genen, medan den omvända primer innehåller en T-tarmkanalen för att generera poly (a) svans och 3 ' slutet av luciferas reporter genen. Genom överhäng extension PCR med hjälp av en Plasmid mall som innehåller en luciferas gen, en DNA-mall genereras. (B) DNA-bandet av önskad storlek från PCR-reaktionen upptäcktes med 1% AGA ros Tae gel Electrophoresis. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mRNA-syntes och transfektion. (A) Schematisk av in vitro-transkription. DNA som förstärks av PCR och som innehåller luciferasgenen nedströms från 5 '-UTR av intresse och T7-Promotorn används som mall. T7-RNA-polymeras rekryteras till Promotorn och lägger till ribonukleotides, som visas i vitt, från 5 ' till 3 '-riktning. När mRNA är 25-30 NT lång, m7G Cap tillsätts med hjälp av en anti-Reverse Cap analog, Arca. (B) RNA-band från in vitro-transkription ware som upptäckts med 1,5% AGA ros TBE gel elektrofores. (C) Schematisk demonstration av transfektion av reportern mRNA till celler. Medium som innehåller antingen reportern mRNA eller katjoniska lipidtransfektionreagens i separata tuber får jämnas ut vid rums temperatur i 5 min. Lösningarna blandas sedan med inkubation vid rums temperatur i 15 minuter varefter RNA/transfection-reagensblandningen tillsätts i celler i odlings plåtar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ökad translationell effektivitet av mRNA som innehåller en 5 '-poly (a) ledare. (A) Fluc mRNA som innehåller en poly (a) ledare i 5 '-utr och Rluc mRNA med Kozak konsensus sekvens i 5 '-utr är co-transfected till celler. (B) Fluc mRNA med 5 '-poly (a) ledare var transfekterade i oinfekterade och vacv-infekterade celler tillsammans med rluc mRNA. 5 HPI, klarferasaktivitet mättes med hjälp av en luminometer. Rluc normaliserade Fluc aktivitet representeras i icke-infekterade och vacv-infekterade celler. Felstaplar anger standard avvikelser (SD) på minst tre upprepningar. Students t-test användes för att bestämma P-värden; P-värde < 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Element | Sekvens |
| T7-promotorn | Mer från TAATACGACTCACTATAGGG |
| Poly (A) ledare | AAAAAAAAAAAA, allt från 3 till 51 som |
| Kozak sekvens | Mer från GCCACC |
| Poly (A) svans | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA...... |
Tabell 1: sekvenser som används i metoden – tabellen innehåller sekvenser av T7 Promotorn, poly (A) ledare, Kozak sekvens, poly (A) svans.
| Komponenter | Volym |
| DNase fritt vatten: | 38 μL |
| 2X High-Fidelity DNA-polymeras Master mix: | 50 μL |
| Framåt primer (10 μM): | 4 μl |
| Omvänd primer (10 μM): | 4 μl |
| Luciferase DNA-mall (1-10 ng/μL): | 4 μl |
| Totala: | 100 μL |
| Källa för Fluc DNA mallen är pGL3-Fluc Plasmid | |
| Källa för Rluc DNA-mall är pRL-Rluc Plasmid |
Tabell 2: PCR-reaktion – Beställ och den mängd komponenter som tillsätts i PCR-reaktionen.
| Steg | Temperatur | Tid | Cykel |
| Inledande denaturering | 95 ° c | 2 minuter | (1x cykel) |
| Denaturering | 95 ° c: | 15 s | |
| Glödgning | X ° c: | 30 s | (25x cykel) |
| Förlängning | 72 ° c: | T min | |
| Slutlig förlängning | 72 ° c: | 7 min | (1x cykel) |
| Hålla | vid 4 ° c: | ∞ |
Tabell 3: PCR-program – stegen för PCR-programmet tillsammans med temperatur, tid och cykel.
| Komponenter | Volym | |
| DNase-RNase fritt vatten: | upp till 20 μL | |
| NTP buffert Mix (20 mM av varje rNTP): | 2 μL | |
| Keps analog (40 mM): | 4 μL | |
| PCR-produkt för mall (400 ng) *: | X μl | (Beroende av PCR-Produktkoncentration) |
| T7-RNA polymeras mix: | 2 μL | |
| Totala: | 20 μL | |
| * T7_12A-Fluc och T7_Kozak-Rluc mall som används för att syntetisera 12A-Fluc och Kozak-Rluc mRNA, respectively. |
Tabell 4: in vitro-transkriptionsreaktion – den ordning och volym av komponenter som lagts till för in vitro-transkriptionsreaktion.
| Steg | Volym/tid |
| Injicera Luciferase assay substrat (Fluc): | 30 μL |
| Vänta/inkubations tid: | Mer från 2 s |
| Luminescence mätning (Fluc): | 10 s |
| Stopp & glo-substrat (Rluc): | 30 μL |
| Vänta/inkubations tid: | Mer från 2 s |
| Luminescence mätning (Rluc): | 10 s |
Tabell 5: inställningar för Luciferase-mätning – stegen för luciferasmätning med den rekommenderade volymen eller tiden.
| Grundfärger | Sekvens |
| T7-12A-Fluc framåt | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGaaaaaaaaaaaa Mer från ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG |
| T7-12A-Fluc omvänd | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACACGGCGATCTTTS CCGC |
| T7-Kozak-Rluc framåt | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGatcgtagccacc ATGACTTCGAAAGTTTATGATC |
| T7-Kozak-Rluc omvänd | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGTTS CATTTTT Mer från GAGAACTCGCTC |
Tabell 6: primers – primers som används i denna metod med kompletta sekvenser.
Kompletterande figur 1: analys av rå data – steg för att analysera rå data för att få normaliserade data. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alla fyra-core steg är avgörande för framgången för in vitro-transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen. Särskild uppmärksamhet bör ägnas primer design, särskilt för T7 promotor sekvens. T7 RNA-polymeras påbörjar transkription från den understrukna första G (ggg-5 '-utr-aug-) i T7 Promotorn som lagts till före 5 '-utr-sekvensen. Även om transkription start site (TSS) startar från den första G vid 5 ' slutet, minskar antalet G: s mindre än tre i T7 promotor regionen minskade RNA avkastning/utgång från in vitro-transkription. Under experimentet observerade vi att gel renad DNA-produkt inte var den bästa för in vitro-transkription eftersom både avkastning och kvalitet av RNA var lägre. Vi sprang bara 5-10% av PCR-reaktionen i 1% AGA ros gelelektrofores för att bestämma storleken och renade resten 90-95%, med hjälp av en PCR renings sats, som skall användas för in vitro-transkription. När det gäller icke-specifik förstärkning från PCR rekommenderas att man klipper det önskade storleks bandet från gel och använder gelrenat DNA-fragment. Eftersom avkastningen kan vara låg, föreslår vi att öka reaktions volymen för in vitro-transkriptionsreaktionen. I likhet med andra transfektionsbaserade metoder kan DNA/RNA stimulera DNA/RNA-avkännande vägar som globalt eller selektivt hämmar översättningen. Därför bör data tolkas med försiktighets åtgärder, även om vi inte har upplevt problem som kan orsakas av detta problem i våra experiment.
Den föreslagna metoden lämpar sig för användning i olika modell system med vissa modifieringar som metoden för mRNA-leverans, intern kontroll som ska användas, en lämplig tid för översättning, prov beredning och analys av data. Den huvudsakliga begränsningen av denna metod är att det är en reporter assay för att snabbt testa översättning reglering av CIS element som inte helt återspeglar fysiologiska förhållanden. Denna metod bör därför bekräftas av andra kompletterande experiment, om möjligt.
Jämfört med DNA-modifiering är rollerna för RNA-modifieringar mindre väl förstådda. Men med upptäckten av enzymer som skriver, läser och raderar RNA-modifieringar30,31,32,33,34,35, är det nu möjligt att studera påverkan av RNA-modifiering i gen uttryck30,31,32,33,34,35. In vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter assay kan modifieras för att införliva olika RNA-modifieringar och används för att testa deras effekter på RNA-översättning. Den här metoden kan till exempel innehålla olika Cap-analoger som har olika modifieringar30,31. Dessutom, komplettera ett internt RNA modifiera enzym under eller efter in vitro-transkription kan möjligen införliva interna RNA modifiering. Tillägg av en modifiering av locket 0, Cap 1, och en intern RNA-modifiering kommer att ge ett verktyg för att studera rollerna för dessa RNA-modifieringar i översättningen.
Den in vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen har stor potential och bred tillämpning i förståelsen grundläggande biologi om RNA-översättning. Olika mekanismer för initiering av översättning, inklusive Cap-beroende initiering, Cap-oberoende initiering, återinsättande och inre initiering såsom IRES kan studeras med hjälp av denna metod. Ovanpå dessa fördelar, denna analys kan användas för att testa översättning reglering av CIS-element på 5 '-utr och 3 '-utr i en mRNA. Det beskrivna protokollet använder PCR-produkten, som ger fördelen att undvika långvarig kloning och snabbt undersöka effekterna av RNA-element på översättning. För att minimera eventuella fel under PCR bör hög fidelity-polymeras och låg PCR-cykelnummer användas. Alternativt, om en mall används ofta, kan den önskade 5-' utr och luciferas ORF klonas i en Plasmid som mallen för in vitro-transkription. Tillsammans konsoliderar protokollet transkription och mRNA tak i en enda reaktion och använder konventionella transfektion och analys som gör in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay en användarvänlig, snabb och enkel metod att studera mekanismerna för mRNA-översättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna skulle vilja deklarera inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Projektet finansierades av National Institute of Health (AI128406 www.nih.gov) till ZY och delvis av Johnson cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) i form av Graduate student Summer stipendium till PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
