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Genetics

डिजाइन स्वचालित, उच्च throughput, सतत सेल विकास प्रयोग eVOLVER का उपयोग

Published: May 19, 2019 doi: 10.3791/59652
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 4, 1,2,5
1Biological Design Center, Boston University, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Boston University, 4Department of Bioengineering, Rice University, 5Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University

Summary

EVOLVER ढांचे के उच्च गति के साथ निरंतर माइक्रोबियल संस्कृति उच्च प्रवाह और प्रयोगात्मक मापदंडों पर गतिशील नियंत्रण सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है कि कैसे एक जटिल फिटनेस प्रयोग आचरण प्रणाली लागू करने के लिए, कई व्यक्तिगत संस्कृतियों पर स्वचालित नियंत्रण प्रोग्रामिंग पर उपयोगकर्ताओं मार्गदर्शक, मापने, संग्रह, और वास्तविक समय में प्रयोगात्मक डेटा के साथ बातचीत ।

Abstract

सतत संस् कृति पद्धतियां मात्रात्मक रूप से नियंत्रित पर्यावरणीय दशाओं के अंतर्गत कोशिकाओं को सक्षम बनाती हैं, और इस प्रकार फिटनेस फीनोटाइप के मापन के लिए और चयन द्वारा जीनोटाइप के आकार के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए मोटे तौर पर उपयोगी हैं । विकसित और आला सतत संस्कृति उपकरणों को लागू करने के लिए व्यापक हाल के प्रयासों कोशिका संस्कृति नियंत्रण के नए रूपों के संचालन के लाभों से पता चला है । यह कस्टम चयन दबाव और लंबी अवधि के प्रयोगात्मक विकास से जीनोम व्यापक पुस्तकालय चयन और सिंथेटिक जीन सर्किट लक्षण वर्णन को लेकर अध्ययन के लिए वृद्धि throughput परिभाषित शामिल हैं । EVOLVER मंच हाल ही में इस बढ़ती मांग को पूरा करने के लिए विकसित किया गया था: scalability, लचीलापन, और स्वचालन के एक उच्च डिग्री के साथ एक सतत संस्कृति मंच । eVOLVER एक मानकीकृत मंच है कि किया जा सकता है प्रदान करता है (आरई)-विंयस्त और ंयूनतम प्रयास के लिए उच्च throughput या बहुआयामी विकास चयन प्रयोगों के कई विभिंन प्रकार के प्रदर्शन के साथ पहुंचा । यहां, एक प्रोटोकॉल के लिए eVOLVER फ्रेमवर्क प्रणाली को विंयस्त करने के लिए एक कस्टम, बड़े पैमाने पर सतत विकास प्रयोग आचरण के उपयोगकर्ताओं को उपलब्ध कराने के लिए प्रस्तुत किया है । विशेष रूप से, प्रोटोकॉल कैसे मल्टीप्लेक्स दो चयन दबाव के लिए प्रणाली प्रोग्राम-तापमान और परासारिता-कई evolver शीशियों भर में आदेश saccharomyces cerevisiae म्यूटेंट के फिटनेस परिदृश्य को ठीक पर परिनिर्धारित करने के लिए पर उपयोगकर्ताओं गाइड संकल्प. हम कैसे युक्ति दोनों प्रोग्राम के माध्यम से विंयस्त किया जा सकता है दिखाने के लिए, अपने खुले स्रोत वेब आधारित सॉफ्टवेयर के माध्यम से, और शारीरिक रूप से, fluidic और हार्डवेयर लेआउट की व्यवस्था द्वारा । शारीरिक रूप से उपकरण की स्थापना, संस्कृति दिनचर्या प्रोग्रामिंग, निगरानी और इंटरनेट पर वास्तविक समय में प्रयोग के साथ बातचीत की प्रक्रिया, बाद में ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए नमूना शीशियों, और पोस्ट प्रयोग डेटा विश्लेषण विस्तृत हैं । यह विभिंन विषयों में शोधकर्ताओं के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करने के लिए अपने स्वयं के जटिल और उच्च throughput सेल विकास प्रयोगों के डिजाइन में eVOLVER लागू करने के लिए अध्ययन और जैविक प्रणालियों में हेरफेर करना चाहिए ।

Introduction

सतत सेल संस्कृति तकनीक, पहले लगभग ७० साल पहले विकसित1,2, हाल ही में एक पुनरुद्धार3,4का आनंद ले रहे हैं । यह कारकों का एक संगम के कारण है । सबसे पहले, उच्च throughput-omics तकनीक है, जो इसे पढ़ने के लिए और जीनोटाइप5,6की बड़ी संख्या पैदा संभव बना दिया है के विकास, प्रयोगात्मक तकनीकों के लिए एक सहवर्ती मांग पैदा की है कि सुविधा अच्छी तरह से नियंत्रित सेल विकास और phenotyping । इस उद्देश्य के लिए, सतत संस्कृति एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करने के लिए आकस्मिक जीनोमिक अग्रिमों पर कैपिटल । ठीक नियंत्रित (और गतिशील) पर्यावरणीय दशाओं में सेलुलर आबादी पर विकास चयन/प्रयोग को सुगम बनाकर, सतत संस्कृति, जीनोटाइप्स को फीनोटाइप7,8, को कड़ाई से मैप करने का साधन प्रदान करती है । प्रमाणात्मक रूप से अभियांत्रिक उपभेदोंऔर जीवों को चित्रित किया गया है, और10,11,12के प्रयोगशाला विकास अध्ययनों में अनुकूली आनुवंशिक परिवर्तन ट्रैक करें ।

दूसरा, सुलभ इस तरह के additive विनिर्माण और खुले स्रोत हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर तत्वों के रूप में उपलब्ध प्रोटोटाइप तकनीकों के हाल के उद्भव, उपयोगकर्ताओं के एक व्यापक सेट डिजाइन और सतत संस्कृति प्रणाली के अपने स्वयं के लागत प्रभावी रूपों का निर्माण करने के लिए सक्षम किया गया है सीधे प्रयोगशाला में । यह सब करने का एक रोमांचक सरणी के लिए नेतृत्व किया है, यह अपने आप (DIY) उपकरणों है कि इस तरह के chemostat13के रूप में सतत संस्कृति functionalities, प्रदर्शन, turbidostat14, या morbidostat15. दुर्भाग्य से, हालांकि विशिष्ट (आला) समस्याओं के लिए जो वे डिजाइन किए थे संबोधित में सफल, इन तदर्थ समाधान आम तौर पर throughput और/

EVOLVER प्रणाली एक एकल मंच है कि सतत संस्कृति की बढ़ती प्रयोगात्मक जरूरतों को समायोजित कर सकते है और गति और आपात जीनोमिक तकनीक16 (चित्र 1क) के पैमाने पर मैच बनाने के लक्ष्य के साथ बनाया गया था । है evolver डिजाइन लागू आम सिद्धांतों अंय17विषयों, मानकीकृत पैरों के निशान, मॉड्यूलर घटकों, और खुले स्रोत डिजाइन सिद्धांतों सहित से उच्च स्केनीय प्रौद्योगिकियों अंतर्निहित । इस प्रकार, नए आला अनुप्रयोगों के लिए समाधान प्रणाली के लिए प्रमुख संशोधनों के बिना डिजाइन किया जा सकता है । अत्यधिक मॉड्यूलर और खुले स्रोत wetware, हार्डवेयर, इलेक्ट्रॉनिक्स, और वेब आधारित सॉफ्टवेयर के शामिल, eVOLVER पहली स्वचालित सतत संस्कृति प्रणाली है कि लागत प्रभावी ढंग से किया जा सकता है और आसानी से फिर से कॉंफ़िगर करने के लिए वस्तुतः किसी भी प्रकार के बाहर ले उच्च थ्रूपुट विकास प्रयोग । मॉड्यूलर और प्रोग्राम स्मार्ट आस्तीन जो घर सभी सेंसरों और व्यक्तिगत संस्कृतियों को नियंत्रित करने की जरूरत actuators के माध्यम से, eVOLVER विशिष्ट दोनों throughput और संस्कृति की स्थिति के व्यक्तिगत नियंत्रण की स्केलिंग सक्षम बनाता है । इसके अलावा, के रूप में एक वेब आधारित मंच, eVOLVER का आदान प्रदान डेटा और वास्तविक समय में दूरदराज के कंप्यूटरों के साथ जानकारी, व्यक्तिगत संस्कृतियों के सैकड़ों की एक साथ निगरानी की अनुमति और स्वचालित संस्कृति perturbations मनमाने ढंग से परिभाषित नियंत्रण के माध्यम से एल्गोरिदम.

पिछले काम में16, evolver के मजबूत प्रदर्शन के आपरेशन के सैकड़ों घंटे से अधिक लंबी अवधि के प्रयोगों में प्रदर्शन किया गया था, और इसकी क्षमता ई. कोलाई और एस cerevisiae से गैर-पालतू करने के लिए विभिन्न जीवों, खेती करने के लिए रोगाणुओं. विशिष्ट विकास चयन प्रयोगों की एक श्रृंखला है, जिसमें प्रोग्राम के माध्यम से परिभाषित बहुआयामी चयन gradients व्यक्तिगत संस्कृति शर्तों और जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर स्वास्थ्य परिदृश्य की एक सरणी भर में लागू किया गया मात्रा निर्धारित. यहां, उद्देश्य कैसे प्रणाली का उपयोग करने के लिए डिजाइन और प्रयोगों के इन प्रकार के विवरण के साथ eVOLVER उपयोगकर्ताओं को प्रदान करना है । एक व्याख्यात्मक उदाहरण के रूप में, एक दो आयामी पर्यावरण तापमान और परासरणी तनाव से बना ढाल भर में एस cerevisiae म्यूटेंट के फिटनेस परिदृश्य बढ़ाता तरीकों प्रस्तुत कर रहे हैं । प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को इस प्रयोग के लिए evolver ढांचे को विंयस्त के माध्यम से गाइड दोनों प्रोग्राम के माध्यम से, 16 समानांतर सतत संस्कृतियों में से प्रत्येक के लिए अनुकूलित आविलता और तापमान नियंत्रण दिनचर्या सेट करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करने में, और शारीरिक रूप से, fluidics लेआउट के माध्यम से विभिन्न नमक सांद्रता के उचित मार्ग medias. इस प्रोटोकॉल evolver को विन्यस्त करने के लिए विभिन्न अध्ययनों और विषयों के लिए स्वचालित सतत संस्कृति प्रयोगों की एक विस्तृत विविधता को निष्पादित करने के लिए एक सामान्य शीर्ष के रूप में सेवा करनी चाहिए.

Protocol

1. मीडिया, शीशियों, और Inoculum तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल मानता है उपयोगकर्ताओं को पहले से ही eVOLVER सिस्टम calibrated है और पहले काम16में वर्णित स्मार्ट आस्तीन विंयास का उपयोग कर रहे हैं । स्मार्ट आस्तीन आसानी से बदल दिया या संशोधित कर रहे हैं, लेकिन मात्रा और नियंत्रण मापदंडों के सेटअप विवरण वैकल्पिक विन्यास के लिए अलग हो सकता है.

  1. प्रयोग से पहले दिन, एस cerevisiae के 2 मिलीलीटर रातोंरात तरल संस्कृतियों BY4741 संदर्भ तनाव और ypd मीडिया (खमीर Peptone डेक्सट्रोज) में 30 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर सेट में कम से ३०० r.p. m ।
  2. साफ, autoclaved टयूबिंग के साथ लगे बोतलों में बाँझ YPD मीडिया हस्तांतरण । वैकल्पिक रूप से, मीडिया की बोतलों में सीधे autoclaved किया जा सकता है पूर्व टयूबिंग के साथ लगे ।
    नोट: बोतलें टोपी में एक छेद ड्रिलिंग और यह जगह में सुरक्षित करने के लिए connectors के साथ यह माध्यम से चल टयूबिंग द्वारा टयूबिंग के साथ फिट हैं । सामग्री तालिकादेखें ।
  3. एक शीशी के लिए एक शीशी और पेंच के लिए हलचल बार जोड़ें प्रवाह और बहाव तिनके से सुसज्जित है । सुनिश्चित करें कि सभी घटकों दृश्य निरीक्षण द्वारा साफ कर रहे हैं ।
  4. एक autoclavable रैक में शीशियों प्लेस, पंनी के साथ कवर, और एक गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम चक्र पर आटोक्लेव एक 20-min नसबंदी कदम के साथ ।

2. एक प्रयोग की स्थापना

  1. तीन बड़े बीकर्स में ५०० मिलीलीटर 10 प्रतिशत ब्लीच, २०० मिलीलीटर 10 प्रतिशत ब्लीच, और ३०० मिलीलीटर का ७० प्रतिशत एथेनॉल तैयार करें ।
  2. EVOLVER डिवाइस पर स्विच का उपयोग करना, eVOLVER पर 5 V बिजली की आपूर्ति पर बारी, 5 एस के लिए रुको, तो 12 वी बिजली की आपूर्ति चालू करें ।
  3. एक ही मीडिया की बोतल से कई शीशियों चल रहा है, ट्यूबिंग splitters के साथ कई मीडिया इनपुट लाइनों कनेक्ट । कस्टम टयूबिंग splitters Luer घटकों के साथ निर्माण किया जा सकता है ।
  4. मीडिया इनपुट पंक्तियाँ पहले ब्लीच बीकर में, और मीडिया बहिस्राव पंक्तियाँ दूसरी ब्लीच बीकर में submerge. प्रवाह के अंत में मीडिया इनपुट लाइनों के दूसरे बीकर में बहाव लाइनों के साथ रखें । अपशिष्ट carboy में जगह अपशिष्ट लाइनों ।
  5. ब्लीच के 1-2 एल बड़े खाली बेकार काबोइ, जो प्रयोग के दौरान उत्पंन कचरे जाएगा में जोड़ें । कचरे का उचित निपटान सुनिश्चित करने के लिए एक सुरक्षा समन्वयक से परामर्श करें ।
  6. EVOLVER पर टचस्क्रीन का उपयोग करना, सेटअप अनुभाग में नेविगेट, और 10% ब्लीच के साथ द्रव लाइनों को भरने के लिए 20 एस के लिए सभी पंपों को चलाने के लिए । रनिंग करते समय, दृश्य निरीक्षण द्वारा सुनिश्चित करें कि सभी लाइनें भर गई हैं और पंप सामान्य रूप से काम कर रहे हैं । ब्लीच की अनुमति के लिए लाइनों में बैठने के लिए ंयूनतम 30 मिनट के लिए ।
  7. भागो पंपों फिर touchscreen अनुप्रयोग का उपयोग कर जब तक लाइनों नहीं रह डूबे हुए हैं, लाइनों के माध्यम से हवा धकेलने के रूप में संभव के रूप में बाहर ब्लीच के ज्यादा मिलता है ।
  8. प्लेस मीडिया इनपुट लाइनों में इथेनॉल बीकर और के रूप में ऊपर में दोहराने, इथेनॉल के साथ लाइनों को भरने और हवा के साथ फ्लशिंग ।
    नोट: के रूप में इथेनॉल जल्दी मारता है, कोई नसबंदी के लिए 30 मिनट इंतजार करने की जरूरत है ।
  9. मीडिया की बोतलें luer कनेक्टर्स के साथ मीडिया इनपुट लाइनों देते हैं और मीडिया पूरी तरह से लाइनों के माध्यम से चलाता है जब तक पंपों चलाने, किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल बाहर निस्तब्धता.
  10. आंशिक रूप से eVOLVER स्मार्ट आस्तीन में निष्फल शीशियों डालें और उचित पदों के लिए लाइनों को हुक, रंग लाइनों पर कोडिंग के अनुसार । कम बाढ़ भूसे के लिए इनपुट लाइनों संलग्न द्वारा शुरू, और फिर लंबे समय से बहाव भूसे के लिए लाइनों बर्बाद.
    चेतावनी: ढीले कनेक्शन या गलत रूट किए गए लाइनों के लिए जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऐसा करने में विफलता ओवरफ्लो कारण और संभावित स्मार्ट आस्तीन नुकसान होगा ।
  11. 10 एस वेतन वृद्धि में सभी पंपों मीडिया के साथ शीशियों को भरने के लिए चलाते हैं । दृश्य निरीक्षण के द्वारा सुनिश्चित करें बहि: स्राव पंपों कुशलतापूर्वक दूर कर रहे है के माध्यम से बहाव straws, overflows को रोकने के लिए मीडिया । यदि बहाव तिनके कुशलता से काम कर रहे प्रतीत नहीं होता है, fluidic लाइन कनेक्शन और सिकुड़नेवाला पंप का निरीक्षण किया । सही या भागों की आवश्यकता के रूप में बदलें ।
  12. जब तक पूरी तरह से स्मार्ट आस्तीन द्वारा encased नीचे शीशियों धक्का ।
  13. प्रयोगात्मक पैरामीटर्स के लिए प्रारंभिक शर्तें सहभागी सेटअप पृष्ठ पर eVOLVER टचस्क्रीन का उपयोग कर सेट करें । सभी शीशियों के लिए, तापमान सेट करने के लिए 30 ° c और हलचल करने के लिए 10. यह सभी शीशियों के लिए एक बार में टचस्क्रीन भर में एक उंगली खींचकर सभी पायलों का चयन करने के लिए किया जा सकता है ।

3. eVOLVER सॉफ्टवेयर और प्रोग्रामिंग एल्गोरिथम संस्कृति दिनचर्या को विंयस्त

  1. कंप्यूटर पर eVOLVER डैशबोर्ड में, प्रयोग प्रबंधक पृष्ठ पर नेविगेट करें. प्रयोग नेविगेटर पैनल या एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में एक मौजूदा प्रयोग में आधार प्रयोग का चयन करें और नया क्लोन करें
    नोट: जहां प्रायोगिक परिभाषा प्रयोग प्रबंधक में सहेजी जाती है, वहां GitHub लिंक को रेपो में चिपकाकर अंय समूहों के प्रयोगों का उपयोग करना संभव है ।
  2. प्रयोग नाम और eVOLVER युक्ति है कि प्रयोग पर चलाया जाएगा निर्दिष्ट करें । सुनिश्चित करें कि इच्छित अंशांकन सेटिंग्स पृष्ठ पर इन फ़ील्ड्स को संशोधित करके चयनित किया गया है ।
  3. प्रायोगिक स्थितियों को सेट करने के लिए शीशी चयनकर्ता और पैरामीटर परिभाषा फलक का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, 0-4 30 डिग्री सेल्सियस के लिए शीशियों के लिए तापमान सेट करने के लिए, शीशी चयनकर्ता में शीशियों का चयन करें, 30 के लिए पैरामीटर परिभाषा सेट, और सेटपर क्लिक करें । प्रत्येक शीशी के लिए एक ऊपरी और निचली दहलीज सेट करने के लिए आयुध डिपो के लिए इस दोहराएं ।
  4. प्रायोगिक पैरामीटर परिभाषाएं पूर्ण होने के बाद, सहेजें क्लिक करके प्रयोग सहेजें और चलाएं प्रारंभ क्लिक करें ।

4. वास्तविक समय में प्रयोग और निगरानी की शुरुआत

  1. प्रयोग चल रहा है एक बार, इंटरैक्टिव डैशबोर्ड में वास्तविक समय डेटा पैनल के लिए नेविगेट. प्रत्येक शीशी के लिए, कि आयुध डिपो मूल्यों शूंय पर पकड़ रहे है की जांच करें, और है कि तापमान पर या रेखांकन के माध्यम से ब्राउज़िंग द्वारा क्रमादेशित स्तर की दिशा में प्रगति कर रहे हैं ।
  2. संरोप तैयार करने के लिए, रातोंरात संस्कृतियों के आयुध डिपो को मापने, 25 मिलीलीटर की शीशी की मात्रा को संभालने वांछित गुना कमजोर पड़ने की गणना, और नमूना बंदरगाह के माध्यम से शीशियों में संरोप के पिपेट की मात्रा की गणना । उदाहरण के लिए, के बारे में एक वांछित शुरू करने के लिए ०.०५ की संस्कृति की शीशी में रात भर संस्कृतियों है कि आयुध डिपो २.०, कोशिकाओं के ६२५ μL में है के बारे में प्रारंभ OD प्रत्येक शीशी में जोड़ा जाना चाहिए ।
  3. डैशबोर्ड पर रेखांकन की जांच करने के लिए देखने के लिए कि ओडी रेखांकन तदनुसार अद्यतन किया गया है । एक वृद्धि के पास वांछित शुरू OD रेखांकन में देखा जाना चाहिए ।
  4. अलग डेटा प्रकार (जैसे OD, तापमान, विकास दर, पीढ़ियों, और मीडिया की खपत) के प्रयोग के दौरान डैशबोर्ड में इसी रेखांकन के माध्यम से ब्राउज़िंग द्वारा ट्रैक । ये मान उपयोगकर्ता द्वारा प्रयोगात्मक निर्णयों को सूचित कर सकते हैं (उदा. शेड्यूल टाइमपॉइंट) या स्वचालित फ़ीडबैक करने के लिए फ़ंक्शंस में भी उपयोग किया जाता है.
  5. मीडिया बोतलें मध्य प्रयोग को प्रतिस्थापित करने के लिए, प्रयोग प्रबंधक पैनल में होने से पंप घटनाओं को रोकने के लिए प्रयोग रोकें । जल्दी खाली बोतल से मीडिया लाइन खोलना और नई बोतल से कनेक्ट । संदूषण को रोकने के लिए टयूबिंग के सिरों को छूने से बचें । प्रयोग प्रबंधक में प्रयोग फिर से शुरू करें ।

5. नमूनाकरण से यीस्ट शीशियों के नमूने खमीर कोशिकाओं

  1. प्रोटीन संश्लेषण को बाधित करने के लिए एक cycloheximide समाधान तैयार करने और प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण के लिए खमीर कोशिकाओं को ठीक । एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली में, 5 एस के लिए 12 मिलीलीटर पीबीएस और 12 μL 20 मिलीग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सामाइड और भंवर जोड़ें ।
  2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, aliquot १०० μl एक ९६-अच्छी तरह गोल नीचे थाली के प्रत्येक में अच्छी तरह से ।
  3. बाहर प्रकाश ब्लॉक और जरूरत जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए एल्यूमीनियम पंनी में थाली लपेटें ।
  4. नमूना करने के लिए, विस्तृत लंबाई २०० μl युक्तियों का उपयोग शीशी ढक्कन पर नमूना बंदरगाह के माध्यम से पिपेट ।
  5. पिपेट १०० μL एक शीशी से एक अच्छी तरह से निर्धारण प्लेट में, 2-3x मिश्रण ऊपर और नीचे pipette द्वारा, तो पंनी में ठीक हो और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली वापस ।

6. प्रयोग टूट और साफ

  1. तैयार 10% ब्लीच के 1 एल और २ ५०० मिलीलीटर DI पानी समाधान बड़े beakers में ।
  2. प्रयोग प्रबंधक पैनल में stop आदेश भेजकर प्रयोग रोकें । डेटा अभी भी क्लाउड-सक्षम डेटाबेस में संग्रहीत है, और अभी भी डैशबोर्ड के रीयल-टाइम डेटा पैनल में बाद में देखा जा सकता है या ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए डाउनलोड किया गया है ।
  3. स्मार्ट आस्तीन से शीशियों को निकालें और उन्हें एक ऑटोक्लेव रैक में जगह बाद के चरणों में ओवरफ्लो से बचने के लिए.
  4. मीडिया की बोतलों से मीडिया इनपुट लाइनों खोलना और उंहें 10% ब्लीच के बीकर में जगह है । लाइनों और शीशियों को करने के लिए सेटअप के रूप में eVOLVER उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस से पंपों भागो ।
  5. शीशियों से लाइनें डिस्कनेक्ट करें और DI पानी में पंक्तियाँ डूब. पंप चलाने के लिए सभी ब्लीच प्रणाली के बाहर DI पानी के साथ पहले फ्लश, तो हवा के साथ ।
  6. पहले 12 वी बिजली की आपूर्ति बंद स्विचन द्वारा eVOLVER बंद करें, 5 एस इंतज़ार कर रही है, और फिर बंद 5 वी बिजली की आपूर्ति ।
  7. भिगोएं 10% ब्लीच में बार और टोपियां हलचल, तो DI पानी के साथ कुल्ला । उन के माध्यम से DI पानी चलाकर प्रत्येक टोपी के प्रवाह और बहाव तिनके का कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें । टेस्ट ट्यूब ब्रश का उपयोग कर अगर फिल्म दीवारों पर बना दिया है स्क्रब शीशियों ।
  8. अपशिष्ट का उचित निपटान करें और अपशिष्ट कंटेनरों को अच्छी तरह से खंगाल लें ।
    चेतावनी: अपशिष्ट कंटेनरों 10% ब्लीच, निष्फल कोशिका संस्कृति अपशिष्ट का मिश्रण होते हैं, और इथेनॉल की मात्रा का पता लगाने जाएगा । उचित हैंडलिंग और निपटान के लिए एक सुरक्षा समंवयक से परामर्श करें ।

7. परिमात्रा फिटनेस का उपयोग करते हुए भिंनात्मक आबादी का प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण

  1. उचित प्रतिदीप्ति चैनल और डिटेक्टरों16के साथ सुसज्जित प्रवाह cytometer का उपयोग कर धारा 5 से एकत्र नमूनों का विश्लेषण ।
  2. प्रति नमूना, और आगे और साइड स्कैटर डेटा का उपयोग करते हुए अक्षुण्ण कक्षों के लिए गेट के लिए न्यूनतम १०,००० ईवेंट्स प्राप्त करें ।
  3. प्रत्येक जनसंख्या के भिंनात्मक वितरण को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त प्रतिदीप्ति चैनल (उदा. जीएफपी) पर आधारित गेट ।
  4. किसी कंप्यूटर पर, "निर्यात करें" बटन क्लिक करके प्रयोग प्रबंधक पृष्ठ से इच्छित स्थान पर डेटा सहेजें ।
  5. EVOLVER डेटा फ़ाइलों से, प्रत्येक शीशी के लिए प्रत्येक timepoint द्वारा पूरा पीढ़ियों की संख्या निर्धारित करते हैं । EVOLVER कोड में, पीढ़ियों प्रत्येक कमजोर पड़ने घटना के बीच आयुध डिपो डेटा पहले segmenting द्वारा गणना कर रहे हैं, तो प्रत्येक खंड प्रत्येक खंड के लिए फार्म Equation 1 का एक बुनियादी घातीय के साथ फिट है, आर, विकास दर16। एक समय अवधि में पीढ़ियों की संख्या फिर निम्न सूत्र का उपयोग करके परिकलित की जाती है:
    Equation 2
  6. प्लॉट करने के लिए समय नमूने लिए गए थे प्रवाह कोशिका मिति डेटा से लेबल और अवेलेबल आबादी का लॉग अनुपात ऊपर की गणना से उत्पादन संख्या । रैखिक क्षेत्र की पहचान और नीचे दिए गए समीकरण के अनुसार ढलान फिट । इस ढलान सामांयतः प्रतिस्पर्धी स्वास्थ्य18,19के रूप में परिभाषित किया गया है ।
    Equation 3

Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग तापमान और लवणता के दो आयामी तनाव ढाल के पार एस. सेरेविसी के आनुवंशिक वेरिएंट के लिए फिटनेस नक्शे का निर्माण करने के लिए किया गया था । विशेष रूप से, प्रत्येक परिवर्ती विकृति के लिए, हमने विकेंद्रक का प्रयोग एक फ्लोरोसेसी-लेबल संदर्भ विकृति (एस सेरेविसिडी स्ट्रेन BY4741 एक एकीकृत संरचक मेन्यूग्रीन रिपोर्टर के साथ) में 16 विभिन्न इन तनावों के युग्म (चित्रा 1) । वेरिएंट के लिए, दो नॉकआउट उपभेदों को चुना गया था प्रत्येक के लिए एक तनाव शर्त अक्षों में से एक के प्रति संवेदनशील होने की भविष्यवाणी: ΔPRX1 जिसमें उच्च तापमान20 में फिटनेस दोष और उच्च पर फिटनेस दोषों के साथ ΔPBS2 की सूचना दी गई है । नमक सांद्रता21। एक नियंत्रण संस्करण के रूप में, एक अवेलेबल जंगली प्रकार BY4741 तनाव का उपयोग किया गया था, संदर्भ तनाव के लिए इसी तरह करने के लिए अपेक्षित । कुल मिलाकर, इन ३ ७२ घंटे के प्रतियोगिता प्रयोगों को एक ही कंप्यूटर से सभी रन तीन eVOLVER (16 शीशी) उपकरणों भर में ४८ शीशियों में एक साथ आयोजित किया गया ।

EVOLVER सहभागी डैशबोर्ड प्रत्येक प्रयोग के दौरान उत्पन्न होता है जो डेटा की बड़ी मात्रा नेविगेट करने के लिए उपयोग किया जाता है (चित्र 2a). एक एकल eVOLVER डिवाइस के सभी 16 शीशियों भर में प्रतिनिधि आयुध डिपो निशान चित्र 2bमें दिखाए जाते हैं । प्रत्येक ट्रेस एक विशेष turbidostat नियंत्रण एल्गोरिथ्म है, जो आयुध डिपो पर प्रतिक्रिया का उपयोग करता है dilutions को ट्रिगर और एक संकीर्ण घनत्व रेंज में संस्कृतियों को बनाए रखने से एक विशेषता sawtooth पैटर्न प्रदर्शित करता है (0.2-0.3 इस मामले में) । आयुध डिपो और तापमान डेटा लगातार मापा जाता है, बादल सक्षम डेटाबेस के लिए स्ट्रीम, और evolver इंटरैक्टिव डैशबोर्ड में वास्तविक समय में नवीनीकृत । निरंतर स्ट्रीम किए गए डेटा से, उच्च-क्रम मीट्रिक (उदा. विकास दर, संचई पीढ़ियों) की गणना की जा सकती है और डैशबोर्ड में प्लॉट किया जा सकता है (चित्र 2c) और यहां तक कि विभिंन चयन योजनाओं (उदा., morbidostat) में फ़ीडबैक पैरामीटर के रूप में भी उपयोग किया जाता है ।

फिटनेस नक्शे उत्पंन करने के लिए, हम दर जिस पर संदर्भ तनाव दोनों प्रवाह cytometry माप और eVOLVER विकास डेटा को शामिल करके variant तनाव outcompetes उपाय । विशेष रूप से, जनसंख्या भिंनों को प्रत्येक timepoint नमूने से प्रवाह कोशिमिति डेटा का उपयोग करते हुए संदर्भ तनाव पर भिन् न विकृति के लॉग-अनुपात के रूप में परिकलित की जाती है । प्रत्येक संस्कृति और समय बिंदु के लिए, पीढ़ियों के गुजरे संख्या प्रत्येक तनुता अवधि में evolver विकास दर डेटा से अंतर्वेशित है. लॉग-अनुपात पीढ़ियों के विरुद्ध प्लॉट करना, स्थितियों के बीच गुणात्मक अंतर उभरने के लिए शुरू (चित्र 3a) । फिटनेस की गणना करने के लिए, एक ढलान प्रत्येक प्लॉट के रैखिक भाग के माध्यम से फिट है18,19, एक मात्रात्मक फिटनेस मूल्य (दोनों हस्ताक्षर और दर के साथ) उपज है कि कैसे variant तनाव संदर्भ तनाव के खिलाफ प्रतिस्पर्धा ( चित्र 3B) । इस प्रयोग में, नकारात्मक फिटनेस मूल्यों से संकेत मिलता है कि वैरिएंट स्ट्रेन का संदर्भ स्ट्रेन से outcompeted है । सभी फिटनेस गणना से heatmaps का निर्माण दो आयामी फिटनेस परिदृश्य के दृश्य परमिट, उपभेदों और शर्तों के बीच प्रदर्शन में सूक्ष्म मात्रात्मक अंतर खुलासा (चित्रा 3C) ।

फिटनेस heatmaps से, हम देखते है कि प्रत्येक संस्करण तनाव फिटनेस दोष है कि विभिंन तरीकों से प्रकट दर्शाती है । ΔPRX1 मुख्य रूप से उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील है, लेकिन नमक तनाव एक additive प्रभाव है प्रतीत होता है, फिटनेस दोष बढ़ रही है । इसके विपरीत, ΔPBS2 मुख्य रूप से उच्च नमक सांद्रता के जवाब में फिटनेस दोष से पता चलता है, तापमान अक्ष के साथ ंयूनतम मतभेदों के साथ । इन परिणामों को विशेष रूप से कई पर्यावरणीय तनाव है, जो additive, synergistic, या epistatic प्रभाव हो सकता है की बातचीत के गूढ़ रहस्य के लिए उच्च संकल्प चयन प्रयोगों की उपयोगिता पर प्रकाश डाला ।

अंत में, यह ध्यान दें कि कुछ मामलों में, विशेष रूप से गंभीर तनाव की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है, फिटनेस गणना अतिशयोक्तिपूर्ण या विषम परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, ΔPBS2 में एक खड़ी सकारात्मक ढलान दिखाने के लिए प्रकट होता है ३९ ° c/1 एम nacl हालत संदर्भ तनाव के सापेक्ष (चित्र3 क) । यह दोनों उपभेदों, जो जंगली प्रकार डेटा में परिलक्षित होता है और इस हालत में इस विशेष मीट्रिक की उपयोगिता सीमा के गरीब विकास के लिए जिंमेदार ठहराया है । पीढ़ियों की एक अपर्याप्त संख्या के परिणाम में 1) timepoints जो ढलान फिटिंग के साथ हस्तक्षेप के गरीब जुदाई, और 2) प्रसंभाव्य प्रभाव के लिए संवेदनशीलता अंतराल चरण से उद्भव । हालांकि हमने इस अध्ययन में ऐसा करने का चुनाव नहीं किया था, लेकिन प्रयोग के दौरान eVOLVER द्वारा एकत्र किए गए वास्तविक समय के विकास के आंकड़ों का प्रयोग प्रयोग बढ़ाने के निर्णय को सूचित करने और कम प्रयास के साथ इस शर्त के लिए अतिरिक्त टाइमपॉइंट एकत्र करने के लिए किया जा सकता था । अनुवर्ती प्रयोगों में, प्रारंभिक अनुपात भी संतृप्ति होने से पहले रेखीय क्षेत्र की लंबाई बढ़ाने के लिए संग्राहक जा सकता है.


Figure 1
चित्रा 1: eVOLVER ढांचे और प्रयोगात्मक डिजाइन का अवलोकन. (क) evolver एक स्वचालित, सतत् संस्कृति मंच है, जो संस्कृति स्थितियों के बहु-प्राचल नियंत्रण की अनुमति देता है । मंच स्मार्ट आस्तीन, जो घर सेंसरों और संस्कृति की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए actuators के होते हैं, मीडिया और कचरे में और संस्कृतियों के बाहर बह के लिए एक सिकुड़नेवाला पंप सरणी, उपकरण के साथ मैंयुअल रूप से बातचीत के लिए एक touchscreen, और एक कंप्यूटर क्लाउड संरचना के साथ इंटरैक्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है, जहां प्लेटफ़ॉर्म से डेटा स्ट्रीम होता है । (B) evolver कई मायनों में विन्यस्त किया जा सकता है: शारीरिक रूप से, सेल और मीडिया आदानों के माध्यम से, और प्रोग्राम स्मार्ट आस्तीन संस्कृति शीशी मॉड्यूल को नियंत्रित एल्गोरिदम का समायोजन करके. यह बहुआयामी चयन कार्यक्रम के लिए उपयोग किया जा सकता है/उच्च संकल्प में पर्यावरण gradients, परिभाषित समय बिंदुओं पर शारीरिक रूप से एकत्र कोशिकाओं से मिलकर outputs और संस्कृति डेटा के वास्तविक समय स्ट्रीमिंग के साथ । (ग) evolver को विंयस्त करने के लिए एक द्वि-आयामी चयन ढाल भर में वृद्धि फिटनेस प्रयोग, तापमान और परासरणी तनाव से बना । eVOLVER संस्कृति शीशियों एक संदर्भ और संस्करण खमीर तनाव के समान अनुपात के साथ वरीयता प्राप्त थे । एक turbidostat दिनचर्या के लिए एक परिभाषित आयुध डिपो विंडो में चरघातांकी चरण में सभी संस्कृतियों को बनाए रखने क्रमादेशित किया गया था (ओडी 0.2-0.3) । दो स्वतंत्र तनाव ढ़ाल बनाने के लिए स्मार्ट स्लीव्स सरणी में तापमान और मीडिया की स्थिति में भिन्नता थी । बेस मीडिया ypd से बना था (2% ग्लूकोज) + १०० μg/एमएल carbenicillin + 25 μg/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल जीवाणु संदूषण के खिलाफ एक एहतियात के रूप में । 0 मीटर, ०.६ मीटर, ०.८ मीटर, या १.० मीटर की संपूरक NaCl को जोड़कर मीडिया रचनाएं भिन्न थीं. शीशी का तापमान चार में से एक मान के लिए क्रमादेशित किया गया था: 30 ° c, ३५ ° c, ३७ ° c, या ३९ ° c. (घ) संस्कृति एवं जनसंख्या के लिए कच्चे उत्पादन के उदाहरण तीन परीक्षित दशाओं से भिन्न हैं । प्रतियोगिता प्रयोग ७२ एच के लिए बनाए रखा गया था, 24 घंटे में सैंपलिंग और बाद में प्रयोग के समापन तक हर 12 घंटे । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: eVOLVER वास्तविक समय डेटा विश्लेषण डैशबोर्ड. (क) evolver डेटा संसाधित और एक इंटरैक्टिव डैशबोर्ड के लिए क्लाउड-आधारित सॉफ्टवेयर के माध्यम से वास्तविक समय में प्रदर्शित किया जाता है. डैशबोर्ड के माध्यम से, उपयोगकर्ताओं को परिभाषित करने और एक से जुड़े eVOLVER पर अपनी संस्कृति दिनचर्या आरंभ कर सकते हैं, वर्तमान में सभी eVOLVER इकाइयों भर में प्रयोग चल रहा है, और एक व्यक्ति की शीशी पर मैन्युअल रूप से प्रयोगात्मक स्थितियों में भिन्नता है या शीशियों का सेट अगर जरूरत. (ख) संपूर्ण प्रयोग अवधि के लिए परीक्षण की गई शर्तों के मैट्रिक्स में प्रत्येक शीशी के लिए ओडी निशान । निशान वास्तविक समय में देखा जा सकता है यह सुनिश्चित करने के प्रयोग के रूप में वांछित और आगे विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता पोस्ट-प्रयोग चल रहा है । (ग) विकास दर और सेल पीढ़ियों की गणना प्रयोग प्रगति को ट्रैक करने के लिए फ्लाई पर ओडी ट्रैस से की जा सकती है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फिटनेस सतहों का निर्माण । (क) कोशिका जनसंख्या भिन्न प्राकृतिक प्रवेश (परिवर्ती विकृति/संदर्भ विकृति) कोशिका पीढ़ियों के विरुद्ध रची गई । रंग चयन के तापमान को इंगित करता है जबकि डैश नमक सांद्रता भेद । (ख) संदर्भ स्ट्रेन के लिए वैरिएंट की सापेक्ष उपयुक्तता की गणना करने के लिए, एक फिटनेस मीट्रिक उस दर से प्राप्त की जाती है जिस पर पीढ़ियों के दौरान सेलुलर जनसंख्या अंश बदलता रहता है । इस मेट्रिक की गणना सेल्युलर फ़्रैक्शन प्लाटों के रैखिक क्षेत्र से न्यूनतम तीन बिंदुओं का उपयोग करके की जाती है । (ग) पर्यावरणीय दबाव ढ़ाल के ऊपर एक फिटनेस की सतह का निर्माण करने के लिए सापेक्ष फिटनेस मैट्रिक्स को heatmap में प्रदर्शित किया जाता है । ऊपर सही कोने हालत (३९ ° c/1.0 M NaCl) जंगली प्रकार और ΔPBS2 के लिए इस विश्लेषण में शामिल नहीं है के रूप में संस्कृतियों अपर्याप्त पीढ़ियों के माध्यम से चला गया (प्रतिनिधि परिणाम देखें) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

विकास चयन जीव विज्ञान में एक अनिवार्य उपकरण है, मोटे तौर पर उत्पंन करने के लिए और सेलुलर आबादी के बीच लक्षणप्ररूपी मतभेद विशेषताएं इस्तेमाल किया । जबकि बैच संस्कृतियों एक सीमित तरीके से विकास के चयन की अनुमति है, सतत संस्कृति तकनीक नाटकीय रूप से और चयन की गतिशीलता पर सटीक विनियमन exerting द्वारा नियंत्रण और इन प्रयोगों के predictability की डिग्री का विस्तार करने के लिए उत्पंन दोहराए जाने योग्य, मात्रात्मक परिणाम22। सतत संस्कृति को कड़ाई से उच्च विविधता पुस्तकालयों के लिए चयन नियंत्रण के लिए नियोजित किया गया है20,23,24,25, और प्रयोगात्मक में परिष्कृत अनुकूली व्यवस्थाओं को लागू करने और निर्देशित विकास11,12,26,27। सतत संस्कृति भी मात्रात्मक नियंत्रित स्थितियों की एक सरणी भर में कोशिकाओं के सटीक लक्षण वर्णन के लिए बेहतर जटिल आनुवंशिक प्रणालियों को समझने के लिए सक्षम बनाता है और अनुकूलित इंजीनियर bioproduction उपभेदों9,14 , २८।

हालांकि, सतत संस्कृति के लिए कोई सार्वभौमिक प्रोटोकॉल है, के रूप में चयनात्मक स्थितियों में सूक्ष्म परिवर्तन जैविक परिणामों में नाटकीय परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते है4,29,30। Experimenters चयन व्यवस्थाओं के बीच चयन और तदनुसार प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और उपकरणों के अनुकूल करने में सक्षम होना चाहिए. नियंत्रण मापदंडों के बीच एक विकल्प की पेशकश करने के अलावा, इस तरह के सिस्टम को आदर्श रूप से काफी परिष्कृत करने के लिए स्वतंत्र रूप से उच्च समानांतर प्रयोगों है कि जटिल में आदानों बातचीत समझने की जरूरत है में एक साथ कई मापदंडों का प्रबंधन होगा जैविक प्रणालियों (उदा. epistasis) । eVOLVER उपयोगकर्ताओं को सक्षम करने के लिए मनमाने ढंग से संस्कृति की स्थिति और fluidic कार्यों के बीच प्रतिक्रिया नियंत्रण के क्रम में उच्च विशेष पर्यावरण niches निर्दिष्ट करने के लिए इस चुनौती के पते ।

वर्तमान सेटअप में सीमाओं पर काबू पाने के लिए और विस्तार या नियंत्रण मापदंडों को बदलने के लिए, स्मार्ट आस्तीन आसानी से नए सेंसर या actuators जोड़ने के लिए बदल दिया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, शीशी की मात्रा को कम करने मीडिया व्यय है, जो सतत संस्कृति में महत्वपूर्ण हो सकता है कम होगा । जबकि वर्तमान डिजाइन माप और तापमान, संस्कृति आंदोलन, प्रकाश प्रेरण, turbidity, और fluidics के नियंत्रण की अनुमति देता है, अंय मानकों को बाहर की शीशियों से नमूना द्वारा मापा जाना चाहिए । वर्तमान काम में luciferase के माध्यम से एंजाइमी गतिविधि की निगरानी और evolver संस्कृतियों में भंग ऑक्सीजन और पीएच को विनियमित करने की क्षमता शामिल है । इसके अतिरिक्त, जबकि इस काम में प्रदर्शन नहीं, eVOLVER उपंयास millifluidic बहुसंकेतन उपकरणों के साथ इंटरफेस कर सकते है16 कि बड़े पैमाने पर एकीकरण के सिद्धांतों पर आकर्षित (इलेक्ट्रॉनिक्स से उद्भव और microfluidics द्वारा अपनाया) सस्ते में अधिक जटिल fluidic हैंडलिंग (जैसे बहुसंकेतन fluidic आदानों, शीशी के लिए शीशी स्थानांतरण) सक्षम करें । इन आर्द्रपात्र मॉड्यूल डिजाइन किया जा सकता है और पूरी तरह से प्रयोगशाला में निर्मित है, उपयोगकर्ताओं को रूट तरल पदार्थ के लिए प्रोग्राम द्वारा स्वचालित fluidic दिनचर्या में वाल्व के विभिंन संयोजनों ऐक्टिंग द्वारा अनुमति देता है । यह उपयोगकर्ताओं को कठोर fluidic पारंपरिक रूप से निरंतर संस्कृति में इस्तेमाल किया डिजाइनों पर काबू पाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी महंगा नियंत्रण तत्वों (जैसे सिकुड़नेवाला पंपों) की एक छोटी संख्या के साथ उच्च throughput के लिए fluidic क्षमताओं पैमाने पर । अंत में, हम एक autosampling मंच है जो इन millifluidics और DIY घटकों का उपयोग करेंगे शामिल करने की उंमीद कर रहे हैं, अब और बड़ा प्रयोग के दौरान मैनुअल बातचीत की सीमा पर काबू पाने जहां संस्कृतियों नमूना बोझिल होगा ।

प्लेटफ़ॉर्म के लिए भौतिक संशोधनों के अलावा, वेब आधारित सॉफ़्टवेयर उपयोगकर्ताओं को लिखने, संपादित करने, और कस्टम eVOLVER स्क्रिप्ट साझा करने, पूरी तरह से स्वचालित, फ़ीडबैक-सक्षम संस्कृति प्रोग्राम (उदा., turbidostat) जेनरेट करने की अनुमति देकर, स्वतंत्रता के नए अंश खोलता है. उपयोगकर्ता प्रोग्राम के जरिए एक ही चयन योजना पर सूक्ष्म विविधताओं में पैरामीटर श्रेणियों में स्वीप कर सकते हैं या परिष्कृत चयन योजनाओं की किसी भी संख्या को निर्दिष्ट करने के लिए उपन्यास संयोजनों में नियंत्रण एल्गोरिदम कनेक्ट कर सकता है । इसके अलावा, आसानी से वास्तविक समय में संस्कृतियों की निगरानी करने की क्षमता में प्रयोग किया जाता है जिस तरह से बदल देती है । रीयल-टाइम मॉनिटरिंग के साथ, उपयोगकर्ताओं को 1) रन, bioproduction अनुप्रयोगों और उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता के बीच संगतता के लिए जाँच करें, और 2) यदि आवश्यक हो तो प्रदर्शन के दौरान हस्तक्षेप, चुनौतीपूर्ण उपभेदों का निवारण करने के लिए गरीब विकास या biofilm गठन, या उपयोगकर्ता त्रुटियों का निदान (जैसे, संदूषण). अंत में, एकाधिक डेटा धाराओं के साथ एकत्र किया जा रहा है और प्रत्येक व्यक्ति की संस्कृति के लिए वास्तविक समय में व्याख्या की, eVOLVER डेटा का एक उच्च घनत्व है, जो उपंयास डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए मशीन सीखने के दृष्टिकोण की सुविधा हो सकती है उत्पंन करता है ।

परे प्रदर्शन फिटनेस लक्षण वर्णन, पुस्तकालय चयन, और प्रयोगशाला विकास के लिए उपयोग करता है, हम एकीकृत fluidics के साथ eVOLVER में कार्यांवयन के लिए परिपक्व के रूप में संबंधित क्षेत्रों के एक नंबर देखते हैं । माइक्रोबायोम नमूनों के साथ evolver प्रयोगों नियंत्रित वातावरण में समुदाय स्थिरता परख सकता है31,३२, culturomics तकनीक का उपयोग कर माइक्रोबायोम संरचना का पता लगाने३३, या गतिशील मिश्रण प्रजातियों के लिए उपनिवेशन या आक्रमण३४,३५की पारिस्थितिकी गतिशीलता पूछताछ । जैव अणु के सतत निर्देश विकास के लिए कई तरीकों को आसानी से के रूप में अच्छी तरह से26,३६,३७डिवाइस पर लागू किया जा सकता है, इन प्रणालियों की पहुंच और throughput में काफी वृद्धि. एक गतिशील, उच्च throughput प्रकृति में मीडिया संरचना, तापमान, और उपभेदों के रूप में बढ़ती स्थितियों का अनुकूलन करने की क्षमता औद्योगिक biomanufacturing आवेदन9के लिए अनुकूलन प्रयासों में सहायता कर सकते हैं. हम एक बंद पाश फैशन में माइक्रोस्कोपी और प्रवाह कोशिका मिति के रूप में अन्य विश्लेषण तकनीकों के साथ ऊर्ध्व एकीकरण को आगे कल्पना, दोनों एकल कोशिका और जनसंख्या पर सेलुलर संस्कृतियों के विकास और विश्लेषण के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली प्रदान स्तर. इसके अलावा, इस तरह के पोत सील और गैस की सामग्री को नियंत्रित करने के रूप में स्मार्ट आस्तीन करने के लिए कुछ हार्डवेयर संशोधनों के साथ, eVOLVER संभवतः इस तरह के निलंबन स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में सेल प्रकार, की एक व्यापक श्रेणी के विकास का समर्थन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । अवायवीय कोशिका संस्कृति के लिए पूरे ढाँचे को अवायवीय कक्ष में रखना भी व्यवहार्य है । आगे खोज, हम एक केंद्रीकृत बादल बुनियादी ढांचे में हमारे सॉफ्टवेयर रूपरेखा बनाने के उद्देश्य और विश्वास है कि यह उपयोगकर्ताओं को आसानी से विंयस्त करने की अनुमति होगी, विश्लेषण, और अपने डेटा को दूर से साझा करने के लिए शारीरिक रूप से प्रयोगशाला में मौजूद होने की जरूरत के बिना । एक डेटा क्यूरेटर के रूप में कार्य, बादल बुनियादी सुविधाओं को भी बड़े पैमाने पर प्रयोगों में मेटा विश्लेषण के लिए खुद को उधार दे देंगे । हमें आशा है कि eVOLVER और इन भावी अग्रिमों बहुत सतत संस्कृति में स्वचालन और नवाचार को सुविधाजनक बनाने के द्वारा संभव विकास चयन प्रयोगों के दायरे का विस्तार होगा ।

Disclosures

लेखक, ब्रेंडन जी वोंग और अहमद एस खलील, Fynch Bioscience इंक, जो eVOLVER इस अनुच्छेद में इस्तेमाल मंच विकसित के सह संस्थापक हैं ।

Acknowledgments

हम प्रणाली के डिजाइन में उसकी सहायता के लिए बी Stafford धंयवाद, और एच खलील, ए Soltanianzadeh, ए सूर्य, एस पाइप, और एक प्रणाली के निर्माण के साथ मदद के लिए Cavale । हम इलेक्ट्रॉनिक्स डिजाइन सुविधा (EDF), इंजीनियरिंग उत्पाद नवाचार केंद्र (महाकाव्य), और उनकी सेवाओं के लिए बोस्टन विश्वविद्यालय में कंप्यूटिंग के लिए हरीरी संस्थान में सॉफ्टवेयर & एप्लीकेशन इनोवेशन लैब (SAIL) स्वीकार करते हैं । यह काम एक NSF कैरियर पुरस्कार (MCB-१३५०९४९ से A.S.K.), और DARPA अनुदान HR0011-15-सी-००९१ और HR0011-18-2-0014 (A.S.K. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया । A.S.K. भी NIH है निदेशक नई प्रर्यातक पुरस्कार (1DP2AI131083-01), DARPA युवा संकाय पुरस्कार (D16AP00142), और कंप्यूटिंग में एनएसएफ अभियान (CCF-१५२२०७४) से धन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 Gallon Plastic Hedpack with cap Midwest Brewing and Winemaking Supplies 45-56Y8-E2FR For waste collection
a-D(+)-Glucose Chem-Impex 00805 For YPD Medium
Attune NxT Autosampler Thermo Fisher Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Used to determine population fractions via single cell fluoresence
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118-07-0 For YPD Medium
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648250 For YPD Medium
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature McMaster- Carr 5121K731 For media input branching
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 For YPD Medium
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 Fisher Scientific 50371500 For Sterilization of fluidic lines
Custom eVOLVER vial lid FynchBio Lid has ports for sampling and fluidic input/output
Cycloheximide Fisher Scientific ICN10018301 For flow cytometry sampling plates
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4 For sterilization of fluidic lines
eVOLVER Unit FynchBio
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) Fisher Scientific 02-681-420 For vial sampling
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars Fisher Scientific 14-513-57 Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap Fisher Scientific FB8002000 Must be fitted with tubing
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD McMaster- Carr 51135K73 For media bottles
Mac Mini Apple For running the experiment/collecting data
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP243820 For flow cytometry sampling plates
Pipettes Eppendorf
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K141 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K144 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K291 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K294 For media bottles
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN Chemglass CG-4910-04 Culture vials
Sodium Chloride (NaCl) Fsher Scientific S271-3 For YPD Medium
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices For measuring OD600 of overnight cell cultures
Vial Only, Sample, 40 mL, Clear, 28 mm x95 mm, GPI 24-400 Chemglass CG-4902-08 Culture vials
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500 For YPD Medium

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References

  1. Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
  2. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
  3. Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
  4. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  5. Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
  6. Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).
  7. Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
  8. Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  9. Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
  10. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
  11. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
  12. Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).
  13. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
  14. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
  15. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  16. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  17. Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP ’00. , 195-203 (2000).
  18. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).
  19. Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).
  20. Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
  21. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
  22. Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
  23. Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  24. Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
  25. McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536 (2018).
  26. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  27. Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
  28. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).
  29. Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).
  30. Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
  31. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42 (2015).
  32. Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
  33. Lagier, J. -C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
  34. Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
  35. Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
  36. Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051 (2016).
  37. Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).

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Heins, Z. J., Mancuso, C. P.,… More

Heins, Z. J., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Wong, B. G., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER. J. Vis. Exp. (147), e59652, doi:10.3791/59652 (2019).

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