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Genetics

रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट Drosophila का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मानव रोगों से जुड़े दुर्लभ जीन वेरिएंट के कार्यात्मक परिणामों का आकलन करने के लिए Drosophila melanogaster में विवो प्रयोगों के डिजाइन और प्रदर्शन की रूपरेखा तैयार करना है।

Abstract

अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में अग्रिम दोनों नैदानिक निदान और अत्याधुनिक मानव आनुवंशिकी अनुसंधान के लिए पूरे जीनोम और पूरे-exome datasets और अधिक सुलभ बना दिया है। हालांकि silico एल्गोरिदम में की एक संख्या इन डेटासेट में पहचान वेरिएंट के रोगजनन की भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया गया है, कार्यात्मक अध्ययन कैसे विशिष्ट जीनोमिक वेरिएंट प्रोटीन समारोह को प्रभावित करने का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, विशेष रूप से missense के लिए वेरिएंट. Undiagnosed रोग नेटवर्क (UDN) और अन्य दुर्लभ रोग अनुसंधान व्यंजन में, मॉडल जीवों (एमओ) Drosophilaसहित, सी elegans, ज़ेब्राफ़िश, और चूहों सक्रिय रूप से putative मानव रोग के कारण के कार्य का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है वेरिएंट. इस प्रोटोकॉल UDN के मॉडल जीव स्क्रीनिंग केंद्र Drosophila कोर में इस्तेमाल दुर्लभ मानव वेरिएंट के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है. कार्यप्रवाह कई सार्वजनिक डेटाबेस से मानव और MO जानकारी एकत्र करने के साथ शुरू होता है, MARRVEL वेब संसाधन का उपयोग करने का आकलन करने के लिए कि क्या संस्करण एक रोगी की स्थिति में योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डिजाइन प्रभावी उपलब्ध प्रयोगों के आधार पर होने की संभावना है ज्ञान और संसाधनों. अगले, आनुवंशिक उपकरण (जैसे, T2A-GAL4 और UAS मानव cDNA लाइनों) Drosophilaमें ब्याज के वेरिएंट के कार्यों का आकलन करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं. इन अभिकर्मकों के विकास पर, बचाव और overexpression प्रयोगों के आधार पर दो आयामी कार्यात्मक परख संस्करण समारोह का आकलन करने के लिए किया जा सकता है. बचाव शाखा में, अंतर्जात मक्खी जीन संदर्भ या भिन्न मानव transgenes के साथ orthologous Drosophila जीन की जगह द्वारा "मानवीकृत" कर रहे हैं. अतिअभिव्यक्ति शाखा में, संदर्भ और भिन्न मानव प्रोटीन exogenously ऊतकों की एक किस्म में संचालित कर रहे हैं. दोनों ही मामलों में, किसी भी scorable phenotype (जैसे, घातकता, नेत्र आकृतिविज्ञान, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) ब्याज की बीमारी के बावजूद, एक पढ़ने के बाहर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. संदर्भ और भिन्न alleles के बीच मनाया अंतर एक संस्करण-विशिष्ट प्रभाव का सुझाव है, और इस प्रकार की संभावना रोगजनकता. इस प्रोटोकॉल तेजी से अनुमति देता है, ज्ञात और अज्ञात कार्यों के साथ जीन के putative मानव रोग पैदा करने वाले वेरिएंट के vivo आकलन में.

Introduction

दुर्लभ रोगों वाले रोगियों को अक्सर एक कठिन यात्रा से गुजरना पड़ता है जिसे सटीक निदान प्राप्त करने के लिए "निदान odyssey" के रूप में जाना जाताहै 1. अधिकांश दुर्लभ रोगों के लिए एक मजबूत आनुवंशिक मूल है माना जाता है, आनुवंशिक / उम्मीदवार जीन पैनल अनुक्रमण और प्रतिलिपि संख्या भिन्नता विश्लेषण गुणसूत्र microarrays के आधार पर के अलावा, पूरे-exome (WES) और पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) प्रौद्योगिकियों पिछले एक दशक में तेजी से मूल्यवान उपकरण बन गए हैं2, 3. वर्तमान में, WES और WGS में एक ज्ञात रोगजनक संस्करण की पहचान करने के लिए नैदानिक दर $ 25% (बाल रोग मामलों में उच्च)4,5है। ज्यादातर मामलों के लिए है कि नैदानिक WES/WGS के बाद undiagnosed रहते हैं, एक आम मुद्दा यह है कि वहाँ कई उम्मीदवार जीन और वेरिएंट हैं. अगली पीढ़ी अनुक्रमण अक्सर कई जीनों में उपन्यास या अल्ट्रा दुर्लभ वेरिएंट की पहचान करता है, और व्याख्या है कि क्या इन वेरिएंट रोग phenotypes के लिए योगदान चुनौतीपूर्ण है. उदाहरण के लिए, हालांकि जीन में सबसे बकवास या frameshift उत्परिवर्तनों को नुकसान के समारोह (LOF) encoded प्रतिलिपि की बकवास मध्यस्थता क्षय के कारण alleles माना जाता है, पिछले exons में पाया उत्परिवर्तनों को काटना इस प्रक्रिया से बच और के रूप में कार्य कर सकते हैं सौम्ययाे या लाभ-कार्य (जीओएफ) एलेलेज6|

इसके अलावा, एक missense allele के प्रभाव की भविष्यवाणी एक चुनौतीपूर्ण काम है, क्योंकि यह विभिन्न आनुवंशिक परिदृश्यों की एक संख्या में परिणाम के रूप में पहली बार 1930 के दशक में हरमन Muller द्वारा वर्णित कर सकते हैं (यानी, अरूप, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, या isomorph)7 . सिलिको कार्यक्रमों और तरीकों में कई विकासवादी संरक्षण के आधार पर missense वेरिएंट के रोगजनन की भविष्यवाणी करने के लिए विकसित किया गया है, एमिनो एसिड परिवर्तन के प्रकार, एक कार्यात्मक डोमेन के भीतर स्थिति, सामान्य आबादी में एलीले आवृत्ति, और अन्य पैरामीटर8. हालांकि, इन कार्यक्रमों संस्करण व्याख्या की जटिल समस्या को हल करने के लिए एक व्यापक समाधान नहीं हैं. दिलचस्प है, हाल ही में एक अध्ययन से पता चला है कि पांच मोटे तौर पर इस्तेमाल किया संस्करण रोगजनकता भविष्यवाणी एल्गोरिदम (पॉलीफेन9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, उत्परिवर्तन टोस्टर) रोगजनकता पर सहमत हैं 80% समय का . विशेष रूप से, यहां तक कि जब सभी एल्गोरिदम सहमत हैं, वे समय के 11% तक रोगजनकता की एक गलत भविष्यवाणी वापस. यह न केवल दोषपूर्ण नैदानिक व्याख्या की ओर जाता है, लेकिन यह भी उन्हें सौम्य के रूप में झूठी लिस्टिंग द्वारा नए वेरिएंट पर निम्नलिखित से शोधकर्ताओं को रोक सकता है. silico मॉडलिंग में की वर्तमान सीमा के पूरक के लिए एक तरीका है प्रयोगात्मक डेटा है कि इन विट्रो, पूर्व विवो (उदा., सुसंस्कृत कोशिकाओं, organoids), या vivo में संस्करण समारोह के प्रभाव को दर्शाता है प्रदान करने के लिए है.

एमओ में दुर्लभ रोग जुड़े वेरिएंट के vivo कार्यात्मक अध्ययन में अद्वितीय ताकतहै 13 और दुनिया भर में कई दुर्लभ रोग अनुसंधान पहल द्वारा अपनाया गया है, संयुक्त राज्य अमेरिका और दुर्लभ में Undiagnosed रोग नेटवर्क (UDN) सहित रोग मॉडल और तंत्र (RDMM) कनाडा, जापान, यूरोप, और ऑस्ट्रेलिया में नेटवर्क14| एक राष्ट्रीय स्तर पर दुर्लभ रोग निदान और मशीनी अध्ययन के कार्यप्रवाह में एमओ शोधकर्ताओं को एकीकृत करने के लिए इन समन्वित प्रयासों के अलावा, नैदानिक और एमओ शोधकर्ताओं के बीच व्यक्तिगत सहयोगी अध्ययन के एक नंबर की खोज करने के लिए नेतृत्व किया है और कई नए मानव रोग पैदा करने वाले जीनों और रूपों की विशेषता82,83,84.

UDN में, एक केंद्रीकृत मॉडल जीव स्क्रीनिंग सेंटर (MOSC) रोगी की स्थिति का विवरण के साथ उम्मीदवार जीन और वेरिएंट के प्रस्तुतियाँ प्राप्त करता है और यह आकलन करता है कि क्या संस्करण सूचना विज्ञान उपकरणों और विवो का उपयोग करके रोगजनक होने की संभावना है प्रयोगों. UDN के चरण I (2015-2018) में, MOSC में एक Drosophila कोर [बिल्लर कॉलेज ऑफ मेडिसिन (बीसीएम)] और ज़ेब्राफ़िश कोर (ओरेगॉन विश्वविद्यालय) शामिल थे, जिसने मामलों का आकलन करने के लिए सहयोगात्मक रूप से काम किया। सूचना विज्ञान विश्लेषण और Drosophila और ज़ेब्राफ़िश में विभिन्न प्रयोगात्मक रणनीतियों के एक नंबर का उपयोग करना, MOSC अब तक 132 रोगियों के निदान के लिए योगदान दिया है, 31 नए सिंड्रोम की पहचान55, कई नए मानव की खोज रोग जीन (उदा., EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) और ज्ञात रोग के phenotypic विस्तार जीन (उदा., CACNA1A21,ACOX122) .

UDN के भीतर परियोजनाओं के अलावा, MOSC Drosophila कोर शोधकर्ताओं ने मेंडेलियन जीनोमिक्स और अन्य पहलों के लिए केंद्र के सहयोग से नई रोग जीन खोजों के लिए योगदान दिया है (जैसे, ANKLE223, TM2D3 24, एनआरडी 125, ओगडीएचएल25, अताड3ए26, अरीह127, मार्क328, डीएनएमबीपी29) इन्फोरेटिक और जेनेटिक के एक ही सेट का उपयोग करते हुए UDN के लिए विकसित रणनीतियों. दुर्लभ रोग निदान पर एमओ अध्ययन के महत्व को देखते हुए, MOSC एक सी elegans कोर और दूसरा ज़ेबराफ़िश कोर (दोनों सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में) द्वितीय चरण के लिए (2018-2022) UDN के लिए शामिल करने के लिए विस्तार किया गया था.

इस पांडुलिपि में एक vivo कार्यात्मक अध्ययन प्रोटोकॉल है कि सक्रिय रूप से UDN MOSC Drosophila कोर में प्रयोग किया जाता है यह निर्धारित करने के लिए अगर missense वेरिएंट ट्रांसजेनिक मक्खियों कि मानव व्यक्त का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन पर कार्यात्मक परिणाम है का वर्णन प्रोटीन. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य MO शोधकर्ताओं नैदानिक अनुसंधान समूहों के साथ सहयोग से काम करने में मदद करने के लिए प्रयोगात्मक सबूत है कि ब्याज की एक जीन में एक उम्मीदवार संस्करण कार्यात्मक परिणाम है प्रदान करने के लिए है, इस प्रकार नैदानिक निदान की सुविधा. इस प्रोटोकॉल एक परिदृश्य में सबसे अधिक उपयोगी है जिसमें एक Drosophila शोधकर्ता एक नैदानिक अन्वेषक जो ब्याज की एक जीन में एक विशिष्ट उम्मीदवार संस्करण के साथ एक दुर्लभ रोग रोगी है द्वारा संपर्क किया है.

इस प्रोटोकॉल को तीन तत्वों में विभाजित किया जा सकता है: (1) रोगी फीनोटाइप के लिए जिम्मेदार होने वाले ब्याज के संस्करण की संभावना और ड्रोसोफिलामें एक कार्यात्मक अध्ययन की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए जानकारी एकत्र करना , (2) सभा मौजूदा आनुवंशिक उपकरण और नए लोगों की स्थापना, और (3) विवो में कार्यात्मक अध्ययन प्रदर्शन. तीसरे तत्व को आगे दो उप-तत्वों में विभाजित किया जा सकता है, इस आधार पर कि ब्याज के किसी प्रकार के कार्य का मूल्यांकन कैसे किया जा सकता है (प्रयोग या अतिअभिव्यक्ति-आधारित रणनीतियों को वापस लिया जा सकता है)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है और दुर्लभ मोनोजेनिक रोग अनुसंधान के बाहर कई परिदृश्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे, सामान्य रोग, जीन-पर्यावरण बातचीत, और चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए औषधीय/ वेरिएंट की कार्यक्षमता और रोगजनकता निर्धारित करने की क्षमता न केवल सटीक आणविक निदान प्रदान करके ब्याज के रोगी को लाभ होगा, लेकिन यह भी दोनों translational और बुनियादी वैज्ञानिक अनुसंधान पर व्यापक प्रभाव पड़ेगा.

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Protocol

1. मानव और एमओ जानकारी इकट्ठा करने का आकलन करने के लिए: ब्याज की एक भिन्न की संभावना रोग Phenotypes और Drosophila में कार्यात्मक अध्ययन की व्यवहार्यता के लिए जिम्मेदार जा रहा है

  1. व्यापक डेटाबेस और साहित्य खोजों प्रदर्शन निर्धारित करने के लिए कि क्या विशिष्ट जीन और ब्याज के वेरिएंट अच्छे उम्मीदवार हैं ब्याज के रोगी के phenotype समझाने के लिए. विशेष रूप से, निम्न जानकारी एकत्रित करें।
    1. यदि ब्याज के जीन पहले अन्य आनुवंशिक विकारों में फंसाया गया है का आकलन (ज्ञात रोग जीन के phenotypic विस्तार) या यह एक पूरी तरह से नई रोग उम्मीदवार जीन है [अनिश्चित महत्व के जीन संस्करण (GVUS)].
    2. रोग या नियंत्रण जनसंख्या डेटाबेस में ब्याज के संस्करण के एलीले आवृत्ति का आकलन करें।
    3. आकलन करें कि क्या प्रतिलिपि संख्या भिन्नताएँ (CNVs) हैं जो इस जीन को रोग या नियंत्रण जनसंख्या डेटाबेस में शामिल करती हैं.
    4. आकलन क्या orthologous जीन माउस, ज़ेब्राफ़िश, Drosophila, सी elegans, और खमीर सहित विभिन्न MO प्रजातियों में हैं, तो आगे ज्ञात कार्यों और इन orthologous जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच.
    5. यह आकलन करें कि क्या ब्याज का संस्करण प्रोटीन के कार्यात्मक क्षेत्र में मौजूद है और यदि ब्याज का एमिनो एसिड विकासकेत: संरक्षित है।
      नोट:इन पांच प्रश्नों के उत्तर (चरण 1.1.1.1.5) व्यक्तिगत रूप से मानव और MO डेटाबेस की एक संख्या तक पहुँचने के द्वारा या MARRVEL का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है (मॉडल जीव दुर्लभ संस्करण अन्वेषण के लिए एकत्रित संसाधन) वेब संसाधन (तालिका देखें 1 ऑनलाइन संसाधनों के लिए)30, जो एक साथ अनुच्छेद31में गहराई से वर्णित है. विशिष्ट उदाहरणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें. मोनार्क पहल वेबसाइट32 और Gene2Function33 भी उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं.
  2. आगे का आकलन करने के लिए अतिरिक्त जानकारी इकट्ठा करें कि क्या संस्करण एक प्रोटीन समारोह और संरचना बिंदु-दृश्य से एक अच्छी बीमारी उम्मीदवार है।
    1. आकलन करें कि क्या ब्याज के संस्करण silico भविष्यवाणी एल्गोरिदम में के आधार पर हानिकारक होने की भविष्यवाणी की है.
      नोट:विभिन्न रोगजनकता एल्गोरिदम पिछले $ 15 वर्षों में कई अनुसंधान समूहों द्वारा विकसित किया गया है, और कुछ भी MARRVEL खोज परिणामों में प्रदर्शित कर रहे हैं. नीचे सूचीबद्ध दो सहित हाल के कार्यक्रम, एक रोगजनकता स्कोर उत्पन्न करने के लिए कई संस्करण रोगजनकता रेडिक्शन एल्गोरिदम और मशीन लर्निंग दृष्टिकोण संयोजित करते हैं। संस्करण भविष्यवाणी एल्गोरिदम और उनके प्रदर्शन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, घोष, एट अल8का संदर्भ लें। (i) CADD (संयुक्त एनोटेशन-निर्भर कमी): 60 से अधिक जीनोमिक सुविधाओं से निर्मित एकीकृत एनोटेशन उपकरण, जो मानव SNVs के लिए स्कोर के साथ-साथ लघु सम्मिलन और विलोपन11प्रदान करता है। (ii) रेवल (दुर्लभ एक्सोमे संस्करण पहनावा शिक्षार्थी): एक एकीकृत स्कोर प्रदान करने के लिए कई प्रकार के रोगजनकता एल्गोरिदम (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVE, MutationAsor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP, और phastCons) को जोड़ती है सभी संभव मानव missense वेरिएंट34के लिए |
    2. यह निर्धारित करें कि क्या आनुवंशिक रोगों से जुड़े मानव जीन/प्रोटीन या इसके MO ऑर्थोलॉग को आनुवंशिक या शारीरिक रूप से जीन/प्रोटीन के साथ आदान-देना दिखाया गया है। यदि हां, तो आकलन अगर ब्याज के रोगी इन विकारों के साथ ओवरलैपिंग phenotypes दर्शाती है.
      नोट:कई उपकरण MO प्रकाशनों के साथ ही कई प्रजातियों स्क्रीन से बड़े पैमाने पर proteomics के आधार पर आनुवंशिक और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है. STRING (पड़ोसी जीन के आवर्ती उदाहरणों के लिए खोज उपकरण)35:ज्ञात और भविष्यवाणी प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के लिए एक डेटाबेस. यह आनुवंशिक बातचीत और सह अभिव्यक्ति डेटासेट के साथ-साथ पाठ खनन उपकरण को एकीकृत करता है ताकि जीन और प्रोटीन की पहचान की जा सके जो विभिन्न जीवों में एक साथ कार्य कर सकते हैं। MIST (अणु संपर्क खोज उपकरण)36:एक डेटाबेस है कि मूल आनुवंशिक MOs से आनुवंशिक और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत डेटा एकीकृत (पूर्व, सी elegans, Drosophila,ज़ेब्राफ़िश, मेंढक, चूहा, माउस) और मनुष्य. ऑर्थोलॉगस जीनों/प्रोटीन (इंटरलॉग) से अनुमानित अन्योन्यक्रियाओं की भविष्यवाणी भी प्रदर्शित की जाती है।
    3. यह निर्धारित कीजिए कि ब्याज के प्रोटीन की 3-डी संरचना को हल किया गया है या मॉडल किया गया है। यदि ऐसा है, तो निर्धारित करें कि मुख्य कार्यशील डोमेन के सापेक्ष रुचि मानचित्र का संस्करण कहाँ है.
      नोट:एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) द्वारा हल प्रोटीन संरचनाओं, और क्रायो-इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी पीडीबी (प्रोटीन डेटा बैंक) और EMDatabank37सहित सार्वजनिक डेटाबेस में पाया जा सकता है। यद्यपि अनुमानित/मॉडल प्रोटीन संरचनाओं के लिए कोई एकल डेटाबेस नहीं है, फिर भी उपयोगकर्ताओं के लिए प्रोटीन मॉडलिंग करने के लिए कई एल्गोरिदम (यानी, SWISS-MODEL38, मॉडलर39,और Phyre240)उपलब्ध हैं।
  3. नैदानिक सहयोगियों के साथ संवाद करने के लिए अनुभाग 1-1.2 में सूचना विश्लेषण से एकत्रित जानकारी पर चर्चा. यदि नैदानिक सहयोगियों को भी लगता है कि ब्याज के संस्करण और जीन अच्छे उम्मीदवार हैं रोगी में देखा phenotypes समझाने के लिए, अनुभाग 2 के लिए आगे बढ़ें. यदि रोगी के जीनोटाइप और फीनोटाइप के बारे में विशिष्ट प्रश्न हैं, तो आगे बढ़ने से पहले नैदानिक सहयोगियों के साथ उन पर चर्चा करें।
    नोट:यदि यह महसूस किया जाता है कि ब्याज के संस्करण ब्याज के phenotype समझाने की संभावना नहीं है (जैसे, समान संस्करण नियंत्रण जनसंख्या में उच्च आवृत्ति में पाया), नैदानिक सहयोगियों के साथ इस पर चर्चा करने के लिए निर्धारित करें कि क्या संस्करण एक अच्छा है उम्मीदवार, के रूप में वहाँ नैदानिक phenotypes की व्याख्या करने के लिए उपयुक्त विशेषज्ञता नहीं हो सकता है.

2. मौजूदा आनुवंशिक उपकरण इकट्ठा करने और ब्याज की एक विशिष्ट भिन्न अध्ययन करने के लिए नई अभिकर्मकों की स्थापना

नोट:एक बार ब्याज के संस्करण प्रयोगात्मक पीछा करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार निर्धारित किया गया है, इकट्ठा या एएजेंट उत्पन्न vivo कार्यात्मक अध्ययन में प्रदर्शन करने के लिए. इस प्रोटोकॉल में वर्णित कार्यात्मक अध्ययन के लिए, कुछ प्रमुख Drosophila melanogaster अभिकर्मकों की आवश्यकता है: 1) अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम विनियमित मानव cDNA ट्रांसजेनिक उपभेदों कि संदर्भ या संस्करण अनुक्रम ले, 2) एक हानि के समारोह ब्याज की एक मक्खी जीन के allele, और 3) एक GAL4 लाइन है कि बचाव के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. UAS मानव cDNA का निर्माण और ट्रांसजेनिक मक्खियों का उत्पादन
    1. पहचान और उचित मानव cDNA निर्माण प्राप्त करते हैं. कई क्लोन MGC (mammalian जीन संग्रह)43 से उपलब्ध हैं और चयनित venders से खरीदा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से जोड़ रहे हैं कि जीन के लिए, जाँच जो आइसोफॉर्म cDNA Ensembl या refSeQ का उपयोग करने के लिए मेल खाती है।
      नोट:कई cDNAs recombinase-मध्यस्थ क्लोनिंग प्रणाली संगत अभिकर्मकों44में उपलब्ध हैं, जो subcloning कदम सरल. dDNAs में आ सकता है एक "खुला (कोई रोक codon)" या "बंद (अंतर्जात या कृत्रिम बंद codon के साथ)" प्रारूप. जबकि खुले क्लोन सी की अनुमति प्रोटीन है कि जैव रासायनिक के लिए उपयोगी होते हैं (जैसे, पश्चिमी धब्बा) और सेल जैविक (जैसे, इम्यूनोस्टेनिंग) ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए assays, यह कुछ मामलों में प्रोटीन समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
    2. उप-क्लोन संदर्भ और भिन्न सीडीएनए को ड्रोसोफिला ट्रांसजेनिक वेक्टर में। का प्रयोग करें [C31-मध्यस्थ transgenesis प्रणाली, क्योंकि यह संदर्भ और संस्करण cDNAs जीनोम45में एक ही स्थान में एकीकृत करने की अनुमति देता है. इस परियोजना के लिए, MOSC Drosophila कोर नियमित रूप से pGW-HA.attB वेक्टर46का उपयोग करता है.
      नोट:यदि मानव cDNA recombinase-मध्यस्थ क्लोनिंग प्रणाली संगत वेक्टर में है (जैसे, pDONR221, pENTR2221), अनुभाग 2.1.4 करने के लिए छोड़, जो lR प्रतिक्रियाओं pGW-HA.atb में cDNAs subclone करने के लिए बताते हैं.
      1. यदि मानव cDNA एक recombinase-मध्यस्थ क्लोनिंग प्रणाली संगत प्लाज्मिड में नहीं है, तो मानक आणविक जैविक तकनीकों का उपयोग कर एक गेटवे प्रविष्टि वेक्टर में मानव cDNAs subclone (इस तरह के प्रोटोकॉल का एक उदाहरण नीचे प्रलेखित है).
        1. attB1 और attB2 हथियार शुरू करने के लिए एक overhang पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। आगे प्राइमर में एटबी 1 अनुक्रम 5'-GGGAAGTGTGTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3' के बाद लक्ष्य CDNA के पहले 22 न्यूक्लिओटाइड होना चाहिए। रिवर्स प्राइमर में एटबी 2 अनुक्रम 5'-GGGACCACTGTGTACAAGAAGCTGGGTCCTA-3' होना चाहिए, जिसके बाद ब्याज की सीडीएएनके के अंतिम 25 न्यूक्लिओटाइड्स के रिवर्स पूरक होने चाहिए। CDNA के स्टॉप कोडोन को छोड़ दें, फिर एक C' टैग जोड़ें यदि यह एक क्लोन को "खुला" करने के लिए वांछित है, या एक क्लोन "बंद करें" करने के लिए एक स्टॉप कोडोन जोड़ें।
        2. उच्च निष्ठा पीसीआर मिश्रण के एक 100 डिग्री एल उच्च निष्ठा पीसीआर मास्टर मिश्रण के 50 डिग्री एल, आसुत पानी के 36 डिग्री एल, प्रत्येक आगे के 5 डिग्री एल और रिवर्स प्राइमर चरण 2.1.2.1.1 पतला करने के लिए 10 डिग्री एम करने के लिए, और लक्ष्य cDNA के 4 डिग्री एल (150 एनजी /
        3. ब्याज के cDNA पर attB1 और attB2 हथियार जोड़ने के लिए मानक mutagenesis प्रोटोकॉल का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन। ब्याज के निर्माण और वेरिएंट के आधार पर शर्तें अलग-अलग होंगी।
        4. जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस और जेल निष्कर्षण के माध्यम से जोड़ा होमोलोजी हथियारों के साथ लक्ष्य cDNA अलग। 1% agarose जेल बनाएँ और मानक तरीकों का उपयोग कर electrophoresis प्रदर्शन करते हैं। बैंड है कि CDNA के आकार के साथ साथ homology हथियारों की अतिरिक्त लंबाई से मेल खाती है उत्पाद शुल्क. मानक तरीकों के माध्यम से जेल से डीएनए निकालें95| वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट कई कंपनियों से उपलब्ध हैं.
        5. उपयोग किया जाता है जो सिस्टम के अनुसार recombinase-मध्यस्थ क्लोनिंग प्रोटोकॉल के आधार पर एक इन विट्रो recombinase प्रतिक्रिया प्रदर्शन.
        6. बीपी प्रतिक्रिया मिश्रण को रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में बदलना। सक्षम कोशिकाओं को घर में बनाया जा सकता है या वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है। कॉलोनी चयन के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं युक्त एक LB प्लेट पर रात भर बदल कोशिकाओं संस्कृति. अगले दिन, कई कालोनियों का चयन करें और उन्हें रात भर स्वतंत्र तरल संस्कृतियों में विकसित करें।
        7. मिनीप्रेप के माध्यम से रात भर संस्कृतियों से डीएनए को अलग करें। Sanger अनुक्रम सकारात्मक क्लोन सुनिश्चित करने के लिए कि CDNA सही अनुक्रम96है . संस्कृतियों है कि 25% ग्लिसरोल में वांछित अनुक्रम के लिए सकारात्मक रहे हैं से कोशिकाओं को बनाए रखने -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत.
    3. साइट निर्देशित mutagenesis प्रदर्शन करने के लिए संदर्भ मानव cDNA97के साथ गेटवे प्लाज्मिड में ब्याज के संस्करण परिचय . इस विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल विक्रेता की वेबसाइट48,49में पाया जा सकता है। पूरे खुले पढ़ने के फ्रेम (ORF) के Sanger अनुक्रमण के माध्यम से उत्परिवर्तित प्लाज्मिड में संस्करण की उपस्थिति को मान्य करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इस म्यूटजेनेसिस चरण के माध्यम से पेश किए गए कोई अतिरिक्त भिन्न रूप नहीं हैं।
    4. दाता प्लाज्मिड (गेटवे प्लाज्मिड के साथ attL1 और attL2 साइटों के साथ) में संदर्भ और भिन्न मानव cDNAs subclone ट्रांसजेनिक प्लाज्मिड में (जैसे, pGW-HA.atTB attR1 और attR2 साइटों के साथ) एक LR clonase प्रतिक्रिया के माध्यम से.
      नोट:पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम आधारित subcloning के लिए डिज़ाइन UAS -C31 वेक्टर हैं (उदाहरण के लिए, pUAST.attB50)अगर यह प्रतिबंध एंजाइम तरीकों के माध्यम से मानव cDNAs subclone करने के लिए पसंद किया जाता है.
    5. यूएएस-मानव cDNA transgenes को एकीकृत करने के लिए जिसमें C31 डॉकिंग साइटों का चयन करें। कई प्रयोगशालाओं द्वारा डॉकिंग स्थलों का सृजन किया गया है और यह स्टॉक केन्द्रों से50,52,53से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है .
      नोट:चूंकि यह एक गुणसूत्र है कि ब्याज की जीन के मक्खी ortholog शामिल नहीं है पर मानव transgene के लिए सुविधाजनक है, यह एक दूसरे गुणसूत्र डॉकिंग साइट का उपयोग करने की सिफारिश की है [VK37 (बीडीएससी स्टॉक #24872] जब मक्खी ortholog एक्स पर है , तीसरे, या चौथे गुणसूत्रों, और एक तीसरे गुणसूत्र डॉकिंग साइट का उपयोग करें [VK33 (बीडीएससी स्टॉक #24871] जब मक्खी ortholog दूसरे गुणसूत्र पर है.
    6. UAS-मानव cDNA उनके germline में $C31 integrase व्यक्त मक्खियों में इंजेक्शन (जैसे, vas-$C31, nos-C31).।
      नोट: माइक्रोइंजेक्शन घर में प्रदर्शन किया जा सकता है या ट्रांसजेनेसिस के लिए कोर सुविधाओं या वाणिज्यिक संस्थाओं के लिए भेजा। ट्रांसजेनिक मक्खियों के उत्पादन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल उद्धृत पुस्तक अध्याय51में पाया जा सकता है .
    7. इंजेक्ट किए गए भ्रूणों से स्थिर ट्रांसजेनिक उपभेदों की स्थापना करना। 94 के निर्माण के प्रति $100-200 भ्रूण इंजेक्शन . दूसरी गुणसूत्र डॉकिंग स्थल (VK37) में ट्रांसजीन प्रविष्टि के लिए एक प्रतिनिधि क्रासिंग योजना को चित्र 1कमें दर्शाया गया है। मूल Drosophila आनुवंशिकी जानकारी के लिए उद्धृत पुस्तकों54,55 को देखें।
  2. प्राप्त करें या एक T2A-GAL4 लाइन है कि बचाव आधारित कार्यात्मक assays की सुविधा उत्पन्न (चित्र 2 और अनुभाग 3.1) देखें.)
    नोट:यह लाइन दो प्रयोजनों की सेवा करेगा. सबसे पहले, सबसे T2A-GAL4 लाइनों का परीक्षण एक जीन जाल allele के रूप में कार्य करके मजबूत LOF alleles के रूप में व्यवहार करते हैं. दूसरा, T2A-GAL4 लाइनों एक GAL4 ड्राइवर है कि UAS निर्माण की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है के रूप में कार्य (जैसे UAS-GFP, UAS मानव CDNAs) ब्याज की जीन के अंतर्जात विनियमन तत्वों के तहत56,57 (चित्र 2ए-सी).
    1. उपलब्ध T2A-GAL4 लाइनों के लिए खोज सार्वजनिक स्टॉक संग्रह Drosophila जीन व्यवधान परियोजना (जीडीपी)58 जिसमें 1,000 T2A-GAL4 लाइनों 59 उत्पन्न किया गया है सहित . इन उपभेदों वर्तमान में ब्लूमिंगटन Drosophila स्टॉक सेंटर (BDSC) से उपलब्ध हैं और दोनों सकल घरेलू उत्पाद और BDSC वेबसाइटों के माध्यम से खोज कर रहे हैं.
    2. यदि ब्याज की मक्खी जीन के लिए एक T2A-GAL4 लाइन उपलब्ध नहीं है, जांच अगर एक उपयुक्त कोडिंग intronic MiMIC(Minos-मध्यस्थ एकीकरण कैसेट) लाइन एक T2A-GAL4 लाइन में रूपांतरण के लिए उपलब्ध है recombinase-मध्यस्थ कैसेट विनिमय का उपयोग कर (RMCE )60 (चित्र 2ए)
      नोट:RMCE एक दाता निर्माण के माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से एक T2A-GAL4 लाइन में परिवर्तित करने के लिए दो कोडिंग exons के बीच में हैं कि intronic MiMIC तत्वों की अनुमति देता है (एक पार योजना का एक उदाहरण चित्र 1बीमें दिखाया गया है ) या की श्रृंखला पार, के रूप में विस्तार से वर्णित57,59.
    3. यदि एक T2A-GAL4 लाइन उपलब्ध नहीं है और एक उपयुक्त कोडिंग intronic MiMIC मौजूद नहीं है, CRIMIC (CRISPR-मध्यस्थ एकीकरण कैसेट) प्रणाली59के माध्यम से एक T2A-GAL4 लाइन पैदा करने की संभावना का पता लगाने .
      नोट:इस पद्धति CRISPR मध्यस्थता डीएनए दरार और homology निर्देशित मरम्मत (HDR) का उपयोग करता है ब्याज की एक जीन में एक कोडिंग intron में एक MiMIC की तरह कैसेट एकीकृत.
    4. यदि ब्याज के जीन में एक बडे़ इनट्रॉन (150 बीपी) का अभाव है या कोई इनट्रॉन्स नहीं है, तो 20 ,61,62के रूप में वर्णित HDR का उपयोग करके CRISPR/Cas9 प्रणाली के साथ मक्खी जीन में एक GAL4 ट्रांसजीन में दस्तक करने का प्रयास करें।
      नोट:यदि एक T2A-GAL4 या GAL4 नॉक-इन allele की पीढ़ी मुश्किल है, इन पूर्व मौजूदा alleles या RNAi लाइनों और सर्वव्यापी ऊतक-विशिष्ट GAL4 ड्राइवरों के रूप में वर्णित92 (REF) का उपयोग कर बचाव प्रयोगों प्रदर्शन करने का प्रयास करें.

3. Drosophila में Vivo में ब्याज की मानव भिन्नता के कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन

नोट:एक बचाव आधारित विश्लेषण (अनुभाग 3.1) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से overexpression अध्ययन (अनुभाग 3.2) Drosophilaमें vivo में ब्याज के संस्करण के परिणामों का आकलन करने के लिए एकत्र या धारा 2 में उत्पन्न उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन. दोनों दृष्टिकोणों के उपयोग पर विचार करें, क्योंकि दोनों पूरक हैं.

  1. बचाव आधारित प्रयोगों के माध्यम से कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन
    नोट: हेटेरोलॉगस बचाव आधारित प्रयोगों मेंDrosophilaमानव प्रोटीन का उपयोग कर के लिए निर्धारित है कि क्या दो orthologous जीन के आणविक समारोह विकास के 500 मिलियन डॉलर से अधिक संरक्षित किया गया है. वे भी मानव प्रोटीन के संदर्भ में संस्करण के समारोह का आकलन63. हालांकि जीन जोड़े के सैकड़ों का अध्ययन एक व्यवस्थित विश्लेषण की सूचना नहीं दी गई है, कई दर्जन मानव और स्तनधारी (उदा., माउस) जीन के समारोह को बदलने में सक्षम हैंDrosophilaजीन13.
    1. बचाव आधारित दृष्टिकोण में, पहले निर्धारित करें कि क्या वहाँ स्पष्ट कर रहे हैं, scorable, और fly ortholog में LOF उत्परिवर्ती में reproduible phenotypes वेरिएंट के कार्यों का आकलन करने से पहले.
      नोट:मक्खी जीन पर पिछले साहित्य पहले डेटा मेरा करने के लिए एक अच्छी जगह है, और यह FlyBase और PubMed सहित डेटाबेस का उपयोग कर पाया जा सकता है. ऐसे MARRVEL, सम्राट पहल, और Gene2Funcion के रूप में अतिरिक्त डेटाबेस भी इस जानकारी को इकट्ठा करने में उपयोगी होते हैं.
    2. समयुग्मज और हेमीजिगस में scorable phenotypes के एक वैश्विक सर्वेक्षण प्रदर्शन (T2A-GAL4 एक आणविक परिभाषित गुणसूत्र की कमी जानवरों पर allele, खासकर अगर T2A-GAL4 allele पहली उत्परिवर्तन के लिए एक विशिष्ट जीन के लिए विशेषता है. घातकता, बाँझपन, दीर्घायु, आकृति विज्ञान (जैसे, आकार और आंख की आकृति विज्ञान) और व्यवहार (जैसे, कोर्टशिप, उड़ान, चढ़ाई, और धमाके संवेदनशीलता दोष) जैसे फीनोटाइप का आकलन करें।
      नोट:यदि इस प्राथमिक स्क्रीन से पहचाने गए कोई प्रमुख फीनोटाइप ्स्ड हैं, तो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग द्वारा मापे गए न्यूरोलॉजिकल दोषों जैसे अधिक सूक्ष्म फीनोटाइप का उपयोग किया जा सकता है यदि वे अत्यधिक पुनरुत्पादक और विशिष्ट हैं। एक उदाहरण के रूप में, इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ERG) का उपयोग कर कार्यात्मक अध्ययन चरण 3.2.3 में वर्णित हैं. यदि किसी भी scorable phenotype का पता लगाने में विफलता है, अनुभाग 3.2 के लिए ले जाएँ और overexpression आधारित कार्यात्मक अध्ययन करते हैं.
    3. एक बार एक scorable phenotype मक्खी LOF उत्परिवर्ती में की पहचान की है, परीक्षण कि क्या संदर्भ मानव cDNA उत्परिवर्ती मक्खी लाइन को बचाने के लिए मानव cDNA का उपयोग करने का प्रयास करके मक्खी ortholog के समारोह की जगह ले सकता है. यहाँ किए जाने वाले फीनोटाइपिक परख चरण 3-1-2 के परिणामों पर निर्भर करती है और अध्ययन किए जा रहे जीन के लिए विशिष्ट होगी।
      नोट:यदि मक्खी जीन के "मानवीकरण" सफल होता है, वहाँ अब एक मंच के संदर्भ समकक्ष की तुलना में ब्याज के संस्करण के लिए बचाव की क्षमता की तुलना है. संदर्भ मानव cDNA के साथ देखा बचाव के लिए सही होना जरूरी नहीं है. एक मानव cDNA का उपयोग कर मक्खी उत्परिवर्ती phenotype के आंशिक बचाव अभी भी संस्करण मानव CDNA तनाव का उपयोग तुलनात्मक अध्ययन करने के लिए एक संदर्भ बिंदु प्रदान करता है.
    4. चरण 3.1.2 में चयनित परख प्रणाली का उपयोग करते हुए, संदर्भ मानव cDNA के साथ मनाया बचाव के लिए मनाया बचाव की तुलना करने के लिए संस्करण मानव cDNA के साथ मनाया यह निर्धारित करने के लिए कि ब्याज के संस्करण ब्याज के जीन पर परिणाम है.
      नोट:यदि संस्करण मानव cDNA संदर्भ allele से भी बदतर प्रदर्शन करता है, यह पता चलता है कि ब्याज के संस्करण प्रोटीन समारोह के लिए हानिकारक है. यदि संस्करण और संदर्भ कार्यात्मक रूप से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, तो 1) allele एक आइसोमॉर्फ (एक संस्करण है कि प्रोटीन समारोह को प्रभावित नहीं करता है) या 2) परख सूक्ष्म अंतर का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है हो सकता है.
    5. यदि संस्करण को एक हानिकारक एलील पाया जाता है, तो पश्चिमी दाग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, या अन्य विधियों93के माध्यम से विवो में ब्याज के संदर्भ और विभिन्न प्रोटीन की अभिव्यक्ति और इंट्रासेल्यूलर स्थानीयकरण का और मूल्यांकन करें।
      नोट:यदि UAS मानव cDNA एक pGW-HA.attB वेक्टर में एक खुले क्लोन से उत्पन्न होता है, एक विरोधी HA एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए इन जैव रासायनिक और सेलुलर परख प्रदर्शन. यदि मूल क्लोन एक बंद क्लोन है, परीक्षण है कि क्या मानव प्रोटीन के खिलाफ वाणिज्यिक एंटीबॉडी इन परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अभिव्यक्ति के स्तर और intracellular स्थानीयकरण में एक अंतर कैसे ब्याज के संस्करण प्रोटीन समारोह को प्रभावित करता है प्रकट कर सकते हैं.
  2. overexpression अध्ययन के माध्यम से कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन
    नोट:अन्यथा जंगली प्रकार मक्खियों में मानव सीडीएएनए के Ubicuitous या ऊतक-विशिष्ट overexpression जानकारी प्रदान कर सकते हैं कि बचाव आधारित अनुभाग 3.1 में चर्चा प्रयोगों के पूरक है. जबकि बचाव आधारित परख मुख्य रूप से LOF वेरिएंट (अरूपात्मक, hypomophic), overexpression आधारित परख भी लाभ के कार्य (GOF) वेरिएंट है कि और अधिक का आकलन करने के लिए कठिन हैं प्रकट हो सकता है का पता लगाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं (hypermorphic, antimorphic, neomorphic).
    1. ब्याज की मानव CDNAs overexpress करने के लिए GAL4 ड्राइवरों का एक सेट का चयन करें। सर्वव्यापी और ऊतक की एक संख्या- / चरण विशिष्ट GAL4 ड्राइवरों सार्वजनिक स्टॉक केन्द्रों से उपलब्ध हैं (जैसे, BDSC), जिनमें से कुछ अधिक बार दूसरों की तुलना में उपयोग किया जाता है. पहले सर्वव्यापी ड्राइवरों और आसानी से scorable phenotypes पर ध्यान केंद्रित (घातकता, बाँझपन, रूपात्मक phenotypes), तो ऊतक विशेष ड्राइवरों और अधिक विशिष्ट phenotypes पर चलते हैं.
      नोट: प्रयोगों में उपयोग करने से पहले अभिव्यक्ति प्रतिमान की पुष्टि करने के लिए एक रिपोर्टर लाइन (उदा., UAS-GFP) के साथ GAL4 ड्राइवर की अभिव्यक्ति मान्य करें।
    2. संदर्भ और भिन्न मानव CDNAs एक ही शर्त के तहत एक ही ड्राइवर का उपयोग व्यक्त (उदाहरण के लिए, तापमान) GAL4 लाइन से 3-5 कुंवारी महिलाओं को पार करके (जैसे आंख कल्पना डिस्क अभिव्यक्ति के लिए ey-GAL4) UAS लाइनों से 3-5 पुरुष मक्खियों के साथ [जैसे, UAS-TBX2(+) या UAS-TBX2 (p.R305H) अनुभाग 4.2 में किसी एकल शीशी में दिखाए गए उदाहरण के लिए।
      1. एक ही क्रॉस से कई जानवरों को बाहर करने के लिए हर 2-3 दिनों में पार स्थानांतरण।
    3. संतान की जांच और संदर्भ और संस्करण उपभेदों के बीच किसी भी मतभेद का पता लगाने (उदा., नेत्र आकृति विज्ञान) एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत. फिनोटाइप दस्तावेज़ के लिए विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी से जुड़े कैमरे का उपयोग करके मक्खियों को छवि करें।
      नोट:यदि एक phenotype केवल संदर्भ में देखा जाता है, लेकिन संस्करण लाइन में नहीं है, तो संस्करण एक अक्रिस्टलीय या एक मजबूत hypomorphic allele हो सकता है. यदि फीनोटाइप दोनों जीनोटाइप में देखा जाता है लेकिन संदर्भ एक मजबूत दोष का कारण बनता है, तो संस्करण एक हल्के से कमजोर hypomorphic allele हो सकता है. यदि संदर्भ एक phenotype नहीं दिखाता है या केवल एक कमजोर phenotype दर्शाती है, लेकिन संस्करण एक मजबूत दोष से पता चलता है, तो संस्करण एक GOF allele हो सकता है.
    4. यदि मानक संस्कृति स्थितियों (आरटी या 25 डिग्री सेल्सियस पर) में कोई फीनोटाइप नहीं देखा जाता है, तो 18-29 डिग्री सेल्सियस तक के विभिन्न तापमानों पर क्रॉस सेट करें, क्योंकि यूएएस/GAL4 प्रणाली को तापमान के प्रति संवेदनशील64,65) के रूप में जाना जाता है। आमतौर पर, UAS transgenes की अभिव्यक्ति उच्च तापमान पर अधिक है.
  3. जीन और ब्याज के प्रोटीन से संबंधित अतिरिक्त कार्यात्मक अध्ययन प्रदर्शन.
    नोट: सामान्य दोषों की जांच के अलावा, एक परख प्रणाली जीन और संस्करण के आणविक कार्यों में जांच करने के लिए चुना जा सकता है. एक उदाहरण में प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की (TBX2मामले), ERG रिकॉर्डिंग photoceptor समारोह पर संस्करण के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया, ब्याज की मक्खी जीन के बाद से (bifid) दृश्य प्रणाली के विकास के संदर्भ में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया था. में ERG के लिए विस्तृत प्रोटोकॉलDrosophilaपहले प्रकाशित के रूप में पाया जा सकता है66,67,68.
    1. दृश्य प्रणाली में कार्यात्मक दोषों के लिए परीक्षण करने के लिए मक्खियों उत्पन्न. Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 लाइन से पार कुंवारी महिलाओं संदर्भ या संस्करण UAS-मानव cDNA transgenes के साथ पुरुषों के लिए R1-R6 photoceptors में ब्याज की मानव प्रोटीन व्यक्त करने के लिए.
      नोट:पार 3-5 कुंवारी महिलाओं को 3-5 पुरुष एक शीशी में मक्खियों और पार हस्तांतरण हर 2-3 दिन कई जानवरों को एक ही पार से eclosing है. सभी पार लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक तापमान पर सेट एक इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए।
    2. एक बार मक्खियों eclose करने के लिए शुरू (25 डिग्री सेल्सियस पर, $ 10 दिन प्रारंभिक पार स्थापित करने के बाद), संतान इकट्ठा (Rh1-GAL4/ UAS-मानव cDNA/+)ताजा शीशियों में और उन्हें वापस इनक्यूबेटर में सेट एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए दृश्य प्रणाली परिपक्व करने के लिए प्रयोगात्मक तापमान पर सेट.
      नोट:हालांकि ERG 1-2 दिन पुराने मक्खियों पर किया जा सकता है, नए eclosed मक्खियों उनके ERG संकेत में बड़े उतार चढ़ाव हो सकता है. यदि यह एक उम्र पर निर्भर phenotype की जांच करने के लिए वांछित है, इन मक्खियों के रूप में लंबे समय के रूप में वे नियमित रूप से कर रहे हैं कई हफ्तों के लिए आयु वर्ग के हो सकता है (उदाहरण के लिए, हर $ 5 दिन) एक नई शीशी को स्थानांतरित करने के लिए गीला भोजन में डूबने से बचने के.
    3. पहले सीओ2 का उपयोग कर मक्खियों anesthetizing या उन्हें बर्फ पर एक शीशी में रखने से ERG रिकॉर्डिंग के लिए मक्खियों को तैयार करें। धीरे से उन्हें स्थिर करने के लिए एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मक्खी के एक तरफ गोंद।
      नोट:एकाधिक संदर्भ और भिन्न मक्खियों एक ही स्लाइड पर चिपके जा सकते हैं। एक आंख रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए सुलभ किया जा रहा है के साथ लगभग एक ही अभिविन्यास में सभी मक्खियों प्लेस. आंख पर गोंद पाने के लिए और सूंड मुक्त छोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    4. रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड तैयार करें. एक सुई खींचने में एक 1.2 मिमी ग्लास केशिका प्लेस और सक्रिय करें. दो तेज पतला इलेक्ट्रोड प्राप्त करने के लिए केशिका ट्यूब तोड़ो। परिणामी इलेक्ट्रोड खोखले होने चाहिए और अंतिम व्यास है [lt;0.5 मिमी.
    5. नमकीन समाधान (100 एमएम NaCl) के साथ केशिकाओं भरें, सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई हवा बुलबुले हैं. चांदी के तार इलेक्ट्रोड पर कांच केशिकाओं स्लाइड (दोनों रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड, चित्र 4देखें) और जगह में केशिकाओं को सुरक्षित.
    6. stimulator और एम्पलीफायर कॉन्फ़िगर करें. एक विस्तृत सेट अप Lauwers, एट अल67 में पाया जा सकता है. UDN Drosophila MOSC सेट अप सामग्री अनुभाग में सूचीबद्ध उपकरणों के होते हैं.
      1. एम्पलीफायर सेट करने के लिए 0.1 हर्ट्ज उच्च पास फिल्टर, 300 हर्ट्ज कम पास फिल्टर, और 100 लाभ.
      2. 1 s अवधि, 500 एमएस पल्स चौड़ाई, 500 एमएस पल्स देरी, चलाने मोड, और 7 Amp करने के लिए stimulator सेट करें।
      3. प्रकाश-उत्तेजना के लिए प्रकाश स्रोत तैयार करें। मक्खी प्रकाशग्राही को सक्रिय करने के लिए हैलोजन प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।
      4. ERG सेट-अप से जुड़े कंप्यूटर पर रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर तैयार करें. अधिग्रहण मॉडल के साथ एक उत्तेजना प्रोटोकॉल बनाएँ "निश्चित लंबाई की घटनाओं" और 20 की अवधि.
    7. ERG रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले अंधेरे को पूरा करने के लिए मक्खियों acclimate। प्रयोग शुरू करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए पूरी तरह अंधेरे में मक्खियों प्लेस.
      नोट:चूंकि मक्खियां लाल प्रकाश का पता नहीं लगा सकती हैं, इसलिए अंधेरे आवास की अवधि के दौरान लाल बत्ती के स्रोत का उपयोग करें।
    8. रिकॉर्डिंग उपकरण पर मक्खियों युक्त स्लाइड प्लेस और संदर्भ ले जाने micromanipulators और स्लाइड पर ब्याज की मक्खी के करीब एक बिंदु पर इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग ले जाएँ. इलेक्ट्रोड की नोक देखें और ध्यान से मक्खी के वक्ष में संदर्भ इलेक्ट्रोड जगह (क्यूटिकल penetrate). एक बार संदर्भ इलेक्ट्रोड stably डाला जाता है, आंख की सतह पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड जगह है.
      नोट:इस संदर्भ इलेक्ट्रोड की सही स्थिति ERG संकेत पर एक बड़ा प्रभाव नहीं है. ERG एक क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के बजाय एक intracellular रिकॉर्डिंग है के बाद से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड आंख की सतह पर रखा जाना चाहिए. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए लागू दबाव की उचित राशि आंख मर्मज्ञ बिना एक छोटे डिंपल का कारण बनता है।
    9. अंधेरे वातावरण के लिए मक्खियों acclimate करने के लिए एक और 3 मिनट के लिए सभी रोशनी बंद करें।
    10. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर सेट और संकेत रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। यदि मैनुअल शटर के साथ एक हैलोजन प्रकाश स्रोत का उपयोग कर, शटर बंद के साथ प्रकाश स्रोत पर बारी. संकेत रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं.
    11. एक ही रन की 20 की अवधि के लिए हर 1 s खोलने और शटर बंद करके प्रकाश के लिए मक्खी आँखों को उजागर.
      नोट:हैलोजन प्रकाश स्रोत के ऑन/ऑफ को मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जा सकता है या सफेद एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग करके स्वचालित होने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है। अधिक मजबूत और विश्वसनीय ERG एक सफेद प्रकाश एलईडी की तुलना में एक हैलोजन प्रकाश स्रोत का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, व्यापक प्रकाश हैलोजन प्रकाश स्रोत से उत्सर्जित स्पेक्ट्रम के कारण होने की संभावना है.
    12. कांच स्लाइड पर माउंट किए गए सभी मक्खियों से ERGs रिकॉर्ड करें। प्रति स्थिति जीनोटाइप 15 मक्खियों से ERGs प्रदर्शन.
      नोट:कुछ पैरामीटर है कि संदर्भ और संस्करण cDNAs के बीच मजबूत मतभेद से पता चलता है एक शर्त को खोजने के लिए बदला जा सकता है तापमान, उम्र, या पर्यावरण की स्थिति (जैसे, प्रकाश अंधेरे चक्र या निरंतर प्रकाश में पाला /
    13. डेटा विश्लेषण करें: यदि अंतर हैं, यह निर्धारित करने के लिए संदर्भ, भिन्न और नियंत्रणों से ERGs की तुलना करें. ऑन-ट्रांसिएट्स, डिपोलोराइजेशन, ऑफ-ट्रांसिएट्स, और पुनर्ध्रुवण69 (चित्र 4ठ)में परिवर्तन के लिए ईआरजी डेटा का आकलन करें।
      नोट:depolarization और repolarization photoceptors के भीतर phototransduction झरना के सक्रियण और निष्क्रियता को प्रतिबिंबित, जबकि पर और बंद-transients पोस्ट-synaptic कोशिकाओं है कि से संकेत प्राप्त की गतिविधियों के उपाय कर रहे हैं फोटोरिसेप्टर्स. पुनर्ध्रुवण के कम आयाम और परिवर्तित गतिज अक्सर प्रकाशग्राही समारोह और स्वास्थ्य के साथ दोषों में जुड़े होते हैं, जबकि पर और ऑफ-ट्रांसिएंट में दोष दोषपूर्ण synapse विकास, समारोह, या रखरखाव के साथ म्यूटेंट में पाए जाते हैं 70|
    14. संदर्भ बनाम भिन्न मानव सीडीएनए के overexpression के साथ ERG phenotypes में मतभेदों की पहचान पर, निर्धारित करें कि क्या इस electrophysiological phenotype photoceptors में संरचनात्मक और अल्ट्रास्ट्रक्चरल दोष के साथ जुड़ा हुआ है और उनके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करके synapses.
      नोट: ईआरजी दोषों और संरचनात्मक/अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण की व्याख्या पर आगे की चर्चा पहले69बताई गई है .

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Representative Results

EBF3 में डी नोवो मिससेंस संस्करण के कार्यात्मक अध्ययन neurodevelopmental Phenotypes से जुड़ा हुआ
hypotonia सहित neurodevelopmental phenotypes के साथ एक 7 साल पुराने पुरुष में, ataxia, वैश्विक विकास में देरी, और अर्थपूर्ण भाषण विकार, चिकित्सकों और मानव आनुवंशिकीविदों स्वास्थ्य undiagnosed रोग परियोजना के राष्ट्रीय संस्थानों में (UDP) EBF3 में एक de नोवो missense संस्करण (p.R163Q) की पहचान की (अर्ली बी-सेल फैक्टर 3)15, एक जीन है कि एक सीओई (Collier/Olfactory-1/Early बी-सेल फैक्टर) परिवार प्रतिलेखन कारक encodes. यह मामला कार्यात्मक अध्ययन के लिए मार्च 2016 में UDN MOSC को प्रस्तुत किया गया था। यह जीन इस मामले के लिए एक अच्छा उम्मीदवार था कि क्या आकलन करने के लिए, MOSC OMIM, ClinVar, ExAC (अब gnomAD करने के लिए विस्तार), जेनो2सांसद, DGV, और DECIPHER से मानव आनुवंशिक और जीनोमिक जानकारी एकत्र की. इसके अलावा, प्रमुख MO प्रजातियों में ऑर्थोलॉगस जीन DIOPT उपकरण का उपयोग कर की पहचान की गई. जीन अभिव्यक्ति और phenotypic व्यक्तिगत MO डेटाबेस से जानकारी (जैसे, Wormbase, FlyBase, $FIN, MGI) तो प्राप्त किए गए थे. यूडीएन एमओएससी में ईबीएफ3 और अन्य अग्रणी अध्ययनों के लिए किए गए सूचना विज्ञान विश्लेषणों ने मरवेल संसाधन30के बाद के विकास के लिए आधार बनाया .

इस पद्धति का उपयोग करके एकत्रित की गई जानकारी ने संकेत दिया कि EBF3 विश्लेषण के समय किसी भी ज्ञात मानव आनुवंशिक विकार के साथ संबद्ध नहीं था, और यह निष्कर्ष निकाला गया था कि p.R163Q संस्करण निम्नलिखित जानकारी के आधार पर एक अच्छा उम्मीदवार था। (1) इस संस्करण को पहले नियंत्रण जनसंख्या डेटाबेस (ExAC) और रोग जनसंख्या डेटाबेस (Geno2MP) में रिपोर्ट नहीं किया गया था, यह दर्शाता है कि यह एक बहुत ही दुर्लभ संस्करण है। (2) ExAC के आधार पर, इस जीन का pLI (LOF intolerance की संभावना) स्कोर 1.00 (PLI स्कोर 0.00-1.00 से लेकर) है। यह इंगित करता है कि सामान्य आबादी में इस जीन में LOF वेरिएंट के खिलाफ चयनात्मक दबाव है और पता चलता है कि इस जीन की haploinsufficiency रोग पैदा कर सकता है. PLI स्कोर और इसकी व्याख्या के बारे में अधिक जानकारी के लिए, JoVE31 में एक साथ MARRVEL ट्यूटोरियल लेख और संबंधित कागजात विवरण प्रदान करतेहैं 30,71.

p.R163Q संस्करण भी एक अच्छा उम्मीदवार माना जाता था क्योंकि (3) यह developmentally संरक्षित डीएनए बाध्यकारी डोमेन में इस प्रोटीन का सुझाव है कि यह डीएनए बाध्यकारी या अन्य प्रोटीन कार्यों को प्रभावित कर सकता है. (4) p.R163 अवशेषों developmentally सी elegans और Drosophila से मनुष्यों के लिए संरक्षित है, सुझाव है कि यह प्रजातियों में कार्यात्मक प्रोटीन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. (5) EBF3 orthologs कई एमओ72 में न्यूरोनल विकास में फंसाया गया है जिसमें सी एलिगेंस73, ड्रोसोफिला74, जेनोपस75और चूहे76शामिल हैं . (6) चूहों में मस्तिष्क के विकास के दौरान, Ebf3 Arx के बहाव कार्य करने के लिए दिखाया गया है (Aristaless से संबंधित homebox)77, कई मिर्गी और बौद्धिक विकलांगता के साथ जुड़े एक जीन मनुष्यों में सिंड्रोम78| इसलिए, इन आंकड़ों को एक साथ सुझाव है कि EBF3 अत्यधिक मानव neurodevelopment के लिए महत्वपूर्ण होने की संभावना है और p.R163Q संस्करण कार्यात्मक परिणाम हो सकता है.

p.R163Q EBF3 फ़ंक्शन को प्रभावित करता है या नहीं, गाँठ के लिए एक T2A-GAL4 लाइन (kn; मानव EBF379के मक्खी ऑर्थोलॉग ) एक कोडिंग intronic MiMIC प्रविष्टि15के RMCE के माध्यम से उत्पन्न किया गया था . knT2A-GAL4 लाइन अप्रभावी घातक है और एक क्लासिक kn allele (kncol-1) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आणविक परिभाषित कमी है कि kn [Df(2R)BSC429] 80 को शामिल किया गया की घातकता के पूरक में विफल रहा . GAL4 की अभिव्यक्ति पैटर्न भी मस्तिष्क में kn अभिव्यक्ति के पहले की सूचना दी पैटर्न के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पंख कल्पना डिस्क15में परिलक्षित . UAS ट्रांसजेनिक मक्खियों तो संदर्भ और संस्करण मानव EBF3 CDNA के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जंगली प्रकार मक्खी kn cDNA की अभिव्यक्ति की अनुमति उत्पन्न किए गए थे. सभी तीन प्रोटीन एक सी टर्मिनल 3xHA टैग के साथ टैग किया गया. महत्वपूर्ण बात यह है कि UAS जंगली प्रकार मक्खी kn (kn+) या संदर्भ मानव EBF3 (EBF3+ )transgenes kn T2A-GAL4/Df(2R) BSC429 की घातकता को बचाया एक समान सीमा के लिए ( चित्र 3C, बाएँ फलक)81.

इसके विपरीत, UAS मानव EBF3 p.R163Q संस्करण के साथ transgene (EBF3p.R163Q) इस उत्परिवर्ती बचाव करने में सक्षम नहीं था, सुझाव है कि p.R163Q संस्करण vivo15में EBF3 समारोह को प्रभावित करता है. दिलचस्प है, जब एक विरोधी HA एंटीबॉडी का उपयोग कर मूल्यांकन, EBF3p.R163Q प्रोटीन सफलतापूर्वक मक्खी ऊतकों में व्यक्त किया गया था, और इसके स्तर और subcellular स्थानीयकरण (मुख्य रूप से परमाणु) EBF3 के उन लोगों से अविवेच्य थे+ और Kn+. यह पता चलता है कि संस्करण प्रोटीन अस्थिरता या गलत स्थानीयकरण के कारण एक LOF phenotype पैदा नहीं कर रहा है. आगे का आकलन करने के लिए कि क्या p.R163Q संस्करण EBF3के प्रतिवर्ती सक्रियण समारोह को प्रभावित करता है, एक luciferase आधारित संवाददाता परख HEK293 कोशिकाओं15में किया गया था. सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में इस प्रयोग से पता चला कि EBF3p.R163Q संस्करण रिपोर्टर constructs के प्रतिलेखन को सक्रिय करने में विफल रहा, Drosophila प्रयोगों से प्राप्त LOF मॉडल का समर्थन.

प्रयोगात्मक अध्ययन के समानांतर में, चिकित्सकों के साथ सहयोग, मानव आनुवंशिकीविदों, और बीसीएम में आनुवंशिक सलाहकारों इसी तरह के लक्षणों के साथ दो अतिरिक्त व्यक्तियों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया. एक रोगी समान p.R163Q संस्करण किया, और एक अन्य एक missense संस्करण है कि एक ही अवशेषों (p.R163L) प्रभावित किया. p.R163L संस्करण भी मक्खी kn उत्परिवर्ती93 बचाव करने में विफल सुझाव है कि यह allele भी EBF3 समारोह प्रभावित. दिलचस्प है, यह काम वापस प्रकाशित किया गया था दो स्वतंत्र मानव आनुवंशिकी अध्ययन के साथ वापस करने के लिए कि de नोवो missense, बकवास, frameshift के साथ अतिरिक्त व्यक्तियों की सूचना दी, और EBF3 में splicing वेरिएंट इसी तरह से जुड़े तंत्रिकाविकासीय लक्षण82,83. इसके बाद तीन अतिरिक्त पत्र प्रकाशित किए गए जिनमें नवो ईबीएफ3 प्रकार के अतिरिक्त मामलों और प्रति संख्या हटानेकीसूचना दी गई. इस उपन्यास neurodevelopmental सिंड्रोम अब Hypotonia के रूप में जाना जाता है, Ataxia, और विलंबित विकास सिंड्रोम (HADDS, एमआईएम #617330) में ऑनलाइन मेंडेलियन विरासत में मैन (ओआईएम, मानव में जीनोटाइप-phenotype संबंधों के लिए एक आधिकारिक डेटाबेस).

TBX2 में प्रमुख रूप से विरासत मिससेंस संस्करण का कार्यात्मक अध्ययन एक Syndromic हृदय और कंकाल विकास विकार से जुड़ा हुआ
craniofacial डिस्मॉर्फिज्म, हृदय विसंगतियों, कंकाल कुरूपता, प्रतिरक्षा की कमी, अंत: स्रावी असामान्यताएं, और विकासात्मक हानि के ओवरलैपिंग स्पेक्ट्रम के साथ प्रभावित एक छोटे से परिवार में, UDN ड्यूक नैदानिक साइट एक missense संस्करण की पहचान की (p.R20Q) TBX2 में जो रोग phenotypes87के साथ अलग . परिवार के चार सदस्यों में से तीन (बेटा, बेटी, मां) इस स्थिति से प्रभावित हैं, और बेटे ने सबसे गंभीर फीनोटाइप का प्रदर्शन किया। चिकित्सकीय, वह "पूर्ण DiGeorge सिंड्रोम", एक शर्त अक्सर TBX1के haploinsufficiency की वजह से एक निदान से मुलाकात की. जबकि इस परिवार में TBX1 में कोई उत्परिवर्तन की पहचान की गई थी, चिकित्सकों और मानव आनुवंशिकीविदों TBX2 में एक संस्करण पर ध्यान केंद्रित, चूहों में पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इन जीन विकास के दौरान ओवरलैपिंग कार्य किया है88 . TBX1 और TBX2 दोनों टी-बॉक्स (TBX) प्रतिलेखन कारकों के परिवार से संबंधित हैं जो संदर्भ के आधार पर ट्रांसक्रिप्शन दमनकारी के साथ-साथ उत्प्रेरकके के रूप में कार्य कर सकते हैं।

इससे पहले, टीबीएक्स परिवार के जीनों के 17 सदस्यों में से 12 में भिन्न रूप मानव रोगों से जुड़े थे। MOSC ने MARRVEL और अन्य संसाधनों के माध्यम से एकत्रित निम्नलिखित जानकारी के आधार पर इस प्रकार को प्रायोगिक रूप से आगे बढ़ाने का निर्णय लिया। (1) इस संस्करण gnomAD में $ 90,000 "नियंत्रण" व्यक्तियों के एक सहगण में केवल एक बार रिपोर्ट किया गया था (इस संस्करण के बाहर एक डिफ़ॉल्ट दृश्य में फ़िल्टर किया गया था, कम कवरेज पढ़ता के कारण होने की संभावना). माँ के मामूली phenotypic प्रस्तुति को ध्यान में रखते हुए, यह अभी भी एक दुर्लभ संस्करण है कि रोग phenotypes के लिए जिम्मेदार हो सकता है के रूप में माना जा सकता है. (2) ExAC/gnomAD में TBX2 के pLI स्कोर 0.96/0.99 है, जो उच्च है (अधिकतम $ 1.00). इसके अलावा, gnomAD में o/e (observed/अपेक्षित) LOF स्कोर 0.05 है (केवल 1/18.6 अपेक्षित LOF संस्करण gnomAD में मनाया जाता है).। इन संख्याओं से पता चलता है कि इस जीन में LOF भिन्न रूपों के खिलाफ सामान्य आबादी में चयन कर रहे हैं.

इसके अतिरिक्त, (3) p.R20 developmentally C. elegans और Drosophila से मनुष्यों के लिए संरक्षित है, सुझाव है कि यह TBX2 समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण अवशेष हो सकता है. (4) एकाधिक प्रोग्राम ्सवेश करते हैं कि संस्करण संभावित रूप से हानिकारक है (पॉलीफेन: संभवतः/शायद हानिकारक, SIFT: हानिकारक, CADD स्कोर: 24.4, REVEL स्कोर: 0.5). (5) MO म्यूटेंट रोगियों में प्रभावित ऊतकों में दोष प्रदर्शित करते हैं (उदा., हृदय प्रणाली में दोष प्रदर्शित करने वाले नॉकआउट चूहे, पाचन/आहार प्रणाली, क्रैनियोफैशियल, अंग/ इसलिए, TBX1 और TBX2 और इन रोगियों और DiGeorge सिंड्रोम के बीच phenotypic लिंक के बीच जैविक लिंक के साथ साथ, यह Drosophilaका उपयोग कर इस जीन में वेरिएंट के कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए इष्टतम था.

यह आकलन करने के लिए कि क्या P.R20Q संस्करण TBX2 फ़ंक्शनको प्रभावित करता है, बिफिड में एक T2A-GAL4 लाइन (द्वि ; मानव TBX2के Drosophila ऑर्थोलॉग ), एक कोडिंग intronic MiMIC के RMCE के माध्यम से उत्पन्न किया गया था (चित्र 2)87. यह allele, द्विT2A-GAL4,अप्रभावी प्यूपल घातक था और एक मजबूत LOF उत्परिवर्ती के रूप में व्यवहार किया, पहले की सूचना द्वि LOF alleles के समान (जैसे, द्विD2, द्विD4; चित्र 2 ई) इन क्लासिक और नव उत्पन्न द्वि alleles की घातकता एक $ 80 केबी जीनोमिक बचाव निर्माण पूरे द्वि टिड्डी ले जाने के द्वारा बचाया गया था, यह दर्शाता है कि इन अभिकर्मकों वास्तव में साफ LOF alleles हैं. द्विT2A-GAL4 लाइन में GAL4 की अभिव्यक्ति पैटर्न भी विंग कल्पना डिस्क में सहित कई ऊतकों में द्वि अभिव्यक्ति के पहले की रिपोर्ट पैटर्न के साथ अच्छी तरह से मिलान किया (चित्र 2डी).

समानांतर में, UAS-ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए TBX2 संदर्भ या संस्करण (p.R20Q) अनुक्रम ले जाने के लिए उत्पन्न किए गए थे। दुर्भाग्य से, न तो transgene द्वि T2A-GAL4 लाइन की घातकता को बचाने में सक्षम था. महत्वपूर्ण बात, एक जंगली प्रकार मक्खी UAS-bi transgene भी द्विT2A-GAL4 एलील बचाव करने में विफल रहा, इस जीन की खुराक संवेदनशीलता के कारण होने की संभावना. दरअसल, UAS-बी+ और UAS-TBX2+ के overexpression घातक के कुछ डिग्री का कारण बना जब एक जंगली प्रकार के जानवर में overexpressed. bi/TBX2 overexpression के इस विषाक्त प्रभाव p.R20Q संस्करण TBX2 समारोह को प्रभावित कर सकता है कि क्या यह आकलन करने के लिए एक कार्यात्मक परख के रूप में उपयोग किया गया था। चूंकि Drosophila द्वि जीन व्यापक रूप से दृश्य प्रणाली के संदर्भ में अध्ययन किया गया है [जीन भी optomotor अंधा (ओम्ब ) के रूप में जाना जाता है], दृश्य प्रणाली से संबंधित phenotypes बड़े पैमाने पर जांच की गई. जब संदर्भ TBX2 एक ey-GAL4 ड्राइवर है कि आंख और दृश्य प्रणाली के लिए प्रासंगिक मस्तिष्क के कुछ हिस्सों में UAS-transgenes व्यक्त का उपयोग कर व्यक्त किया गया था, $85% घातकता (चित्र 3सी, सही पैनल) और महत्वपूर्ण नेत्र ों का आकार में कमी (चित्र 4ठ) देखी गई। इस phenotype phenotype से मजबूत था मनाया जब एक जंगली प्रकार मक्खी UAS-bi transgene व्यक्त किया गया था, सुझाव है कि मानव TBX2 मक्खी के लिए अधिक हानिकारक है जब overexpressed.

दिलचस्प बात यह है कि p.R20Q TBX2 घातकता पैदा करने में कम शक्तिशाली था (चित्र 3ब्, दाएँ पैनल) और एक छोटी सी आंख phenotype प्रेरित करने में (चित्र 4बी) समान हालत87के तहत एक ही ड्राइवर का उपयोग कर , सुझाव कि संस्करण प्रोटीन समारोह को प्रभावित करता है. इसके अलावा, photoceptors के समारोह एक अलग GAL4 ड्राइवर का उपयोग कर संदर्भ और संस्करण TBX2 overexpressing, (Rh1-GAL4) कि विशेष रूप से R1-R6 photoceptors में UAS transgenes व्यक्त करता है, पता चला कि संस्करण TBX2 एक का प्रदर्शन किया संदर्भ TBX2 की तुलना में बहुत मामूली ERG phenotype (चित्र 4बी)87. दिलचस्प है, p.R20Q TBX2 प्रोटीन के अधिकांश अभी भी नाभिक में पाया गया था, संदर्भ प्रोटीन के समान, सुझाव है कि संस्करण परमाणु स्थानीयकरण को प्रभावित नहीं किया. HEK293T कोशिकाओं में एक luciferase आधारित ट्रांसक्रिप्शन दमन परख से पता चला कि p.R20Q प्रभावी ढंग से palindromic टी बॉक्स साइटों87के साथ एक पत्रकार के निर्माण के प्रतिलेखन को दबाने में सक्षम नहीं था. इसके अलावा, TBX2p.R20Q के प्रोटीन स्तर में कमी TBX2+की तुलना में मनाया गया, सुझाव है कि संस्करण अनुवाद या TBX2 के प्रोटीन स्थिरता को प्रभावित कर सकता है, जो बारी में एक सेल के भीतर अपनी बहुतायत को प्रभावित करता है.

TBX2 में दुर्लभ वेरिएंट के साथ अतिरिक्त रोगियों इन प्रयोगात्मक अध्ययन के साथ समानांतर में UDN ड्यूक नैदानिक साइट पर चिकित्सकों द्वारा की पहचान की गई.  एक असंबंधित परिवार से एक de नोवो missense (p.R305H) संस्करण के साथ एक 8 वर्षीय लड़का पहले परिवार87में पाया सुविधाओं के कई प्रदर्शन किया. Drosophila और मानव सेल लाइनों में अतिरिक्त कार्यात्मक अध्ययन से पता चला कि p.R305H संस्करण भी TBX2 समारोह और प्रोटीन के स्तर को प्रभावित करता है, दृढ़ता से सुझाव है कि इस जीन में दोष की संभावना कई phenotypes दो परिवारों में पाया underlie. इस विकार को हाल ही में ओआईएम में "कशेरुक विसंगतियों और चर अंत: स्रावी और टी सेल डिसफंक्शन" (वीटीडी, एमआईएम #618223) के रूप में क्यूरेट किया गया था। ओवरलैपिंग phenotypes के साथ TBX2 में हानिकारक वेरिएंट के साथ अतिरिक्त व्यक्तियों की पहचान मानव रोग में इस जीन के लिए जीनोटाइप-phenotype संबंधों का पूरा स्पेक्ट्रम को समझने के लिए महत्वपूर्ण है.

Figure 1
चित्र 1 : इंजेक्शन और पार योजना UAS मानव CDNA और T2A-GAL4 लाइनों उत्पन्न करने के लिए. (क) माइक्रोइंजेक्शन और क्रॉस के माध्यम से यूएएस-मानव सी डी एन ए ट्रांसजीन्स का उत्पादन। पहली और दूसरी पीढ़ी में पुरुष मक्खियों का उपयोग कर एक दूसरे गुणसूत्र डॉकिंग साइट (VK37) में transgenes एकीकृत करने के लिए पार योजना एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। मानव cDNA के इंजेक्शन पर -C31 ट्रांसजेनिक निर्माण (pGW-HA.attB) जल्दी भ्रूण में है कि एक germline स्रोत होते हैं $C31 integrase (3xP3-GFP और 3xP3-RFP के साथ लेबल) और VK37 डॉकिंग साइट [एक पीले+ के साथ लेबल + (y+ ) मार्कर], ट्रांसजेनिक घटनाओं सफेद+ (w+) minigene कि ट्रांसजेनिक वेक्टर में मौजूद है के साथ पीछा किया जा सकता है। यह GFP और आरएफपी के साथ मक्खियों के खिलाफ चयन करके $C31 integrase बाहर पार करने के लिए सिफारिश की है. अंतिम स्थिर स्टॉक को समयुग्मज के रूप में या एक संतुलित स्टॉक के रूप में रखा जा सकता है यदि गुणसूत्र एक दूसरी साइट घातक/स्टराइल हिट उत्परिवर्तन करता है। ट्रांसजेनिक निर्माण पर दूसरी साइट घातक/स्टराइल उत्परिवर्तनों की उपस्थिति आमतौर पर कार्यात्मक अध्ययनों के परिणाम को तब तक प्रभावित नहीं करती है जब तक कि इन ट्रांसजेनेस का उपयोग विषमयुग्मज अवस्था में किया जाता है (चित्र 3)। (बी) माइक्रोइंजेक्शन और क्रॉस के माध्यम से टी 2 ए-जीएल4 लाइनों का उत्पादन। एक T2A-GAL4 तत्व में एक दूसरे गुणसूत्र MiMIC प्रविष्टि परिवर्तित करने के लिए पार योजना एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है. T2A-GAL4 (PBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, ब्याज की MiMIC के लिए एक उपयुक्त पढ़ने के फ्रेम का चयन किया जाता है) के लिए एक अभिव्यक्ति वेक्टर के लिए एक अभिव्यक्ति वेक्टर microinctइंजेक्शन द्वारा. विवरण के लिए निम्नलिखित कागजात देखें57,59 ब्याज की जीन में एक कोडिंग intron में एक MiMIC ले जाने भ्रूण में, एक T2A-GAL4 लाइन में मूल MiMIC परिवर्तित कर सकते हैं. चित्र 2 A RMCE कनवर्ज़न का एक योजनाबद्ध आरेख दिखाता है. रूपांतरण घटना मूल MiMIC कैसेट60में y+ मार्कर के खिलाफ स्क्रीनिंग द्वारा चुना जा सकता है. चूंकि RMCE दो दिशाओं में हो सकता है, सफल रूपांतरण घटना का केवल 50% GAL4 के सफल उत्पादन की ओर जाता है, जो अगली पीढ़ी में एक UAS-GFP रिपोर्टर transgene द्वारा पता लगाया जा सकता है. अंतिम स्थिर स्टॉक को समयुग्मज के रूप में या एक संतुलित स्टॉक के रूप में रखा जा सकता है यदि जीन का एलओएफ घातक/स्टराइल है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : RMCE के माध्यम से T2A-GAL4 लाइनों में MiMIC तत्वों का रूपांतरण. (ए) )C31 integrase मक्खी (ऊपर) में दो attP साइटों और एक T2A-GAL4 कैसेट एक परिपत्र वेक्टर (नीचे) के रूप में दिखाया के बगल में दो attB साइटों के बीच पुनर्संयोजन की सुविधा. (बी) सफल RMCE घटनाओं एक चयन मार्कर के नुकसान के लिए नेतृत्व (पीला +) और ब्याज की जीन के एक ही अभिविन्यास में T2A-GAL4 कैसेट की प्रविष्टि. चूंकि RMCE घटना दो अभिविन्यास में हो सकता है, RMCE प्रतिक्रिया का केवल 50% एक वांछित उत्पाद पैदावार. विपरीत अभिविन्यास में डाला एक RMCE उत्पाद एक जीन जाल allele या व्यक्त GAL4 के रूप में कार्य नहीं करेगा. निर्माण की दिशात्मकता Sanger अनुक्रमण के माध्यम से पुष्टि की जानी चाहिए. (ग) ब्याज के जीन के ट्रांसक्रिप्शन (ऊपर) और अनुवाद (नीचे) T2A-GAL4 कैसेट के 3' अंत में मौजूद polyA संकेत के कारण एक छोटा MRNA और प्रोटीन की पीढ़ी की ओर जाता है. T2A एक राइबोसोम लंघन संकेत है, जो राइबोसोम को रोकने और इस संकेत के बाद अनुवाद को फिर से शुरू करने की अनुमति देता है। यह एक GAL4 तत्व है कि सहसंयोजक ब्याज की काट जीन उत्पाद से जुड़ा नहीं है उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. GAL4 नाभिक में प्रवेश करेंगे और transgenes कि UAS तत्वों के नियंत्रण में हैं के प्रतिलेखन की सुविधा होगी. UAS-GFP एक जीन अभिव्यक्ति रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और UAS मानव cDNA जीन के माध्यम से बचाव प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता "मानवीकरण". (डी) दिखाया UAS-GFP (ऊपर) की द्वि ड्राइविंग अभिव्यक्ति में एक T2A-GAL4 तत्व का एक उदाहरण है. यह अभिव्यक्ति पैटर्न एक ही जीन के लिए पहले से उत्पन्न बढ़ाने जाल लाइन जैसा दिखता है(द्वि-मंगल4; नीचे). (ई) पहले सूचित LOF द्वि alleles के साथ द्वि के T2A-GAL4 allele की तुलना. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशनों57,87से अपनाया और संशोधित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : बचाव आधारित (बाएं) और overexpression आधारित (दाएं) अध्ययन का उपयोग कर मानव वेरिएंट के कार्यात्मकविश्लेषण। (ए) (बाएं पैनल): EBF3 वेरिएंट के समारोह मक्खी गाँठ (kn) LOF allele घातकता पर ध्यान केंद्रित की एक बचाव आधारित विश्लेषण के साथ मूल्यांकन किया गया / (दाएं पैनल): टीबीएक्स2 में वेरिएंट के समारोह का मूल्यांकन जंगली प्रकार की मक्खियों में मानव टीबीएक्स2 ट्रांसजेनेस के ओवरएक्सप्रेशन के प्रदर्शन से किया गया था, घातकता/व्यवहार्यता, नेत्र आकृति विज्ञान, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी फीनोटाइप्स पर ध्यान केंद्रित करते हुए (चित्र 4) . (ख) कार्यात्मक अध्ययनों में परीक्षण किए जाने वाले मक्खियों को प्राप्त करने के लिए क्रासिंग योजनाएं। यह हमेशा एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में एक तटस्थ यूएएस तत्व (जैसे, यूएएस-लाख,, UAS-GFP)का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। (ग) परिणामों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक उपयुक्त नियंत्रण प्रयोगों के साथ क्रमशः EBF3p.R163Q और TBX2p.R20Q वेरिएंट के कार्यात्मक अध्ययन से प्रतिनिधि परिणाम। बचाव-आधारित विश्लेषण और अतिअभिव्यक्ति अध्ययन दोनों ही बताते हैं कि भिन्न रूप अक्रिस्टलीय या hypomorphic alleles के रूप में व्यवहार करते हैं। यहां दर्शाए गए घातकता/व्यवहार्यता के आंकड़े पिछले प्रकाशनों15,87में प्रस्तुत प्रयोगात्मक आंकड़ों पर आधारित हैं . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : Drosophilaमें नेत्र आकृति विज्ञान और इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम के आधार पर मानव TBX2 में एक दुर्लभ missense संस्करण के कार्यात्मक विश्लेषण. (क) मक्खी आंख पर रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड की विशिष्ट स्थान को दर्शाने वाली एक योजनाबद्ध छवि, साथ ही चार प्रमुख घटकों (पर-परिवर्तन, विध्रुवण, ऑफ-ट्रांसिएंट, के साथ एक प्रतिनिधि इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम रिकॉर्डिंग के साथ, पुनर्ध्रुवण)। (B) TBX2 संस्करण (p.R20Q) दृश्य प्रणाली के लिए विशिष्ट GAL4 ड्राइवरों का उपयोग कर मक्खी आँख में overexpression अध्ययन के आधार पर एक आंशिक LOF allele के रूप में कार्य करता है (ey-GAL4 और Rh1-GAL4) . यह पता चला है कि संदर्भ TBX2 संस्करण प्रोटीन की तुलना में एक मजबूत रूपात्मक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल phenotype का कारण बना. (शीर्ष पैनल): आंख के आकार में एक गंभीर कमी UAS-TBX2के overexpression पर देखा जाता है + ey-GAL4के साथ. UAS-TBX2p.R20Q| ey-GAL4 के साथ संचालित भी एक छोटी आंख का कारण बनता है, लेकिन phenotype बहुत मामूली है. (बॉटम पैनल): जब UAS-TBX2+ कोर R1-R6 photoceptors Rh1-GAL4 का उपयोग कर में व्यक्त किया जाता है, वहाँ पर और ऑफ-ट्रांसिएंट, कम depolarization, और बड़े असामान्य लंबे समय तक depolarization के बाद क्षमता (पीडीए) phenotype का नुकसान है, जो नियंत्रण मक्खियों में नहीं देखा जाता है। ये phenotypes के रूप में गंभीर के रूप में जब UAS-TBX2p.R20Q एक ही Rh1-GAL4का उपयोग कर व्यक्त किया जाता है नहीं कर रहे हैं. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशनों69,87से अपनाया और संशोधित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

Drosophila melanogaster का उपयोग कर प्रयोगात्मक अध्ययन रोग से जुड़े मानव वेरिएंट के परिणामों का आकलन करने के लिए एक मजबूत परख प्रणाली प्रदान करते हैं। यह ज्ञान के विशाल शरीर और विविध आनुवंशिक उपकरणों के कारण है जो पिछली शताब्दी89में फ्लाई फील्ड में कई शोधकर्ताओं द्वारा उत्पन्न किए गए हैं . बस किसी भी अन्य प्रयोगात्मक प्रणाली की तरह, तथापि, यह caveats और सीमाओं है कि अस्तित्व को स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है.

डेटा खनन के साथ जुड़े Caveats
हालांकि इस प्रोटोकॉल में पहला कदम ब्याज की एक जीन से संबंधित जानकारी के लिए मेरा डेटाबेस के लिए है, यह केवल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इसका इस्तेमाल करने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, हालांकि भिन्न फ़ंक्शन के silico पूर्वानुमान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, इन डेटा को हमेशा सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए. कुछ उदाहरण हैं जिनमें सभी प्रमुख एल्गोरिदम यह भविष्यवाणी करते हैं कि मानव संस्करण सौम्य है, फिर भी ड्रोसोफिला में कार्यात्मक अध्ययनों ने स्पष्ट रूप से इस प्रकार24की हानिकारक प्रकृति का प्रदर्शन किया है। इसी तरह, हालांकि प्रोटीन प्रोटीन बातचीत, सह-अभिव्यक्ति, और संरचनात्मक मॉडलिंग डेटा जानकारी के सभी व्यावहारिक टुकड़े कर रहे हैं, वहाँ छद्म सकारात्मक और छद्म नकारात्मक जानकारी इन बड़े -omics डेटा सेट में मौजूद हो सकता है. उदाहरण के लिए, पहले पहचान या भविष्यवाणी प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के कुछ कृत्रिम या केवल कुछ सेल और ऊतक प्रकार में देखा जा सकता है.

इसके अलावा, इन डेटा सेट में कैप्चर नहीं किए गए कई झूठे नकारात्मक इंटरैक्शन हो सकते हैं, क्योंकि कुछ प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन क्षणिक होते हैं (उदा., एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन)। प्रायोगिक सत्यापन यह प्रदर्शित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कुछ जीन या प्रोटीन आनुवंशिक रूप से या शारीरिक रूप से ब्याज के जैविक संदर्भ में विवो में सहभागिता करते हैं। इसी तरह, होमोलोजी मॉडलिंग के आधार पर अनुमानित संरचनाओं को हल संरचना के बजाय एक मॉडल के रूप में माना जाना चाहिए। हालांकि यह जानकारी उपयोगी हो सकता है अगर यह पाया जाता है कि ब्याज की एक एमिनो एसिड प्रोटीन के एक संरचनात्मक महत्वपूर्ण भाग में मौजूद है, नकारात्मक डेटा संभावना है कि संस्करण हानिकारक हो सकता है बाहर शासन नहीं करता. अंत में, पहले की रिपोर्ट जीनोटाइप-phenotype जानकारी के कुछ भी सावधानी के साथ इलाज किया जाना चाहिए, के बाद से कुछ सार्वजनिक डेटाबेस में संग्रहीत जानकारी सही नहीं हो सकता है. उदाहरण के लिए, MO डेटाबेस में कुछ जानकारी प्रयोगों है कि अच्छी तरह से नियंत्रित किया गया है और कड़ाई से प्रदर्शन पर आधारित हैं, जबकि दूसरों को आगे कोई अनुवर्ती अध्ययन और कड़े नियंत्रण के साथ एक बड़े स्क्रीन पेपर से आ सकता है.

T2A-GAL4 रणनीति का उपयोग कर "मानवीकरण" प्रयोग हमेशा सफल नहीं
जबकि बचाव- और overexpression आधारित कार्यात्मक अध्ययन मानव CDNAs का उपयोग कर मानव प्रोटीन के संदर्भ में वेरिएंट के मूल्यांकन की अनुमति है, यह दृष्टिकोण हमेशा सफल नहीं है. यदि एक संदर्भ मानव cDNA मक्खी उत्परिवर्ती phenotype बचाव नहीं कर सकते हैं, वहाँ दो संभावित स्पष्टीकरण कर रहे हैं. पहली संभावना यह है कि मानव प्रोटीन nonfunctional है या काफी एक मक्खी सेल के संदर्भ में गतिविधि कम हो गया है. यह 1 के कारण हो सकता है 1) कम प्रोटीन अभिव्यक्ति, स्थिरता, गतिविधि और / या स्थानीयकरण या 2) मक्खी प्रोटीन है कि एक बहु प्रोटीन परिसर में काम के साथ संगतता की कमी. चूंकि UAS/GAL4 प्रणाली तापमान संवेदनशील है, मक्खियों को अपेक्षाकृत उच्च तापमान (जैसे, 29 डिग्री सेल्सियस) पर उठाया जा सकता है ताकि इस स्थिति में बचाव की संभावना को देखा जा सके। इसके अलावा, एक UAS मक्खी cDNA निर्माण और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में transgene उत्पन्न किया जा सकता है. यदि ब्याज के संस्करण एक संरक्षित एमिनो एसिड को प्रभावित करता है, अनुरूप संस्करण मक्खी ortholog के संदर्भ में संस्करण के कार्यात्मक अध्ययन के लिए मक्खी cDNA में पेश किया जा सकता है. यद्यपि यह आवश्यक नहीं है, यह उन मामलों में अध्ययन में बहुत मददकरता है कि मानव सी डीएनए ट्रांसजेनिक रेखाओं का उपयोग करने से नकारात्मक या अनिर्णायक परिणाम प्राप्त होते हैं (चित्र 3)।

दूसरी संभावना यह है कि मानव प्रोटीन की अभिव्यक्ति कुछ सेलुलर या जीव स्तर विषाक्तता का कारण बनता है. यह एंटीमॉर्फिक (जैसे, एक प्रमुख नकारात्मक प्रोटीन के रूप में कार्य करने के कारण हो सकता है), हाइपरमॉर्फिक (जैसे, बहुत अधिक गतिविधि), या नवरूपी (जैसे, प्रोटीन एकत्रीकरण जैसे एक उपन्यास विषाक्त समारोह का लाभ जो हमेशा जीन के अंतर्जात फलन से संबंधित नहीं होता है ब्याज) प्रभाव. इस मामले में, मक्खियों को कम तापमान में रखने (उदा., 18 डिग्री सेल्सियस) इन समस्याओं में से कुछ को कम कर सकता है। अंत में, वहाँ कुछ परिदृश्यों में एक मक्खी cDNA के overexpression उड़ान T2A-GAL4 लाइन के रूप में TBX2 उदाहरण में देखा बचाव नहीं हो सकता है, जीन उत्पाद की trit खुराक निर्भरता के कारण होने की संभावना. ब्याज की एक प्रोटीन के overexpression से बचने के लिए, ब्याज की मक्खी जीन CRISPR के माध्यम से सीधे संशोधित किया जा सकता है, एक जीनोमिक बचाव निर्माण है कि ब्याज के संस्करण शामिल इंजीनियर किया जा सकता है, या बचाव प्रयोगों एक LOF allele21का उपयोग कर किया जा सकता है. छोटे जीनों के लिए, "मानवीकरण" मक्खी जीनोमिक बचाव निर्माण मानव वेरिएंट है कि गैर संरक्षित अमीनो एसिड को प्रभावित परीक्षण करने के लिए विचार किया जा सकता है24. संक्षेप में, जब मानवीकरण प्रयोग ब्याज के प्रकार के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति नहीं देता है, तो वैकल्पिक रणनीतियों पर विचार किया जाना चाहिए.

नकारात्मक और सकारात्मक परिणामों की व्याख्या
यदि 1) दोनों संदर्भ और भिन्न मानव cDNAs एक समान डिग्री के लिए मक्खी उत्परिवर्ती phenotypes बचाव और 2) वहाँ कोई अंतर नहीं सभी स्थितियों में मनाया जाता है परीक्षण किया है, तो यह माना जा सकता है कि संस्करण में Drosophila में कार्यात्मक अभेद्य है Vivo. हालांकि, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि यह जानकारी इस बात से इनकार करने के लिए पर्याप्त नहीं है कि ब्याज का संस्करण गैर-रोगजनक है, क्योंकि Drosophila परख पर्याप्त संवेदनशील नहीं हो सकता है या ब्याज के जीन/प्रोटीन के सभी संभावित कार्यों को कैप्चर कर सकता है मनुष्यों के लिए प्रासंगिक. दूसरी ओर, सकारात्मक डेटा, एक मजबूत संकेत है कि संस्करण प्रोटीन समारोह पर हानिकारक परिणाम है, लेकिन अकेले यह डेटा अभी भी रोगजनकता का दावा करने के लिए पर्याप्त नहीं है। अमेरिकन कॉलेज ऑफ मेडिकल जेनेटिक्स एंड जीनोमिक्स (ACMG) ने मानव रोग से जुड़े जीनों में भिन्न रूपों को "लाभ", "शायद सौम्य", "अज्ञात महत्व (वीयूएस) के "परिवर्ती", "शायद रोगजनक" में वर्गीकृत करने के लिए मानकों और दिशानिर्देशों का एक सेट प्रकाशित किया है, और "रोगजनक"90| हालांकि यह वर्गीकरण केवल स्थापित रोग-संबद्ध जीनों पर लागू होता है और सीधे "अनिश्चित महत्व की जीन" (जीयूएस) में भिन्न-भिन्न रूपों पर लागू नहीं होता है, मानव संस्करण कार्यात्मक अध्ययनों में शामिल सभी व्यक्तियों को दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है संस्करण फ़ंक्शन रिपोर्टिंग करते समय इस दिशानिर्देश का पालन करें.

MO Phenotypes एक मानव रोग की स्थिति मॉडल नहीं है जब उपयोगी जैविक जानकारी निकालने
यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि overexpression आधारित कार्यात्मक परख सीमाओं है, खासकर के बाद से phenotypes के कुछ रन बनाए जा रहा है ब्याज की बीमारी की स्थिति के लिए थोड़ा प्रासंगिकता हो सकती है. इसी प्रकार, बचाव प्रयोगों के माध्यम से जिन फीनोटाइपकाओं का मूल्यांकन किया जा रहा है, उनकी रुचि की बीमारी से कोई प्रत्यक्ष संबंध नहीं हो सकता है। चूंकि इन प्रयोगों को अंतर्जात संदर्भों के बाहर अकशेरुकी प्रणाली में आयोजित किया जाता है, इसलिए उन्हें रोग मॉडल नहीं माना जाना चाहिए बल्कि एक जीन फंक्शन टेस्ट के रूप में एक "जीवित परीक्षण ट्यूब" के रूप में Drosophila का उपयोग करना चाहिए।

यहां तक कि अगर मॉडल जीव एक मानव रोग की स्थिति की नकल नहीं करता है, बचाव प्रयोगों में इस्तेमाल scorable phenotypes अक्सर रोग की स्थिति में उपयोगी जैविक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. "phenologs की अवधारणा (गैर-अदृश्य समजात phenotypes)"91 Drosophila और मानव phenotypes के बीच अंतर्निहित आणविक कनेक्शन निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मक्खी विंग में morphological phenotypes, छाती, पैर, और आँखें पायदान संकेतन मार्ग में दोषों के लिए उत्कृष्ट phenotypic readouts हैं, एक developmentally संरक्षित मार्ग कई जन्मजात विकारों से जुड़ा हुआ है, हृदय दोष सहित मनुष्यों में62| Drosophilaमें कुछ phenotypes के पीछे आणविक तर्क को समझने के द्वारा, यह मानव में जीन और phenotypes है कि अभी तक समझ में नहीं आ रहे हैं के बीच छिपा जैविक संबंध की पहचान संभव है.

नैदानिक सहयोगियों के साथ सतत संचार
जब चिकित्सकों के साथ काम करने के लिए एक दुर्लभ रोगी में पाया संस्करण के समारोह का अध्ययन करने के लिए, यह एक मजबूत सहयोगी संबंध स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यद्यपि नैदानिक और बुनियादी जैव-चिकित्सा अनुसंधानकर्ता एक ही जीन/आनुवंशिक मार्ग में हितों को साझा कर सकते हैं, नैदानिक और वैज्ञानिक क्षेत्रों के बीच एक बड़ा सांस्कृतिक और भाषाई (उदा., चिकित्सा शब्दजाल, मॉडल जीव-विशिष्ट नामकरण) अंतर है। व्यापक संचार के माध्यम से दोनों पक्षों के बीच एक मजबूत, विश्वास आधारित संबंध बनाया जा सकता है। इसके अलावा, द्विदिश संचार स्थापित करने और इस रिश्ते को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित दो मामलों में, समान जीनोटाइप और फीनोटाइप के साथ अतिरिक्त रोगियों की पहचान, साथ ही बाद में कार्यात्मक अध्ययन, ब्याज के रूपों की रोगजनकता को साबित करने के लिए महत्वपूर्ण थे। यहां तक कि मजबूत कार्यात्मक डेटा के साथ, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों अक्सर कठिनाइयों मानव आनुवंशिकीविदों समझाने है कि एक संस्करण में पहचान की है "एन $ 1" मामलों रोग का असली कारण है.

एक बार एमओ शोधकर्ता की पहचान करता है कि ब्याज का एक प्रकार हानिकारक है, यह जितनी जल्दी हो सके नैदानिक सहयोगियों को वापस संवाद करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि वे सक्रिय रूप से अन्य चिकित्सकों और मानव आनुवंशिकीविदों के साथ नेटवर्किंग द्वारा मिलान मामलों की पहचान करने की कोशिश कर सकते हैं. जेनो2सांसद जैसे उपकरण [Genotypes मेंडेलियन Phenotypes के लिए: एक de-पहचान डेटाबेस 9,650 व्यक्तियों के विश्वविद्यालय में नामांकित Mendelian जीनोमिक्स अध्ययन के लिए विश्वविद्यालय में दाखिला41;रोगियों और परिवार के सदस्यों के संदिग्ध भी शामिल है आनुवंशिक विकार होने - व्यक्तियों है कि एक ही विकार हो सकता है का आकलन करने के लिए खोजा जा सकता है. फिर, लीड चिकित्सक से संदेश सेवा सुविधा का उपयोग करके संपर्क किया जा सकता है.

वैकल्पिक रूप से, GeneMatcher इस्तेमाल किया जा सकता है, जो चिकित्सकों के लिए एक विवाह वेबसाइट है, बुनियादी शोधकर्ताओं, और रोगियों को जो एक ही जीन में हितों का हिस्सा अतिरिक्त रोगियों है कि दुर्लभ वेरिएंट ले की पहचान. GeneMatcher Matchmaker 42 बुलाया मैचमेकिंग वेबसाइटों काएक बड़ा एकीकृत नेटवर्क का हिस्सा है के बाद से, दुनिया भर में अतिरिक्त डेटाबेस ऑस्ट्रेलियाई जीनोमिक्स स्वास्थ्य एलायंस रोगी पुरालेख, ब्रॉड Matchbox सहित खोजा जा सकता है , DECIPHER, MyGene2, और PhenomeCentral एक एकल GeneMatcher जीन प्रस्तुत करने में. हालांकि GeneMatcher में भागीदारी एक "अनुसंधानकर्ता" के रूप में संभव है, यह अनुशंसा की जाती है कि बुनियादी वैज्ञानिकों को अपने नैदानिक सहयोगियों के साथ इस वेबसाइट का उपयोग, के बाद से एक मैच के बाद अन्य चिकित्सकों के साथ संचार चिकित्सा के कुछ स्तरों की आवश्यकता है विशेषज्ञता.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जोस Salazar, जूलिया वांग, और डॉ करेन Schulze धन्यवाद. हम यहाँ चर्चा TBX2 वेरिएंट के कार्यात्मक विशेषता के लिए Drs Ning लियू और Xi Luo स्वीकार करते हैं. Undiagnosed रोग नेटवर्क मॉडल जीव स्क्रीनिंग केंद्र स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के माध्यम से समर्थित किया गया था (NIH) आम कोष (U54 NS093793). एच.टी.सी. आगे NIH[CNCDP-K12 और NINDS (1K12 NS098482)], अमेरिकन एकेडमी ऑफ न्यूरोलॉजी (न्यूरोसाइंस रिसर्च ग्रांट), Burroughs वेलकम फंड (चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए कैरियर पुरस्कार), चाइल्ड न्यूरोलॉजी सोसायटी और चाइल्ड न्यूरोलॉजी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था ( PERF Elterman अनुदान), और NIH निदेशक के प्रारंभिक स्वतंत्रता पुरस्कार (DP5 OD026426). एम एफ डब्ल्यू आगे साइमन्स फाउंडेशन (SFARI पुरस्कार: 368479) द्वारा समर्थित किया गया था। एस वाई आगे NIH द्वारा समर्थित किया गया था (R01 DC014932), साइमन्स फाउंडेशन (SFARI पुरस्कार: 368479), अल्जाइमर एसोसिएशन (नए अन्वेषक अनुसंधान अनुदान: 15-364099), बुनियादी अनुसंधान के लिए नमन परिवार कोष, और कैरोलीन Wies कानून कोष में अनुसंधान के लिए आण्विक चिकित्सा. बीसीएम में Confocal माइक्रोस्कोपी भाग में NIH अनुदान U54HD083092 बौद्धिक और विकासविकलांग अनुसंधान केंद्र (IDDRC) Neurovisualization कोर के लिए समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

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आनुवंशिकी अंक 150 मानव आनुवंशिकी और जीनोमिक्स मेंडेलियन रोग दुर्लभ और undiagnosed रोगों अज्ञात रोग नेटवर्क Drosophila मेलेनोगैस्टर,अज्ञात महत्व के संस्करण VUS अनिश्चित महत्व के जीन GUS कार्यात्मक जीनोमिक्स ट्रांसजेनिक मक्खियां यूएएस/GAL4 प्रणाली T2A-GAL4 इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम ERG
रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट <em>Drosophila</em> का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में
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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao,… More

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

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