Summary
Мы представляем протокол для изучения регулирования перевода мРНК в poxvirus-инфицированных клетках с использованием в пробирке Транскрибированного РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Анализ может быть использован для изучения правил перевода СНГ-элементами мРНК, в том числе 5 '-непереведенного региона (UTR) и 3 '-UTR. С помощью этого метода можно также изучить различные режимы инициирования перевода.
Abstract
Каждый poxvirus мРНК транскрибируется после вирусной репликации ДНК имеет эволюционно сохраняется, не-шаблонированные 5 '-поли (а) лидер в 5 '-UTR. Для того, чтобы вскрыть роль 5 '-поли (A) лидер в переводе мРНК во время poxvirus инфекции мы разработали в пробирке транскрипции РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Этот репортер анализ состоит из четырех основных этапов: (1) ЦР, чтобы усилить шаблон ДНК для экстракорпорального транскрипции; (2) в пробирке транскрипции для генерации мРНК с использованием T7 РНК-полимеразы; (3) трансфеекция ввести в пробирке транскрибированной мРНК в клетки; (4) обнаружение активности люциферазы как индикатора перевода. РНК-основанная люцифазы репортер анализ описал здесь обходит вопросы плазмированной репликации в poxvirus-инфицированных клеток и загадочные транскрипции из плазмида. Этот протокол может быть использован для определения правил перевода СНГ-элементов в мРНК, включая 5 '-UTR и 3 '-UTR в системах, не инфицированных poxvirus. Кроме того, с помощью этого метода можно исследовать различные режимы инициирования перевода, такие как ограничения, зависящие от капитализации, повторное посвящение и внутреннее инициирование.
Introduction
Согласно Центральной догме, генетическая информация течет от ДНК к РНК, а затем, наконец, к белку1,2. Этот поток генетической информации жестко регулируется на многих уровнях, включая мРНК перевод3,4. Разработка журналистскими проверочные исследования для измерения регулирования экспрессии генов облегчит понимание регуляторных механизмов, участвующих в этом процессе. Здесь мы описываем протокол для изучения перевода мРНК с помощью экстракорпорального транскрибированного РНК-анализа на основе вируса люциферазы в poxvirus-инфицированных клетках.
Poxviruses состоят из многих очень опасных патогенов человека и животных5. Как и все другие вирусы, поксвирусов полагаются на оборудование клеток-хозяев для синтеза белка6,7,8. Для эффективного синтеза вирусных белков, вирусы развивались многие стратегии, чтобы захватить сотовой трансляционной машины, чтобы перенаправить его для перевода вирусного mRNAs7,8. Одним из распространенных механизмов, используемых вирусами, является использование в их транскриптах элементов, действующих в СНГ. Известные примеры включают в себя внутренний вход ribosome (IRES) и Кап-независимый перевод усилитель (цитируют)9,10,11. Эти СНГ-элементы оказывают вирусную стенограммы поступательное преимущество путем привлечения поступательного машинного оборудования через различные механизмы12,13,14. Более 100 poxvirus mRNAs имеют эволюционно консервативны цис-действующий элемент в 5 '-непереведенный регион (5 '-UTR): 5 '-поли (а) лидер в самом 5 ' концы этих mRNAs15,16. Длины этих 5 '-поли (а) лидеры гетерогенных и генерируются проскальзывание poxvirus кодируется РНК полимеразы во время транскрипции17,18. Мы и другие, недавно обнаружили, что 5 '-поли (а) лидер дает перевод преимущество мРНК в клетках, инфицированных вирусом вакцинии (ВАВ), прототипический член поксвирусов19,20.
В пробирке транскрибированный РНК-основанный люциффераз репортер анализ был первоначально разработан, чтобы понять роль 5 '-поли) лидер в мРНК перевода во время poxvirus инфекция19,21. Хотя плазмино ДНК-основанные люциферазы репортер анализы широко используются, есть несколько недостатков, которые усложнят интерпретации результатов в poxvirus-инфицированных клеток. Во-первых, плазмид способны реплицировать в ВАV-инфицированных клетках22. Во-вторых, загадочные транскрипции часто происходит от плазмид ДНК18,23,24. В-третьих, ВАВ промоутер управляемой транскрипции генерирует поли (а)-лидер гетерогенной длины, следовательно, делает его трудно контролировать поли (а)-лидер длины в некоторых экспериментах18. В пробирке транскрибированный на основе РНК-люциффераза репортер анализ обходит эти вопросы и интерпретации данных проста.
Есть четыре ключевых шага в этом методе: (1) полимеразной цепной реакции (ЦР) для генерации шаблона ДНК для экстракорпорального транскрипции; (2) в пробирке транскрипции для генерации мРНК; (3) трансфеекция для доставки мРНК в клетки; и (4) обнаружение деятельности люциферазы в качестве показателя перевода (рис. 1). В результате КЦР ампликон содержит следующие элементы в 5 ' к 3 ' направление: T7-промоутер, поли (а) лидер или желаемого 5 '-UTR последовательности, Открытый люциферазы чтения кадр (ОРФ), а затем поли (а) хвост. КЦР ампликон используется в качестве шаблона для синтеза мРНК в пробирке транскрипции с использованием T7 полимеразы. Во время в пробирке транскрипции, m7G Cap или другой аналоговый колпачок включен в недавно синтезированных мРНК. Увенчанные стенограммы трансфцируются в неинфицированные или вкv-инфицированные клетки. Клетка lyнасыт собирается в нужное время после переливания для измерения деятельности люциферазы, которые указывают на выработку белка с трансффицированных мРНК. Этот репортер анализ может быть использован для изучения перевода регулирование СНГ-элемент присутствует в 5 '-UTR, 3 '-UTR или других регионах мРНК. Кроме того, в пробирке транскрибированной РНК-анализ может быть использован для изучения различных механизмов начала перевода в том числе крышки-зависимого инициирования, крышка независимого инициирования, повторного посвящения и внутреннего начала, как IRES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка ДНК шаблона путем ЦР для экстракорпорального транскрипции
- Для подготовки шаблона ДНК по ЦР, Дизайн праймеров. При проектировании праймеров рассмотрим важнейшие характеристики, такие как длина грунтовки, отжима температуры (Tm), содержание GC, 3 ' конец с G или C и т.д.
Примечание: Подробно обсуждался в этой литературе25,26,27. - Дизайн праймеров для создания КЦР ампликон содержащие следующие элементы в 5 ' к 3 ' направление: T7-промоутер, поли (а) лидер, Светлячок люциферазы ОРФ и поли (а) хвост, упомянутых далее в качестве T7_12A-fluc. Дизайн праймеров (вперед и назад), чтобы охватить все дополнительные элементы, не присутствующие в шаблоне ДНК (рисунок 2A).
Примечание: Последовательность всех элементов можно найти в таблице 1. - Включите несколько дополнительных нуклеотидов в форвард грунт (5 '-3 ')28, а затем T7-промоутер, поли (а) лидер или желаемого 5 '-UTR последовательности и около 20 нуклеотиды, корректировать на основе Tm, соответствующий 5 ' конец репортер гена Orf. Убедитесь, что соответствующий регион в прайде идентична нити чувства (+ нить) гена.
Примечание: Для длинных 5 '-UTR, синтезировать два фрагмента ДНК: один с T7 промоутер следуют длинные 5 '-UTR и второй с журналистом гена ОРФ. Присоединяйтесь к этим двум фрагментам, используя расширение перекрытия ЦР-29. - Дизайн обратной грунтовки (5 '-3 '), чтобы включить поли (а) хвост и около 20 нуклеотиды, корректировать на основе тм, соответствующий 3 ' конец репортер гена в ОРФ. Обеспечить соответствующий регион в грунт совпадает с анти-Sense прядь (-Стрэнд) гена и в кадр остановка кодон присутствует перед поли (а) хвост.
Примечание: Желаемая длина A в поли (A) лидер или поли (A) хвост может быть настроен в праймеров. Например, чтобы добавить 50 A в поли (A) хвост, обратный грунт должен повлечь за собой 50 т. Аналогичным образом, чтобы добавить 20 а в поли (а) лидер, вперед грунт должен повлечь за собой 20 а. - Для внутреннего контроля, Дизайн другой набор праймеров, содержащие следующие элементы в 5 ' к 3 ' направление: T7 промоутер, случайные 5 '-UTR последовательности кодирования, содержащие последовательность Козака, Ренилла люциферазы ОРФ и поли (а) хвост, упомянутых далее в качестве T7_ Козак-Рлюк.
- В трубке для ЦР добавьте реагенты в следующем порядке: Свободная вода, 2x высокая точность ДНК-полимеразы, праймеры и последовательность подтвержденной ДНК шаблона люциферазы (Таблица 2).
Примечание: Количество отдельных компонентов в смеси должно корректироваться в зависимости от объема реакции. - Используйте стандартный 3-Step (денатурации, Анналин, расширение), цикл для создания шаблона ДНК, как показано в таблице 3.
Примечание: Аннилинг температура X ° c зависит от набора грунтовки используются и время расширения T мин зависит от размера КЦР ампулион и полимеразы ДНК используется. - Обнаружить продукт ЦР путем запуска 5-10% от реакции ЦР в 1% агарозы рис-ацетат-ЭДТА (ТЭ) гель электрофорез (содержащий 0,1 мкг/мл этидий бромид) наряду с коммерчески доступным молекулярный вес стандарта. Визуализируйте гель под ультрафиолетовым иллюминатором, чтобы определить размер продукта для ЦР.
- После определения правильного размера продукта КЦР, ~ 1,7 КБ для T7_12A-fluc и ~ 1,0 КБ для T7_Kozak-Rluc, очистить его с помощью коммерчески доступного комплекта очистки ЦР. Елют ДНК с помощью 100 мкл Нуклеаза свободной воды (рис. 2B).
- После очищения, проверить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра и определить соотношение A260/A280 (~ 1.8-2.0 является приемлемым).
- Храните очищенную ДНК при температуре-20 °C или используйте сразу в пробирке.
2. генерировать мРНК в пробирке транскрипции
-
Синтезировать РНК из продукта ЦР в пробирке, используя в пробирке комплект транскрипции (Рисунок 3a).
Примечание: T7_12A-fluc и T7_Kozak-RLUC ДНК шаблоны используются для синтеза 12A-fluc и Козак-Рлюк mRNAs, соответственно.- Для этого следует взять трубку микроцентрифуги и добавить реагенты в следующем порядке: Свободная вода, НТП буфер Mix, Кап аналоговый, шаблон ЦР-продукт, T7-РНК-полимеразы Mix (Таблица 4).
Примечание: Другие системы укупорки также могут быть использованы для ограничения РНК последовательно после экстракорпорального транскрипции после инструкции производителя. - Тщательно перемешать и инкубировать при температуре 37 ° c в течение 2 ч.
- Приступаем к очистке синтезированной РНК с помощью комплекта для очистки РНК.
- Для этого следует взять трубку микроцентрифуги и добавить реагенты в следующем порядке: Свободная вода, НТП буфер Mix, Кап аналоговый, шаблон ЦР-продукт, T7-РНК-полимеразы Mix (Таблица 4).
- Выполнить очищенную РНК в 1,5% агарозы ТРС-боната-ЭДТА (TBE) гель (содержащий 0,5 мкг/мл этидий бромид) для проверки РНК. Визуализируйте гель под ультрафиолетовым иллюминатором (рисунок 3B).
- Проверить концентрацию РНК с помощью спектрофотометра и определить соотношение A260/A280 (~ 1.8-2.0 приемлемо).
- Aliquot очищенной РНК и хранить при температуре-80 ° c.
3. transfect мРНК к клеткам
- Семян Неа клетки в 24-хорошо пластины (будет около. ~ 80-90% свободно на следующий день) и инкубировать ночь в инкубаторе при 37 ° c с 5% CO2.
- Заразить клетки Неа с вакциной вируса (ВАВ) на множественности инфекции (МВД) из 5 или сохранить незараженные клетки Хелы для сравнения.
Примечание: МВД является количество инфекционных вирусных частиц на ячейку. - МВД X = {[(количество ячеек * X)/вирус Титер] * 1000} мкл вируса на 1 мл среды.
-
После желаемого h сообщению инфекции (ИНН) (в этом эксперименте на 10-12 Инн), трансфицировать мРНК (500 нг общей мРНК в колодец 24-хорошо пластин) с использованием катионических липидного перелив, как показано на рисунке 3c.
- Для одной скважины из 24-хорошо пластины, смешайте 480 нг 12A последовательности подшипник люциферазы Светлячок (12A-fluc) мРНК и 20 нг последовательности Козак подшипник Ренилла люциферазы (Козак-рлюк) мРНК в одной микроцентрифуге трубки. В другой трубке микроцентрифуга добавить 1,1 МКН катионических липидных преобразовающих реагентов.
- Добавить 55 мкл уменьшил сыворотки в обеих трубках. Смешайте и Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
- После 5 минут инкубации, добавить 55 мкл катионический липидный перелив, содержащий снижение сыворотки средней в мРНК содержащие трубки.
- Смешайте осторожно, но тщательно, и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Во время инкубации, удалить клеточной культуры среды и добавить 400 мкл уменьшил сыворотки среднего на хорошо 24-хорошо пластин.
- После инкубации, добавить 100 мкл смеси дровыли и равномерно, чтобы один колодец 24-хорошо пластин.
4. мера Люцифераза деятельности
- Пятичасовой пост-совместное подключение 12A-fluc и Козак-Рлюк мРНК, мера Люцифераза деятельности с помощью системы анализа Люцифера, способных выполнять два репортера (например, двойной люциферазы репортер пробирного комплекта).
- Удалите уменьшые средние и Lyse клетки, добавив 150 Мкl 1x-буфер лизиса, компонент пробирного набора люциферазы.
- После 10 мин инкубации при комнатной температуре, соберите lyнасыт путем утилизации клеток и передачи в пробирку микроцентрифуги.
- Центрифуга насытить на 12 000 x g в течение 10 минут при температуре 4 ° с до мусора клеток гранул.
- Добавить 30 мкл супернатант в непрозрачной стеной 96 хорошо белая Пробирная плита с твердым дном.
- Измерьте двойное свечение с помощью пробирного комплекта люцифферазы и многорежимного читателя пластины люминиметр.
- Выполните измерение с помощью кинетики функции (на основе хорошо) с помощью параметров, описанных в таблице 5.
Примечание: Чтение также может быть взято с помощью ручного светильнометра. Добавьте равный объем ливы и субстрата для fluc в кюветте. Подождите 2 с и измерьте 10 с использованием светильнометра. После измерения fluc, быстро Возьмите Кюветт из лютометра и добавить равный объем подложки для Рлюка вручную. Опять же, подождите 2 с и измерить 10 с помощью светильнометра. - Экспорт люминесценции чтения данных в желаемом формате файла.
- Определите относительный коэффициент перевода от 12A-fluc мРНК в незараженных и ВАВ инфицированных клетках Неа путем деления значения fluc внутренним контролем Rluc значение.
Примечание: Дополнительная диаграмма 1 показывает пошаговый анализ исходных данных для получения относительной активности fluc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Четыре шага в пробирке транскрибированной РНК-на основе корреспондент анализа: КЦР для создания шаблона ДНК для в пробирке транскрипции, в пробирке транскрипции для генерации мРНК, РНК-трансформирования и измерения люциферазы, можно увидеть в схеме схематичный ( Рисунок 1). Проектирование праймеров как для шаблонов ДНК (fluc и Rluc), так и для общей схемы расширения навеса, показано на схеме (рисунок 2A). После ОЦР, правильный размер продукта ЦР был обнаружен электрофорез гель ТЭ агарозы (рис.2B). Впоследствии, продукт ЦР используется в качестве шаблона для синтеза РНК в пробирке (Рисунок 3A), который очищается и запустить в электрофорез гель TBE для проверки размера (Рисунок 3a). Очищенная и проверенная мРНК трансфетифицирован в клетки с использованием катионного липидного реагента (рис. 3C). Праймеры, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 6.
В пробирке ТРАНСКРИБИРОВАННОЕ РНК-на основе репортер анализа был разработан, чтобы понять роль 5 '-поли (а) лидером в переводе мРНК во время poxvirus инфекции. Используя этот анализ, мы протестировали эффективность перевода fluc мРНК, которая содержит 5 '-поли (а) лидер (12 NT) в незараженных и ВАV-инфицированных клетках. Значение fluc было нормализовалось с помощью значения Rluc в обеих неинфицированных и ВАВ-инфицированных клетках, чтобы определить относительную активность fluc (т.е. активность fluc/Rluc) (рис. 4A). Разделение fluc на Рлюк нормализовала трансфекции эффективности и РНК стабильности в частности хорошо. Используя этот анализ подхода, мы определили, что 5 '-поли (а) лидер, содержащий мРНК имеет поступательное преимущество во время инфекции вав (рис. 4B). Преимущество в инфицированных клетках не было вызвано дифференциальной эффективностью и стабильностью мРНК, так как уровень РНК был схоже в незараженных и ВЖК-инфицированных клетках 5 h после мРНК-трансфации19.
Рисунок 1: схема экспериментальной процедуры. Для создания шаблона ДНК с желаемым элементом используется СЦР. мРНК, кодирующий ген репортера люциферазы, синтезируется в пробирке с помощью системы T7 РНК-полимеразы. Люцифераза Светлячок (fluc) мРНК является Co-трансфазированной с люциферазы Ренилла (Rluc) мРНК в неинфицированных или ВАВ-инфицированных клеток. Деятельность Люцифераза измеряется с помощью лютометра с двойной способностью люциферазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2: конструкция грунтовки и усиление ДНК на основе ЦР. (A) вперед грунт синтезируется включить 8nt случайной последовательности, T7 промоутер следуют желаемого 5 '-UTR и часть 5 ' конец гена репортер люциферазы, в то время как обратный грунт включает в себя т-тракта для создания поли (а) хвост и 3 ' конец ген репортер люциферазы. По навеса расширение ЦР с использованием плазмид шаблон, содержащий ген люциферазы, шаблон ДНК генерируется. (B) ДНК-полоса желаемого размера от реакции ЦР была обнаружена с использованием 1% АГРОЗЫ Тхэ гель электрофорез. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3: синтез мРНК и трансfекция. (А) схема экстракорпорального транскрипции. ДНК усиливается методом ЦР-, содержащей ген люциферазы вниз по течению от 5 '-UTR интересов и промоутер T7 используется в качестве шаблона. T7 РНК-полимеразы набирается на промоутер и добавляет рибонуклеотиды, показано в белом, от 5 ' до 3 ' направлении. После того, как мРНК 25-30 NT долго, m7G Cap добавляется с использованием анти-обратный колпачок аналоговый, арка. (B) РНК-диапазонов из пробирке транскрипционного изделия обнаружены с использованием 1,5% АГАРОЗЫ TBE гель электрофорез. (C) схема, демонстрирующая перелив репортера мРНК в клетки. Средство, содержащее либо репортер мРНК или катионический липидный переагент в отдельных трубках разрешается выравнивиться при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем растворы смешиваются после инкубации при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего смесь РНК/трансfекционной реагента добавляется в ячейки в культурных пластиках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4: повышенная поступательная эффективность мРНК, содержащая 5 '-поли (а) лидер. (A) fluc мРНК, содержащая поли (а) лидер в 5 '-UTR и Рлюк мРНК с Козак консенсусной последовательности в 5 '-UTR являются совместно транссекцированных в клетках. (B) fluc мРНК с 5 '-поли (а) лидер был трансфцировано в неинфицированных и ВАВ-инфицированных клеток вместе с Рлюк мРНК. 5 Инн, активность люциферазы измерялась с помощью светильнометра. Rluc нормализованных fluc активность представлена в неинфицированных и ВАВ-инфицированных клеток. Бары ошибок обозначают стандартные отклонения (SD), по крайней мере, трех повторов. T-test студента был использован для того чтобы обусловить P-значения; P-значение < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
| Элементы | Последовательности |
| T7 промоутер | ТААТАКГАКТКАКТАТАГГГ |
| Лидер поли (A) | AAAAAAAAA, от 3 до 51 как |
| Последовательность Козака | ГККАКК |
| Поли (A) хвост | Аааааааааааааааааааaaaaaaaaaaa |
Таблица 1: последовательности, используемые в методе – таблица содержит последовательности промоутер T7, поли (а) лидер, последовательность Козака, поли (а) хвост.
| Компоненты | Объем |
| Свободная вода Днase: | 38 мкл |
| 2X высокая точность ДНК-полимеразы Мастер микс: | 50 мкл |
| Форвард грунтовки (10 мкм): | 4 мкл |
| Обратный грунт (10 мкм): | 4 мкл |
| Шаблон ДНК люциферазы (1-10 нг/мкл): | 4 мкл |
| Общая: | 100 мкл |
| Источник для шаблона ДНК fluc является pGL3-fluc плазмид | |
| Источником для шаблона ДНК Рлюка является ПРЛ-Рлюк плазмид |
Таблица 2: реакция ЦР- тон порядок и объем компонентов, добавленных в реакции ЦР.
| Шаг | Температура | Время | Цикл |
| Начальная денатурации | 95 °C | 2 мин. | (1x цикл) |
| Денатурация | 95 °C: | 15 с | |
| Отжига | X °c: | 30-е годы | (25x цикл) |
| Расширение | 72 °C: | T мин | |
| Окончательное продление | 72 °C: | 7 мин. | (1x цикл) |
| Держать | 4 °C: | ∞ |
Таблица 3: Программа для ЦР – шаги для программы, наряду с температурой, временем и циклом.
| Компоненты | Объем | |
| Свободная вода: | до 20 мкл | |
| Буферная смесь NTP (20 мм от каждого НТП): | 2 мкл | |
| Cap аналоговый (40 mM): | 4 мкл | |
| Продукт-шаблон ЦР (400 нг) *: | X мкл | (В зависимости от концентрации продукции ЦР) |
| T7-РНК-полимеразы Mix: | 2 мкл | |
| Общая: | 20 мкл | |
| * T7_12A-fluc и T7_Kozak-Rluc шаблон, используемый для синтеза 12A-fluc и Козак-Рлюк мРНК, соответственно. |
Таблица 4: в пробирке транскрипция реакция-порядок и объем компонентов, добавленных для реакции в пробирке транскрипции.
| Шаги | Объем/время |
| Впрыснуть Люциффераза пробирка (fluc): | 30 мкл |
| Подождите/инкубации время: | 2 с |
| Измерение люминесценции (fluc): | 10 с |
| Стоп & гло субстрат (Рлюк): | 30 мкл |
| Подождите/инкубации время: | 2 с |
| Измерение люминесценции (Рлюк): | 10 с |
Таблица 5: параметры измерения люциферазы -шаги для измерения люциферазы с рекомендуемым объемом или временем.
| Грунтовки | Последовательности |
| T7-12A-fluc вперед | Аткгакгатаатакгакткактатагггаааааааааааа ATGGAAGACGCCAAAAATAAAG |
| T7-12A-fluc обратный | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCТЦКГК |
| T7-Козак-Рлюк Форвард | Аткгакгатаатакгакткактатагггаткгтагккакк АТГАТТЦГАААГТТАГАТЦ |
| T7-Козак-Рлюк реверс | Tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt ГАГААЦЦГКТК |
Таблица 6: Грунтовки – Праймеры, используемые в этом методе с полными последовательностей.
Дополнительная диаграмма 1: анализ исходных данных -шаги для анализа исходных данных для получения нормализованных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Все четыре основные шаги имеют решающее значение для успеха в пробирке транскрибированной РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Особое внимание следует уделять дизайну грунтовки, особенно для последовательности промоутера T7. T7 РНК-полимеразы начинается транскрипция с подчеркнутой первой G (gGG-5'-UTR-Август-) в T7 промоутер добавил до 5 '-UTR последовательности. Хотя транскрипция начала сайта (стш) начинается с первого G на 5 ' конец, уменьшая число G меньше, чем три в T7 промоутер регионе снизилась РНК доходности/выход из пробирке транскрипции. В ходе эксперимента, мы наблюдали, что гель очищенный ДНК продукт не был лучшим для в пробирке транскрипции как и урожайность и качество РНК были ниже. Мы только побежал 5-10% от реакции ЦР в 1% агарозы гель электрофорез, чтобы определить размер и очищенный остальные 90-95%, используя комплект очистки ЦР, которые будут использоваться для в пробирке транскрипции. В случае неспецифическое усиление от ЦР-, резки желаемого размера полоса из геля и с использованием гель-очищенный фрагмент ДНК рекомендуется. Поскольку урожайность может быть низкой, мы предлагаем увеличить объем реакции для реакции в пробирке транскрипции. Подобно другим методам, основанным на методах, ДНК/РНК могут стимулировать зондирование ДНК/РНК, которое может глобально или выборочно подавлять перевод. Таким образом, данные должны толковаться с предостережениями, хотя мы не испытываем проблем, потенциально вызванных этой проблемой в наших экспериментах.
Предлагаемый метод подходит для использования в различных модельных системах с некоторыми модификациями, такими как метод доставки мРНК, используемый внутренний контроль, подходящее время для перевода, подготовки образцов и анализа данных. Основным ограничением этого метода является то, что это репортер анализа быстро проверить перевод регулирования со стороны СНГ элементов, которые не полностью отражают физиологические условия. Поэтому этот метод следует подкрепляться другими дополнительными экспериментами, если это возможно.
По сравнению с изменением ДНК, роли модификаций РНК менее хорошо изучены. Однако, с открытием ферментов, которые пишут, читать и удалять РНК изменения30,31,32,33,34,35, теперь можно изучать влияние модификации РНК в экспрессии генов30,31,32,33,34,35. В пробирке транскрибированного РНК-на основе репортер анализа, могут быть изменены, чтобы включить различные модификации РНК и используется для проверки их воздействия на РНК перевода. Например, этот метод может включать различные аналоги Кап, которые имеют различные модификации30,31. Кроме того, дополняя внутренние РНК изменения фермента во время или после в пробирке транскрипции может возможно включать внутреннюю модификацию РНК. Добавление модификации к кепке 0, крышка 1, и внутренняя модификация РНК предоставит инструмент для изучения ролей этих модификаций РНК в переводе.
В пробирке ТРАНСКРИБИРОВАННОЕ РНК-на основе репортер анализа, имеет большой потенциал и широкое применение в понимании базовой биологии о переводе РНК. С помощью этого метода можно изучать различные механизмы инициирования перевода, в том числе инициирование с крышкой, зависимое от крышки, независимое инициирование, повторное посвящение и внутреннее инициирование, такие как IRES. Помимо этих преимуществ, этот анализ может быть использован для проверки перевода по СНГ-элементы на 5 '-UTR и 3 '-UTR в мРНК. Описанный протокол использует продукт ЦР, который обеспечивает преимущество, чтобы избежать длительного клонирования и быстро изучить влияние элементов РНК на перевод. Чтобы свести к минимуму потенциальные ошибки во время ЦР, следует использовать высокую точность полимеразы и низкий номер цикла. В качестве альтернативы, если шаблон используется часто, желаемые 5-' UTR и люциферазы ОРФ могут быть клонированы в плазмид как шаблон в пробирке транскрипции. Вместе, протокол консолидирует транскрипцию и мРНК укупорки в единую реакцию и использует обычные трансфации и анализа, которые делают в пробирке транскрибированной РНК-на основе репортера люцифферазы анализ удобный, быстрый и простой метод изучить механизмы перевода мРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы хотели бы заявить о неконкурирующем финансовом интересе.
Acknowledgments
Проект финансировался национальными институтами здоровья (AI128406 www.nih.gov) в ZY и частично Джонсон онкологический исследовательский центр (http://cancer.k-state.edu) в форме аспирант летняя Стипендия для PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
