Summary
In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 '-非翻訳領域 (UTR) および 3 '-UTR を含む、mRNA のシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。この方法を使用して、異なる翻訳開始モードを調べることもできます。
Abstract
ウイルス DNA 複製後に転写されるすべてのポックスウイルス mRNA は、5 '-UTR において進化的に保存された、非テンプレート 5 '-ポリ (A) リーダーを有する。ポックスウイルス感染時の mRNA 翻訳における 5 ' ポリ (A) リーダーの役割を分析するために、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイを開発しました。このレポーターアッセイは、4つのコアステップで構成されています:(1) PCR 法転写のための DNA テンプレートを増幅します。(2) T7 RNA ポリメラーゼを用いて mRNA を生成する in vitro 転写;(3) インビトロで転写した mRNA を細胞内に導入するトランスフェクション。(4) 翻訳の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出ここで説明した RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染細胞におけるプラスミド複製の問題と、プラスミドからの不可解な転写を回避します。このプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞以外の系で 5 '-UTR および 3 '-UTR を含む mRNA 中のシス要素による翻訳調節を決定するために用いることができる。さらに、この方法を使用して、キャップ依存性、キャップ非依存、再開始、および内部開始などのさまざまな変換開始モードを調べることができます。
Introduction
セントラルドグマによると、遺伝情報は DNA から RNA へ、そして最終的にタンパク質1,2に流れます。この遺伝情報の流れは、mRNA 翻訳3,4を含む多くのレベルで高度に調節されている。遺伝子発現の調節を測定するレポーターアッセイの開発は、このプロセスに関与する規制メカニズムの理解を容易にします。ここでは、ポックスウイルスに感染した細胞において、in vitro 転写 RNA ベースのルシフェラーゼを用いた mRNA 翻訳を研究するためのプロトコールについて述べる。
ポックスウイルスは、多くの非常に危険なヒトおよび動物病原体5を含む。他のすべてのウイルスと同様に、ポックスウイルスはタンパク質合成6、7、8のための宿主細胞機械に独占的に依存しています。ウイルスは、ウイルスタンパク質を効率的に合成するために、ウイルス mRNAs7,8の翻訳にリダイレクトするために細胞翻訳機械をハイジャックする多くの戦略を進化させました。ウイルスによって一般的に採用されているメカニズムの1つは、 cisの作用する要素をトランスクリプトに使用することです。顕著な例には、内部リボソーム進入部位 (IRES) およびキャップ非依存性翻訳促進剤 (引用)9、10、11が含まれる。これらのシス元素は、ウイルス転写物を多様なメカニズム12,13,14を介して翻訳機械を誘致することによって翻訳優位にレンダリングする。100以上のポックスウイルス mRNAs は、5 '-非翻訳領域 (5 '-UTR) において進化的に保存されたシス作用素子を有する: これらの mRNAs15,16の非常に 5 ' 末端の 5 '-ポリ (a) リーダー。これらの 5 '-ポリ (A) リーダーの長さは不均一であり、転写17,18の間にポックスウイルスで符号化された RNA ポリメラーゼの滑りによって生成される。我々、および他の人は、最近、5 '-ポリ (A) リーダーがワクシニアウイルス (VACV) に感染した細胞の mRNA に翻訳優位を与えることを発見し、ポックスウイルス19,20のプロトタイプメンバーである。
In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染19,21の間の mRNA 翻訳における 5 '-ポリ (A) リーダーの役割を理解するために最初に発達しました。プラスミド DNA 系ルシフェラーゼのレポーターアッセイは広く使用されていますが、ポックスウイルスに感染した細胞では結果の解釈が複雑になる欠点がいくつかあります。まず、プラスミドは、VACV 感染細胞22で複製することができる。第2に、不可解な転写は、しばしばプラスミド DNA18、23、24から生じる。第3に、VACV プロモーター駆動転写は、不均一な長さのポリ (A) −リーダーを生成し、その結果、いくつかの実験18においてポリ (a) −リーダーの長さを制御することを困難にする。インビトロ転写された RNA ベースのルシフェラーゼは、これらの問題を回避し、データの解釈は簡単です。
この方法には、(1) ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の4つの主要なステップがあり、in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成します。(2) mRNA を生成するインビトロ転写;(3) 細胞内に mRNA を送達するトランスフェクションおよび (4) 変換の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出 (図 1)。得られた PCR アンプリコンは、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の元素を含有する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、または所望の 5 '-UTR 配列は、ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレーム (ORF) に続いて、ポリ (A) テールを有する。PCR アンプリコンは、T7 ポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって mRNA を合成する鋳型として使用される。In vitro 転写の間、m7G キャップまたは他のキャップアナログは、新たに合成された mRNA に組み込まれる。証明された転写物は未感染または VACV 感染細胞にトランスフェクトします。.細胞溶解物をトランスフェクション後の所望の時間に収集し、トランスフェクトされた mRNA からのタンパク質産生を示すルシフェラーゼ活性を測定します。このレポーターアッセイは、5 '-UTR、3 '-UTR、またはその他の mRNA の領域に存在するシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。さらに、in vitro 転写された RNA ベースのアッセイは、キャップ依存性の開始、キャップ非依存の開始、再開始および IRES のような内部開始を含む翻訳開始の異なるメカニズムを研究するために使用することができる。
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Protocol
1. PCR による In Vitro転写用 DNA テンプレートの作成
- PCR によって DNA テンプレートを調製するために、設計プライマー。プライマーの設計に際しては、プライマー長、アニーリング温度 (Tm)、GC 含有量、G や C などの 3 ' 末端などの重要な特性を考慮してください。
注:これらの文献25、26、27に詳細に論じた。 - 設計プライマーは、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の元素を含む PCR アンプリコンを生成する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、ホタルルシフェラーゼ ORF およびポリ (A) 尾を T7_12A-Fluc として以下に記す。鋳型 DNA に存在しないすべての追加要素を包含するようにプライマー (前方および後方) を設計する (図 2a)。
注:すべての要素の順序は表1で見つけることができます。 - いくつかの余分なヌクレオチドを前方プライマー (5 '-3 ')28に含み、続いて T7 プロモーター、ポリ (A) リーダーまたは所望の 5 '-UTR 配列および約20ヌクレオチドを、Tmに基づいて調整し、レポーター遺伝子の 5 ' 末端に対応するOrf。プライマー内の対応する領域が遺伝子のセンス鎖 (+ 鎖) と同一であることを確認します。
注:長い 5 '-UTR の場合、2つの DNA 断片を合成します: T7 プロモーターを持つ1つは長い 5 '-UTR、レポーター遺伝子の ORF と2番目です。オーバーラップ拡張 PCR29を使用してこれらの2つのフラグメントを結合します。 - 設計逆プライマー (5 ' − 3 ') は、ポリ (A) 尾と約20ヌクレオチドを含むように、Tmに基づいて調整し、レポーター遺伝子の ORF の 3 ' 末端に対応する。プライマー内の対応する領域が遺伝子のアンチセンス鎖 (−ストランド) と同一であること、およびフレーム内停止コドンがポリ (A) テールの前に存在していることを確認する。
注:ポリ (A) リーダーまたはポリ (A) テールにおける A の所望の長さは、プライマーにおいてカスタマイズすることができる。例えば、ポリ (A) テールに 50 A のを追加するには、リバースプライマーは 50 T を伴うべきです。同様に、ポリ (A) リーダーに 20 A を追加するには、フォワードプライマーは 20 A を伴う必要があります。 - 内部制御のために、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の要素を含む別のプライマーのセットを設計する: T7 プロモーター、Kozak 配列を含むランダム 5 '-UTR コード配列、レニラルシフェリンルシフェラーゼ ORF およびポリ (a) 尾として以下に記す T7_Kozak-Rluc。
- PCR チューブでは、試薬を次の順序で追加します: DNase の自由な水、2x 高忠実度の DNA ポリメラーゼ、プライマー、および配列確認されたルシフェラーゼテンプレート DNA (表 2)。
注:混合物中の個々の成分の量は、反応量に応じて調整されるべきである。 - 表 3に示すように、標準の3ステップ (変性、アニーリング、エクステンション) PCR サイクルを使用して、DNA テンプレートを生成します。
注:アニーリング温度 X ° c は、使用されているプライマーセットによって異なり、延長時間 T min は PCR アンプリコンサイズおよび使用される DNA ポリメラーゼによって異なります。 - Pcr 反応の 5-10% を、市販の分子量標準とともに 1% のアガローストリス-アセテート-EDTA (エチジウム) ゲル電気泳動 (0.1 μ g/ml の臭化) で実行することによって検出します。UV イルミネータの下でゲルを視覚化して、PCR 産物のサイズを決定します。
- PCR 産物の正しいサイズを決定した後、T7_12A-Fluc のための〜 1.7 kb、T7_Kozak-Rluc のための〜 1.0 kb、市販の PCR 精製キットを使用してそれを精製する。100μ l のヌクレアーゼ自由水を使用して DNA を溶出します (図 2b)。
- 一旦精製した後、分光光度計を用いて DNA の濃度を確認し、A260/A280 比 (〜 1.8-2.0 が許容される) を決定する。
- 精製された DNA を-20 ° c で保存するか、またはインビトロ転写に使用してください。
2. インビトロ転写による mRNA の生成
-
PCR 産物からインビトロで RNA を合成し、in vitro 転写キット (図 3a) を使用する。
注: T7_12A-Fluc および T7_Kozak-RLUC DNA テンプレートは、それぞれ 12a-Fluc および Kozak-Rluc mRNAs を合成するために使用されます。- これを行うには、マイクロ遠心チューブを取り、次の順序で試薬を加えてください: DNase 自由水、NTP バッファミックス、キャップアナログ、テンプレート PCR 産物、T7 RNA ポリメラーゼ混合物 (表 4)。
注:他のキャッピングシステムはまた、製造業者の指示に従ってインビトロ転写後に RNA を順次キャップするために使用することができる。 - 十分に混合し、2 h のための37° c で孵化しなさい。
- RNA 精製キットを用いて合成された RNA の精製に進みます。
- これを行うには、マイクロ遠心チューブを取り、次の順序で試薬を加えてください: DNase 自由水、NTP バッファミックス、キャップアナログ、テンプレート PCR 産物、T7 RNA ポリメラーゼ混合物 (表 4)。
- 精製された RNA を 1.5% のアガローストリス-ホウ酸-EDTA (TBE) ゲル (0.5 μ g/mL エチジウムを含む) で泳動し、RNA を検査します。UV 照明器の下のゲルを視覚化します (図 3b)。
- 分光光度計を使用して RNA の濃度を確認し、A260/A280 比 (〜 1.8-2.0 が許容される) を決定します。
- 精製 RNA をアリコート、-80 ° c で保存します。
3. 細胞への mRNA のトランスフェクト
- 種子 HeLa 細胞を24ウェルプレートに (約 80-90% コンフルエントである次の日)、5% の CO2で37° c のインキュベーター内で一晩インキュベートします。
- 複数の感染の多重度 (MOI) でのワクシニアウイルス (VACV) を細胞に感染するか、または感染していない HeLa 細胞を比較します。
注:MOI は、細胞当たりの感染性ウイルス粒子の数です。 - の MOI X = {[(細胞数× X)/ウイルス力価] * 1000} μ l 1 mL 培地あたり。
-
所望の h ポスト感染 (hpi) (本実験では 10-12 hpi) の後、トランスフェクト mRNA (24 ウェルプレートの1ウェルあたりの全 mRNA の 500 ng) をカチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いて図 3cに示す。
- 24ウェルプレートの1つのウェルについて、1つの Rluc チューブ中に 480 ng の12A 配列の Fluc (12A-2-2) mRNA および 20 ng の Kozak 配列レニラルシフェリンルシフェラーゼ (Kozak-マイクロ遠心) mrna を混合する。別のマイクロ遠心チューブで、カチオン性脂質トランスフェクション試薬の1.1 μ l を添加する。
- 両方の管の減らされた血清の媒体の55μ l を加えなさい。混合し、室温で5分間インキュベートします。
- 5分間のインキュベーションの後、チューブを含有する mRNA 中に減少した血清培地を含む55μ l カチオン性脂質トランスフェクション試薬を加える。
- 優しく、十分に混合し、室温で15分間インキュベートします。
- インキュベーションの間、細胞培養培地を除去し、24ウェルプレートのウェルあたりの減少した血清培地400μ l を加えた。
- インキュベートした後、24ウェルプレートの1つのウェルに滴下して均等に100μ l の混合物を加えます。
4. ルシフェラーゼ活性の測定
- 12A-Fluc および Kozak-Rluc mRNA の5時間の再トランスフェクションは、2つのレポーターアッセイ (例えば、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイキット) を行うことができるルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼ活性を測定します。
- 減少した血清培地を除去し、150μ l 1x 溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、ルシフェラーゼ測定キットの成分とする。
- 室温で10分間インキュベートした後、細胞を廃棄することによって溶解物を回収し、マイクロ遠心管に移す。
- 溶解液を4° c で10分間 12000 x gで遠心分離し、細胞デブリをペレットにします。
- 不透明な壁の96に30μ l の上澄みを加え、しっかりとした底を有する白色アッセイプレート。
- ルシフェラーゼアッセイキットとマルチモードプレートリーダールミノメーターを使用して、二重発光を測定します。
- 表 5に記載されている設定を使用して、動力学関数 (ウェル単位) を使用して測定を実行します。
注:読書はまた手動ルミノメーターを使用して取ることができる。キュヴェットの Fluc のための等量の溶解物および基質を加えなさい。2秒待ってから、ルミノメーターを使用して10秒間測定します。Fluc 測定の後、すぐにルミノメーターからキュベットを取り出し、手動で Rluc のために同じ体積の基板を追加します。もう一度、2秒待って、ルミノメーターを使用して 10 s のために測定して下さい。 - 発光読み取りデータを望ましいファイル形式にエクスポートします。
- 非感染および VACV に感染した HeLa 細胞において、Fluc 値を内部制御 Rluc 値で割ることにより、Fluc mRNA からの相対移動率を求めます。
注:補足図 1は、相対的な Fluc アクティビティを取得するための生データのステップごとの分析を示しています。
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Representative Results
In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼの4つのステップは、レポーターアッセイ: in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成するために、インビトロで、mRNA を生成する転写、mRNA トランスフェクション、およびルシフェラーゼ測定、スケマティックダイアグラムで見ることができます (図 1)。DNA テンプレート (Fluc および Rluc) の両方のためのプライマーの設計および突出部延長 PCR の一般的なスキームが概略図に示されている (図 2a)。PCR の後、適切なサイズの PCR 産物が、タエアガロースゲル電気泳動によって検出されました (図 2b)。続いて、インビトロで RNA を合成するための鋳型として PCR 産物を使用し (図 3a)、これを精製し、TBE ゲル電気泳動で実行してサイズを検証した (図 3b)。精製および検証された mRNA を、カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いて細胞にトランスフェクトする (図 3c)。このプロトコルで使用されるプライマーは、表 6に列挙されている。
In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染時の mRNA 翻訳における 5 '-ポリ (A) リーダーの役割を理解するために開発しました。このアッセイを用いて、未感染および VACV 感染細胞に 5 '-ポリ (A) リーダー (12 nt) を含む Fluc mRNA の翻訳効率を試験しました。Fluc 値は、未感染および VACV 感染細胞の両方の Rluc 値を用いて正規化され、相対 Fluc 活性 (すなわち Fluc 活性/Rluc 活性) を決定した (図 4a)。Rluc による Fluc の分裂は、特定の井戸におけるトランスフェクション効率および RNA 安定性を標準化した。この分析アプローチを用いて、mRNA を含む 5 '-ポリ (A) リーダーが VACV 感染の間の翻訳優位を有することを決定した (図 4b)。感染細胞における利点は、RNA レベルが非感染性および VACV 感染細胞 5 h 後 mRNA トランスフェクション19において類似していたので、微分トランスフェクション効率または mrna 安定性によるものではなかった。
図 1: 実験手順の概略PCR は、目的の要素を持つ DNA テンプレートを生成するために使用されます。ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする mRNA は、T7 RNA ポリメラーゼベースのシステムを用いて in vitro で合成される。ホタルルシフェラーゼ (Fluc) mRNA は、未感染または VACV 感染細胞へのレニラルシフェリンルシフェラーゼ (Rluc) mRNA と共トランスフェクトされます。ルシフェラーゼ活性は、二重ルシフェラーゼ機能を持つルミノメーターを使用して測定されます。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: プライマー設計と PCR ベースの DNA 増幅(A) フォワードプライマーは、8nt ランダム配列を含むように合成され、T7 プロモーターは所望の 5 '-UTR およびその 5 ' 末端のルシフェラーゼレポーター遺伝子の一部を、逆プライマーは、ポリ (A) 尾および 3 ' 末端の生成する T 管を含むルシフェラーゼレポーター遺伝子。ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド鋳型を用いて伸長 PCR をオーバーハングさせることにより、DNA 鋳型が生成される。(B) PCR 反応から所望のサイズの DNA バンドを、1% のアガロース・タエゲル電気泳動を用いて検出した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: mRNA 合成とトランスフェクション(A) in vitro 転写の概略図。関心のある 5 '-UTR から下流へのルシフェラーゼ遺伝子を含む PCR によって増幅された DNA と T7 プロモーターとがテンプレートとして用いられる。T7 RNA ポリメラーゼをプロモーターに動員し、5 ' 〜 3 ' 方向に白で示すリボヌクレオチドを加えます。MRNA が 25-30 nt であれば、m7G キャップはアンチリバースキャップアナログを使用して追加されます。(B) インビトロ転写焼からの RNA バンドは、1.5% のアガロース TBE ゲル電気泳動を使用して検出した。(C) 細胞へのレポーター mRNA のトランスフェクションを実証する概略図。別々のチューブにレポーター mRNA またはカチオン性脂質トランスフェクション試薬のいずれかを含む培地は、5分間室温で平衡化することができる。その後、溶液を混合し、次いで15分間室温でインキュベートし、その後 RNA/トランスフェクション試薬混合物を培養プレート中の細胞に添加する。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 5 '-ポリ (a) 引出線を含む mRNA の増加した翻訳効率。(A) 5 '-utr においてポリ (a) リーダーを含有する Fluc mrna と、Kozak コンセンサス配列を有する Rluc mrna を、細胞に共トランスフェクトする。(B) 5 '-ポリ (A) リーダーを Fluc mrna を、Rluc mrna と共に未感染および VACV 感染細胞にトランスフェクトした。5 hpi、ルシフェラーゼ活性はルミノメーターを用いて測定した。Rluc に正規化された Fluc 活性は、未感染および VACV 感染細胞において表される。誤差バーは、少なくとも3回の繰り返しの標準偏差 (SD) を示します。スチューデントの t 検定は、P 値を決定するために使用されました。P 値 < 0.001。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 要素 | シーケンス |
| T7 プロモーター | TAATACGACTCACTATAGGG |
| ポリ (A) リーダー | AAAAAAAAAAAA は、3 ~ 51 の範囲で |
| Kozak 配列 | GCCACC |
| ポリ (A) テール | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA...... |
表 1: メソッドで使用されるシーケンス-テーブルには、T7 プロモーターのシーケンス、ポリ (A) リーダー、Kozak シーケンス、ポリ (A) テールが含まれています。
| コンポーネント | ボリューム |
| DNase 無料の水: | 38μ l |
| 2X 高忠実度の DNA ポリメラーゼマスターミックス: | 50μ l |
| フォワードプライマー (10 μ m): | 4μ l |
| 逆プライマー (10 μ m): | 4μ l |
| ルシフェラーゼ DNA テンプレート (1-10 ng/μ l): | 4μ l |
| 合計： | 100μ l |
| Fluc DNA テンプレートのソースは pGL3-Fluc プラスミド | |
| Rluc DNA テンプレートのソースは pRL-Rluc プラスミド |
表 2: pcr 反応– 彼が注文し、pcr 反応で添加された成分の量。
| ステップ | 温度 | 時間 | サイクル |
| 初期変性 | 95° c | 2分 | (1x サイクル) |
| 変性 | 95° c: | 15秒 | |
| 焼鈍 | X ° C: | 30秒 | (25x サイクル) |
| 拡張子 | 72° c: | T 分 | |
| 最終拡張 | 72° c: | 7分 | (1x サイクル) |
| 保持 | 4° c: | ∞ |
表 3: PCR プログラム– PCR プログラムの手順を温度、時間、サイクルと共に示します。
| コンポーネント | ボリューム | |
| DNase-RNase フリー水: | 20μ l まで | |
| NTP バッファミックス (各 rNTP の 20 mM): | 2μ l | |
| キャップアナログ (40 mM): | 4μ l | |
| テンプレート PCR 製品 (400 ng) *: | X μ l | (PCR 産物濃度依存) |
| T7-RNA ポリメラーゼ混合物: | 2μ l | |
| 合計： | 20μ l | |
| * T7_12A-Fluc および T7_Kozak-Rluc テンプレートは、それぞれ 12A-Fluc および Kozak-Rluc mRNA を合成するために使用されます。 |
表 4: in vitro 転写反応–インビトロ転写反応のために添加される成分の次数と体積。
| 手順 | ボリューム/時間 |
| ルシフェラーゼアッセイ基板 (Fluc) を注入します。 | 30μ l |
| 待機/インキュベーション時間: | 2 s |
| 発光測定 (Fluc): | 10秒 |
| 停止 & Glo 基板 (Rluc): | 30μ l |
| 待機/インキュベーション時間: | 2 s |
| 発光測定 (Rluc): | 10秒 |
表 5: ルシフェラーゼ測定設定 –推奨される体積または時間でのルシフェラーゼ測定のためのステップ。
| プライマー | シーケンス |
| T7-12A-Fluc フォワード | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGaaaaaaaaaaaa ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG |
| T7-12A-Fluc 逆 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACACGGCGATCTTTCCGC |
| T7-Kozak-Rluc フォワード | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGatcgtagccacc ATGACTTCGAAAGTTTATGATC |
| T7-Kozak-Rluc 逆 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGTTCATTTTT GAGAACTCGCTC |
表 6: プライマー–完全な配列でこの方法で使用されるプライマー.
補足図 1: 生データの解析–生データを分析して正規化されたデータを取得するための手順。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
全ての4コアステップは、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイの成功にとって重要である。プライマーの設計、特に T7 プロモーター配列には特別な注意が払われるべきである。T7 RNA ポリメラーゼは、5 '-UTR 配列の前に追加された T7 プロモーターにおいて下線が付いた最初の G (gGG-5'-UTR-AUG-) からの転写を開始する。転写開始部位 (TSS) は、5 ' 末端で最初の G から開始するが、T7 プロモーター領域では G の3未満の数を減少させることは、RNA の収率/出力を in vitro 転写から減少させた。実験の間、RNA の収量と質の両方が低かったので、ゲル精製 DNA 産物はインビトロ転写に最適ではなかったことが観察された。1% のアガロースゲル電気泳動で 5-10% の PCR 反応を実行し、サイズを決定し、残りの 90-95% を精製し、PCR 精製キットを使用してインビトロ転写に使用しました。PCR からの非特異的増幅の場合、ゲルから所望のサイズのバンドを切断し、ゲル精製した DNA 断片を使用することが推奨されます。収率が低い可能性があるので、インビトロ転写反応の反応量を増加させることを提案する。他のトランスフェクションベースの方法と同様に、DNA/RNA は、グローバルに、または選択的に翻訳を抑制することができる DNA/RNA 検出経路を刺激することができる。したがって、この問題によって発生する可能性のある問題は、実験では発生しませんでしたが、データは注意して解釈する必要があります。
提案された方法は、mRNA 送達の方法、使用する内部制御、翻訳、サンプル調製およびデータ分析のための適切な時間などのいくつかの変更を伴う異なるモデルシステムでの使用に適している。この方法の主な制限は、生理学的条件を完全に反映していないcis元素による翻訳調節を迅速に試験するレポーターアッセイであることである。したがって、この方法は、可能であれば他の補完的な実験によって裏付けされるべきである。
DNA 修飾と比較して、RNA 修飾の役割はあまりよく理解されていません。しかしながら、書き出した酵素の発見に伴い、RNA 改変30、31、32、33、34、35を読み出して消去し、その影響を研究することが可能になった。遺伝子発現30、31、32、33、34、35における RNA 修飾の。In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイは、異なる RNA 修飾を組み込んで、RNA 翻訳に対するその効果をテストするために修飾することができます。例えば、この方法は、種々の修正30、31を有する異なるキャップ類似体を組み込むことができる。さらに、体外転写中または後に内部 RNA 修飾酵素を補うことは、おそらく内部 RNA 修飾を組み込むことができます。キャップ0、cap 1、および内部 RNA 修飾への変更の追加は、これらの RNA 修飾の翻訳の役割を研究するためのツールを提供します。
In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼは、RNA 翻訳に関する基礎生物学を理解する上で大きな可能性と広い応用があります。IRES のようなキャップ依存の開始、キャップ非依存性の開始、再開始および内部開始を含む翻訳の開始のための異なるメカニズムは、この方法を用いて研究することができる。これらの利点の上に、このアッセイは、mRNA において 5 '-UTR および 3 '-UTR におけるシス要素による翻訳調節を試験するために用いることができる。記述されたプロトコルは、長いクローニングを回避し、翻訳上の RNA 要素の影響を迅速に調べる利点を提供する PCR 産物を使用します。PCR 中の潜在的なエラーを最小限に抑えるために、高忠実度のポリメラーゼと低 PCR サイクル番号を使用する必要があります。あるいは、鋳型を頻繁に使用する場合には、所望の 5-' UTR およびルシフェラーゼ ORF を、インビトロ転写の鋳型としてプラスミドにクローニングすることができる。併せて、このプロトコルは、単一の反応で転写および mRNA キャッピングを統合し、従来のトランスフェクションと分析を利用して、インビトロ転写 RNA ベースのルシフェラーゼを使用して、ユーザーフレンドリーで迅速、かつ簡単な方法でアッセイを行います。mRNA 翻訳の仕組みを研究する。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言したいと思います。
Acknowledgments
このプロジェクトは、国立衛生研究所 (AI128406 www.nih.gov) が ZY に、また一部はジョンソンがん研究センター (http://cancer.k-state.edu) によって、大学院生の夏期給付の形で PD に資金を提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
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