गुर्दे की सबकैप्सुलर ट्रांसप्लांटेशन 2'-Deoxyguanosine-treated Murine भ्रूण थाइमस में नग्न चूहे
Summary
हम एक नग्न माउस के गुर्दे कैप्सूल में 2’deoxyguanosine इलाज E18.5 थाइमस प्रत्यारोपण करने के लिए एक सरल और कुशल विधि प्रदान करते हैं. इस विधि दोनों थाइमिक उपकला कोशिकाओं समारोह और टी कोशिकाओं परिपक्वता के अध्ययन में सहयोगी होना चाहिए.
Abstract
थाइमस एक महत्वपूर्ण केंद्रीय प्रतिरक्षा अंग है, जो टी कोशिकाओं के विकास और भेदभाव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। थाइमस प्रत्यारोपण थाइमिक उपकला कोशिका समारोह और वीवो में टी कोशिकाओं परिपक्वता की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। यहाँ हम प्रत्यारोपण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला के भीतर इस्तेमाल प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन करेंगे 2′-deoxyguanosine (दाता के लिम्फोसाइटों को कम करने के लिए) एक athymic नग्न माउस के गुर्दे कैप्सूल में भ्रूण थाइमस इलाज किया. इस विधि दोनों सरल और कुशल है और विशेष कौशल या उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। इस सरल विधि के माध्यम से प्राप्त परिणामों से पता चला कि प्रत्यारोपित थाइमस प्रभावी रूप से प्राप्तकर्ता की टी कोशिकाओं के उत्पादन का समर्थन कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल के संबंध में कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को आगे स्पष्ट किया जाएगा।
Introduction
थाइमस केंद्रीय प्रतिरक्षा अंग है, थाइमस थाइमोसाइट्स के भीतर सकारात्मक और नकारात्मक चयन से गुजरना, और परिपक्व टी कोशिकाओं1,2हो जाते हैं। असामान्य सकारात्मक या नकारात्मक चयन का परिणाम प्रतिरक्षा कमी या ऑटोम्यून्यून पैथोलॉजीज में क्रमशः3,4. इसलिए, थाइमस अंग प्रत्यारोपण दाता के थाइमस में टी कोशिकाओं के चयन की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है। जीन उत्परिवर्तनों द्वारा मध्यस्थता किए गए थाइमिक उपकला फलन का विश्लेषण करते समययह विधि विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो 5 उत्परिवर्तित होने पर भ्रूणीय घातक फीनोटाइप का कारण बनती है .
प्रतिरोपित थाइमस में प्राप्तकर्ता की टी कोशिकाओं की परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए, थाइमस के भीतर दाता के लिम्फोसाइटों की कमी आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए भ्रूण 14, 15 या 16 दिन (E14, E15, E16) थाइमस का चयन आमतौर पर6,7किया जाता है। अधिक परिपक्व चरणों से थाइमस भी सफलतापूर्वक 2′-deoxyguanosine के साथ इलाज के द्वारा दाता के लिम्फोसाइटों के समाप्त किया जा सकता है. तथापि, लिम्फोसाइटों को कम करने और पुराने थाइमस संस्कृति के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन पहले8,9नहीं किया गया है। जबकि प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल कई अध्ययनों से शुरू किया गया है10,11, आगे संशोधन और इन प्रोटोकॉल के सुधार आवश्यक है.
हमारे प्रोटोकॉल को दो भागों में विभाजित किया गया है: (i) देर से विकास के चरण E18.5 थाइमस से टी लिम्फोसाइटों की कमी 2′-deoxyguanosine युक्त मीडिया में संस्कृति द्वारा। (ii) प्राप्तकर्ताओं में सुसंस्कृत थाइमस का प्रत्यारोपण। इस प्रक्रिया में, हम गुर्दे की चोट के कम मौका के साथ गुर्दे कैप्सूल में बड़े ऊतक (E18.5 थाइमस) देने के लिए एक सरल तरीका विकसित की है। बाद के चरण थाइमस पर ध्यान केंद्रित करते समय, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे या विभिन्न विकासात्मक चरणों या अन्य समान आकार के ऊतकों में थाइमस के प्रत्यारोपण के लिए संशोधनों के साथ भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
भ्रूणीय थाइमस का वृक्क उपकैप्सुलर प्रतिरोपण थाइमिक उपकला कोशिकाओं के कार्य और विवो में टी कोशिकाओं की परिपक्वता की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। हालांकि भ्रूण थाइमस अंग सं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम S.J. के लिए जिनान विश्वविद्यालय के प्रारंभ पैकेज द्वारा और ग्वांग्झू चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (ग्रेट नंबर 201704020209 S.J.). हम पांडुलिपि के proofreading और संपादन के लिए एमी Botta (जीव विज्ञान विभाग, न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय, टोरंटो, पर M3J 1P3, कनाडा) धन्यवाद.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
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