Summary
Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo um método simplificado para a geração eficiente de plasmídeos expressando tanto a enzima CRISPR quanto o RNA guia único associado (sgRNAs). A co-transfecção de células mamíferas com este vetor sgRNA/CRISPR e um vetor de repórter de luciferase dupla que examina o reparo de quebra de dois fios permite avaliação da eficiência do nocaute.
Abstract
Embora altamente eficiente, a modificação de um site genômico pela enzima CRISPR requer a geração de um sgRNA exclusivo do site de destino de antemão. Este trabalho descreve os principais passos que levam à construção de vetores sgRNA eficientes usando uma estratégia que permite a detecção eficiente das colônias positivas por PCR antes do sequenciamento de DNA. Uma vez que a edição eficiente do genoma usando o sistema CRISPR requer um sgRNA altamente eficiente, uma pré-seleção de alvos sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único ressarcimento de fios. Aqui, usamos este sistema de repórteres para pegar o alvo xCas9/sgRNA preferido dos vetores sgRNA candidatos para edição específica de genes. O protocolo delineado fornecerá um vetor de enzima sgRNA/CRISPR preferido em 10 dias (começando com oligonucleotídeos devidamente projetados).
Introduction
Os sgRNAs CRISPR compreendem uma sequência de 20 nucleotídeos (o protoespaço), que é complementar à sequência genômica de alvo1,2. Embora altamente eficiente, a capacidade do sistema CRISPR/Cas de modificar um determinado site genômico requer a geração de um vetor que carrega um sgRNA eficiente exclusivo do site de destino2. Este artigo descreve os principais passos na geração desse vetor sgRNA.
Para a edição de genoma bem-sucedida usando o sistema CRISPR/Cas, o uso de sgRNAs altamente eficientes é um pré-requisito crucial3,4,5. Uma vez que os núcleos projetados usados na edição de genomas manifestam diversas eficiências em diferentes loci1direcionados , uma pré-seleção de metas de sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço6,7,8,9. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único fio de ressarcimento3,10. Aqui usamos este sistema de repórteres para escolher um alvo sgRNA CRISPR preferido de diferentes vetores sgRNA candidatos projetados para edição específica de genes. O protocolo aqui estabelecido foi implementado em nosso grupo e laboratórios colaboradores nos últimos anos para gerar e avaliar as SGRNAs crispr.
O protocolo a seguir resume como projetar sgRNA adequado através de software de rede. Uma vez selecionados os sgRNAs adequados, descrevemos as diferentes etapas para obter os oligonucleotídeos necessários, bem como a abordagem para inserir os oligonucleotídeos emparelhados no vetor de expressão pX330-xCas9. Também apresentamos um método para a montagem de vetores de repórter sgRNA e dupla luciferase baseado na ligadura dessas sequências em um vetor de expressão predigdenciado (passos 2-10, Figura 1A). Finalmente descrevemos como analisar a eficiência de corte de DNA para cada um dos sgRNAs (etapas 11-12).
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Protocol
1. sgRNA design de oligonucleotídeo
- Design sgRNAs usando ferramentas on-line, como a ferramenta online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). A sequência PAM é importante com base no Cas9 que está sendo usado. Para xCas9, as sequências pam relevantes são NG e a antiga ferramenta on-line Cas-Designer referida pode gerar sgRNAs relevantes xCas9.
- Use ferramentas de design sgRNA que englobam algoritmos para previsão on-and-target (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. É preferível uma pontuação de 0,2 ou superior.
- Selecione até 3 alvos de edição de genes para uma triagem ideal (por exemplo, T1, T2 e T3 foram projetados para o alvo genético DKK2 exon 1 de ovelhas[Tabela 1]).
2. Modificação de oligonucleotídeo
- Para modificar o oligonucleotídeo sgRNA, exclua o motivo adjacente do protoespaço de 3'-NG (PAM), mantendo a sequência do protoespaço (por exemplo, sequência inicial para T1: TGCCTGCCTCTACTGGCCGC [20 nt]).
- Adicione o caccg pentanucleotídeo ao fim de 5'end do oligo.
NOTA: Após a ligadura para o esqueleto pX330-xCas9, esta sequência conterá o 3'-end do promotor U6 motivando a transcrição sgRNA. A matriz "CACC" garante que o oligo esteja combinando com as saliências do plasmídeo pX330-xCas9 digerido pelo BbsI. A base "G" é um pré-requisito dos promotores do RNA Polymerase III e garante a inicialização eficaz da transcrição sgRNA (por exemplo, anexando a matriz de 5'-CACCG ao protoespaço do T1, alcançando T1-F: CACCGTGCCTGCCTCTACTCTGGCCGC [25 nt]). A eficiência do decote de 21 nt gRNA é significativamente diferente da de 20 nt gRNA1,12,13,14. É geralmente aconselhável usar 20 nt com 5'-G gerando um protoespaço mais curto, se isso não for possível, então 21 nt com 5'-G extra podem ser usados. - Crie um complemento reverso (rc) da sequência do protoespaço.
NOTA: Por exemplo, o rc do protoespaço T1 é GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Anexar AAAC ao final de 5'/10 da sequência rc protospacer. Adeia um C adicional ao 3'-end do protoespaço.
NOTA: A sequência "AAAC" garante que o oligonucleotídeo seja adequado para clonagem no plasmídeo pX330-xCas9 digerido pelo BbsI. O adicional "C" no 3'-end é essencial para a ressarcimento com o início "G" para a transcrição sgRNA descrita acima (por exemplo, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] é a sequência final de oligonucleotídeo para o protoespaçor T1 rc). - Ordene os oligonucleotídeos.
3. Oligonucleotídeos
- Diluir oligonucleotídeos liofilizados a uma concentração final de 10 μM em água dupla destilada (ddH2O).
- Misture oligonucleotídeos para a frente e para frente em um tubo PCR de parede fina, maintaning uma razão de 1:1 (por exemplo, 20 μL cada) sem adicionar qualquer buffer extra.
- Incubar a mistura a 95 °C por 5 min e, em seguida, diminuir a temperatura para 72 °C por 10 min. Siga com um período de resfriamento à temperatura ambiente (RT) que consiste em simplesmente remover a amostra da máquina PCR e colocá-la em RT.
NOTA: Não é necessário fosforilarar as misturas de oligonucleotídeos para facilitar a ligadura.
4. digestão vetorial sgRNA/CRISPR
- Digerir 1 μg do vetor pX330-xCas9 selecionado com BbsI (10 unidades de enzima por 1 μg de plasmídeo) por 2 h a 37 °C(Figura 2). Conduza a digestão do vetor de expressão sgRNA pX330-xCas9 em um volume total de 50 μL, contendo 5 μL de tampão de digestão de 10x e água destilada para alcançar o volume final.
- Purifique o vetor digerido por extração de banda a partir de um gel de 2% de agarose abaixo de 10 V/cm e, posteriormente, purifique usando uma coluna de sílica usando um kit de extração de gel comercial.
5. Ligação dos oligonucleotídeos sgRNA enaltados ao vetor de expressão
- Misture os oligonucleotídeos sgRNA enlatados (5 μL da mistura a partir do passo 4) com o vetor pX330-xCas9 digerido por BbsI (purificado, 100 ng).
- Adicione 1 μL de ligase e 1 μL de tampão ligase de 10x.
- Adicione água destilada com volume apropriado, até 10 μL.
- Incubar durante a noite a 4 °C.
6. Transformação celular competente
- Retire as células competentes E. coli DH5α do armazenamento a -80 °C e descongele-as no gelo.
- Adicione 5 μL da mistura de ligadura a 50 μL de E. coli DH5α competente e mantenha a mistura no gelo por 30 minutos.
- Aqueça a mistura a 42 °C durante 90 s.
- Descanse no gelo por 2 minutos.
- Recupere a cultura em um agitador rotativo em 500 μL de mídia LB por 1 h a 37 °C.
- Placa 200 μL da cultura em uma placa de agarose resistência à ampicilina LB e incuba-la durante a noite a 37 °C.
7. Identificação dos plasmídeos recombinantes corretos por PCR
- Escolha de 5 a 10 colônias bacterianas da placa LB e use cada uma delas para inocular um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de mídia LB com 60 mg/mL de ampicillina.
- Incubar os tubos em um agitador rotativo por 2-3 h.
- Realize a detecção de plasmídeos recombinantes corretos usando pares de primer específicos para os oligonucleotídeos sgRNA [por exemplo, primer avançado para construção vetorial de expressão T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTCTCTACTCTGGCCGC, primer reverso (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, produzindo um amplicon de 287 bps (Figura 3)].
- Prepare a mistura PCR(Tabela 2).
- Use as seguintes condições de ciclismo PCR: 95 °C para 5 min para pré-desnaturação; 30 ciclos de 95 °C para 30 s para desinaturação, 60 °C para 30 s para ressar e 72 °C para 30 s para extensão. Após a conclusão dos 30 ciclos, realize uma etapa final de extensão por aquecimento por 5 min a 72 °C.
- Execute o produto PCR em um gel de 2% de agarose abaixo de 10 V/cm. Uma banda do tamanho certo [por exemplo, 287 bp] é considerada positiva.
8. Validar a sequência de plasmídeo de expressão sgRNA
- Verifique a sequência de colônias positivas de PCR pelo Sanger sequenciamento15 usando o primer reverso BbsI-R (ver passo 7.3). Esta primer se acotorna no local a jusante da inserção sgRNA oligo. Foi construída a sequência sgRNA de expressão pX330-xCas9-T1 contendo protoespaço TGCCTGCCTCTACTGGCCGGGGGG e xCas9.
- Use o primer T1-F para sequenciar as colônias positivas. O atacante não pôde dar informações completas de sequência para o site em torno do local de inserção do oligo sgRNA, pois o fragmento de 30-50 bp após o primer de sequenciamento não poderia ser exatamente lido.
9. Construção de vetor de repórter de dupla luciferase
- Sintetizar fragmentos de DNA de 300-500 bp contendo os alvos sgRNA e subclone-lo em um vetor de repórter de luciferase dupla através de digestão dupla [por exemplo, subclone 440 bp ovelhas DKK2 exon1 fragmento em pSSA-Dual plasmid16,17 usando digestão dupla com AscI e SalI, resultando pSSA-Dual-D2KK].
- Sintetizar fragmentos de DNA de 300-500 bp contendo os alvos sgRNA. Observe que as sequências dos fragmentos de DNA devem ser partes das sequências genômicas, que poderiam ser obtidas a partir do site ncbi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou referências relacionadas.
- Selecione um vetor de repórter de dupla luciferase adequado, como pSSA-Dual16,17 (ou dois vetores expressando luciferase de vagalume e renilla luciferase respectivamente) e, em seguida, digerir este vetor e os fragmentos de DNA indicados acima com dois endonucleases como AscI e SalI.
- Finalmente ligar esses dois fragmentos com Ligase de DNA T4, resultando em pSSA-Dual-Target. Os detalhes para dupla digestão e ligadura são exibidos na Tabela 3 e Tabela 4, respectivamente. Vale ressaltar que o vetor repórter deve ser amplificado em cepas de bactérias estáveis (como top10), que são recomendadas para serem cultivadas com menor velocidade rotacional (tipicamente não mais do que 200 rpm), com o propósito de evitar a recombinação do DNA.
10. Transfecção celular
- Extrair plasmídeos livres de endotoxinas para vetores acima. Avalie a pureza e concentração dos plasmídeos utilizando instrumentos adequados. Recomenda-se uma concentração final de nada menos que 500 ng/μL e uma razão de pureza de 1,7-1,9 na absorvância 260/280 nm (A260/A280) para estes plasmídeos.
- Co-transfeito uma linha celular apropriada como PIEC18 com os plasmídeos em igual proporção (por exemplo, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmid para cada duplicação ao usar placa de 24 poços). Use um vetor vazio como pX330-xCas9 como um controle negativo.
- Um dia antes da transfecção, as células da placa em uma placa de cultura de 24 poços a uma densidade de 2 x 105 células/bem. As células estarão prontas para a transfecção quando alcançarem uma confluência de 60-80%.
- Antes do ponto de tempo de transfecção, remova o supernascente o máximo possível e adicione suavemente 0,5 mL de mídia fresca para cada poço.
- Diluir reagente de transfecção na mídia DMEM na proporção de 1:25 e misturar bem.
- Prepare a mistura mestre de DNA diluindo 0,5 μg de DNA em 25 μL de mídia DMEM e, em seguida, adicione 1 μL de reagente P3000.
- Adicione DNA diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído (proporção 1:1).
- Incubar por 10-15 min em temperatura ambiente.
- Adicione 50 μL de dna-lipídicos complexo às células.
- Incubar células por 24 h a 37 °C. Em seguida, analise as células transfeinadas como no Passo 11.
11. Detecção de dupla luciferase
- Prepare uma quantidade suficiente do tampão de 1x de lise passiva (PLB) adicionando 1 volume de 5x PLB a 4 volumes de água destilada e misture bem.
- Lise passiva de células cultivadas em placas de cultura de 24 poços.
- Remova o meio de crescimento das células cultivadas e aplique suavemente um volume suficiente de soro fisco tamponado de fosfato (PBS) para lavar a superfície do vaso cultural. Gire o vaso brevemente para remover células separadas e meio de crescimento residual. Remova completamente a solução de enxágue antes de aplicar reagente PLB.
- Dispense 100 μL de 1x PLB em cada cultura bem para cobrir completamente a monocamada celular. Deixe as placas de cultura ficarem por 20 minutos.
- Transfira o lise para um tubo ou frasco para posterior manuseio ou armazenamento.
- Prepare o reagente de ensaio de luciferase (LAR) reutilizando o substrato de ensaio de luciferase fornecido em 10 mL do tampão de ensaio de luciferase fornecido.
- Prepare um volume adequado para realizar o número desejado de ensaios de repórter de dupla luciferase (100 μL reagente por ensaio). Adicione 1 volume de substrato de parada de 50x a 50 volumes de tampão de parada em um copo ou tubo de polipropileno siliconado.
- Ensaio de repórter de dupla luciferase (DLR)
- Programar luminômetros para fornecer um atraso pré-leitura de 2 segundos, seguido de um período de medição de 10 segundos.
- Predispense 100 μL de reagente de ensaio de luciferase no número apropriado de tubos de luminômetro para completar o número desejado de ensaios DLR.
- Transfira cuidadosamente até 20 μL de lise celular para o tubo luminômetro contendo LAR; misturar por pipetação 2 ou 3 vezes. Coloque o tubo no luminômetro e inicie a leitura.
- Remova o tubo de amostra do luminômetro, adicione 100 μL de reagente stop e vórtice brevemente para misturar. Substitua a amostra no luminômetro e inicie a leitura.
- Regisso recorde a atividade de renilla luciferase normalizada para a atividade de luciferase de vagalume, ou seja, a recíproca da razão exibida na tela.
- Descarte o tubo de reação e siga para o próximo ensaio.
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Representative Results
Os métodos descritos neste protocolo são para a construção de vetores de expressão sgRNA e xCas9 e, em seguida, para a triagem de otimização de oligos sgRNA com eficiências relativamente mais altas de segmentação genética. Aqui exibimos um exemplo representativo de 3 alvos sgRNA para ovelhas DKK2 exon 1. Os vetores de expressão SgRNA e xCas9 podem ser construídos predigesting a espinha dorsal vetorial (Figura 2), seguido por ligante-lo em uma série de fragmentos curtos de DNA de dois fios através de pares de oligo de relagem. As colônias positivas poderiam ser detectadas através de pares de primer específicos guiados PCR(Figura 3). Um fragmento de DNA de 440 bps da ovelha DKK2 exon 1 foi subclorado em pSSA-Dual plasmid15 usando dupla digestão com AscI e SalI, resultando em pSSA-Dual-DKK2. As capacidades de segmentação genética de pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 e pX330-xCas9-T3 foram detectadas simutanusamente(Figura 5),e então o último vetor sgRNA foi identificado como o relativamente melhor, que pegamos para pesquisa de edição de genes de ovelhas na próxima etapa.
Este método de detecção combina um mecanismo de ressarcimento de fios únicos (SSA)(Figura 1B e Figura 4) com um gene de relatório de luciferase, a fim de monitorar a eficiência de corte de DNA. Como ilustrado na Figura 4,SSA é um processo iniciado quando uma quebra dupla de fios é feita entre duas sequências repetidas orientadas na mesma direção. Regiões de fios únicos são criadas adjacentes às quebras que se estendem às sequências repetidas para que os fios complementares possam se ressarar entre si. Este intermediário de ressaramento pode ser processado digerindo as caudas únicas encalhadas e preenchendo as lacunas. O gene Dual-Luciferase Reporter inclui principalmente os genes da luciferase do flumeto Photinus pyralis e de Renilla reniformis (também conhecido como pansy marinho). As atividades de luciferases de vagalumes e renilla são medidas sequencialmente a partir de uma única amostra. Quando a área de reconhecimento que tem o códon de terminação não é cortada no meio, o gene no sistema SSA é bloqueado e não pode ser traduzido em uma proteína funcional. Quando o processamento ocorre, o sistema SSA irá mesclar a sequência homólogo automaticamente, e sequências sobrepostas se tornam uma única sequência, o gene é reparado pela recombinação e, em seguida, pode ser lido ao longo da produção de uma proteína funcional.
Figura 1: Representação esquemática das diferentes etapas do processo de clonagem.
(A) Esquema de construção de vetor sgRNA, adaptado dos protocolos do Feng Zhang Lab. (B) Esquema do edifício vetorial de repórter de dupla luciferase (seleto vetor pSSA-DKK2 como exemplo), fragmentos de DNA Rluc-, Rluc-2 e Rluc-3 representam três partes de sequência de codificação completa de Renilla luciferase. O MCS representa "site de clonagem múltipla". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Predigesting a espinha dorsal vetorial pX330-xCas9 com BbsI.
1: Marcador de DNA, 2: pX330-xCas9 plasmid, 3: pX330-xCas9 plasmid digerido com BbsI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pares de primer específicos guiaram o PCR para detecção de vetores SgRNA DKK2-T1.
As faixas 1-7 indicam bandas pcr para 7 colônias de bactérias diferentes separadamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Esquemas para ressarcimento de fios únicos (SSA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ensaio de luciferase dupla com repórter vetor pSSA-DKK2 na linha celular PIEC.
As atividades de luciferase ranilla luciferase são significativamente induzidas (P<0.01, Teste do aluno) no PIEC por superexpresagem de pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 ou pX330-xCas9-T3 com a variação do fold de 3.15, 5.84 ou 13.10, respectivamente. As barras de erro indicam desvios padrão (SD)(n=3) para cada grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Alvos de DNA genômico (5'-3') | sgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCCTCTACTGGCCGCGGGG | T1-F: CACCGTGCCTGCCTCTACTCTCTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 | ATCAAGCTCTCTGGGGGGGGGG | T2-F: CACCGATCAAGCTCTCTGGGCGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCGCGGGCGCGCGCGC | ||||
Tabela 1: alvos sgRNA e oligos projetados para edição de genes de ovelhas DKK2.
| Componente PCR | Reação de 25 μL |
| Primer forward de 10 μM (por exemplo, T1-F) | 1 μL |
| 10 μM Primer Reverso BbsI-R | 1 μL |
| Tampão PCR 10x | 2,5 μL |
| DNTPs de 2,5 mM | 1 μL |
| fluido bacteriano | 1 μL |
| DNA Taq Polimerase | 2,5 unidades |
| Água sem nuclease | Até 25 μL |
Tabela 2: Mistura pcr para detecção de colônias bacterianas positivas.
| Reagente | Volume |
| vetor pSSA-Dual (fragmento de DNA sintetizado ou produto PCR) | 1-2 μg |
| CutSmart Buffer | 5 μL |
| Asci | 1 μL |
| Sali-HF | 1 μL |
| Água destilada | até 50 μL |
| Volume total | 50 μL |
Tabela 3: Dupla digestão do vetor pSSA-Dual e fragmento de DNA sintetizado (ou produto PCR).
| Reagente | Volume |
| vetor pSSA-Dual (predigested) | 0,5 μg |
| Fragmentos de DNA contendo os alvos sgRNA (predigsted) | 0,2 μg |
| Tampão de ligase de DNA T4 (10x) | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
| Água destilada | até 10 μL |
| Volume total | 10 μL |
Tabela 4: Uma reação de ligadura de fragmentos de DNA contendo os alvos sgRNA em um vetor pSSA-Dual predigrado.
| Passo 1: preparação do reagente | |
| Reagente de transfecção | 2 μL |
Tabela 5: Detalhes da transfecção celular em uma placa de 24 poços.
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Discussion
Os procedimentos de clonagem de vetores sgRNA que descrevemos aqui facilitam a produção eficiente de sgRNAs, com a maioria dos custos derivados do pedido de oligonucleotídeos e sequenciamento vetorial. Embora o método delineado seja projetado para permitir que os usuários gerem sgRNAs para uso com CRISPR/Cas9, o protocolo pode ser facilmente adaptado para uso com ortomologias Cas9 ou outros endonucleases guiados por RNA, como o Cpf1, introduzindo pequenas modificações na espinha dorsal vetorial e nas sequências de saliência do oligonucleotídeo.
O protocolo descrito acima fornecerá uma meta sgRNA preferencial em 10 dias, quando começar com oligonucleotídeos devidamente projetados. Isso inclui o design sgRNA (1 h, passos 1 - 2), diluição, alíquota e recozimento dos oligonucleotídeos (30 min, passo 3), digestão e purificação do vetor de expressão sgRNA (3h, etapa 4), clonagem dos oligonucleotídeos sgRNA em um vetor vazio predigested (durante a noite, etapas 5 - 6), a detecção pcr das colônias (4-5 h, passo 7) e a validação da sequência da expressão sgRNA plasmid (24 h , passo 8). Enquanto isso, a construção e a validação de sequência de vetor de repórter de dupla luciferase leva 5 – 7 d (etapa 9). A preparação da linha celular, transfecção plasmida e detecção dupla de luciferase levam cerca de 48 h (etapas 10 - 11). As taxas de falha para gerar cada plasmídeo são quase 0.
O passo mais crítico do protocolo é a digestão restritiva da enzima do vetor sgRNA por enzimas como o BbsI. Se a digestão não for suficiente, então a taxa positiva de colônias de bacteria pode ser muito baixa. Enquanto a abordagem de detecção baseada em PCR poderia monitorar sensivelmente a eficiência de digestão e a taxa positiva. Os primers dianteiros, anteriormente usados como oligos dianteiros do fragmento sgRNA inserido, garantiram uma distinção altamente eficaz de inserções certas e vetores vazios. Uma das vantagens dessa estratégia é justamente a detecção eficiente das colônias positivas por PCR antes do sequenciamento de DNA. Como dito acima, a verificação de sequência ainda é relativamente mais cara em comparação com o PCR, especialmente quando ocorre a digestão incompleta do BbsI. Em termos de economia de recursos, emparelhamos os oligos dianteiros para ressaramento de fragmentos sgRNA (como T1-F, T2-F ou T3-F) com o primer de sequenciamento BbsI-R para amplificação PCR. Mais de 500 vetores sgRNA foram construídos com sucesso em laboratório através desta estratégia para identificação de colônias.
Outro mérito do protocolo é a efetiva pré-seleção de candidatos sgRNA usando sistema de repórteres de dupla luciferase. Enorme variância da eficiência de corte de fato existe em diferentes metas sgRNA4. Identificar um alvo sgRNA altamente eficiente pelo ensaio T7E1 ou ensaio nuclease surveyor1 em uma linha celular difícil de transfetar é o tempo e o trabalho de consumo. Além disso, para amplificação pcr no ensaio T7E1 ou ensaio nuclease Surveyor, às vezes é difícil amplificar especificamente a sequência de destino no DNA do genoma devido à falta de pares de primer adequados1. Em contraste, o ensaio de repórter de luciferase dupla é independente dos procedimentos de amplificação do genoma. Anteriormente, usamos este método para obter sgRNAs altamenteativos 16,19.
Apesar das claras vantagens do método descrito neste trabalho, há também algumas limitações que devem ser apontadas. Embora garanta uma alta taxa de sucesso, o método baseado em luciferase para seleção de sgRNA proposto poderia ser mais caro do que outras abordagens (análise de derretimento de agrimensor/alta resolução, etc.) devido à necessidade de sintetizar a sequência de destino. Além disso, essa abordagem não é mais rápida do que qualquer um desses métodos alternativos devido à necessidade de clonar o plasmídeo repórter se uma linha celular fácil de transfectar será conduzida para direcionamento genético. Também é necessário esclarecer que o método é adequado para fazer nocautes, mas não para editar nucleotídeos específicos. Além disso, apenas quebras duplas e nem quebras de um único fio podem ser avaliadas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pelo Programa de Disciplina de Ciência de Pastagens de Primeira Classe da Província de Shandong (China), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31301936, 31572383), fundo especial de pesquisa agrocientífica de interesse público (201403071), Avaliação nacional de risco grande projeto especial de qualidade e segurança do produto leite (GJFP201800804) e Projetos de Ciência e Tecnologia de Sustento do Povo de Qingdao (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
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