Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver en strømlinjeformet metode for effektiv generering av plasmider som uttrykker både CRISPR-enzymet og tilhørende enkeltguide RNA (sgRNAs). Samtidig transfection av pattedyrceller med denne sgRNA / CRISPR vektor og en dobbel luciferase reporter vektor som undersøker dobbel-strand pause reparasjon tillater evaluering av knockout effektivitet.
Abstract
Selv om det er svært effektivt, krever modifisering av et genomisk sted av CRISPR-enzymet generering av en sgRNA som er unik for målstedet(e) på forhånd. Dette arbeidet beskriver de viktigste trinnene som fører til bygging av effektive sgRNA vektorer ved hjelp av en strategi som gjør det mulig å effektiv påvisning av de positive koloniene av PCR før DNA sekvensering. Siden effektiv genomredigering ved hjelp av CRISPR-systemet krever en svært effektiv sgRNA, er det nødvendig med et forhåndsvalg av kandidatsgRNA-mål for å spare tid og krefter. En dobbel luciferase reporter system er utviklet for å evaluere knockout effektivitet ved å undersøke dobbel-strand pause reparasjon via enkelt strand annealing. Her bruker vi dette reportersystemet til å plukke opp det foretrukne xCas9/sgRNA-målet fra kandidatsgRNA-vektorer for spesifikk genredigering. Protokollen som er skissert vil gi en foretrukket sgRNA / CRISPR enzymvektor om 10 dager (starter med riktig utformede oligonucleotides).
Introduction
CRISPR sgRNAs består av en 20-nukleotidsekvens (protospaceren), som er komplementær til den genomiskemålsekvensen 1,2. Selv om crispr/cas-systemet er svært effektiv, krever CRISPR/Cas-systemets evne til å endre et gitt genomisk nettsted generering av en vektor som bærer en effektiv sgRNA som er unik for målområdet(e)2. Dette papiret beskriver de viktigste trinnene i generering av denne sgRNA-vektoren.
For vellykket genomredigering ved hjelp av CRISPR/Cas-systemet er bruk av svært effektive sgRNAer en avgjørende forutsetning3,4,5. Siden konstruerte kjerner som brukes i genomredigering manifesterer ulike effektiviteter på forskjellige målrettede loci1,er det nødvendig med et forhåndsvalg av kandidatsgRNA-mål for å spare tid og krefter6,7,8,9. En dobbel luciferase reporter system er utviklet for å evaluere knockout effektivitet ved å undersøke dobbel-strand pause reparasjon via enkelt strand annealing3,10. Her bruker vi dette reportersystemet til å velge et foretrukket CRISPR sgRNA-mål fra ulike kandidatsgRNA-vektorer designet for spesifikk genredigering. Protokollen som er angitt her har blitt implementert i vår gruppe og samarbeide laboratorier for de siste årene for å generere og evaluere CRISPR sgRNAs.
Følgende protokoll oppsummerer hvordan du designer egnet sgRNA gjennom nettverksprogramvare. Når de egnede sgRNAene er valgt, beskriver vi de forskjellige trinnene for å få de nødvendige oligonucleotides samt tilnærmingen for å sette inn de parede oligonucleotides i pX330-xCas9 uttrykksvektoren. Vi presenterer også en metode for montering av sgRNA-uttrykksfulle og doble luciferase reportervektorer basert på ligation av disse sekvensene i en predigested uttrykk vektor (trinn 2-10, figur 1A). Til slutt beskriver vi hvordan du analyserer DNA-skjæreeffektiviteten for hver av sgRNAs (trinn 11-12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA oligonukleotid design
- Design sgRNAs ved hjelp av elektroniske verktøy som Cas-Designer online verktøy (http://www.rgenome.net/cas-designer/). PAM-sekvensen er viktig basert på at Cas9 brukes. For xCas9 er de relevante PAM-sekvensene NG, og det tidligere refererte Cas-Designer online-verktøyet kan generere xCas9 relevante sgRNAs.
- Bruk sgRNA-designverktøy som omfatter algoritmer for on- og off-target prediksjon (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. En score på 0,2 eller høyere foretrekkes.
- Velg opptil 3 genredigeringsmål for en optimal screening (f.eks. T1, T2 og T3 ble designet for sauer DKK2 exon 1 genmålretting [Tabell 1]).
2. Oligonucleotid modifikasjon
- Hvis du vil endre sgRNA oligonucleotide, sletter du 3'-NG protospacer tilstøtende motiv (PAM), holde protospacer sekvensen (f.eks startsekvens for T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).
- Legg pentanucleotide CACCG til 5'-enden av oligo.
MERK: Ved ligation til pX330-xCas9 skjelettet, vil denne sekvensen inneholde 3'-slutten av U6 arrangør motiverende sgRNA transkripsjon. Matrisen "CACC" garanterer at oligo samsvarer med overhengene til bbsi-fordøyd pX330-xCas9 plasmid. Basen "G" er en forutsetning for RNA Polymerase III arrangører og garanterer effektiv oppstart av sgRNA transkripsjon (f.eks legge til 5'-CACCG array til protospacer av T1, oppnå T1-F: CACCGTGCCTCCTCCTACTGGCCGC [25 nt]). Spaltingseffektiviteten til 21 nt gRNA er vesentlig forskjellig fra 20 nt gRNA1,12,13,14. Det anbefales vanligvis å bruke 20 nt med 5'-G ved å generere en kortere protospacer, hvis dette ikke er mulig, kan 21 nt med ekstra 5'-G brukes. - Lag et omvendt komplement (rc) av protospacer-sekvensen.
MERK: For eksempel er rc av T1 protospacer GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt). - Tilføy AAAC til 5'-enden av rc protospacer-sekvensen. Legg til en ekstra C til 3'-enden av rc protospacer.
MERK: "AAAC"-sekvensen sikrer at oligonukleotid er egnet for kloning i bbsi-fordøyd pX330-xCas9 plasmid. Den ekstra"C"på 3'-enden er avgjørende for å gløde med initiering "G" for sgRNA transkripsjon beskrevet ovenfor (f.eks AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] er den endelige oligonucleotide sekvensen for T1 rc protospacer). - Bestill oligonucleotides.
3. Oligonucleotide annealing
- Fortynn lyofiliserte oligonukleotider til en endelig konsentrasjon på 10 μM i dobbelt destillert vann (ddH2O).
- Bland forover og revers oligonukleotider i en tynn vegg PCR rør maintaning en 1:1 ratio (f.eks 20 μL hver) uten å legge til noen ekstra buffer.
- Inkuber blandingen ved 95 °C i 5 min og ramp deretter ned temperaturen til 72 °C i 10 min. Følg med en kjøleperiode ved romtemperatur (RT) som består av å bare fjerne prøven fra PCR-maskinen og plassere den ved RT.
MERK: Det er ikke nødvendig å fosforylere oligonukleotidblandingene for å lette ligationen.
4. sgRNA/ CRISPR vektor fordøyelse
- Digest 1 μg av den valgte pX330-xCas9 vektor med BbsI (10 enheter enzym per 1 μg plasmid) i 2 timer ved 37 °C (figur 2). Utuk fordøyelsen av pX330-xCas9 sgRNA uttrykksvektor i et totalt volum på 50 μL, som inneholder 5 μL 10x fordøyelsesbuffer og destillert vann for å oppnå det endelige volumet.
- Rens den fordøyde vektoren med båndutvinning fra en 2% agarose gel under 10 V / cm og deretter rense ved hjelp av en silikakolonne ved hjelp av et kommersielt gelekstraksjonssett.
5. Ligation av glødet sgRNA oligonucleotides til uttrykket vektor
- Bland de glødede sgRNA oligonukleotider (5 μL av blandingen fra trinn 4) med BbsI-fordøyd pX330-xCas9 vektor (renset, 100 ng).
- Tilsett 1 μL ligase og 1 μL μL 10x ligasebuffer.
- Tilsett destillert vann med passende volum, opptil 10 μL.
- Inkuber over natten ved 4 °C.
6. Kompetent celletransformasjon
- Ta ut E. coli DH5α kompetente celler fra lagring ved -80 °C og tin den på is.
- Tilsett 5 μL av ligation blandingen til 50 μL kompetent E. coli DH5α og hold blandingen på is i 30 min.
- Varmestøt blandingen ved 42 °C i 90 s.
- Hvil den på is i 2 min.
- Gjenopprett kulturen på en roterende shaker i 500 μL LB media i 1 time ved 37 °C.
- Plate 200 μL av kulturen på en ampicillin motstand LB agarose plate og inkubere den over natten ved 37 °C.
7. Identifikasjon av de riktige rekombinante plasmidene fra PCR
- Velg 5 til 10 bakterielle kolonier fra LB-platen og bruk hver av dem til å inokulere en 1,5 ml rør som inneholder 1 ml LB media med 60 mg / ml ampicillin.
- Inkuber rørene på en roterende shaker i 2-3 timer.
- Utfør påvisning av korrekte rekombinante plasmider ved hjelp av spesifikke primerpar for sgRNA oligonucleotides [f.eks. fremover primer for T1 sgRNA uttrykk vektor konstruksjon (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, omvendt primer (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, produserer en 287 bp amplicon (Figur 3)].
- Klargjør PCR-blandingen (tabell 2).
- Bruk følgende PCR-sykkelforhold: 95 °C i 5 min for forhåndsdeningen; 30 sykluser på 95 °C for 30 s for denning, 60 °C for 30 s for glødende, og 72 °C for 30 s for forlengelse. Etter at de 30 syklusene er fullført, utfør et siste forlengelsestrinn ved oppvarming i 5 min ved 72 °C.
- Kjør PCR-produktet på en 2% agarose gel under 10 V / cm. Et bånd i riktig størrelse [f.eks. 287 bp] anses som positivt.
8. Validere sekvensen av sgRNA uttrykk plasmid
- Kontroller sekvensen av PCR-positive kolonier ved å sekvensere15 ved hjelp av den omvendte primeren BbsI-R (se trinn 7.3). Denne primeren anneals på stedet nedstrøms av sgRNA oligo innsats. pX330-xCas9-T1 som uttrykker sgRNA-sekvens som inneholder protospacer TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG og xCas9 ble konstruert.
- Bruk den fremre primeren T1-F til å sekvensere de positive koloniene. Den fremre kunne ikke gi fullstendig sekvensinformasjon for området rundt innsettingsstedet for sgRNA oligo, fordi 30-50 bp fragment etter sekvensering primer ikke kunne leses nøyaktig ut.
9. Bygging av dual luciferase reporter vektor
- Syntetisere 300-500 bp DNA fragmenter som inneholder sgRNA mål og subclone det inn i en dobbel luciferase reporter vektor gjennom dobbel fordøyelse [f.eks subclone 440 bp sauer DKK2 exon1 fragment i pSSA-Dual plasmid16,17 ved hjelp av dobbel fordøyelse med AscI og SalI, noe som resulterer pSSA-Dual-DKK2].
- Syntetisere 300-500 bp DNA fragmenter som inneholder sgRNA mål. Vær oppmerksom på at sekvensene av DNA-fragmentene må være deler av genomiske sekvenser, som kan fås fra NCBI-nettstedet (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eller relaterte referanser.
- Velg en passende dual luciferase reporter vektor som pSSA-Dual16,17 (eller to vektorer som uttrykker firefly luciferase og renilla luciferase henholdsvis) og deretter fordøye denne vektoren og DNA fragmenter nevnt ovenfor med to endonucleases som AscI og SalI.
- Endelig ligate disse to fragmentene med T4 DNA Ligase, noe som resulterer i pSSA-Dual-Target. Detaljer for dobbel fordøyelse og ligation vises i henholdsvis tabell 3 og tabell 4. Det er verdt å nevne at reportervektoren skal forsterkes i stabile bakteriestammer (for eksempel Top10), som anbefales å bli dyrket med lavere rotasjonshastighet (vanligvis ikke mer enn 200 rpm), med det formål å unngå DNA-rekombinasjon.
10. Celletransinfeksjon
- Trekk ut endotoksinfrie plasmider for vektorer nevnt ovenfor. Evaluer renheten og konsentrasjonen av plasmidene ved hjelp av egnede instrumenter. En endelig konsentrasjon på ikke mindre enn 500 ng/μL og et renhetsforhold på 1,7-1,9 ved absorbans 260/280 nm (A260/A280) anbefales for disse plasmidene.
- Samtidig transfect en passende cellelinje som PIEC18 med plasmidene i lik andel (f.eks pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2 = 1:1, 0,5 μg plasmid for hver duplisering når du bruker 24 brønnplate). Bruk en tom vektor, for eksempel pX330-xCas9 som en negativ kontroll.
- En dag før transfection, plateceller i en 24-brønns kulturplate med en tetthet på 2 x 105 celler / brønn. Celler vil være klare for transfeksjon når de oppnår en samløpet på 60-80%.
- Før transfection-tidspunktet fjerner du supernatanten så mye som mulig og legger forsiktig til 0, 5 ml friskt medium for hver brønn.
- Fortynn transfection reagens i DMEM media i forholdet 1:25 og bland godt.
- Forbered masterblandingen av DNA ved å fortynne 0,5 μg DNA i 25 μL DMEM-medier, og tilsett deretter 1 μL P3000-reagens.
- Tilsett fortynnet DNA til hvert rør med fortynnet transfeksjonsreagens (1:1-forhold).
- Inkuber i 10–15 min ved romtemperatur.
- Tilsett 50 μL DNA-lipidkompleks til celler.
- Inkuber celler i 24 timer ved 37 °C. Deretter analyserer du trans infiserte celler som i trinn 11.
11. Deteksjon av dobbel luciferase
- Forbered en tilstrekkelig mengde av 1x passiv lysisbuffer (PLB) ved å tilsette 1 volum 5x PLB til 4 volumer destillert vann og bland godt.
- Passiv lysis av celler dyrket i 24-brønns kulturplater.
- Fjern vekstmediet fra de kultiverte cellene, og påfør forsiktig et tilstrekkelig volum fosfatbufret saltvann (PBS) for å vaske overflaten av kulturkaret. Virvle fartøyet kort for å fjerne frittliggende celler og gjenværende vekstmedium. Fjern skylleoppløsningen helt før du påfører PLB-reagensen.
- Dispenser 100 μL 1x PLB i hver kultur godt for å dekke cellemonolaget helt. La kulturplatene stå i 20 min.
- Overfør lysatet til et rør eller hetteglass for videre håndtering eller lagring.
- Forbered luciferase analyse reagens (LAR) ved å gjenopplive den medfølgende lyofiliserte luciferase analysesubstratet i 10 ml av den medfølgende luciferaseanalysebufferen.
- Forbered et tilstrekkelig volum for å utføre ønsket antall dual-luciferase reporter analyser (100 μL reagens per analyse). Tilsett 1 volum av 50x stoppsubstrat til 50 stoppbuffer i et glass eller silikonisert polypropylenrør.
- Dual-luciferase reporter (DLR) analyse
- Programmer luminometre for å gi en 2-sekunders forhåndslest forsinkelse, etterfulgt av en 10-sekunders måleperiode.
- Predispense 100 μL luciferase analyse reagens i riktig antall luminometer rør for å fullføre ønsket antall DLR-analyser.
- Overfør forsiktig opptil 20 μL cellelylat inn i luminometerrøret som inneholder LAR; ved å pipettering 2 eller 3 ganger. Plasser røret i armometeret og start avlesningen.
- Fjern prøverøret fra armometeret, tilsett 100 μL stoppreagens og virvelen kort for å blande. Sett prøven i armometeret tilbake på plass, og start avlesningen.
- Registrer renilla luciferase aktiviteten normalisert til firefly luciferase aktivitet, nemlig gjensidig av forholdet som vises på skjermen.
- Kast reaksjonsrøret, og gå videre til neste analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodene som er skissert i denne protokollen er for bygging av sgRNA og xCas9 uttrykk vektorer og deretter for optimalisering screening av sgRNA oligos med relativt høyere gen rettet mot effektivitet. Her viser vi et representativt eksempel på 3 sgRNA-mål til sauer DKK2 exon 1. SgRNA og xCas9 som uttrykker vektorer kan bygges ved å forebygge vektorbackbone (figur 2) etterfulgt av ligating det i en rekke korte dobbelttrådEDE DNA-fragmenter gjennom glødende oligopar. De positive koloniene kan oppdages gjennom bestemte primerpar veiledet PCR (figur 3). Et 440 bp DNA fragment fra sauer DKK2 exon 1 ble subcloned i pSSA-Dual plasmid15 ved hjelp av dobbel fordøyelse med AscI og SalI, noe som resulterer i pSSA-Dual-DKK2. Genmålrettingskapasiteten til pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 og pX330-xCas9-T3 ble simutanusly oppdaget (figur 5), og deretter ble den siste sgRNA-vektoren identifisert som den relativt bedre, som vi plukker opp for sauegenredigeringsforskning ved neste trinn.
Denne deteksjonsmetoden kombinerer en enkelt tråd glødemekanisme (SSA) (figur 1B og figur 4) med et luciferase rapportgen for å overvåke DNA-skjæreeffektiviteten. Som illustrert i figur 4er SSA en prosess initiert når en dobbel trådpause gjøres mellom to gjentatte sekvenser orientert i samme retning. Enkelt tråd regioner er opprettet ved siden av pauser som strekker seg til de gjentatte sekvenser slik at komplementære tråder kan gløde til hverandre. Denne glødende mellomliggende kan behandles ved å fordøye bort de enkle strandede haler og fylle hullene. Dual-Luciferase Reporter genet omfatter hovedsakelig luciferase gener fra firefly Photinus pyralis og fra Renilla reniformis (også kjent som sjøpansy). Aktivitetene til firefly og renilla luciferases måles sekvensielt fra en enkelt prøve. Når anerkjennelsesområdet som har oppsigelseskodonen ikke kuttes i midten, blokkeres genet i SSA-systemet og kan ikke oversettes til et funksjonelt protein. Når behandlingen finner sted, vil SSA-systemet slå sammen den homologe sekvensen automatisk, og overlappende sekvenser blir en enkelt sekvens, genet blir rekombinasjon reparert og kan deretter leses gjennom å produsere et funksjonelt protein.
Figur 1: Skjematisk representasjon av de ulike trinnene i kloningsprosessen.
(A) Skjematisk av sgRNA vektor konstruksjon, tilpasset fra protokollene til Feng Zhang Lab.(B) Skjematisk av dual luciferase reporter vektor bygging (velg vektor pSSA-DKK2 som et eksempel), DNA fragmenter Rluc-, Rluc-2 og Rluc-3 representerer tre deler av full lengde koding sekvens av Renilla luciferase. MCS representerer "multiple kloning nettsted". Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Predigesting vektor ryggraden pX330-xCas9 med BbsI.
1: DNA-markør, 2: pX330-xCas9 plasmid, 3: pX330-xCas9 plasmid fordøyd med BbsI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Spesifikke primerpar veiledet PCR for DKK2-T1 sgRNA vektordeteksjon.
Lanes 1-7 indikerer PCR-bånd for 7 forskjellige bakteriekolonier separat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjemaer for en tråd annealing (SSA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Dobbel luciferase analyse med reporter vektor pSSA-DKK2 i cellelinje PIEC.
Ranilla luciferase luciferase-aktivitetene er signifikant indusert (P<0,01, Studentens t-test) i PIEC ved å overeksponere pX330-xCas9-T1, pX330-xCas9-T2 eller pX330-xCas9-T3 med foldendringen på henholdsvis 3,15, 5,84 eller 13,10. Feilfeltene angir standardavvik (SD)(n=3) for hver gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| navn | Genomiske DNA-mål (5'-3') | SgRNA Oligos (5'-3') | ||
| T1 | TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG | T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC | ||
| T1-R: AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC | ||||
| T2 (andre personer) | ATCAAGTCCTCTCTGGGCGGGG | T2-F: CACCGATCAAGTCCTCTCTGGGCGG | ||
| T2-R: AAACCCGCCCAGAGAGGACTTGATC | ||||
| T3 (andre personer) | GCCCGCGAGCTGCCGAACTGTG | T3-F: CACCGCCCGCGAGCTGCCGAACTG | ||
| T3-R: AAACCAGTTCGGCAGCTCGCGGGC | ||||
Tabell 1: SgRNA mål og oligos designet for genredigering av sauer DKK2.
| PCR-komponent | 25 μL reaksjon |
| 10 μM fremover primer (f.eks T1-F) | 1 μL |
| 10 μM omvendt primer bbsi-r | 1 μL |
| 10x PCR-buffer | 2,5 μL |
| 2,5 mM dNTPs | 1 μL |
| bakteriell væske | 1 μL |
| DNA Taq Polymerase | 2.5 enheter |
| Kjernefritt vann | Opptil 25 μL |
Tabell 2: PCR-blanding for sikker bakteriell kolonier deteksjon.
| Reagent | Volum |
| pSSA-Dual vektor (syntetisert DNA fragment eller PCR-produkt) | 1-2 μg |
| CutSmart Buffer | 5 μL |
| Åsen | 1 μL |
| Sali-HF | 1 μL |
| Destillert vann | opptil 50 μL |
| Totalt volum | 50 μL |
Tabell 3: Dobbel fordøyelse av pSSA-Dual vektor og syntetisert DNA fragment (eller PCR produkt).
| Reagent | Volum |
| pSSA-Dual vektor (predigested) | 0,5 μg |
| DNA-fragmenter som inneholder sgRNA-målene (forutfordrt) | 0,2 μg |
| T4 DNA Ligase Buffer (10x) | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
| Destillert vann | opptil 10 μL |
| Totalt volum | 10 μL |
Tabell 4: En ligation reaksjon av DNA-fragmenter som inneholder sgRNA mål i en predigested pSSA-Dual vektor.
| Trinn 1: Reagenspreparat | |
| Transfection reagens | 2 μL |
Tabell 5: Detaljer om celletransfeksjon i en 24 brønnplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SgRNA vektor kloning prosedyrer vi har beskrevet her forenkler effektiv produksjon av sgRNAs, med de fleste kostnadene avledet fra oligonucleotide bestilling og vektor sekvensering. Mens den skisserte metoden er utformet for å tillate brukere å generere sgRNAs for bruk med CRISPR / Cas9, kan protokollen enkelt tilpasses for bruk med Cas9 orthologues eller andre RNA-guidede endonukleærer som Cpf1, og introduserer mindre modifikasjoner til vektor ryggraden og oligonucleotide overhengende sekvenser.
Protokollen som er skissert ovenfor vil gi et foretrukket sgRNA-mål om 10 dager når du starter med riktig utformede oligonucleotides. Dette inkluderer sgRNA design (1 t, trinn 1 - 2), fortynning, aliquot og annealing av oligonucleotides (30 min, trinn 3), fordøyelse og rensing av sgRNA uttrykk vektor (3 h, trinn 4), kloning av sgRNA oligonucleotides i en predigested tom vektor (over natten, trinn 5 - 6), PCR deteksjon av koloniene (4-5 h, trinn 7) og validering av sekvensen av sgRNA uttrykket plasmid (24 h , trinn 8). I mellomtiden tar konstruksjonen og sekvensvalideringen av dual luciferase reportervektor 5 - 7 d (trinn 9). Utarbeidelsen av cellelinjen, plasmidtransfection og dobbel luciferase deteksjon tar ca 48 h (trinn 10 - 11). Feilratene for å generere hver plasmid er nesten 0.
Det mest kritiske trinnet i protokollen er den restriktive enzymfordøyelsen av sgRNA vektor av enzymer som BbsI. Hvis fordøyelsen ikke er tilstrekkelig, kan den positive frekvensen av bactera kolonier være svært lav. Mens pcr-basert deteksjon tilnærming kan følsomt overvåke fordøyelsen effektivitet og positiv hastighet. De fremre primere, tidligere brukt som fremover oligos av det innsatte sgRNA fragmentet, sikret svært effektiv forskjell av riktige innsettinger og tomme vektorer. En av fordelene med denne strategien er nettopp effektiv påvisning av de positive koloniene av PCR før DNA sekvensering. Som nevnt ovenfor er sekvensverifisering fortsatt relativt dyrere sammenlignet med PCR, spesielt når ufullstendig fordøyelse av BbsI oppstår. Når det gjelder ressursbesparende, paret vi de fremre oligos for sgRNA fragment annealing (for eksempel T1-F, T2-F eller T3-F) med sekvensering primer BbsI-R for PCR forsterkning. Mer enn 500 sgRNA vektorer har blitt vellykket konstruert i laboratoriet gjennom denne strategien for koloni identifikasjon.
En annen fortjeneste av protokollen er effektiv forhåndsvalg av kandidat sgRNA mål ved hjelp av dual luciferase reporter system. Stor varians av kutte effektivitet faktisk eksisterer på ulike sgRNA mål4. Å identifisere et svært effektivt sgRNA-mål ved T7E1-analyse eller Surveyor-kjerneanalyse1 i en vanskelig å transfisere cellelinje er tid og arbeidskrevende. I tillegg, for PCR-forsterkning i T7E1-analysen eller Surveyor-kjernen analyse, er det noen ganger vanskelig å spesifikt forsterke målsekvensen i genom-DNA på grunn av mangel på passende primerpar1. I motsetning er den doble luciferase reporteranalysen uavhengig av genomforsterkningsprosedyrer. Tidligere har vi brukt denne metoden for å få svært aktive sgRNAs16,19.
Til tross for de klare fordelene med metoden som er beskrevet i dette arbeidet, er det også noen begrensninger som må påpekes. Selv om det sikrer en høy suksessrate, kan den luciferase-baserte metoden for sgRNA-valg foreslått være dyrere enn andre tilnærminger (landmåler / høyoppløselig smelteanalyse, etc.) på grunn av behovet for å syntetisere målsekvensen. I tillegg er denne tilnærmingen ikke raskere enn noen av disse alternative metodene på grunn av behovet for å klone reporteren plasmid hvis en lett-å-transfect cellelinje vil bli utført for genmålretting. Det er også nødvendig å klargjøre at metoden er egnet for å lage knockouts, men ikke å redigere spesifikke nukleotider. I tillegg kan bare dobbelttrådet pauser og ikke enkelttrådet pauser evalueres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av First Class Grassland Science Discipline Program i Shandong-provinsen (Kina), National Natural Science Foundation of China (31301936, 31572383), Spesialfondet for agrovitenskapelig forskning i offentlig interesse (201403071), Nasjonalt risikovurderingsprosjekt for melkeproduktkvalitet og -sikkerhet (GJFP201800804) og prosjekter av Qingdao People's Livelihood Science and Technology (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
- Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
- An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. Li, K., et al. , 201210509946.1 (2012).
- Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
- A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. Li, H., et al. , 201510398717.0 (2015).
