Summary
Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 '-região não traduzida (UTR) e 3 '-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.
Abstract
Cada mRNA do poxvirus transcrito após a replicação viral do ADN tem um 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, não-modelado do 5 '-UTR. Para dissecar o papel de 5 '-Poly (A) líder na tradução de mRNA durante a infecção do poxvirus nós desenvolvemos in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Este ensaio do repórter compreende de quatro etapas do núcleo: (1) PCR para amplificar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA usando T7 RNA polimerase; (3) transfecção para introduzir in vitro o mRNA transcrito nas pilhas; (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução. O ensaio do repórter do luciferase RNA-baseado descrito aqui contorna edições da replicação do plasmídeo em pilhas poxvirus-contaminadas e na transcrição enigmático do plasmídeo. Este protocolo pode ser usado para determinar o Regulamento da tradução por cis-elementos em um mRNA que inclui 5 '-UTR e 3 '-UTR nos sistemas diferentes das pilhas poxvirus-contaminadas. Além disso, diferentes modos de iniciação de tradução, como o tampão-dependente, Cap-Independent, re-iniciação, e iniciação interna podem ser investigados usando este método.
Introduction
De acordo com o dogma central, a informação genética flui do DNA para o RNA e, finalmente, para a proteína1,2. Este fluxo de informação genética é altamente regulamentado em vários níveis,incluindo a tradução mRNA3,4. O desenvolvimento de ensaios de repórter para medir a regulação da expressão gênica facilitará a compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos nesse processo. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a tradução do mRNA usando um in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase em pilhas poxvirus-infected.
Os poxvirus compreendem muitos micróbios patogénicos humanos e animais altamente perigosos5. Como todos os outros vírus, os poxvirus dependem exclusivamente de máquinas de células hospedeiras para síntese protéica6,7,8. Para sintetizar de forma eficiente as proteínas virais, os vírus evoluíram com muitas estratégias para a seqüestro da maquinaria translacional celular para redirecioná-la para a tradução de mRNAs virais7,8. Um mecanismo comumente empregado por vírus é o uso de elementos de ação cisem suas transcrições. Exemplos notáveis incluem o local de entrada Ribossome interna (ires) e o potenciador de tradução independente de Cap (CITE)9,10,11. Esses cis-elementos tornam as transcrições virais uma vantagem translacional atraindo máquinas translacionais através de diversos mecanismos12,13,14. Mais de 100 mRNAs de Poxvirus têm um elemento cis-acting evolutivamente conservado na região 5 '-Untranslated (5 '-UTR): um 5 '-Poly (a) líder no muito 5 ' extremidades destes mRNAs15,16. Os comprimentos destes 5 '-Poly (a) os líderes são heterogêneos e são gerados pelo derrapagem da polimerase poxvirus-codificada do RNA durante a transcrição17,18. Nós, e outro, descobrimos recentemente que o 5 '-Poly (a) o líder confere uma vantagem da tradução a um mRNA nas pilhas contaminadas com o vírus de vaccinia (vacv), o membro prototípicas de Poxvirus19,20.
O ensaio de repórter de luciferase baseado em RNA transcrito in vitro foi inicialmente desenvolvido para compreender o papel do líder 5 '-Poly (a) na tradução de mRNA durante a infecção pelo poxvirus19,20. Embora os ensaios do repórter do luciferase DNA-baseado do plasmídeo sejam amplamente utilizados, há diversos inconvenientes que complicarão a interpretação do resultado em pilhas poxvirus-contaminadas. Em primeiro lugar, os plasmís são capazes de replicar em células infectadas VACV22. Em segundo lugar, a transcrição críptica geralmente ocorre a partir do plasmídeo DNA18,23,24. Em terceiro lugar, a transcrição impulsionada pelo promotor VACV gera poli (A)-líder de comprimentos heterogêneos, consequentemente, dificultando o controle do comprimento do líder Poly (A) em alguns experimentos18. Um ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseado em RNA contorna estas edições e a interpretação dos dados é direta.
Há quatro etapas chaves neste método: (1) reacção em cadeia do polymerase (PCR) para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA; (3) transfection para entregar o mRNA nas pilhas; e (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução (Figura 1). O amplicon resultante do PCR contem os seguintes elementos no sentido 5 ' a 3 ': T7-promotor, líder poli (A) ou 5 '-seqüência desejada de UTR, frame de leitura aberto do luciferase do Firefly (ORF) seguido por uma cauda poli (A). O amplicon do PCR é usado como o molde para sintetizar mRNA pela transcrição in vitro usando o polymerase de T7. Durante a transcrição in vitro, o tampão de m7G ou o outro Analog do tampão são incorporados no mRNA recentemente sintetizado. As transcrições tampadas são transfected em células não infectadas ou VACV-infectadas. O lisado da pilha é coletado no tempo desejado após o transfection para medir atividades do luciferase que indicam a produção da proteína do mRNA transfected. Este ensaio do repórter pode ser usado para estudar a regulação da tradução pelo cis-elemento atual em 5 '-UTR, em 3 '-UTR ou em outras regiões de um mRNA. Além disso, o ensaio in vitro transcrito RNA-baseado pode ser usado para estudar os mecanismos diferentes da iniciação da tradução que incluem a iniciação tampão-dependente, a iniciação tampão-independente, a reiniciação e a iniciação interna como IRES.
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Protocol
1. preparação do modelo de DNA por PCR para transcrição in vitro
- Para preparar o modelo de DNA por PCR, iniciadores de design. Ao projetar primers considerar características cruciais como primer comprimento, temperatura de recozimento (Tm), GC conteúdo, 3 ' final com G ou C etc.
Nota: Discutido em detalhe nesta literatura25,26,27. - Projete primeiras demão para gerar o amplicon do PCR que contem os seguintes elementos em 5 ' a 3 ' sentido: T7-promoter, líder poli (A), luciferase do Firefly ORF e uma cauda de Poly (A) consultá-se daqui para a T7_12A-Fluc. Iniciadores de design (Forward e Reverse) para abranger todos os elementos adicionais não presentes no modelo DNA (Figura 2a).
Nota: A sequência de todos os elementos pode ser encontrada na tabela 1. - Inclua diversos nucleotídeos extra na primeira demão para diante (5 '-3 ')28, seguido pelo T7-promotor, pelo líder poli (A) ou pela seqüência desejada de 5 '-UTR e por aproximadamente 20 nucleotídeos, ajuste baseado em Tm, correspondendo ao 5 ' extremidade do gene do repórter Orf. Assegure-se de que a região correspondente no primer seja idêntica à vertente do sentido (+ vertente) do gene.
Nota: Para longo 5 '-UTR, sintetizar dois fragmentos de DNA: um com o promotor T7 seguido por Long 5 '-UTR e segundo com ORF do gene do repórter. Junte esses dois fragmentos usando a extensão de sobreposição PCR29. - O primer reverso do projeto (5 '-3 ') para incluir a cauda poli (A) e aproximadamente 20 nucleotides, ajusta baseado em Tm, correspondendo ao 3 ' extremidade do ORF do gene do repórter. Assegure-se de que a região correspondente na primeira demão seja idêntica à vertente antisense (-vertente) do gene e um Codon do batente do em-frame esteja atual antes da cauda de Poly (A).
Nota: O comprimento desejado de A em um poli (A) líder ou Poly (A) cauda pode ser personalizado nos primers. Por exemplo, para adicionar 50 a ' s na cauda poli (a), o primer reverso deve implicar 50 T' s. Da mesma forma, para adicionar 20 A ' s no poli (a) líder, o primer para a frente deve implicar 20 A ' s. - Para o controle interno, projete um outro conjunto de primers contendo os seguintes elementos em 5 ' a 3 ' direção: T7 promotor, uma sequência de codificação 5 '-UTR aleatória contendo a sequência de Kozak, renilla luciferase ORF e Poly (a) cauda referida doravante como T7_ Kozak-Rluc.
- Em um tubo do PCR, adicione os reagentes na seguinte ordem: água livre de DNase, polymerase do ADN da elevado-fidelidade 2x, primeiras demão, e ADN confirmado seqüência do molde do luciferase (tabela 2).
Nota: As quantidades de componentes individuais na mistura devem ser ajustadas de acordo com o volume da reacção. - Use um ciclo de PCR padrão de 3 etapas (desnaturação, recozimento, extensão) para gerar um modelo de DNA, conforme mostrado na tabela 3.
Nota: Temperatura de recozimento X ° c depende do conjunto de primer sendo usado e tempo de extensão T min dependem do tamanho do amplicon PCR e DNA polimerase usado. - Detecte o produto do PCR executando 5-10% da reação do PCR na electroforese do gel do agarose Tris-Acetato-EDTA (Tae) de 1% (que contem o brometo do etídio 0.1 μg/ml) junto com o padrão de peso molecular disponível comercialmente. Visualize o gel um iluminador UV para determinar o tamanho do produto do PCR.
- Após ter determinado o tamanho correto do produto do PCR, ~ 1,7 KB para T7_12A-Fluc e ~ 1,0 KB para T7_Kozak-rluc, purificar o usando um jogo comercialmente disponível da purificação do PCR. Elute o DNA usando 100 μL de água livre de nuclease (Figura 2b).
- Uma vez purificada, verifique a concentração do DNA usando um espectrofotômetro e determine a relação A260/A280 (~ 1.8-2.0 é aceitável).
- Armazene o ADN purified a-20 ° c ou use-o para a transcrição in vitro imediatamente.
2. gerar mRNA por transcrição in vitro
-
Sintetizar RNA do produto PCR in vitro, utilizando um kit de transcrição in vitro (Figura 3a).
Nota: os moldes do ADN de T7_12A-Fluc e de T7_Kozak-rluc são usados para sintetizar 12A-Fluc e Kozak-Rluc mRNAs, respectivamente.- Para fazer isso, pegue um tubo de microcentrífuga e adicione os reagentes na seguinte ordem: água livre de DNase-RNase, mistura do tampão de NTP, Analog do tampão, produto do PCR do molde, mistura da polimerase T7-RNA (tabela 4).
Nota: Outros sistemas tampando podem igualmente ser usados para tampar o RNA sequencialmente após a transcrição in vitro que segue a instrução do fabricante. - Misture completamente e incubar a 37 ° c durante 2 h.
- Prossiga para a purificação do RNA sintetizado usando um kit de purificação de RNA.
- Para fazer isso, pegue um tubo de microcentrífuga e adicione os reagentes na seguinte ordem: água livre de DNase-RNase, mistura do tampão de NTP, Analog do tampão, produto do PCR do molde, mistura da polimerase T7-RNA (tabela 4).
- Executar RNA purificado em 1,5% de agarose Tris-borato-EDTA (TBE) gel (contendo 0,5 μg/ml de brometo de etídio) para verificar o RNA. Visualize o gel um iluminador UV (Figura 3B).
- Verifique a concentração do RNA usando um espectrofotômetro e determine a relação A260/A280 (~ 1.8-2.0 é aceitável).
- Aliquot o RNA purified e armazene em-80 ° c.
3. transfect mRNA para células
- Células HeLa semente em uma placa de 24 poços (para ser aprox. ~ 80-90% confluente no dia seguinte) e incubar durante a noite em uma incubadora em 37 ° c com 5% CO2.
- Infectar células HeLa com vírus vacinia (VACV) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 ou manter células HeLa não infectadas para comparação.
Nota: MOI é o número de partículas virais infecciosas por célula. - MOI de X = {[(número de células * X)/titer de vírus] * 1000} μL de vírus por 1 mL médio.
-
Após a infecção desejada do borne de h (HPI) (neste experimento em 10-12 HPI), difícil transfecção mRNA (500 ng do mRNA total por o poço de 24 placas do poço) usando um reagente catiônicos do transfection do lipido como mostrado na Figura 3C.
- Para um poço de uma placa de 24 poços, misture 480 ng da seqüência 12A que carrega o luciferase do Firefly do vagalume (12A-Fluc) mRNA e 20 ng da seqüência de Kozak que carrega o mRNA de Renilla luciferase (Kozak-rluc) em um tubo do microcentrífuga. Em outro tubo de microcentrífuga adicionar 1,1 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica.
- Adicionar 55 μL de meio sérico reduzido em ambos os tubos. Misture e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Após 5 min de incubação, adicionar 55 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica contendo meio sérico reduzido em tubo contendo mRNA.
- Misture suavemente, mas completamente, e incubar à temperatura ambiente por 15 min.
- Durante a incubação, retire o meio de cultura celular e acrescente 400 μL de meio sérico reduzido por poço de placas de 24 poços.
- Após a incubação, adicione 100 μl da mistura gota e uniformente a um poço de 24 placas do poço.
4. Meça atividades de luciferase
- Cinco horas pós-co-transfection de 12A-Fluc e Kozak-Rluc mRNA, meça a atividade do luciferase usando um sistema do ensaio do luciferase capaz de executar dois ensaios do repórter (por exemplo, jogo duplo do ensaio do repórter do luciferase).
- Remova o meio sérico reduzido e lyse as células adicionando 150 μL de tampão de Lise 1x, um componente do kit de ensaio de luciferase.
- Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, colete o lisado raspando as células e transfira para um tubo de microcentrífuga.
- Centrifugue o lisado em 12.000 x g por 10 minutos em 4 ° c aos restos da pilha da pelota.
- Adicionar 30 μL de sobrenadante em placa de ensaio com paredes opacas 96 bem branco com fundo sólido.
- Meça a luminescência dupla usando o kit de ensaio de luciferase e um luminômetro de leitor de placas multimodo.
- Realize a medição utilizando a função cinética (numa base por poço) utilizando as definições descritas na tabela 5.
Nota: A leitura também pode ser tomada usando o luminômetro manual. Adicionar um volume igual de lisado e substrato para Fluc em uma cubeta. Aguarde 2 s e meça por 10 s usando o luminômetro. Após a medição Fluc, rapidamente tirar a cubeta do luminômetro e adicionar um volume igual do substrato para Rluc manualmente. Novamente, aguarde 2 s e meça por 10 s usando o luminômetro. - Exporte os dados de leitura de luminescência para um formato de arquivo desejável.
- Determine a taxa relativa da tradução de 12A-Fluc mRNA em pilhas não infectados e vacv Infected Hela dividindo o valor de Fluc pelo controle interno valor de rluc.
Nota: A Figura 1 complementar mostra a análise passo a passo dos dados brutos para obter a atividade Fluc relativa.
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Representative Results
As quatro etapas do ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseada em RNA: PCR para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro, in vitro a transcrição para gerar o mRNA, o transfection do mRNA, e a medida do luciferase, podem ser considerados no diagrama esquemático ( Figura 1). A concepção de primers para ambos os modelos de DNA (Fluc e rluc) e o esquema geral de extensão de saliência PCR é ilustrado no esquema (Figura 2a). Após a PCR, o produto de PCR de tamanho correto foi detectado por eletroforese de gel de agarose TAE (Figura 2b). Subseqüentemente, o produto do PCR é usado como o molde para sintetizar o RNA in vitro (Figura 3a), que é purified e funcionado na electroforese do gel de TBE para verificar o tamanho (Figura 3B). O mRNA purified e verific é transfected nas pilhas usando o reagente catiônicos do transfection do lipido (Figura 3C). Os primers utilizados neste protocolo estão listados na tabela 6.
O ensaio in vitro transcrito do repórter do luciferase RNA-baseado foi desenvolvido para compreender o papel do 5 '-poli (A) líder na tradução do mRNA durante a infecção do poxvirus. Usando este ensaio, nós testamos a eficiência da tradução de um mRNA de Fluc que contenha um 5 '-poli (a) líder (12 NT) em pilhas não infectados e vacv-infected. O valor de Fluc foi normalizado usando o valor de Rluc em pilhas não infectadas e VACV-Infected para determinar a atividade relativa de Fluc (isto é atividade de Fluc Activity/Rluc) (figura 4a). A divisão de Fluc por Rluc normalizou a eficiência do transfection e a estabilidade do RNA em um poço particular. Usando essa abordagem de análise, determinamos que um líder 5 '-Poly (A) contendo mRNA tem uma vantagem translacional durante a infecção VACV (Figura 4B). A vantagem em pilhas contaminadas não era devido à eficiência diferencial do transfection ou à estabilidade do mRNA porque o nível do RNA era similar em não infectados e vacv infectou as pilhas 5 h transfection do mRNA19.
Figura 1: esquema do procedimento experimental. O PCR é usado para gerar um molde do ADN com os elementos desejados. o mRNA que codifica um gene do repórter do luciferase é sintetizado in vitro usando um sistema do RNA polymerase-baseado T7. A luciferase Firefly (Fluc) mRNA é cotransfected com um Renilla luciferase (Rluc) mRNA em células não infectadas ou VACV-infectados. As atividades de luciferase são medidas utilizando um luminômetro com capacidade dupla de luciferase. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: projeto da primeira demão e amplificação PCR-based do ADN. (A) o primer dianteiro é sintetizado para incluir uma sequência aleatória de 8NT, o promotor T7 seguido por um 5 '-UTR desejado e parte do 5 ' final do gene do repórter luciferase, enquanto o primer reverso inclui um T-Tract para gerar Poly (a) cauda e o 3 ' final do gene do repórter do luciferase. Pela extensão do saliência PCR usando um molde do plasmídeo que contem um gene do luciferase, um molde do ADN é gerado. (B) a faixa do ADN do tamanho desejado da reação do PCR foi detectada usando a electroforese do gel do agarose de 1% Tae. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: síntese e transfecção do mRNA. (A) esquema de transcrição in vitro. O DNA amplificado por PCR contendo o gene da luciferase a jusante do 5 '-UTR de interesse e o promotor T7 é usado como modelo. O RNA polymerase de T7 é recrutado ao promotor e adiciona ribonucleotides, mostrado no branco, de 5 ' a 3 ' sentido. Uma vez que o mRNA é 25-30 NT longo, o tampão de m7G é adicionado usando um Analog da tampa do anti-reverso, arca. (B) bandas de RNA de produtos de transcrição in vitro detectados usando 1,5% de eletroforese de gel de agarose TBE. (C) esquemático demonstrando a transfecção do repórter mRNA em células. O meio que contem o mRNA do repórter ou o reagente catiônicos do transfection do lipido em uns tubos separados é permitido equilibrar na temperatura ambiente por 5 minutos. As soluções são então misturadas seguida de incubação à temperatura ambiente por 15 minutos após o qual a mistura de RNA/transfection reagente é adicionado em células em placas de cultura. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: aumento da eficiência translacional do mRNA contendo um 5 '-Poly (a) líder. (A) Fluc mRNA contendo um líder de poli (a) no 5 '-UTR e Rluc mRNA com a seqüência de consenso de Kozak no 5 '-UTR são cotransfected em pilhas. (B) o Fluc mRNA com 5 '-Poly (A) o líder foi transfected em pilhas não infectados e vacv-Infected junto com rluc mRNA. 5 HPI, a atividade da luciferase foi medida utilizando-se um luminômetro. Rluc normalizou a atividade de Fluc é representada em células não infectadas e VACV-infectadas. As barras de erro indicam os desvios padrão (SD) de pelo menos três repetições. O teste t de Student foi utilizado para determinar os valores de P; Valor de P < 0, 1. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Elementos | Seqüência |
| Promotor T7 | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Poli (A) líder | AAAAAAAAAAAA, variando de 3 a 51 como |
| Seqüência de Kozak | O GCCACC |
| Poly (A) cauda | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA...... |
Tabela 1: sequências utilizadas no método – a tabela contém as sequências do promotor T7, o líder poli (A), a sequência de Kozak, a cauda de poli (A).
| Componentes | Volume |
| DNase água livre: | 38 μL |
| mistura mestra da polimerase do ADN da elevado-fidelidade 2X: | 50 μL |
| Iniciador dianteiro (10 μM): | 4 μL de |
| Primer reverso (10 μM): | 4 μL de |
| Modelo de ADN luciferase (1-10 ng/μL): | 4 μL de |
| Total: | 100 μL |
| Fonte para Fluc DNA modelo é pGL3-Fluc plasmídeo | |
| A fonte para o molde do ADN de rluc é plasmídeo de PRL-rluc |
Tabela 2: reação de PCR – tele ordem e o volume de componentes adicionados na reação de PCR.
| Passo | Temperatura | Tempo | Ciclo |
| Desnaturação inicial | 95 ° c | 2 minutos | (ciclo 1x) |
| Desnaturação | 95 ° c: | 15 de s | |
| Recozimento | X ° c: | 30 de s | (ciclo 25x) |
| Extensão | 72 ° c: | T min | |
| Extensão final | 72 ° c: | 7 minutos | (ciclo 1x) |
| Segurar | 4 ° c: | ∞ |
Tabela 3: programa de PCR – os passos para o programa de PCR, juntamente com temperatura, tempo e ciclo.
| Componentes | Volume | |
| DNase-RNase água livre: | até 20 μL | |
| Mistura do amortecedor de NTP (20 milímetros de cada rNTP): | 2 μL de | |
| Tampão analógico (40 mM): | 4 μL de | |
| Modelo de produto PCR (400 NG) *: | X μl | (Concentração do produto PCR dependente) |
| Mistura do polymerase de T7-RNA: | 2 μL de | |
| Total: | 20 μL | |
| * T7_12A-Fluc e T7_Kozak-Rluc modelo usado para sintetizar 12A-Fluc e Kozak-Rluc mRNA, respectivamente. |
Tabela 4: reação de transcrição in vitro – a ordem e o volume de componentes adicionados para a reação de transcrição in vitro.
| Passos | Volume/tempo |
| Injetar substrato do ensaio luciferase (Fluc): | 30 μL |
| Tempo de espera/incubação: | 2 de s |
| Medição de luminescência (Fluc): | 10 de s |
| Parar & substrato Glo (Rluc): | 30 μL |
| Tempo de espera/incubação: | 2 de s |
| Medição de luminescência (Rluc): | 10 de s |
Tabela 5: definições de medição de luciferase – os passos para a medição da luciferase com o volume ou tempo recomendado.
| Primers | Seqüência |
| T7-12A-Fluc para a frente | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGaaaaaaaaaaaa ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG |
| T7-12A-Fluc reverso | O TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGC. |
| T7-Kozak-Rluc Forward | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGatcgtagccacc ATGACTTCGAAAGTTTATGATC |
| T7-Kozak-Rluc reverso | A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGTTCATTTTT GAGAACTCGCTC |
Tabela 6: primers – os primers utilizados neste método com sequências completas.
Figura 1 complementar: análise de dados brutos – etapas para analisar dados brutos para obter dados normalizados. Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Todas as etapas do quatro-núcleo são críticas ao sucesso do in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Uma atenção especial deve ser dada ao projeto da primeira demão, especial para a seqüência do promotor T7. T7 RNA polymerase começa a transcrição do sublinhado primeiro G (ggg-5 '-UTR-Aug-) em T7 promotor adicionado antes da seqüência de 5 '-UTR. Embora o local do começo da transcrição (TSS) Comece do primeiro G no 5 ' extremidade, diminuindo o número de G ' s menos de três na região do promotor T7 diminuiu o rendimento/saída do RNA da transcrição in vitro. Durante o experimento, observou-se que o produto DNA purificado com gel não foi o melhor para a transcrição in vitro, já que tanto a produtividade quanto a qualidade do RNA foram menores. Nós executamos somente 5-10% da reação do PCR na electroforese do gel do agarose de 1% para determinar o tamanho e purified o descanso 90-95%, usando um jogo da purificação do PCR, para ser usado para a transcrição in vitro. No caso de amplificação não específica da PCR, recomenda-se o corte da faixa de tamanho desejada do gel e o uso de fragmento de DNA purificado por gel. Como o rendimento pode ser baixo, sugerimos aumentar o volume de reação para a reação de transcrição in vitro. Semelhante a outros métodos baseados em transfecção, DNA/RNA pode estimular as vias de detecção de DNA/RNA que podem suprimir globalmente ou seletivamente a tradução. Portanto, os dados devem ser interpretados com precauções, embora não tenhamos tido problemas potencialmente causados por esse problema em nossos experimentos.
O método proposto é adequado para uso em diferentes sistemas de modelo com algumas modificações, como o método de entrega de mRNA, controle interno a ser usado, um tempo adequado para a tradução, preparação da amostra e análise de dados. A principal limitação deste método é que é um ensaio de repórter para testar rapidamente a regulação da tradução por elementos cis que não refletem completamente as condições fisiológicas. Portanto, este método deve ser corroborado por outros experimentos complementares, se possível.
Em comparação com a modificação do DNA, os papéis das modificações do RNA são menos bem compreendidos. No entanto, com a descoberta de enzimas que escrevem, lêem e apagam as modificações de RNA30,31,32,33,34,35, agora é possível estudar a influência da modificação do RNA na expressão do gene30,31,32,33,34,35. O ensaio de repórter de luciferase baseado em RNA transcrito in vitro pode ser modificado para incorporar diferentes modificações de RNA e utilizado para testar os seus efeitos na tradução de RNA. Por exemplo, esse método pode incorporar diferentes análogos de Cap que têm várias modificações30,31. Adicionalmente, completando uma enzima modificadora do RNA interno durante ou após a transcrição in vitro pode possivelmente incorporar a modificação interna do RNA. A adição de uma modificação ao tampão 0, tampão 1, e uma modificação interna do RNA fornecerá uma ferramenta para estudar os papéis destas modificações do RNA na tradução.
O ensaio in vitro transcrito do repórter do luciferase RNA-baseado tem o grande potencial e a aplicação larga em compreender a biologia básica sobre a tradução do RNA. Diferentes mecanismos para o início da tradução, incluindo iniciação dependente da tampa, iniciação independente da tampa, reiniciação e iniciação interna, como IRES, podem ser estudados por meio deste método. Em cima destas vantagens, este ensaio pode ser empregado para testar o Regulamento da tradução por cis-elementos em 5 '-UTR e em 3 '-UTR em um mRNA. O protocolo descrito usa o produto do PCR, que fornece a vantagem para evitar a clonagem longa e para examinar rapidamente os efeitos de elementos do RNA na tradução. Para minimizar erros potenciais durante o PCR, o polymerase da alta fidelidade e o baixo número do ciclo do PCR devem ser usados. Alternativamente, se um molde é usado freqüentemente, o desejado 5-' UTR e luciferase ORF pode ser clonado em um plasmídeo como o molde da transcrição in vitro. Conjuntamente, o protocolo consolida a transcrição e o nivelamento de mRNA em uma única reação e utiliza o transfection e a análise convencionais que fazem in vitro o ensaio transcrição RNA-baseado do repórter do luciferase um método User-friendly, rápido, e direto para estudar mecanismos de tradução de mRNA.
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Disclosures
Os autores gostariam de declarar nenhum interesse financeiro concorrente.
Acknowledgments
O projeto foi financiado pelos institutos nacionais de saúde (AI128406 www.nih.gov) para ZY e em parte pelo centro de pesquisa de câncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu), na forma de estudante de pós-graduação Summer stipend para PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
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- Crick, F.
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