Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama

Published: May 19, 2019 doi: 10.3791/59652
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 4, 1,2,5
1Biological Design Center, Boston University, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Boston University, 4Department of Bioengineering, Rice University, 5Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University

Summary

EVOLVER çerçevesi yüksek çözünürlüklü ve deneysel parametreler üzerinde dinamik kontrol ile yüksek verimlilik sürekli mikrobiyal kültür sağlar. Bu protokol, kullanıcıların birçok bireysel kültürde otomatik kontrolü programlama, ölçme, toplama ve deneysel verilerle gerçek zamanlı etkileşime girme konusunda rehberlik ederek karmaşık bir fitness deneyi yapmak için sistemin nasıl uygulanacağını gösterir.

Abstract

Sürekli kültür yöntemleri, hücrelerin niceli kontrollü çevresel koşullarda yetiştirilmesine olanak sağlar ve böylece Fitness fenotiplerini ölçmek ve genotiplerin seçime göre nasıl şekillendirileceğini anlayışımızı iyileştirmek için geniş ölçüde yararlıdır. Kapsamlı son çabaları geliştirmek ve niş sürekli kültür cihazları uygulamak için hücre kültürü kontrolü yeni formları gerçekleştirme yararları ortaya koydu. Bu, uzun vadeli deneysel evrimin genom çapında Kütüphane seçimleri ve sentetik gen devresi karakterizasyonu ile değişen çalışmalar için özel seçim basınçları ve artan verim tanımlama içerir. EVOLVER platformu son zamanlarda bu büyüyen talebi karşılamak için geliştirilmiştir: ölçeklenebilirlik, esneklik ve otomasyon yüksek derecede bir sürekli kültür platformu. eVOLVER (yeniden)-yapılandırılabilir ve yüksek verimlilik veya çok boyutlu büyüme seçim deneyleri birçok farklı türde gerçekleştirmek için minimal çaba ile ölçeklendirilebilir tek bir Standartlama platformu sağlar. Burada, bir protokol eVOLVER çerçevesi kullanıcıları özel, büyük ölçekli sürekli büyüme deneyi yapmak için sistem yapılandırma için bir açıklama sağlamak için sunulmuştur. Özellikle, protokol, sistem nasıl iki seçim basıncı-sıcaklık ve Osmolarite-birçok Evolver şişeleri genelinde Saccharomyces cerevisiae mutantlar Fitness manzaralar ölçmek için Multiplex için program kılavuzları kullanıcılar ince Çözünürlük. Cihazın, açık kaynak Web tabanlı yazılımı aracılığıyla ve fiziksel olarak, fluidik ve donanım mizanpajları düzenleyerek hem programlı olarak nasıl yapılandırıldığını gösteriyoruz. Fiziksel olarak cihazı kurma, kültür rutinini programlama, internet üzerinden gerçek zamanlı deneyle izleme ve etkileşime girme, sonraki çevrimdışı analiz için şişe örnekleme ve deney sonrası veri analizinin Analizi ayrıntılı bir süreçtir. Bu, çeşitli disiplinlerde araştırmacılar için bir başlangıç noktası olarak çalışma ve biyolojik sistemleri işlemek için kendi karmaşık ve yüksek verimlilik hücre büyüme denemeleri tasarımında eVOLVER uygulamak için hizmet etmelidir.

Introduction

Sürekli hücre kültürü teknikleri, ilk geliştirilen yaklaşık 70 yıl önce1,2, yeni bir canlanma zevk var3,4. Bu faktörlerin bir konfluence kaynaklanmaktadır. İlk olarak, yüksek verimlilik-omics teknikleri, hangi okumak ve genotip5,6çok sayıda üretmek mümkün kılan gelişimi, kolaylaştırmak Deneysel teknikler için bir eşlik talebi yarattı iyi kontrollü hücre büyümesi ve fenotipleme. Bu amaçla, sürekli kültür, acil genomik ilerlemeler için güçlü bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Tam kontrollü (ve dinamik) çevre koşullarında hücresel nüfus üzerinde büyüme seçimleri/deneyleri kolaylaştırarak, sürekli kültürü fenotipleri için titiz bir şekilde harita için bir yol sağlar7,8, niciliksel olarak tasarlanan suşları ve organizmaları9olarak karakterize edin ve laboratuar evrim çalışmalarında adaptif genetik değişiklikleri10,11,12.

İkinci olarak, ilave üretim ve açık kaynak donanım ve yazılım elemanları gibi erişilebilir prototipleme tekniklerinin son ortaya çıkması, kullanıcıların daha geniş bir yelpazeyi tasarım ve sürekli kültür sistemlerinin kendi maliyet etkin formlarını oluşturmak için sağladı doğrudan laboratuvarda. Tüm bunlar, chemostat13, turbidostat14veya MORBIDOSTAT15gibi sürekli kültür işlevlerini gerçekleştiren heyecan verici bir dizi yapmak-it-yourself (DIY) aygıtlarına yol açtı. Ne yazık ki, belirli (niş) sorunları hangi onlar tasarlanmış, bu geçici çözümler genellikle verimi ve/veya deneysel tasarım karmaşıklığı ölçek yeteneği eksikliği ele başarılı olsa.

EVOLVER sistemi, sürekli kültürün büyüyen deneysel ihtiyaçlarını karşılayacak ve acil genomik tekniklerin hızı ve ölçeği16 (Şekil 1a) ile eşleşen tek bir platform oluşturma amacı ile tasarlanmıştır. eVOLVER 'ın tasarımı, standart ayak izleri, modüler bileşenler ve açık kaynak tasarım ilkeleri dahil olmak üzere17diğer disiplinlerden yüksek oranda ölçeklenebilir teknolojilerin temel aldığı ortak ilkeleri uygular. Böylece, yeni niş uygulamalar için çözümler sistemde büyük değişiklikler olmadan tasarlanmış olabilir. Son derece modüler ve açık kaynaklı Wetware, donanım, elektronik ve Web tabanlı yazılım oluşur, eVOLVER maliyet-etkin ve kolayca yeniden yapılandırılmış ilk otomatik sürekli kültür sistemi neredeyse her türlü yürütmek için yüksek verimlilik büyüme deneyi. Bireysel kültürlerin kontrol edilmesi için gerekli tüm sensörler ve aktüatörlerin bulunduğu modüler ve programlanabilir akıllı kollu ile eVOLVER, her iki verimlilik ve kültür koşullarının bireysel kontrolünü ölçeklendirmeyi sağlar. Ayrıca, Web tabanlı bir platform olarak, eVOLVER gerçek zamanlı olarak uzak bilgisayarlar ile veri ve bilgi değişimi, bireysel kültürler ve otomatik kültür perturbations yüzlerce eşzamanlı izleme keyfi tanımlı kontrol yoluyla izin Algoritma.

Önceki çalışma16' da Evolver 'in güçlü performansı, yüzlerce saatlik operasyon boyunca uzun vadeli deneyler ve E. coli ve s. cerevisiae 'den çeşitli organizmaları yetiştirmek için yeteneklerini ortaya koymuştur. Mikrop. Farklı büyüme seçim deneyleri bir dizi, hangi programlı olarak tanımlanmış çok boyutlu seçim degradeler bireysel kültür koşulları bir dizi boyunca uygulanan ve ortaya çıkan hücresel Fitness manzaralar yapıldı Quantified. Burada, amaç, eVOLVER kullanıcılarının tasarım ve bu tür deneyler için sistemi nasıl kullananlar hakkında bir açıklama sunlamasıdır. Açıklayıcı bir örnek olarak, S. cerevisiae mutantların Fitness manzarayı sıcaklıktan ve osrotik stresden oluşan iki boyutlu çevresel gradyan arasında ölçülme yöntemleri sunulmaktadır. Protokol her iki programlı olarak, her 16 paralel sürekli kültürler için özelleştirilmiş bulanıklık ve sıcaklık kontrol rutinleri ayarlamak için yazılımı kullanarak, bu deneme için eVOLVER çerçevesi yapılandırma yoluyla kullanıcılar kılavuzları ve fiziksel olarak, farklı tuz konsantrasyonları Medias uygun rota için Akışkanlar düzeni aracılığıyla. Bu protokol, eVOLVER 'in çeşitli çalışmalar ve disiplinler için çok çeşitli otomatik sürekli kültür denemeleri yürütmek üzere yapılandırılması için genel bir dereceli Puanlama anahtarı olarak hizmet vermelidir.

Protocol

1. medya, şişeler ve Inoculum hazırlamak

Not: Bu protokol, kullanıcıların eVOLVER sistemini önceden kalibre ettiğini ve önceki çalışma16' da açıklanan akıllı kol yapılandırmasını kullandığını varsayar. Akıllı kollu kolayca yeniden tasarlanmış veya değiştirilmiş, ancak birim ve kontrol parametrelerinin kurulum ayrıntılarını alternatif yapılandırmaları için farklı olabilir.

  1. Deneyden bir gün önce, S. cerevisiae BY4741 referans gerinim ve varyant suşlarının YPD medyasında (Maya peptone Dextrose) 30 °c ' de, en az 300 rpm olarak ayarlanmış bir sallayarak kuluçta 2 ml gece sıvı kültürleri hazırlayın
  2. Steril YPD ortamını, tüplerle donatılmış temiz, otoklavlı şişelere aktarın. Alternatif olarak, medya doğrudan tüplerle önceden donatılmış şişelerde Otoklavlanmış olabilir.
    Not: Şişeler kapağın içine bir delik delme ve yerine güvenli konnektörler ile boru çalışan boru ile uygun. Bkz. malzeme tablosu.
  3. Her şişeye karıştırın Bar ekleyin ve bir şişe kapağı üzerinde akma ve "effluks" Pipetler ile donatılmış vida. Görsel muayene ile tüm bileşenlerin temiz olduğundan emin olun.
  4. Bir otoklavlanabilir raf içinde yer şişeleri, folyo ile kapak, ve bir yerçekimi veya vakum döngüsü üzerinde otoklav 20-dakika sterilizasyon adım.

2. deney kurma

  1. Üç büyük bubi içinde,% 10 çamaşır suyu, 200 mL% 10 çamaşır suyu ve 300 mL% 70 etanol 500 mL hazırlayın.
  2. EVOLVER cihazda anahtarlarını kullanarak, eVOLVER 5 V güç kaynağını açın, 5 s bekleyin, sonra 12 V güç kaynağını açın.
  3. Aynı ortam şişesinden birkaç şişe çalıştırıyorsanız, birden fazla ortam giriş satırını tüp ayırıcıyla bağlayın. Özel boru ayırıcılar Luer bileşenleri ile inşa edilebilir.
  4. İlk çamaşır suyu Beaker medya giriş hatları ve ikinci çamaşır suyu Beaker medya "effluks" hatları Submerge. Ortam giriş çizgilerinin aşağı uç ucunu "effluks" hatları ile ikinci bir kabı içine yerleştirin. Atık hatları atık karçocuk içine yerleştirin.
  5. Deneme sırasında oluşturulan atık sterilize edecek büyük boş atık carboy içine çamaşır suyu 1-2 L ekleyin. Atıkların doğru şekilde bertaraf edilmesini sağlamak için bir güvenlik koordinatörü ile görüşün.
  6. EVOLVER üzerinde dokunmatik ekran kullanarak, kurulum bölümüne gidin ve% 10 çamaşır suyu ile sıvı hatları doldurmak için 20 s için tüm pompalar çalıştırın. Çalışırken, tüm çizgilerin doldurulduğu ve pompaların normal şekilde çalıştığını görsel incelemeden emin olun. Çamaşır suyu sterilize etmek için en az 30 dakika için çizgiler oturmak izin verin.
  7. Çizgiler artık subbirleştirilmiş olana kadar dokunmatik ekran uygulamasını kullanarak tekrar pompalar çalıştırın, mümkün olduğunca çamaşır suyu dışarı kadar almak için çizgiler üzerinden hava itmek.
  8. Etanol kabı ortam giriş hatları yerleştirin ve yukarıda olduğu gibi tekrar, etanol ile çizgiler doldurma ve hava ile yıkama.
    Not: Etanol hızla öldürür gibi, sterilizasyon için 30 dakika beklemek gerek yoktur.
  9. Luer konnektörleri ile medya şişeleri medya giriş hatları iliştirin ve medya tamamen hatları üzerinden çalışır kadar pompalar çalıştırmak, herhangi bir kalıntı etanol dışarı yıkanıyor.
  10. Kısmen eVOLVER akıllı kollu içine sterilize şişeleri eklemek ve çizgiler üzerinde renk kodlama göre, uygun pozisyonlara hatları kanca. Kısa akması saman giriş hatları ekleyerek başlayın ve sonra uzun "effluks" saman için atık hatları.
    Dikkat: Gevşek bağlantılar veya yanlış yönlendirilmiş satırlar için kontrol etmek önemlidir. Bunu yapmak için başarısızlık neden olur ve büyük olasılıkla akıllı kol zarar verir.
  11. 10 s artışlarla tüm pompaları çalıştırın medya ile şişeleri doldurmak için. Görsel muayene "effluks" pompalarından emin olmak, taşmaları önlemek için "effluks" pipetler aracılığıyla medyayı verimli bir şekilde kaldırmaktadır. Eğer "effluks" pipetler verimli şekilde çalışmıyorsa, fluidik hat bağlantılarını ve peristaltik pompası inceleyin. Parçaları gerektiği gibi düzeltin veya değiştirin.
  12. Tam olarak akıllı kol tarafından kaplı kadar aşağı itme şişeleri.
  13. İnteraktif kurulum sayfasındaki eVOLVER dokunmatik ekranını kullanarak deneysel parametrelerin başlangıç koşullarını ayarlayın. Tüm şişeler için, sıcaklığı 30 °C ' ye ayarlayın ve 10 ' a kadar karıştırın. Tüm şişeleri seçmek için dokunmatik ekrana bir parmak sürükleyerek bir kerede tüm şişeler için yapılabilir.

3. eVOLVER yazılımı ve programlama Algoritmik Kültür rutinleri yapılandırma

  1. Bir bilgisayardaki eVOLVER panosunda deneme Yöneticisi sayfasına gidin. Deneme gezgin panelinde temel deneyi veya mevcut bir denemeyi başlangıç noktası olarak seçin ve yeni Klonla 'yı tıklatın.
    Not: Diğer gruplardaki denemeleri, deneysel tanımın deneme yöneticisine kaydedildiği repo 'ya GitHub bağlantısını yapıştırarak kullanmak mümkündür.
  2. Denemenin çalıştırılacak deneme adını ve eVOLVER aygıtını belirtin. Sayfadaki bu alanları değiştirerek istenen kalibrasyon ayarlarının seçildiğinden emin olun.
  3. Deneysel koşulları ayarlamak için şişe seçici ve parametre Tanım bölmeleri kullanın. Örneğin, şişeler için 0-4 sıcaklığını 30 °C ' ye ayarlamak için, şişe seçicisindeki şişeleri seçin, parametre tanımını 30 olarak ayarlayın ve set'e tıklayın. Her şişe için bir üst ve alt eşik ayarlamak için bu OD için tekrarlayın.
  4. Deneysel parametre tanımları tamamlandıktan sonra, Kaydet 'i tıklatarak deneyi kaydedin ve çalıştırmak için Başlat 'ı tıklatın.

4. gerçek zamanlı olarak deney ve Izleme başlatma

  1. Deneme devam ettikten sonra, interaktif panoda gerçek zamanlı veri paneline gidin. Her şişe için, OD değerlerinin sıfır olarak tuttukları ve sıcaklıkların grafiklerde gezinerek programlanmış seviyelere doğru veya ilerlemesini kontrol edin.
  2. İnokulumunu hazırlamak için, gece kültürlerinin od ölçmek, 25 ml bir şişe hacmi varsayarak istenilen kat seyreltme hesaplamak ve örnekleme portu aracılığıyla şişeleri içine inokulumunu hacmi hesaplanan pipet. Örneğin, gerekli bir başlangıç OD yaklaşık 0,05 bir kültür şişe içinde OD 2,0 olan gece kültürlerinden ulaşmak için, 625 μL hücrelerin her şişeye eklenmesi gerekir.
  3. OD grafiklerinin uygun şekilde güncellendiğini görmek için Pano üzerindeki grafikleri kontrol edin. İstenen başlangıç OD yakın bir artış grafiklerde görülmelidir.
  4. Panoda ilgili grafiklerde gezinerek deneme boyunca farklı veri türlerini (OD, sıcaklık, büyüme oranı, nesiller ve medya tüketimi gibi) izleyin. Bu değerler, Kullanıcı tarafından deneysel kararlar bildirebilir (örneğin zamanlama zaman noktaları) veya otomatik geribildirim gerçekleştirmek için işlevlerde bile kullanılır.
  5. Ortam şişeleri orta deney değiştirmek için, pompa olayların oluşmasını önlemek için deneme Yöneticisi panelinde deneme duraklatın. Hızlı bir şekilde boş şişeden medya çizgisini sökün ve yeni şişeye bağlayın. Kirlenme önlemek için Boru uçları dokunmadan kaçının. Deneyi deneme yöneticisinde devam ettirin.

5. eVOLVER şişeler dan örnekleme Maya hücreleri

  1. Protein sentezi inhibe ve akış sitometri analizi için Maya hücrelerini düzeltmek için bir sikloheksimit çözüm hazırlayın. 15 ml konik tüpte 12 ml PBS ve 12 μL, 20 mg/ml sikloheksimit ve 5 s için Vortex ekleyin.
  2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, kısım 100 μL, her bir 96-kuyu yuvarlak alt plakasının her bir kuyusu içine.
  3. Işığı engellemek ve gerekli olana kadar 4 °C ' de tutmak için plakası alüminyum folyo içinde sarın.
  4. Numune almak için, uzun uzunluk 200 μL ipuçları kullanılarak şişe kapağındaki örnekleme portu üzerinden pipet takın.
  5. Pipet 100 μL 'yi bir şişeden, sabitleme plakasında bir kuyu haline getirerek, 2-3x 'yi yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırarak folyo içinde iyileşir ve plakası 4 °C ' ye geri döner.

6. deney kırmak ve temizlemek

  1. Hazırlamak 1 L% 10 çamaşır suyu ve 2 500 mL dı su çözümleri büyük Beakers.
  2. Deneme Yöneticisi panelinde Stop komutunu göndererek deneyi durdurun. Veriler hala bulut özellikli veritabanında saklanır ve yine de daha sonra panonun gerçek zamanlı veri panelinde görüntülenebilir veya çevrimdışı analiz için indirilir.
  3. Akıllı kollu şişeleri çıkarın ve sonraki adımlarda taşmaları önlemek için bir otoklav raf yerleştirin.
  4. Medya şişelerinden medya giriş çizgilerini sökün ve onları% 10 çamaşır suyuna yerleştirin. Hatları ve şişeleri sterilize etmek için kurulum gibi eVOLVER kullanıcı arayüzünden pompalar çalıştırın.
  5. Dı suyunda şişeleri ve daldırın satırlarından hatları ayırın. İlk dı su ile sistem dışında tüm çamaşır suyu temizlemek için pompa çalıştırın, sonra hava ile.
  6. İlk 12 V güç kaynağını kapatmak, 5 s bekleyen ve sonra 5 V güç kaynağını kapatarak eVOLVER kapatın.
  7. 10% çamaşır suyu, sonra da dı su ile durulayın bar ve kapaklar karıştırın emmek. Onlar aracılığıyla dı su çalıştırarak her kapağın akını ve "effluks" piponları durulayın emin olun. Film duvarlara oluşmuştur Eğer test tüp fırça kullanarak şişeleri Scrub.
  8. Atıkları uygun şekilde bertaraf edin ve atık kapları iyice durulayın.
    Dikkat: Atık kaplar% 10 çamaşır suyu, sterilize hücre kültürü atık ve etanol iz miktarlarının bir karışımı içerecektir. Uygun kullanım ve bertaraf için bir güvenlik koordinatörüne danışın.

7. kesirli nüfusun akış sitometri analizini kullanarak Fitness ölçümü

  1. Uygun floresan kanal ve dedektörler16ile donatılmış bir akış sitometresi kullanarak Bölüm 5 toplanan örnekleri analiz edin.
  2. En az 10.000 örnek başına olayları ve ileriye ve yan dağılım verileri kullanarak bozulmamış hücreler için kapı edinin.
  3. Her bir popülasyonun kesirli dağılımını belirlemek için uygun floresan kanalına (örn. GFP) dayalı kapı.
  4. Bir bilgisayarda, "dışa aktar" düğmesini tıklatarak verileri deneme Yöneticisi sayfasından istediğiniz konuma kaydedin.
  5. EVOLVER veri dosyalarından her şişe için her zaman noktası tarafından tamamlanan nesillerin sayısını belirleyin. EVOLVER kodunda, nesiller ilk olarak her bir seyreltme olayı arasındaki OD verilerini segmentlere ayırarak hesaplanır, sonra her segment, büyüme hızı Equation 1 16olan her segment için formun temel bir üstel ile sığar. Bir zaman dilimindeki nesillerin sayısı aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:
    Equation 2
  6. Etiket ve etiketlenmemiş nüfusların günlük oranını, akış sitometri verilerinden üretim sayısında, yukarıdaki hesaplamalardan alınan zaman örneklerinin alındığı anda çizin. Doğrusal bölgeyi tanımlayın ve eğimi aşağıdaki denkleme göre sığdırın. Bu eğim genellikle rekabetçi Fitness18,19olarak tanımlanır.
    Equation 3

Representative Results

Burada açıklanan protokol, sıcaklık ve tuzluluk iki boyutlu stres gradyan arasında S. cerevisiae genetik türevleri için fitness haritaları oluşturmak için kullanılmıştır. Özellikle, her varyant gerinim için, bir floresan etiketli referans gerilme (S. cerevisiae gerinim BY4741 entegre bir kurucu mneongreen muhabiri) karşı ikili rekabet denemeleri yapmak için Evolver kullanılan 16 farklı Bu gerilimlerin kombinasyonları (Şekil 1). Varyantlar için, her biri stres koşulu eksenlerine duyarlı olarak öngörülen iki nakavt suşları seçilmiştir: yüksek sıcaklıklarda20 ve Δpbs2 Fitness kusurlarına sahip olduğu bildirilmiştir δprx1 yüksek tuz konsantrasyonları21. Bir kontrol varyantı olarak, referans gerilime benzer şekilde gerçekleştirilmesi beklenen, etiketlenmemiş bir vahşi tip BY4741 gerinim kullanılmıştır. Toplam olarak, bu 3 72-saat rekabet deneyler üç eVOLVER (16-şişe) cihazlar tüm tek bir bilgisayardan çalıştırmak arasında 48 şişeler aynı anda gerçekleştirildi.

EVOLVER interaktif Pano, her deneme sırasında oluşturulan büyük miktarda veri gezinmek için kullanılır (Şekil 2a). Tek bir eVOLVER cihazının 16 şişeleri arasında temsili OD izleri Şekil 2B'de gösterilir. Her iz, seyreltme tetiklemek ve kültürleri dar bir yoğunluk aralığında korumak için OD üzerinde geribildirim kullanan turbidostat kontrol algoritmasından karakteristik bir testere diş deseni görüntüler (Bu durumda 0.2-0.3). OD ve sıcaklık verileri sürekli olarak ölçülür, bulut özellikli veritabanına akışlı ve eVOLVER interaktif panoda gerçek zamanlı olarak güncellenir. Sürekli akış verilerinden, yüksek sıralı metrikler (örn. büyüme oranı, birikimli nesiller) panoda hesaplanabilir ve çizilebilir (Şekil 2C) ve hatta farklı seçim şemaları (örneğin, morbidostat) geri bildirim parametreleri olarak kullanılır.

Fitness haritaları oluşturmak için, referans geriliminin hem akış sitometri ölçümleri hem de eVOLVER büyüme verilerini birleştirerek varyant gerginliği outcompetes oranını ölçüyoruz. Özellikle, nüfus fraksiyonları her timepoint örneğinden akış sitometri verilerini kullanarak referans gerinim üzerinde varyant gerinim günlük oranı olarak hesaplanır. Her kültür ve zaman noktası için, geçen nesillerin sayısı, her seyreltme döneminde eVOLVER büyüme oranı verilerinden interpolasyonlu edilir. Günlük oranlarını nesillere karşı çizmek, koşullar arasındaki nitel farklar ortaya çıkmaya başlar (Şekil 3A). Fitness hesaplamak için, bir eğim her Plot18,19, bir nicel Fitness değeri (hem işaret ve oranı ile), varyant gerinim referans gerinim karşı nasıl yarışır açıklayan doğrusal kısmı ile uygundur ( Şekil 3B). Bu deneyde, negatif Fitness değerleri varyant gerinim referans gerinim tarafından outcompeted olduğunu gösterir. Tüm fitness hesaplamalarından ısı haritaları oluşturmak iki boyutlu Fitness peyzaj görselleştirme izin verir, suşlar ve koşullar arasında performans ince nicel farklılıkları açığa (Şekil 3c).

Fitness heatmaps, biz her varyant gerinim farklı şekillerde tezahür Fitness kusurları sergiler bakın. Δprx1 , öncelikle yüksek sıcaklıklara duyarlıdır, ancak tuz gerilimi, Fitness kusurunu artıran bir katkı efekti gibi görünür. Bunun tersine, Δpbs2 , sıcaklık ekseni boyunca minimal farklar ile yüksek tuz konsantrasyonlarına yanıt olarak öncelikle Fitness kusurları gösterir. Bu sonuçlar, özellikle birden fazla çevresel stresler, katkı, sinerjik veya epistatik etkileri olabilir etkileşimleri deşifre için yüksek çözünürlüklü seçim deneylerinin yardımcı programını vurgulayın.

Son olarak, bazı durumlarda, özellikle ciddi stres koşulları için, Fitness hesaplamaları abartılı veya eğrilmiş sonuçlara yol açabilir dikkat etmek önemlidir. Örneğin, Δpbs2 , referans gerilimine göre 39 °c/1 M NaCl koşulunda dik bir pozitif eğim göstermek için görünür (Şekil 3A). Bu, vahşi tür verilerinde yansıtılır ve bu durumda bu belirli metrik yardımcı programı sınırlar her iki suşların kötü büyüme atfedilir. Nesil yetersiz sayısı 1), eğim bağlantısı ile müdahale zaman noktalarının zayıf ayrımı ve 2) gecikme aşamasından kaynaklanan Stokastik etkilere karşı duyarlılık oluşur. Bu çalışmada bunu seçmediğiniz sırada, eVOLVER tarafından deney sırasında toplanan gerçek zamanlı büyüme verileri, deneyi uzatmak ve bu durum için ek timepoints toplamak için küçük bir çaba ile karar vermek için kullanılmış olabilir. Takip deneylerinde, doygunluk oluşmadan önce doğrusal bölgenin uzunluğunu uzatmak için başlangıç oranları da modüe edilebilir.


Figure 1
Şekil 1: eVOLVER çerçevesi ve deneysel tasarım genel bakış. (A) Evolver, kültür koşullarının çok parametreli kontrolüne izin veren otomatik, sürekli bir kültür platformudur. Platform, kültür koşullarını kontrol etmek için sensörler ve aktüatörler, kültürlerin içinde ve dışında akan medya ve atık için peristaltik pompa dizisi, cihaz ile manuel etkileşim için bir dokunmatik ekran ve bir bilgisayar olan akıllı kollu, oluşur platformdaki verilerin akışa aldığı bulut altyapısıyla etkileşimde bulunmak için kullanılır. (B) Evolver birden çok şekilde yapılandırılabilir: fiziksel olarak, hücre ve medya girişleri ve program aracılığıyla akıllı kollu kültür şişe modülleri kontrol algoritmaları ayarlayarak. Bu çok boyutlu seçim/çevresel degradeler yüksek çözünürlükte program için kullanılabilir, belirlenen zaman noktalarında fiziksel olarak toplanan hücrelerden oluşan çıkışlar ve kültür verilerinin gerçek zamanlı akışı ile. (C) bir iki boyutlu seçim gradyan arasında büyüme Fitness deneyi yapmak Için Evolver yapılandırma, sıcaklık ve ozostik stres oluşur. Evolver kültür şişeleri bir referans ve varyant Maya gerinim eşit oranlarda ile seribaşı edildi. Bir turbidostat rutin tanımlanmış bir OD penceresinde (OD 0.2-0.3) üstel faz tüm kültürler korumak için programlanmıştır. Sıcaklık ve medya koşulları, iki bağımsız stres degradeleri oluşturmak için akıllı kol dizisi boyunca değişebilir. Temel medya, bakteriyel kontaminasyona karşı önlem olarak YPD (% 2 glikoz) + 100 μg/ml karbenikilin + 25 μg/ml kloramfenikol 'dan oluşmuştur. Medya bileşimleri, 0 M, 0,6 m, 0,8 M veya 1,0 M 'ye ek NaCl ekleyerek çeşitlendirilmiş. şişe sıcaklıkları dört değerden birine programlanmıştır: 30 °C, 35 °C, 37 °C, veya 39 °C. (D) üç test koşulundan kültür od ve nüfus fraksiyonları için ham çıktı örnekleri. Yarışma deneyi 72 h, 24 saat ve daha sonra her 12 saat deneme sonucuna kadar örnekleme için tutulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: eVOLVER gerçek zamanlı veri analizi panosu. (A) Evolver verileri, bulut tabanlı yazılım aracılığıyla interaktif bir panoya gerçek zamanlı olarak işlenir ve akışa verilir. Pano aracılığıyla, kullanıcılar tanımlayabilir ve bağlı bir eVOLVER üzerinde kendi kültür rutinleri başlatmak, tüm eVOLVER birimleri arasında şu anda çalışan denemeler monitör ve tek bir şişe veya gerekirse şişeleri set el ile deneysel koşullar değişebilir. (B) tüm deney süresi boyunca test edilen koşulların matrisinde her şişe için od izleri. İzlemeler, deneylerin istenilen şekilde çalıştığını ve daha fazla analiz için kullanılan Post-deney olmasını sağlamak için gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. (C) büyüme oranları ve hücre nesiller deney ilerlemesini izlemek için sınek üzerinde od izleri hesaplanabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Fitness yüzeylerinin inşası. (A) hücre popülasyon fraksiyonları doğal log (varyant strain/referans strain) hücreler nesil karşı çizilen. Renk, tuz konsantrasyonlarını ayırt ederken seçimin sıcaklığını gösterir. (B) varyantın göreli Fitness değerini referans gerilmesine göre ölçmek için, bir fitness ölçümü, hücre nüfus kesinin nesiller boyunca değiştiğini gösteren oranlardan türetilir. Bu metrik, en az üç nokta kullanarak hücresel kesir grafiklerinde doğrusal bölgeden hesaplanır. (C) Bağıl Fitness ölçümleri, çevresel stres degradelerinin üzerinde bir fitness yüzeyi oluşturmak için bir heatmap 'de görüntülenir. Vahşi tip ve Δpbs2 için sağ üst köşe koşulu (39 °c/1.0 M NaCl), kültürlerin yetersiz nesillerden geçtiğini (bkz. temsilci sonuçları) kullanarak bu analizlere dahil edilmez. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Büyüme seçimi biyoloji vazgeçilmez bir araçtır, geniş oluşturmak ve hücresel nüfus arasındaki fenotipi farklılıkları karakterize etmek için kullanılır. Toplu kültürler büyüme seçimi sınırlı bir şekilde izin verirken, sürekli kültür teknikleri önemli ölçüde bu deneylerin kontrol ve öngörülebilirlik derecesini genişletmek, form ve seçim dinamikleri oluşturmak için üzerinde hassas düzenleme uygulayarak tekrarlanabilen, nicel sonuçlar22. Sürekli kültür, yüksek çeşitlilik kitaplıkları için20,23,24,25ve deneysel olarak sofistike adaptif rejimler uygulamak için seçimi titizlikle kontrol etmek için kullanıldı ve Yönetmen evrim11,12,26,27. Sürekli kültür, kompleks genetik sistemleri daha iyi anlamak ve mühendislik biyoprodüksiyon suşları optimize etmek için bir dizi niceli kontrollü koşullarda hücrelerin kesin karakterizasyonu sağlar9,14 , 28oldu.

Ancak, sürekli kültür için evrensel bir protokol yoktur, seçici koşullarda ince değişiklikler biyolojik sonuçlarında dramatik değişikliklere yol açabilir gibi4,29,30. Deneyler seçim rejimi arasında seçim yapmak ve buna göre deneysel protokoller ve ekipman uyum mümkün olmalıdır. Kontrol parametreleri arasında bir seçim sunmanın yanı sıra, bu tür sistemler, karmaşık olarak etkileşime giren girişleri deşifre etmek için gerekli olan yüksek paralel deneylerde aynı anda çeşitli parametreleri yönetmek için yeterince sofistike olacaktır biyolojik sistemler (örn. epistasis). eVOLVER, kullanıcıların oldukça uzmanlaşmış çevresel niş belirtmek için kültür koşulları ve fluidik fonksiyonlar arasında keyfi program geribildirim denetimi sağlayarak bu sorunu giderir.

Geçerli kurulumun sınırlamalarını aşmak ve kontrol parametrelerini genişletmek veya değiştirmek için akıllı kol, yeni sensörler veya aktüatörler eklemek için kolayca yeniden tasarlanabilirdi. Ayrıca, şişe hacmini azaltmak, sürekli kültürde önemli olabilecek medya harcamalarını azaltacaktır. Mevcut tasarım sıcaklık, kültür ajitasyon, ışık indüksiyon, bulanıklık ve Fluidics ölçüm ve kontrol izin verirken, diğer parametreler dıştan şişe örnekleme tarafından ölçülmelidir. Güncel çalışmalar, Lusiferaz yoluyla enzimatik aktivitesi izleme ve çözünmüş oksijen ve pH 'yı doğrudan Evolver kültürlerinde düzenleyen yeteneğini içerir. Ayrıca, bu çalışma gösterilmiyor iken, Evolver yeni millifluidic çoğullama cihazları ile arayüz olabilir16 büyük ölçekli entegrasyon ilkeleri üzerinde beraberlik (elektronik kaynaklanan ve mikrofluidics tarafından benimsenen) amacıyla pahalı olmayan daha karmaşık fluidik elleçleme (örn. Multiplexed fluidik girişler, şişe-şişe transferleri). Bu Wetware modülleri, otomatikleştirilmiş fluidik rutinlerde farklı vanalar kombinasyonlarını programlayarak kullanıcıların akışkanlar yönlendirmesine olanak tanıyan laboratuvarda tamamen tasarlanıp imal edilebilir. Bu, kullanıcıların geleneksel olarak sürekli kültürde kullanılan sert fluidik tasarımları üstesinden gelmelerine izin verir, aynı zamanda daha az sayıda pahalı kontrol elemanı (örn. Peristaltik pompalar) ile fluidik yetenekleri yüksek verim için ölçeklendirebilir. Son olarak, bu millifluidics ve DıY bileşenleri kullanacak bir autosampling platformu dahil etmek umuduyla, daha uzun ve örnekleme kültürlerinin hantal olacağını daha büyük deneyler sırasında manuel etkileşim sınırlaması üstesinden.

Platformdaki fiziksel değişikliklere ek olarak, Web tabanlı yazılım, kullanıcıların özel eVOLVER komut dosyalarını yazmalarına, düzenlemesine ve paylaşmasına izin vererek, tam otomatik, geri bildirim özellikli kültür programları (örn. turbidostat) oluşturarak yeni özgürlük derecelerini açar. Kullanıcılar programlı olarak aynı seçim şeması üzerinde ince varyasyonlar parametre aralıkları arasında süpürme veya karmaşık seçim düzenleri herhangi bir sayıda belirtmek için yeni kombinasyonları denetim algoritmaları bağlayın. Ayrıca, kültürlerin gerçek zamanlı olarak kolayca izlenmesi yeteneği, deneylerin gerçekleştirildiği yolu dönüştürür. Gerçek zamanlı izleme ile, kullanıcılar 1) çalışır arasında tutarlılık, biyoüretim uygulamaları ve yüksek verimlilik denemeleri için kritik bir özellik kontrol ve 2) gerektiğinde denemeler sırasında müdahale, sergileyen zorlu suşları gidermek için düşük büyüme veya biyofilm oluşumu veya kullanıcı hatalarını teşhis etmek (örneğin, kontaminasyon). Son olarak, birden çok veri akışları ile toplanan ve gerçek zamanlı olarak her bir kültür için yorumlanan eVOLVER yeni akış analizi için makine öğrenme yaklaşımlarını kolaylaştırabilir veri, yüksek yoğunlukta oluşturur.

Fitness karakterizasyonu, Kütüphane seçimi ve laboratuar evrimine yönelik kullanımlarının ötesinde, entegre fluidikler ile eVOLVER 'de uygulama için olgunlaşmış olarak ilgili alanların bir sayısını görebilirsiniz. Mikrobiyom örnekleri ile Evolver deneyler kontrollü ortamlarda,32, Kültüromik teknikleri33kullanarak Mikrobiyota kompozisyon keşfetmek, veya dinamik türler için türleri karışım tahlil toplum istikrar olabilir kolonizasyon veya istila34,35ekolojik dinamiklerini sorgulama. Biyomoleküllerin sürekli yönlendirilmiş evrim için çok sayıda yöntem kolayca de26,36,37, büyük ölçüde erişilebilirlik ve bu sistemlerin verimi artan cihazda uygulanabilir. Dinamik, yüksek verim doğası içinde medya kompozisyon, sıcaklık ve suşları gibi büyüyen koşulları optimize yeteneği endüstriyel biomanufacturing uygulamaları için optimizasyon çabaları yardımcı olabilir9. Biz daha fazla dikey entegre eVOLVER mikroskopi ve akış sitometri gibi diğer analiz teknikleri ile kapalı bir döngü moda, büyüme ve hem tek hücre ve nüfus hücresel kültürlerin analizi için tam otomatik bir sistem sağlayan Düzey. Dahası, akıllı Sleeve bazı donanım modifikasyonları ile gemi sızdırmazlık ve gaz içeriği kontrol gibi, eVOLVER potansiyel hücre türleri, süspansiyon memeli hücreler gibi daha geniş bir yelpazede büyümesini desteklemek için adapte edilebilir. Ayrıca, tüm çerçeveyi anaerobik hücre kültürü için bir anaerobik odasına yerleştirmek de mümkündür. İleriye bakarak, bizim yazılım çerçevesi merkezi bir bulut altyapısına oluşturmak ve bu kullanıcıların kolayca yapılandırmak, analiz ve fiziksel laboratuvarında mevcut olmasına gerek kalmadan uzaktan verileri paylaşmak için izin inanıyorum hedefliyoruz. Veri küratörü olarak işleyen bulut altyapısı, deneyler boyunca büyük ölçekli meta analizlere de kendini ödünç verir. Biz eVOLVER ve bu gelecekteki gelişmeler büyük ölçüde sürekli kültürde Otomasyon ve yenilik kolaylaştırarak olası büyüme seçim deneylerinin kapsamını genişletmek olacağını tahmin ediyoruz.

Disclosures

Yazarlar, Brandon G. Wong ve Ahmad S. Khalil, bu makalede kullanılan eVOLVER platformu geliştiren Fynch Bioscience Inc., kurucularından vardır.

Acknowledgments

Sistemin tasarımında yardım için B. Stafford 'a ve sistemin inşasına yardımcı olmak için H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe ve A. Cavale 'ye teşekkür ederiz. Elektronik tasarım tesisi (EDF), mühendislik ürün Yenilik Merkezi (EPıC) ve yazılım & uygulama Inovasyon Laboratuvarı (yelken), Boston Üniversitesi 'nde bulunan Hariri Bilişim Enstitüsü 'nde hizmet verebileceğini kabul ediyoruz. Bu iş bir NSF karıyer Ödülü (MCB-1350949 için A.S.K.) tarafından destekleniyordu ve DARPA HR0011-15-C-0091 ve HR0011-18-2-0014 (A.S.K.) verir. A.S.K. Ayrıca NıH yönetmen yeni yenilik Ödülü (1DP2Aı131083-01), DARPA genç fakülte Ödülü (D16AP00142) ve bilgisayar (CCF-1522074) NSF Expeditions gelen fon kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 Gallon Plastic Hedpack with cap Midwest Brewing and Winemaking Supplies 45-56Y8-E2FR For waste collection
a-D(+)-Glucose Chem-Impex 00805 For YPD Medium
Attune NxT Autosampler Thermo Fisher Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Used to determine population fractions via single cell fluoresence
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118-07-0 For YPD Medium
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648250 For YPD Medium
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature McMaster- Carr 5121K731 For media input branching
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 For YPD Medium
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 Fisher Scientific 50371500 For Sterilization of fluidic lines
Custom eVOLVER vial lid FynchBio Lid has ports for sampling and fluidic input/output
Cycloheximide Fisher Scientific ICN10018301 For flow cytometry sampling plates
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4 For sterilization of fluidic lines
eVOLVER Unit FynchBio
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) Fisher Scientific 02-681-420 For vial sampling
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars Fisher Scientific 14-513-57 Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap Fisher Scientific FB8002000 Must be fitted with tubing
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD McMaster- Carr 51135K73 For media bottles
Mac Mini Apple For running the experiment/collecting data
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP243820 For flow cytometry sampling plates
Pipettes Eppendorf
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K141 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K144 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K291 For media bottles
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene McMaster- Carr 51525K294 For media bottles
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN Chemglass CG-4910-04 Culture vials
Sodium Chloride (NaCl) Fsher Scientific S271-3 For YPD Medium
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices For measuring OD600 of overnight cell cultures
Vial Only, Sample, 40 mL, Clear, 28 mm x95 mm, GPI 24-400 Chemglass CG-4902-08 Culture vials
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500 For YPD Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monod, J. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology. , (1949).
  2. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).
  3. Bull, A. T. The renaissance of continuous culture in the post-genomics age. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).
  4. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  5. Lang, G. I., et al. Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations. Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).
  6. Maddamsetti, R., et al. Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).
  7. Ishii, N., et al. Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations. Science. 316 (5824), 593-597 (2007).
  8. Brauer, M. J., et al. Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast. Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  9. Moser, F., et al. Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors. ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).
  10. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).
  11. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).
  12. Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast. Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).
  13. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).
  14. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).
  15. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  16. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  17. Bondi, A. B. Characteristics of scalability and their impact on performance. Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP ’00. , 195-203 (2000).
  18. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology. Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).
  19. Sanchez, M. R., et al. Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species. PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).
  20. Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).
  21. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).
  22. Piper, M. D. W., et al. Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).
  23. Badarinarayana, V., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  24. Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile. Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).
  25. McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries. bioRxiv. , 450536 (2018).
  26. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  27. Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).
  28. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).
  29. Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).
  30. Yona, A. H., et al. Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).
  31. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3, 42 (2015).
  32. Goldford, J. E., et al. Emergent simplicity in microbial community assembly. Science. 361 (6401), 469-474 (2018).
  33. Lagier, J. -C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. Culturing the human microbiota and culturomics. Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).
  34. Fukami, T. Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).
  35. Friedman, J., Gore, J. Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations. Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).
  36. Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast. Nature Communications. 7, 13051 (2016).
  37. Ravikumar, A., et al. Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds. Cell. 175, (2018).

Tags

Genetik sayı 147 eVOLVER sürekli kültür mikrobiyal nüfus laboratuar Otomasyonu büyüme seçimi deneysel evrim Fitness peyzaj sistem biyoloji
EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heins, Z. J., Mancuso, C. P.,… More

Heins, Z. J., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Wong, B. G., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER. J. Vis. Exp. (147), e59652, doi:10.3791/59652 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter