Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Designing automatisert, høy gjennomstrømming, kontinuerlig cellevekst eksperimenter bruke eVOLVER

Published: May 19, 2019 doi: 10.3791/59652
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 4, 1,2,5
1Biological Design Center, Boston University, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Boston University, 4Department of Bioengineering, Rice University, 5Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University

Summary

Den eVOLVER rammeverket muliggjør høy gjennomstrømming kontinuerlig mikrobiell kultur med høy oppløsning og dynamisk kontroll over eksperimentelle parametere. Denne protokollen demonstrerer hvordan du bruker systemet til å gjennomføre en kompleks fitness eksperiment, guiding brukere på programmering automatisert kontroll over mange individuelle kulturer, måling, innsamling, og samspill med eksperimentelle data i sanntid.

Abstract

Kontinuerlig kultur metoder gjør det mulig for celler å bli dyrket under kvantitativt kontrollerte miljøforhold, og er dermed bredt nyttig for å måle fitness fenotyper og forbedre vår forståelse av hvordan genotyper er formet av utvalg. Omfattende siste innsats for å utvikle og anvende nisje kontinuerlig kultur enheter har avdekket fordelene med å gjennomføre nye former for cellekultur kontroll. Dette inkluderer å definere tilpasset utvalgs trykk og økt gjennomstrømming for studier som spenner fra langsiktige eksperimentelle evolusjon til Genova bibliotek utvalg og syntetisk gen krets karakterisering. EVOLVER-plattformen ble nylig utviklet for å møte denne økende etterspørselen: en kontinuerlig kultur plattform med en høy grad av skalerbarhet, fleksibilitet og automatisering. eVOLVER gir en enkelt standardisering plattform som kan (re)-konfigurert og skalert med minimal innsats for å utføre mange forskjellige typer høy gjennomstrømming eller multi-dimensjonale vekst utvalg eksperimenter. Her presenteres en protokoll for å gi brukerne av eVOLVER-rammeverket en beskrivelse for konfigurering av systemet for å gjennomføre en tilpasset, storstilt kontinuerlig vekst eksperiment. Nærmere bestemt protokollen guider brukerne om hvordan du programmere systemet til multiplex to utvalg press-temperatur og OSMOLARITETSSYSTEM-på tvers av mange eVOLVER hetteglass for å kvantifisere fitness landskap av Saccharomyces cerevisiae mutanter på fine Oppløsning. Vi viser hvordan enheten kan konfigureres både programmatisk, gjennom sin åpen kildekode-Web-basert programvare, og fysisk, ved å arrangere fluidic og hardware oppsett. Prosessen med fysisk å sette opp enheten, programmering kulturen rutine, overvåking og samhandling med eksperimentet i sanntid over Internett, prøvetaking ampuller for påfølgende offline analyse, og etter eksperimentdata analyse er detaljert. Dette bør tjene som et utgangspunkt for forskere på tvers av ulike disipliner å anvende eVOLVER i utformingen av sin egen komplekse og høy gjennomstrømming cellevekst eksperimenter for å studere og manipulere biologiske systemer.

Introduction

Kontinuerlig cellekultur teknikker, først utviklet nesten 70 år siden1,2, nyter en fersk vekkelse3,4. Dette skyldes en samløpet av faktorer. For det første, utvikling av høy gjennomstrømning-omics teknikker, som har gjort det mulig å lese ut og generere et stort antall genotyper5,6, har skapt en samtidig etterspørsel etter eksperimentelle teknikker som letter godt kontrollert cellevekst og bestemmelse av fenotype. For dette formål, kontinuerlig kultur representerer en kraftig eksperimentell tilnærming til å kapitalisere på emergent genomisk fremskritt. Ved å tilrettelegge for vekst utvalg/eksperimenter på cellulære populasjoner i nøyaktig kontrollerte (og dynamiske) miljøforhold, gir kontinuerlig kultur et middel til å nøye kartlegge genotyper til fenotyper7,8, kvantitativt karakteriserer konstruerte stammer og organismer9, og spore adaptive genetiske endringer i laboratoriet Evolution Studies10,11,12.

For det andre, den nylige fremveksten av tilgjengelig prototyping teknikker, slik som additiv produksjon og åpen kildekode maskinvare og programvareelementer, har aktivert et bredere sett av brukere til å designe og bygge sine egne kostnadseffektive former for kontinuerlig kultur systemer direkte i laboratoriet. Alt dette har ført til et spennende utvalg av gjør-det-selv (DIY) enheter som utfører kontinuerlig kultur funksjonalitet, slik som chemostat13, turbidostat14, eller morbidostat15. Dessverre, men lykkes i adressering spesifikke (nisje) problemer som de ble utformet, disse ad hoc løsninger generelt mangler muligheten til å skalere i gjennomstrømning og/eller eksperimentell design kompleksitet.

Den eVOLVER systemet ble utviklet med det mål å skape en enkelt plattform som kan imøtekomme den økende eksperimentelle behovene til kontinuerlig kultur og matche hastigheten og omfanget av emergent genomisk teknikker16 (figur 1a). eVOLVER design implementerer felles læresetninger underliggende svært skalerbare teknologier fra andre disipliner17, inkludert standardiserte fotavtrykk, modulære komponenter, og åpen kildekode-design prinsipper. Således, løsninger for ny nisje søknadene kan designet uten større modifiseringer å systemet. EVOLVER består av svært modulære og åpen kildekode-wetware, maskinvare, elektronikk og webbasert programvare, og er det første automatiserte, kontinuerlige kultur systemet som kan være kostnadseffektivt og enkelt re-konfigurert til å utføre praktisk talt alle typer vekst eksperiment med høy gjennomstrømming. Gjennom modulære og programmerbare smart ermer som huset alle sensorer og aktuatorer som trengs for å styre individuelle kulturer, eVOLVER unikt muliggjør skalering av både gjennomstrømning og individuell kontroll av kultur forhold. Videre, som en Web-basert plattform, eVOLVER utveksler data og informasjon med eksterne datamaskiner i sanntid, tillater samtidig overvåking av hundrevis av individuelle kulturer og automatisert kultur forstyrrelser gjennom vilkårlig definert kontroll Algoritmer.

I tidligere arbeid16, eVOLVER ' s robuste ytelse ble demonstrert i langsiktige eksperimenter over hundrevis av timer med drift, og dens evne til å dyrke ulike organismer, fra E. coli og s. cerevisiae å undomesticated Mikrober. En rekke forskjellige vekst utvalg eksperimenter ble utført, der programmatisk definerte multi-dimensjonale utvalg gradienter ble brukt på tvers av en rekke individuelle kultur forhold og den resulterende cellulære fitness landskaper ble Kvantifisert. Her er målet å gi eVOLVER brukere en beskrivelse av hvordan man bruker systemet til å designe og disse typer eksperimenter. Som et illustrerende eksempel metoder kvantifisere fitness landskapet av S. cerevisiae mutanter over en todimensjonal miljømessige gradient sammensatt av temperatur og osmotisk stress presenteres. Protokollen veileder brukerne gjennom konfigurering av eVOLVER-rammeverket for dette eksperimentet både programmatisk, ved bruk av programvaren for å sette tilpassede turbiditet-og temperaturkontroll rutiner for hver av 16 parallelle sammenhengende kulturer, og fysisk, gjennom fluider layout til hensiktsmessig rute medier av ulike salt konsentrasjoner. Denne protokollen skal fungere som en generell vurderingsmatrise for å konfigurere eVOLVER til å utføre et bredt utvalg av automatiserte, kontinuerlige kultur eksperimenter for ulike studier og disipliner.

Protocol

1. klargjøre medier, hetteglass og Inokulum

Merk: Denne protokollen forutsetter at brukerne allerede har kalibrert eVOLVER-systemet og bruker smart Sleeve-konfigurasjonen som er beskrevet i tidligere arbeid16. Smarte ermer kan enkelt tilpasses eller endres, men oppsettsdetaljer for volum-og kontroll parametre varierer avhengig av alternative konfigurasjoner.

  1. Dagen før forsøket, forberede 2 mL over natten flytende kulturer av S. cerevisiae BY4741 referanse belastning og variant stammer i YPD Media (gjær Peptone druesukker) ved 30 ° c i en risting inkubator satt til minst 300 r.p.m.
  2. Overfør sterile YPD-medier til rene, autoklaveres flasker utstyrt med slange. Alternativt kan Media være autoklaveres direkte i flasker pre-utstyrt med slange.
    Merk: Flasker er passe med rør ved å bore et hull i hetten og kjører slangen gjennom den med kontakter for å sikre den på plass. Se tabell over materialer.
  3. Legg røre bar til hvert hetteglass og skru på et hetteglass lokk utstyrt med tilstrømningen og utstrømming strå. Kontroller at alle komponentene er rene ved visuell inspeksjon.
  4. Plasser hetteglassene i en autoklaverbar rack, dekk med folie, og autoklav på en tyngdekraft eller vakuum syklus med en 20-min sterilisering trinn.

2. sette opp et eksperiment

  1. I tre store kanner forbereder du 500 mL på 10% blekemiddel, 200 mL 10% blekemiddel, og 300 mL 70% etanol.
  2. Bruk bryterne på eVOLVER enheten, slå på 5 V strømforsyningen på eVOLVER, vent i 5 s, og slå på 12 V strømforsyningen.
  3. Hvis du kjører flere hetteglass fra samme medie flaske, kobler du til flere medie inngangs linjer med slange splitter. Custom slange splitter kan konstrueres med luer komponenter.
  4. Senk medie inn data linjene i det første bleke begeret, og medie utstrømming linjene i det andre bleke begeret. Plasser nedstrøms enden av medie inn data linjene i det andre begeret med de utstrømming linjene. Plasser avfalls linjer i avfalls carboy.
  5. Tilsett 1-2 L av blekemiddel i store tomme avfalls carboy, som vil sterilisere avfall som genereres under eksperimentet. Rådfør deg med en sikkerhets koordinator for å sikre riktig avfallshåndtering.
  6. Bruk berøringsskjermen på eVOLVER, Naviger til oppsett delen, og Kjør alle pumper for 20 s for å fylle væske linjer med 10% blekemiddel. Mens du kjører, sikre ved visuell inspeksjon at alle linjer er fylt og at pumper fungerer normalt. Tillat blekemiddel å sitte i linjene i minst 30 min til å sterilisere.
  7. Kjør pumper igjen ved hjelp av touchscreen app til linjene ikke lenger er neddykket, presser luft gjennom linjene for å få så mye av blekemiddel ut som mulig.
  8. Plasser Media input linjer i etanol begeret og gjenta som i ovenfor, fylle linjene med etanol og rødme med luft.
    Merk: Som etanol dreper raskt, er det ikke nødvendig å vente 30 min for sterilisering.
  9. Fest Media input linjer til Media flasker med luer kontakter og kjøre pumpene til Media fullt går gjennom linjene, skylle ut eventuelle rester etanol.
  10. Delvis sett sterilisert hetteglass inn i eVOLVER smart ermene og koble linjene til de riktige posisjonene, i henhold til fargekodingen på linjene. Start med å feste innspill linjer til den korte tilstrømningen halm, og deretter kaste bort linjer til den lange utstrømming halm.
    Forsiktig: Det er viktig å se etter løse tilkoblinger eller feil rutet linjer. Unnlatelse av å gjøre dette vil føre til overflyt og potensielt skade smart Sleeve.
  11. Kjør alle pumper i 10 s trinn for å fylle hetteglassene med Media. Sikre ved visuell inspeksjon utstrømming pumper er effektivt å fjerne Media gjennom utstrømming sugerør, for å hindre overflyt. Hvis utstrømming strå ikke ser ut til å fungere effektivt, inspisere fluidic linje tilkoblinger og peristaltisk pumpen. Korriger eller Erstatt deler etter behov.
  12. Skyv hetteglassene ned til det er fullt innkapslet av Smart Sleeve.
  13. Angi de første betingelsene for eksperimentelle parametre ved hjelp av eVOLVER berøringsskjerm på den interaktive oppsettsiden. For alle hetteglass, Still inn temperaturen til 30 ° c og rør til 10. Dette kan gjøres for alle hetteglass samtidig ved å dra en finger over berøringsskjermen for å velge alle hetteglassene.

3. konfigurering eVOLVER programvare og programmering algoritmer kultur rutiner

  1. Gå til siden for eksperiment behandling på eVOLVER-dashbordet på en datamaskin. Velg grunn eksperimentet i eksperiment navigasjonspanelet eller et eksisterende eksperiment som startpunkt, og klikk på klone nytt.
    Merk: Det er mulig å bruke eksperimenter fra andre grupper ved å lime inn GitHub-lenken til repo der den eksperimentelle definisjonen lagres i eksperiment behandleren.
  2. Angi eksperiment navnet og eVOLVER-enheten som eksperimentet skal kjøres på. Kontroller at du har valgt de ønskede kalibreringsinnstillingene ved å endre disse feltene på siden.
  3. Bruk hetteglass velgeren og parameter definisjons rutene til å angi eksperimentelle forhold. Hvis du for eksempel vil angi temperaturen for hetteglass 0-4 til 30 ° c, velger du hetteglassene i velgeren for hetteglasset, setter parameterdefinisjonen til 30 og klikker på Sett. Gjenta dette for OD for å angi en øvre og nedre terskel for hvert hetteglass.
  4. Når de eksperimentelle parameter definisjonene er fullført, lagrer du eksperimentet ved å klikke på Lagre og klikke på Start for å kjøre.

4. igangsetting eksperiment og avlytting inne virkelig-tid

  1. Når eksperimentet er i gang, navigerer du til sanntidsdata panelet på det interaktive instrumentbordet. For hvert hetteglass, sjekk at OD verdier holder på null, og at temperaturen er på eller framover mot programmert nivåer ved å bla gjennom grafene.
  2. For å forberede inokulum, måle OD av overnight kulturer, beregne ønsket fold fortynning forutsatt et hetteglass volum på 25 mL, og pipette beregnet volum av inokulum inn ampuller gjennom prøvetaking porten. For eksempel, for å nå en ønsket Start OD på ca 0,05 i kulturen hetteglasset fra natten kulturer som er på OD 2,0, 625 μL av celler skal legges til hvert hetteglass.
  3. Kontroller diagrammene på dashbordet for å se at OD-grafene har blitt oppdatert i henhold til dette. En økning til nær ønsket Start OD bør sees i grafene.
  4. Spor ulike datatyper (for eksempel OD, temperatur, vekst, generasjoner og medieforbruk) gjennom eksperimentet ved å bla gjennom de tilsvarende grafene i dashbordet. Disse verdiene kan informere eksperimentelle avgjørelser av brukeren (for eksempel planlegge tidspunkter) eller til og med brukes i funksjoner for å utføre automatiserte tilbakemeldinger.
  5. Hvis du vil erstatte medie flasker midt i eksperimentet, kan du stoppe eksperimentet i eksperiment behandlings panelet for å unngå at det oppstår pumpe hendelser. Løsne raskt medielinjen fra den tomme flasken og koble den til den nye flasken. Unngå å berøre endene på slangen for å unngå forurensning. Gjenoppta eksperimentet i eksperiment styre ren.

5. prøvetaking gjærceller fra eVOLVER hetteglass

  1. Forbered en cycloheximide løsning for å hemme proteinsyntese og fikse gjærceller for flyt flowcytometri analyse. I et 15 mL konisk rør, tilsett 12 mL PBS og 12 μL 20 mg/mL cycloheximide og Vortex for 5 s.
  2. Ved hjelp av en flerkanals pipette alikvot 100 μL i hver brønn på en 96-brønn rund bunnplate.
  3. Pakk platen i aluminiumsfolie for å stenge ut lys og holde ved 4 ° c til nødvendig.
  4. For prøvetaking, Pipetter gjennom Prøvetakings porten på hetteglass lokket med forlenget lengde 200 μL-spisser.
  5. Pipetter 100 μL fra et hetteglass til en brønn i fikserings platen, og blander 2-3x ved å pipettering opp og ned, deretter gjenopprette i folie og returnere platen til 4 ° c.

6. eksperiment bryte ned og rydde opp

  1. Forbered 1 L av 10% blekemiddel og 2 500 mL DI vann løsninger i store kanner.
  2. Stopp eksperimentet ved å sende stopp kommandoen i eksperiment behandlings panelet. Dataene er fortsatt lagret i den skybaserte databasen, og kan fortsatt vises senere i data panelet i sanntid på instrumentbordet, eller lastes ned for frakoblet analyse.
  3. Fjern hetteglassene fra Smart ermene og legg dem i et autoklav rack for å unngå overflyt i påfølgende trinn.
  4. Skru ut medie inngangs linjene fra medie flaskene og plasser dem i begeret med 10% blekemiddel. Kjør pumper fra eVOLVER brukergrensesnitt som i oppsett for å sterilisere linjer og hetteglass.
  5. Koble linjer fra hetteglass og senk linjene i DI vann. Kjør pumper å spyle alle blekemiddel ut av systemet først med DI vann, deretter med luft.
  6. Slå av eVOLVER ved først å slå av strømforsyningen på 12 V, vente 5 s, og deretter slå av strømforsyningen på 5 V.
  7. Sug rør barer og caps i 10% blekemiddel, og skyll med DI vann. Pass på å skylle tilstrømningen og utstrømming strå av hver hette ved å kjøre DI vann gjennom dem. SCRUB hetteglass med test tube pensel hvis filmen har dannet på vegger.
  8. Kast avfallet på riktig måte og skyll avfalls beholderne grundig.
    Forsiktig: Avfallsbeholdere vil inneholde en blanding av 10% blekemiddel, sterilisert cellekultur avfall, og spormengder etanol. Rådfør deg med en sikkerhets koordinator for riktig håndtering og avhending.

7. kvantifisere fitness bruke Flow flowcytometri analyse av Brøkdelen populasjoner

  1. Analyser innsamlede prøver fra del 5 ved hjelp av en strømnings flowcytometer som er utstyrt med riktig fluorescens kanal og detektorer16.
  2. Anskaffe minst 10 000 hendelser per prøve, og gate for intakte celler ved hjelp av forover og side scatter data.
  3. Port basert på den aktuelle fluorescens kanalen (f. eks GFP) for å bestemme brøk fordelingen av hver populasjon.
  4. På en datamaskin lagrer du data til ønsket sted på siden eksperiment behandling ved å klikke på «Eksporter»-knappen.
  5. Fra eVOLVER-datafiler fastslår du hvor mange generasjoner som er fullført av hver timepoint for hvert hetteglass. I eVOLVER-koden, er generasjoner beregnet ved først å segmentere OD data mellom hver fortynning hendelse, deretter hvert segment er passe med en grunnleggende eksponentiell av skjemaet Equation 1 til hvert segment, gir r, vekstraten16. Antall generasjoner over en tidsperiode beregnes deretter ved hjelp av følgende formel:
    Equation 2
  6. Plot log-forholdet mellom de merkede og umerkede populasjoner fra flyten flowcytometri data kontra generasjons nummer fra ovenstående beregninger på den tiden prøvene ble tatt. Identifiser den lineære regionen og Monter skråningen i henhold til følgende ligning. Denne skråningen er vanligvis definert som konkurransedyktig fitness18,19.
    Equation 3

Representative Results

Protokollen beskrevet her ble brukt til å konstruere fitness kart for genetiske varianter av S. cerevisiae over en todimensjonal stress gradient av temperatur og saltinnhold. Spesielt for hver variant belastning, brukte vi eVOLVER å gjennomføre parvis konkurranse eksperimenter mot en fluorescensmerkete-merket referanse stamme (S. cerevisiae stamme BY4741 med en integrert konstituerende mNeonGreen reporter) i 16 forskjellige kombinasjoner av disse påkjenninger (figur 1). For varianter ble to knockout stammer valgt hver spådd å være følsomme for en av stress tilstand akser: ΔPRX1 som har blitt rapportert å ha egnethet defekter i høye temperaturer20 og ΔPBS2 med fitness defekter ved høy salt konsentrasjoner21. Som en kontroll variant, en umerkede vill-type BY4741 belastning ble brukt, forventes å utføre på samme måte som referanse belastningen. Totalt ble disse 3 72-timers konkurranse forsøkene gjennomført samtidig i 48 hetteglass over tre eVOLVER-enheter (16 hetteglass) alle kjørt fra en enkelt datamaskin.

EVOLVER interaktive dashbord brukes til å navigere den store mengden data som genereres under hvert eksperiment (figur 2a). Representative OD-spor på tvers av alle de 16 hetteglassene på én enkelt eVOLVER-enhet vises i figur 2b. Hver spor viser en karakteristisk Sawtooth mønster fra turbidostat kontroll algoritmen, som brukertilbakemelding på OD å utløse fortynninger og vedlikeholde kulturer i en smal tetthet rekkevidde (0,2-0,3 i dette tilfellet). OD-og temperaturdata måles kontinuerlig, streames til den skybaserte databasen og oppdateres i sanntid i eVOLVER interaktive dashbord. Fra kontinuerlig streamet data, kan høyere-Order beregninger (f. eks vekstrate, kumulative generasjoner) beregnes og tegnes i dashbordet (figur 2C) og til og med brukt som feedback parametre i ulike utvalg ordninger (f. eks morbidostat).

For å generere fitness kart, måler vi hastigheten som referanse belastningen outcompetes varianten belastningen ved å innlemme både Flow flowcytometri målinger og eVOLVER vekst data. Nærmere bestemt beregnes populasjons brøker som Logg forholdet for variant belastning over referanse belastningen ved hjelp av flyt flowcytometri data fra hver timepoint prøve. For hver kultur og tidspunkt, er det forløpt antall generasjoner interpolert fra eVOLVER vekstrate data i hver fortynning periode. Å plotte log-prosenter mot generasjoner, kvalitative forskjeller mellom forholdene begynner å dukke opp (figur 3a). For å beregne egnethet, er en skråning passe gjennom den lineære delen av hvert plott18,19, gir en kvantitativ fitness verdi (med både tegn og hastighet) som beskriver hvordan varianten belastningen konkurrerer mot referanse belastningen ( Figur 3B). I dette eksperimentet indikerer negative treningsverdier at variant belastningen outcompeted av referanse belastningen. Konstruere heatmaps fra alle fitness beregninger tillater visualisering av to-dimensjonale fitness landskapet, avslører subtile kvantitative forskjeller i ytelse mellom stammer og forhold (figur 3c).

Fra fitness heatmaps, ser vi at hver variant belastningen utstillinger egnethet defekter som manifesterer på forskjellige måter. ΔPRX1 er primært følsomme for høye temperaturer, men salt stress ser ut til å ha en additiv effekt, øker fitness defekt. Motsatt, ΔPBS2 viser egnethet defekter primært som svar på høye salt konsentrasjoner, med minimale forskjeller langs temperaturen aksen. Disse resultatene markere nytten av høyoppløselig utvalg eksperimenter spesielt for å tyde interaksjoner av flere miljømessige stressfaktorer, som kan ha additiv, synergi, eller epistatisk effekter.

Til slutt er det viktig å merke seg at i noen tilfeller, spesielt for alvorlige stress forhold, kan fitness beregninger føre til overdrevne eller skjeve resultater. For eksempel synes ΔPBS2 å vise en bratt positiv skråning i 39 ° c/1 M NaCl tilstand i forhold til referanse belastningen (figur 3a). Dette skyldes dårlig vekst av begge stammer, noe som gjenspeiles i vill type data og begrenser nytten av denne beregningen i denne tilstanden. Et utilstrekkelig antall generasjoner resulterer i 1) dårlig separasjon av tidspunkter som forstyrrer skråningen montering, og 2) følsomhet for Stokastisk effekter som stammer fra lag fasen. Selv om vi ikke velger å gjøre det i denne studien, kan sann tids vekst dataene som samles inn av eVOLVER under eksperimentet, ha blitt brukt til å informere beslutningen om å forlenge eksperimentet og samle inn flere tidspunkter for denne tilstanden med liten innsats. I oppfølgingseksperimenter kan Start forholdene også være modulert for å forlenge lengden på det lineære området før metningen oppstår.


Figure 1
Figur 1: oversikt over eVOLVER-rammeverket og eksperimentell design. (A) eVOLVER er en automatisert, kontinuerlig kultur plattform som gir multiparameter kontroll over kultur forholdene. Plattformen består av Smart ermer, som huset sensorer og aktuatorer for å kontrollere kultur forhold, en peristaltisk pumpe array for flytende Media og avfall inn og ut av kulturer, en berøringsskjerm for samhandling manuelt med enheten, og en datamaskin brukes for samhandling med skyinfrastrukturen der data fra plattformen strømmes. (B) eVOLVER kan konfigureres på flere måter: fysisk, gjennom celle-og medie innganger, og programmatisk ved å justere algoritmene som styrer smart Sleeve kultur hetteglass moduler. Dette kan utnyttes til å programmere flerdimensjonale utvalg/miljømessige graderinger i høy oppløsning, med utganger bestående av fysisk innsamlede celler på definerte tidspunkt poeng og sanntids streaming av kultur data. (C) konfigurering eVOLVER å gjennomføre en vekst fitness eksperiment over en todimensjonal utvalg gradient, sammensatt av temperatur og osmotisk stress. eVOLVER kultur ampuller ble sådd med like proporsjoner av en referanse og variant gjær belastning. En turbidostat rutine ble programmert til å opprettholde alle kulturer i eksponentiell fase i et definert OD-vindu (OD 0.2-0.3). Temperatur og Media forholdene var varierte over smart Sleeve array å danne to uavhengige stress graderinger. Base media besto av YPD (2% glukose) + 100 μg/mL carbenicillin + 25 μg/mL kloramfenikol som en forholdsregel mot bakteriell forurensning. Media komposisjoner ble variert ved å legge supplerende NaCl til 0 M, 0,6 m, 0,8 M, eller 1,0 M. hetteglass temperaturene ble programmert til en av fire verdier: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c eller 39 ° c. (D) eksempler på rå produksjon for kultur OD og befolkning fraksjoner fra tre testede forhold. Konkurransen eksperimentet ble opprettholdt for 72 h, prøvetaking ved 24 h og deretter hver 12 h til avslutningen av eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eVOLVER instrumentbord for dataanalyse i sanntid. (A) eVOLVER data behandles og streames i sanntid via skybasert programvare til et interaktivt dashbord. Gjennom dashbordet, kan brukerne definere og initiere sin egen kultur rutiner på en tilkoblet eVOLVER, overvåke for øyeblikket kjører eksperimenter på tvers av alle eVOLVER enheter, og varierer eksperimentelle forhold manuelt på et individuelt hetteglass eller sett med hetteglass hvis nødvendig. (B) OD spor for hvert hetteglass på tvers av matrisen av forhold testet for hele eksperimentet varighet. Spor kan vises i sanntid for å sikre at eksperimentet kjører som ønsket og brukt etter eksperimentet for videre analyse. (C) vekstrater og celle generasjoner kan BEREGNES fra OD-spor på fly for å spore fremdriften i eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Bygging av fitness overflater. (A) celle befolknings brøker naturlig Logg (variant stamme/referanse belastning) plottet mot celle generasjoner. Farge indikerer temperaturen i utvalget mens bindestreker skiller salt konsentrasjoner. (B) å kvantifisere relative egnethet av varianten til referanse belastningen, en fitness beregning er avledet fra den hastigheten som den cellulære befolkningen brøkdel endringer over generasjoner. Denne målingen er beregnet fra den lineære regionen av cellulære brøkdel tomter ved hjelp av minimum tre poeng. (C) de relative trenings beregningene vises i en heatmap for å konstruere en trenings flate over de miljømessige stress graderinger. Den øvre høyre hjørne tilstand (39 ° c/1,0 M NaCl) for vill og ΔPBS2 er ikke inkludert i denne analysen som kulturer gikk gjennom utilstrekkelig generasjoner (se representative resultater). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vekst utvalg er et uunnværlig redskap i biologi, grovt brukes til å generere og karakterisere fenotypiske forskjeller mellom cellulære populasjoner. Mens satsvise kulturer tillater vekst utvalg i en begrenset måte, kontinuerlig kultur teknikker dramatisk utvide graden av kontroll og forutsigbarhet av disse eksperimentene, ved å øve presis regulering over form og dynamikk av utvalget til å generere kvantitative resultater22. Kontinuerlig kultur har vært benyttet for å nøye kontrollere utvalget for høy-mangfold biblioteker20,23,24,25, og å gjennomføre sofistikerte adaptive regimer i eksperimentell og regissert evolusjon11,12,26,27. Kontinuerlig kultur muliggjør også presis karakterisering av celler over en rekke kvantitativt kontrollerte forhold for å bedre forstå komplekse genetiske systemer og optimalisere konstruert bioproduction stammer9,14 , 28og andre.

Det finnes imidlertid ingen universell protokoll for kontinuerlig kultur, ettersom subtile endringer i de selektive forholdene kan føre til dramatiske endringer i biologiske utfall4,29,30. Forskere må kunne velge mellom utvalgs regimer og tilpasse eksperimentelle protokoller og utstyr tilsvarende. I tillegg til å tilby et valg mellom kontrollparametere, ville slike systemer ideelt sett være sofistikerte nok til selvstendig administrere flere parametre samtidig i svært parallelle eksperimenter som er nødvendig for å dechiffrere samspill innganger i komplekse biologiske systemer (f.eks. epistasis). eVOLVER løser denne utfordringen ved å gjøre det mulig for brukere å vilkårlig programmere feedback-kontroll mellom kultur forhold og fluidic funksjoner for å spesifisere høyt spesialiserte miljø nisjer.

For å overkomme begrensningene i det gjeldende oppsettet og utvide eller endre kontrollparametere, kan smart Sleeve lett bli redesignet for å legge til nye sensorer eller aktuatorer. I tillegg ville redusere hetteglass volum redusere Media utgifter, som kan være betydelig i kontinuerlig kultur. Mens dagens design tillater måling og kontroll av temperatur, kultur agitasjon, lys induksjon, turbiditet og fluider, må andre parametre måles eksternt ved prøvetaking fra hetteglassene. Nåværende arbeid omfatter å innlemme evnen til å overvåke enzymatisk aktivitet via luciferase og regulere oppløst oksygen og pH direkte i eVOLVER kulturer. I tillegg, mens ikke demonstrert i dette arbeidet, kan eVOLVER grensesnitt med romanen millifluidic multipleksing enheter16 som trekker på prinsipper for stor skala integrering (som stammer fra elektronikk og vedtatt av materialer) for å muliggjør mer kompleks fluidic håndtering (f.eks. multiplekset fluidic innganger og overføringer av hetteglass til hetteglass). Disse wetware modulene kan være utformet og produsert helt i laboratoriet, slik at brukerne kan rute væsker ved programmatisk actuating forskjellige kombinasjoner av ventiler i automatiserte fluidic rutiner. Dette tillater brukere å overvinne den stive fluidic design tradisjonelt brukt i kontinuerlig kultur, men også å skalere fluidic evner til høy gjennomstrømming med et mindre antall kostbare kontrollelementer (f. eks peristaltisk pumper). Til slutt, vi håper å innlemme en autosampling plattform som vil benytte disse millifluidics og DIY komponenter, overvinne begrensningen av manuell interaksjon under lengre og større eksperimenter der prøvetaking kulturer ville være tungvint.

I tillegg til fysiske modifikasjoner på plattformen, åpner den nettbaserte programvaren nye frihetsgrader ved å la brukerne skrive, redigere og dele tilpassede eVOLVER-skript, generere helautomatisk, tilbakemeldings aktiverte kulturprogrammer (f.eks. turbidostat). Brukere kan programmatisk feie over parameter områder i subtile variasjoner på samme utvalgs skjema eller koble kontroll algoritmer i romanen kombinasjoner for å angi et antall sofistikerte utvalg ordninger. Videre kan evnen til enkelt å overvåke kulturer i sanntid forvandler måten eksperimenter blir utført. Med sanntids overvåking, brukere kan 1) se etter konsistens mellom kjøringer, en kritisk funksjon for bioproduction applikasjoner og høy gjennomstrømming eksperimenter, og 2) gripe inn under eksperimenter om nødvendig, for å feilsøke utfordrende stammer som viser dårlig vekst eller biofilm dannelse, eller diagnostisere bruker feil (f.eks. forurensning). Til slutt, med flere datastrømmer som samles inn og tolkes i sanntid for hver enkelt kultur, eVOLVER genererer en høy tetthet av data, som kan forenkle maskinlæring tilnærminger for romanen nedstrøms analyse.

Utover demonstrert bruk for fitness karakterisering, bibliotek utvalg, og laboratorium evolusjon, viser vi en rekke relaterte felt som moden for gjennomføring i eVOLVER med integrert fluider. eVOLVER eksperimenter med mikrobiomet prøver kunne analysen samfunnet stabilitet i kontrollerte miljøer31,32, utforske bakterieflora sammensetning ved hjelp av culturomics teknikker33, eller dynamisk blanding arter å avhøre økologiske dynamikken i kolonisering eller invasjon34,35. Tallrike metoder for kontinuerlig rettet utvikling av biomolekyler kan lett bli implementert på enheten også26,36,37, sterkt økende tilgjengelighet og gjennomstrømning av disse systemene. Evnen til å optimalisere vekstforhold som for eksempel medie sammensetning, temperatur og belastninger i en dynamisk, høy gjennomstrømnings natur kan hjelpe til med optimaliserings arbeid for industrielle biomanufacturing applikasjoner9. Vi videre envision vertikalt integrere eVOLVER med andre analyse teknikker som mikroskopi og flyt flowcytometri i en lukket sløyfe mote, og gir et helautomatisk system for vekst og analyse av cellulære kulturer på både enkelt celle og befolkning Nivåer. Videre, med noen hardware modifikasjoner til smart Sleeve som tetting fartøyet og kontrollerende gass innhold, eVOLVER kan potensielt være tilpasset for å støtte veksten av et bredere spekter av celletyper, for eksempel suspensjon pattedyrceller. Det er også mulig å plassere hele rammeverket i en anaerob kammer for anaerob cellekultur. Ser frem, vi tar sikte på å bygge vår programvarerammeverk til en sentralisert skyinfrastruktur og tror dette ville tillate brukere å enkelt konfigurere, analysere og dele sine data eksternt uten å måtte fysisk være til stede i laboratoriet. Som en data kurator vil skyinfrastrukturen også låne seg til store meta-analyser på tvers av eksperimenter. Vi forventer at eVOLVER og disse fremtidige fremskrittene i stor grad vil utvide omfanget av mulig vekst utvalgs eksperimenter ved å tilrettelegge for automatisering og innovasjon i kontinuerlig kultur.

Disclosures

Forfatterne, Brandon G. Wong og Ahmad S. Khalil, er co-grunnleggerne av Fynch Bioscience Inc., som utvikler eVOLVER plattformen som brukes i denne artikkel.

Acknowledgments

Vi takker B. Stafford for hans assistanse i utformingen av systemet, og H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, og A. Cavale for hjelp med bygging av systemet. Vi erkjenner at Electronics design Facility (EDF), ingeniør produkt Innovation Center (EPIC), og programvaren & Application Innovation Lab (SAIL) ved Hariri Institute for Computing ved Boston University for sine tjenester. Dette arbeidet ble støttet av en NSF karriere Award (MCB-1350949 til A.S.K.), og DARPA tilskudd HR0011-15-C-0091 og HR0011-18-2-0014 (til A.S.K.). A.S.K. erkjenner også finansiering fra NIH Director ' s nye innovatør Award (1DP2AI131083-01), DARPA unge fakultet Award (D16AP00142), og NSF ekspedisjoner i Computing (CCF-1522074).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 Gallon Plastic Hedpack with cap Midwest Brewing and Winemaking Supplies 45-56Y8-E2FR For waste collection
a-D(+)-Glucose Chem-Impex 00805 For YPD Medium
Attune NxT Autosampler Thermo Fisher Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Used to determine population fractions via single cell fluoresence
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118-07-0 For YPD Medium
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648250 For YPD Medium
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature McMaster- Carr 5121K731 For media input branching
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 For YPD Medium
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 Fisher Scientific 50371500 For Sterilization of fluidic lines
Custom eVOLVER vial lid FynchBio Lid has ports for sampling and fluidic input/output
Cycloheximide Fisher Scientific ICN10018301 For flow cytometry sampling plates
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4 For sterilization of fluidic lines
eVOLVER Unit FynchBio
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) Fisher Scientific 02-681-420 For vial sampling
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars Fisher Scientific 14-513-57 Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap Fisher Scientific FB8002000 Must be fitted with tubing
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD McMaster- Carr 51135K73 For media bottles
Mac Mini Apple For running the experiment/collecting data
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP243820 For flow cytometry sampling plates
Pipettes Eppendorf
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K141 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K144 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K291 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K294 For media bottles
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN Chemglass CG-4910-04 Culture vials
Sodium Chloride (NaCl) Fsher Scientific S271-3 For YPD Medium
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices For measuring OD600 of overnight cell cultures
Vial Only, Sample, 40 mL, Clear, 28 mm x95 mm, GPI 24-400 Chemglass CG-4902-08 Culture vials
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500 For YPD Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
  2. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
  3. Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
  4. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  5. Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
  6. Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).
  7. Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
  8. Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  9. Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
  10. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
  11. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
  12. Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).
  13. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
  14. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
  15. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  16. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  17. Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP ’00. , 195-203 (2000).
  18. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).
  19. Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).
  20. Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
  21. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
  22. Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
  23. Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  24. Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
  25. McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536 (2018).
  26. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  27. Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
  28. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).
  29. Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).
  30. Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
  31. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42 (2015).
  32. Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
  33. Lagier, J. -C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
  34. Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
  35. Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
  36. Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051 (2016).
  37. Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).

Tags

Genetikk eVOLVER kontinuerlig kultur mikrobielle populasjoner Lab automatisering vekst utvalg eksperimentell evolusjon fitness landskap systemer biologi
Designing automatisert, høy gjennomstrømming, kontinuerlig cellevekst eksperimenter bruke eVOLVER
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heins, Z. J., Mancuso, C. P.,… More

Heins, Z. J., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Wong, B. G., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER. J. Vis. Exp. (147), e59652, doi:10.3791/59652 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter