Summary

गुर्दे की सबकैप्सुलर ट्रांसप्लांटेशन 2'-Deoxyguanosine-treated Murine भ्रूण थाइमस में नग्न चूहे

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

हम एक नग्न माउस के गुर्दे कैप्सूल में 2’deoxyguanosine इलाज E18.5 थाइमस प्रत्यारोपण करने के लिए एक सरल और कुशल विधि प्रदान करते हैं. इस विधि दोनों थाइमिक उपकला कोशिकाओं समारोह और टी कोशिकाओं परिपक्वता के अध्ययन में सहयोगी होना चाहिए.

Abstract

थाइमस एक महत्वपूर्ण केंद्रीय प्रतिरक्षा अंग है, जो टी कोशिकाओं के विकास और भेदभाव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। थाइमस प्रत्यारोपण थाइमिक उपकला कोशिका समारोह और वीवो में टी कोशिकाओं परिपक्वता की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। यहाँ हम प्रत्यारोपण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला के भीतर इस्तेमाल प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन करेंगे 2′-deoxyguanosine (दाता के लिम्फोसाइटों को कम करने के लिए) एक athymic नग्न माउस के गुर्दे कैप्सूल में भ्रूण थाइमस इलाज किया. इस विधि दोनों सरल और कुशल है और विशेष कौशल या उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। इस सरल विधि के माध्यम से प्राप्त परिणामों से पता चला कि प्रत्यारोपित थाइमस प्रभावी रूप से प्राप्तकर्ता की टी कोशिकाओं के उत्पादन का समर्थन कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल के संबंध में कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को आगे स्पष्ट किया जाएगा।

Introduction

थाइमस केंद्रीय प्रतिरक्षा अंग है, थाइमस थाइमोसाइट्स के भीतर सकारात्मक और नकारात्मक चयन से गुजरना, और परिपक्व टी कोशिकाओं1,2हो जाते हैं। असामान्य सकारात्मक या नकारात्मक चयन का परिणाम प्रतिरक्षा कमी या ऑटोम्यून्यून पैथोलॉजीज में क्रमशः3,4. इसलिए, थाइमस अंग प्रत्यारोपण दाता के थाइमस में टी कोशिकाओं के चयन की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है। जीन उत्परिवर्तनों द्वारा मध्यस्थता किए गए थाइमिक उपकला फलन का विश्लेषण करते समययह विधि विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो 5 उत्परिवर्तित होने पर भ्रूणीय घातक फीनोटाइप का कारण बनती है .

प्रतिरोपित थाइमस में प्राप्तकर्ता की टी कोशिकाओं की परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए, थाइमस के भीतर दाता के लिम्फोसाइटों की कमी आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए भ्रूण 14, 15 या 16 दिन (E14, E15, E16) थाइमस का चयन आमतौर पर6,7किया जाता है। अधिक परिपक्व चरणों से थाइमस भी सफलतापूर्वक 2′-deoxyguanosine के साथ इलाज के द्वारा दाता के लिम्फोसाइटों के समाप्त किया जा सकता है. तथापि, लिम्फोसाइटों को कम करने और पुराने थाइमस संस्कृति के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन पहले8,9नहीं किया गया है। जबकि प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल कई अध्ययनों से शुरू किया गया है10,11, आगे संशोधन और इन प्रोटोकॉल के सुधार आवश्यक है.

हमारे प्रोटोकॉल को दो भागों में विभाजित किया गया है: (i) देर से विकास के चरण E18.5 थाइमस से टी लिम्फोसाइटों की कमी 2′-deoxyguanosine युक्त मीडिया में संस्कृति द्वारा। (ii) प्राप्तकर्ताओं में सुसंस्कृत थाइमस का प्रत्यारोपण। इस प्रक्रिया में, हम गुर्दे की चोट के कम मौका के साथ गुर्दे कैप्सूल में बड़े ऊतक (E18.5 थाइमस) देने के लिए एक सरल तरीका विकसित की है। बाद के चरण थाइमस पर ध्यान केंद्रित करते समय, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे या विभिन्न विकासात्मक चरणों या अन्य समान आकार के ऊतकों में थाइमस के प्रत्यारोपण के लिए संशोधनों के साथ भी किया जा सकता है।

Protocol

प्रस्तुत प्रोटोकॉल पशु देखभाल के बारे में जिनान विश्वविद्यालय की आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है। नोट: प्रयुक्त सामग्री सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं. 1. भ?…

Representative Results

यहाँ हम पृथक E18.5 थाइमस को दर्शाते हैं जिसमें दो पूर्ण खण्ड होते हैं (चित्र 1)। इसके अतिरिक्त, हम खोपड़ी नस सुई है कि जलसेक ट्यूब पर एक बेवल बनाने के लिए काटा गया था दिखाने के लिए (चित्र 2</strong…

Discussion

भ्रूणीय थाइमस का वृक्क उपकैप्सुलर प्रतिरोपण थाइमिक उपकला कोशिकाओं के कार्य और विवो में टी कोशिकाओं की परिपक्वता की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। हालांकि भ्रूण थाइमस अंग सं?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम S.J. के लिए जिनान विश्वविद्यालय के प्रारंभ पैकेज द्वारा और ग्वांग्झू चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रेट नंबर 201704020209 S.J.). हम पांडुलिपि के proofreading और संपादन के लिए एमी Botta (जीव विज्ञान विभाग, न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय, टोरंटो, पर M3J 1P3, कनाडा) धन्यवाद.

Materials

0.5% Povidone iodine Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd 20171113
0.9% Sodium Chloride Injection Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd 2C17112101
1 mL Sterile syringe Solarbio YA1090
2’-Deoxyguanosine MEC HY-17563 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM)
24 Well Plate Corning Incorporated Costar 3524
4-0 Surgical suture needles with thread NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China YY0166-2002
60mm Cell Culture Dish Corning Incorporated 430166
70% ETOH LIRCON 20181221
APC anti-mouse CD8a antibodies Biolegend 100711 1:100
Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1060 To sterilize before use
Cefmetazole Sodium for Injection Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd 17062111 079 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight
Dissecting scissors, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JC2303 To sterilize before use
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10270-106
Fine forceps, JZ 10 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. JD1050 To sterilize before use
Flow cytometry BD FACSCanto II
Flunixin meglumine MACLIN F810147 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight
Forceps, Dumont#5 World Precision Instruments 14098 To sterilize before use
Infrared lamp OTLAN MT-810
Needle holder, JZ 14 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J32010 To sterilize before use
PE anti-mouse CD4 Biolegend 100511 1:100
Penicillin-Streptomycin mixture GIBCO 15140122 1:100
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight
RPMI1640 Medium GIBCO C14-11875-093
Scalp vein needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd XC001
Spring scissors VANNAS S11014-12 To sterilize before use
stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sterile 15cm cotton swab Guangzhou Haozheng 20150014
Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P Guangzhou Haozheng 20172640868
Sterile PBS (1x) GENOM GNM20012
Tissue forceps, JZ 12.5 cm Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. J41010 To sterilize before use

References

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Cite This Article
Wang, J., Chen, G., Cui, Q., Song, E., Tao, W., Chen, W., Wang, C., Jia, S. Renal Subcapsular Transplantation of 2′-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice. J. Vis. Exp. (149), e59657, doi:10.3791/59657 (2019).

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