Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la progettazione e le prestazioni degli esperimenti in vivo nella Drosophila melanogaster per valutare le conseguenze funzionali delle varianti genetiche rare associate alle malattie umane.
Abstract
I progressi nella tecnologia di sequenziamento hanno reso i set di dati dell'intero genoma e dell'intero esoma più accessibili sia per la diagnosi clinica che per la ricerca sulla genetica umana all'avanguardia. Sebbene siano stati sviluppati diversi algoritmi in silico per prevedere la patogenicità delle varianti identificate in questi set di dati, gli studi funzionali sono fondamentali per determinare come specifiche varianti genomiche influiscono sulla funzione delle proteine, in particolare per un errore Varianti. Nella rete di ricerca sulle malattie non diagnosticate (UDN) e in altri consorzi di ricerca sulle malattie rare, gli organismi modello (MO) tra cui la Drosophila, i c. elegans, ipesci zebra e i topi sono utilizzati attivamente per valutare la funzione di malattia umana putativa che causa Varianti. Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione funzionale delle varianti umane rare utilizzate nel Centro di screening degli organismi modello Drosophila Core dell'UDN. Il flusso di lavoro inizia con la raccolta di informazioni umane e MO da più database pubblici, utilizzando la risorsa web MARRVEL per valutare se la variante potrebbe contribuire alle condizioni di un paziente e progettare esperimenti efficaci basati su quelli disponibili conoscenze e risorse. Successivamente, vengono generati strumenti genetici (ad esempio, linee CDNA T2A-GAL4 e UAS-umani) per valutare le funzioni delle varianti di interesse per la Drosophila. Dopo lo sviluppo di questi reagenti, è possibile eseguire analisi funzionali su due punte basate su esperimenti di salvataggio e sovraespressione per valutare la funzione di variante. Nel ramo del salvataggio, i geni della mosca endogena vengono "umanizzati" sostituendo il gene ortologo della Drosophila con transgeni umani di riferimento o variante. Nel ramo della sovraespressione, le proteine umane di riferimento e variante sono esogenamente guidate in una varietà di tessuti. In entrambi i casi, qualsiasi fenotipo setabile (ad esempio, letalità, morfologia degli occhi, elettrofisiologia) può essere utilizzato come lettura, indipendentemente dalla malattia di interesse. Le differenze osservate tra gli alleli di riferimento e varianti suggeriscono un effetto specifico della variante, e quindi probabilmente patogenicità. Questo protocollo consente valutazioni rapide e in vivo delle varianti putative che causano malattie umane di geni con funzioni note e sconosciute.
Introduction
I pazienti con malattie rare spesso subiscono un viaggio arduo indicato come "odissea diagnostica" per ottenere una diagnosi accurata1. Si ritiene che la maggior parte delle malattie rare abbia una forte origine genetica, rendendo critici gli elementi critici dell'elaborazione genetica/genomica dell'elaborazione clinica. Oltre all'analisi delle variazioni dei pannelli genici e dei numeri di copie candidati, oltre all'analisi delle variazioni dei numeri cromosomici, all'intero esoma (WES) e al sequenziamento dell'intero genoma sono diventati strumenti sempre più preziosi nell'ultimo decennio2, 3. Attualmente, il tasso diagnostico per identificare una variante patogena nota in WES e WGS è di 25% (superiore nei casi pediatrici)4,5. Per la maggior parte dei casi che rimangono non diagnosticati dopo WES/WGS clinici, un problema comune è che ci sono molti geni e varianti candidati. Il sequenziamento di nuova generazione spesso identifica varianti nuove o ultrarare in molti geni e interpretare se queste varianti contribuiscono ai fenotipi della malattia è difficile. Ad esempio, anche se la maggior parte delle mutazioni senza senso o frameshift nei geni sono ritenute come alleli di perdita di funzione (LOF) a causa del decadimento mediato da sciocchezze della trascrizione codificata, mutazioni troncanti trovate negli ultimi esoni sfuggono a questo processo e possono funzionare come benigni o gain-of-function (GOF) alleli6.
Inoltre, prevedere gli effetti di un allele missense è un compito scoraggiante, dal momento che può portare a una serie di diversi scenari genetici come descritto per la prima volta da Herman Muller negli anni '30 (cioè amorfi, ipomorfi, ipomorfi, antimorfi, antimorfi, neomorfi o isomorfi)7 . Numerosi programmi e metodologie in silico sono stati sviluppati per prevedere la patogenicità delle varianti missense basate sulla conservazione evolutiva, il tipo di cambiamento degli amminoacidi, la posizione all'interno di un dominio funzionale, la frequenza allele nella popolazione generale, e altri parametri8. Tuttavia, questi programmi non sono una soluzione completa per risolvere il complicato problema dell'interpretazione delle varianti. È interessante notare che, un recente studio ha dimostrato che cinque algoritmi di previsione della patogenicità variante ampiamente utilizzati (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) concordano sulla patogenicità 80% delle volte8 . In particolare, anche quando tutti gli algoritmi sono d'accordo, restituiscono una previsione errata della patogenicità fino all'11% del tempo. Questo non solo porta a un'interpretazione clinica imperfetta, ma può anche dissuadere i ricercatori dal seguire le nuove varianti elencandole falsamente come benigne. Un modo per completare l'attuale limitazione della modellazione in silico consiste nel fornire dati sperimentali che dimostrino l'effetto della funzione variant in vitro, ex vivo (ad esempio, cellule coltivate, organoidi) o in vivo.
Gli studi funzionali in vivo sulle varianti associate alle malattie rare nel MO hanno punti di forza unici13 e sono stati adottati da molte iniziative di ricerca sulle malattie rare in tutto il mondo, tra cui la Rete delle Malattie Non Diagnosi (UDN) negli Stati Uniti e Rara Malattie Modelli & Meccanismi (RDMM) Reti in Canada, Giappone, Europa e Australia14. Oltre a questi sforzi coordinati per integrare i ricercatori MO nel flusso di lavoro della diagnosi di malattie rare e degli studi meccanicistici su scala nazionale, una serie di studi di collaborazione individuale tra ricercatori clinici e MO hanno portato alla scoperta e caratterizzazione di molti nuovi geni e varianti che causano malattie umane82,83,84.
Nell'UDN, un Centro di screening centralizzato degli organismi modello (MOSC) riceve la presentazione di geni e varianti candidati con una descrizione delle condizioni del paziente e valuta se la variante è probabilmente patogena utilizzando strumenti informatici e in vivo Esperimenti. Nella Fase I (2015-2018) dell'UDN, il MOSC comprendeva un Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] e il nucleo di pesce zebra (Università dell'Oregon) che ha lavorato in collaborazione per valutare i casi. Utilizzando l'analisi informatica e una serie di diverse strategie sperimentali in Drosophila e pesce zebra, il MOSC ha finora contribuito alla diagnosi di 132 pazienti, l'identificazione di 31 nuove sindromi55, scoperta di diversi nuovi i geni della malattia (ad esempio, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) e l'espansione fenotipica della malattia nota (ad esempio, CACNA1A21, ACOX122).
Oltre ai progetti all'interno dell'UDN, i ricercatori del MOSC Drosophila Core hanno contribuito a nuove scoperte geniche della malattia in collaborazione con i Centers for Mendelian Genomics e altre iniziative (ad esempio, ANKLE223, TM2D3 24 , NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) utilizzando lo stesso insieme di informatica e genetica strategie sviluppate per l'UDN. Dato il significato degli studi di MO sulla diagnosi di malattia rara, il MOSC è stato ampliato per includere un C. elegans Core e un secondo nucleo di pesce zebra (entrambi alla Washington University di St. Louis) per la fase II (2018-2022) dell'UDN.
Questo manoscritto descrive un protocollo di studio funzionale in vivo che viene utilizzato attivamente nel nucleo di Drosophila UDN MOSC per determinare se le varianti missense hanno conseguenze funzionali sulla proteina di interesse utilizzando mosche transgeniche che esprimono l'uomo Proteine. L'obiettivo di questo protocollo è quello di aiutare i ricercatori MO a lavorare in collaborazione con gruppi di ricerca clinica per fornire prove sperimentali che una variante candidata in un gene di interesse ha conseguenze funzionali, facilitando così la diagnosi clinica. Questo protocollo è particolarmente utile in uno scenario in cui un ricercatore della Drosophila viene avvicinato da un ricercatore clinico che ha un paziente a malattia rara con una variante candidata specifica in un gene di interesse.
Questo protocollo può essere suddiviso in tre elementi: (1) raccogliere informazioni per valutare la probabilità che la variante di interesse sia responsabile del fenotipo del paziente e la fattibilità di uno studio funzionale in Drosophila, (2) raccolta strumenti genetici esistenti e stabilirne di nuovi, e (3) svolgere studi funzionali in vivo. Il terzo elemento può essere ulteriormente suddiviso in due sottoelementi in base al modo in cui può essere valutata la funzione di una variante di interesse (esperimento di salvataggio o strategie basate su sovraespressioni). È importante notare che questo protocollo può essere adattato e ottimizzato a molti scenari al di fuori della ricerca sulle malattie monogeniche rare (ad esempio, malattie comuni, interazioni genetico-ambiente e schermi farmacologici/genetici per identificare gli obiettivi terapeutici). La capacità di determinare la funzionalità e la patogenicità delle varianti non solo gioverà al paziente di interesse fornendo una diagnosi molecolare accurata, ma avrà anche un impatto più ampio sulla ricerca scientifica traslazionale e di base.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Raccolta di informazioni umane e MO per valutare: probabilità che una variante di interesse sia responsabile dei fenotipi della malattia e fattibilità degli studi funzionali nella Drosophila
- Eseguire ricerche approfondite nel database e nella letteratura per determinare se i geni specifici e le varianti di interesse sono buoni candidati per spiegare il fenotipo del paziente di interesse. In particolare, raccogliere le informazioni seguenti.
- Valutare se il gene di interesse è stato precedentemente implicato in altri disturbi genetici (espansione fenotipica del gene della malattia nota) o se si tratta di un gene candidato della malattia completamente nuovo [variante genica di significato incerto (GVUS)].
- Valutare la frequenza allele della variante di interesse nei database delle malattie o della popolazione di controllo.
- Valutare se esistono variazioni del numero di copie (CPV) che includono questo gene nelle banche dati sulle malattie o nel controllo della popolazione.
- Valutare quali sono i geni ortologhi in diverse specie di MO tra cui topo, pesce zebra, Drosophila, C. elegans, e lievito, quindi indagare ulteriormente le funzioni note e modelli di espressione di questi geni ortologhi.
- Valutare se la variante di interesse è presente in un dominio funzionale della proteina e se l'amminoacido di interesse è conservato evolutivamente.
NOTA: le risposte a queste cinque domande (passaggi 1.1.1-1.1.5) possono essere ottenute accedendo singolarmente a numerosi database umani e MO oppure utilizzando la risorsa Web MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (vedere Tabella 1 per le risorse online)30, che è descritto in modo approfondito in un articolo di accompagnamento31. Vedere la sezione dei risultati rappresentativi per esempi specifici. Anche il sitoweb 32 di Monarch Initiative e Gene2Function33 forniscono informazioni utili.
- Raccogliere informazioni aggiuntive per valutare ulteriormente se la variante è una buona malattia candidata da una funzione proteica e struttura punto di vista.
- Valutare se si prevede che la variante di interesse sia dannosa in base agli algoritmi di previsione del silico.
NOTA: Gli algoritmi di patogenicità delle varianti sono stati sviluppati da molti gruppi di ricerca negli ultimi 15 anni, e alcuni sono visualizzati anche nei risultati di ricerca MARRVEL. Programmi più recenti, inclusi i due elencati di seguito, combinano algoritmi di ridisposizione della patogenicità a variante multipla e approcci di apprendimento automatico per generare un punteggio di patogenicità. Per ulteriori informazioni sugli algoritmi di previsione delle varianti e sulle relative prestazioni, fare riferimento a Ghosh, et al.8. (i) CADD (esaurimento combinato dipendente dalle annotazioni): strumento di annotazione integrativa costruito su più di 60 caratteristiche genomiche, che fornisce punteggi per SNV umani e brevi inserimenti ed eliminazioni11. (ii) REVEL (raro dime variante ensemble learner): combina algoritmi di patogenicità a variante multipla (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP e phastCons) per fornire un punteggio integrato per tutte le possibili varianti di missense umano34. - Determinare se il gene/proteina umana di interesse o i suoi ortologhi MO hanno dimostrato di interagire geneticamente o fisicamente con geni/proteine precedentemente collegati a malattie genetiche. Se è così, valutare se il paziente di interesse presenta fenotipi sovrapposti con questi disturbi.
NOTA: Sono stati sviluppati diversi strumenti per analizzare le interazioni genetico e proteina-proteina sulla base di pubblicazioni MO e di proteomica su larga scala provenienti da schermi di specie multiple. STRING (strumento di ricerca per istanze ricorrenti di geni vicini)35: un database per le interazioni proteina-proteina note e previste. Integra l'interazione genetica e i set di dati di co-espressione, nonché strumenti di estrazione del testo per identificare geni e proteine che possono funzionare insieme in una varietà di organismi. MIST (strumento di ricerca dell'interazione molecolare)36: un database che integra i dati genetici e di interazione proteina-proteina dai principali STUDI genetici (lievito, C. elegans, Drosophila, pesce zebra, rana, ratto, topo) e gli esseri umani. Vengono inoltre visualizzate le previsioni delle interazioni dedotte da geni/proteine ortologhi (interlog). - Determinare se la struttura 3D della proteina di interesse è stata risolta o modellata. In tal caso, determinare dove mappa della variante di interesse rispetto ai domini funzionali chiave.
NOTA: Le strutture proteiche risolte dalla cristallografia a raggi X, dalla risonanza magnetica nucleare (NMR) e dalla microscopia crioelettronica possono essere trovate nelle banche dati pubbliche, tra cui il PDB (banca dati proteine) e EMDatabank37. Sebbene non esista un unico database per le strutture proteiche stimate/modellate, sono disponibili per gli utenti una serie di algoritmi (ad esempio, SWISS-MODEL38, Modeller39e Phyre240) per eseguire la modellazione delle proteine.
- Valutare se si prevede che la variante di interesse sia dannosa in base agli algoritmi di previsione del silico.
- Comunicare con i collaboratori clinici per discutere le informazioni raccolte dalle analisi informatiche nelle sezioni 1.1-1.2. Se i collaboratori clinici ritengono anche che la variante e il gene di interesse siano buoni candidati per spiegare i fenotipi visti nel paziente, procedere alla sezione 2. Se ci sono domande specifiche sul genotipo e sul fenotipo del paziente, discuteteli con i collaboratori clinici prima di andare avanti.
NOTA: Se si ritiene che la variante di interesse non spiegherà il fenotipo di interesse (ad esempio, variante identica trovata in alta frequenza nella popolazione di controllo), discuterne con i collaboratori clinici per determinare se la variante è una buona candidato, in quanto potrebbe non esserci la competenza appropriata per interpretare i fenotipi clinici.
2. Raccolta di strumenti genetici esistenti e creazione di nuovi reagenti per studiare una variante specifica di interesse
NOTA: Una volta che la variante di interesse è stata determinata un buon candidato per perseguire sperimentalmente, raccogliere o generare reagenti per eseguire studi funzionali in vivo. Per gli studi funzionali descritti in questo protocollo, sono necessari alcuni reagenti chiave drosophila melanogaster: 1) ceppi transgenici cDNA umani regolati da una sequenza a monte che portano la sequenza di riferimento o variante, 2) una perdita di funzione allele di un gene di mosca di interesse, e 3) una linea GAL4 che può essere utilizzata per esperimenti di salvataggio.
- Generazione di costrutti cDNA umani UAS e mosche transgeniche
- Identificare e ottenere i costrutti cDNA umani appropriati. Molti cloni sono disponibili presso la MGC (collezione di geni mammiferi)43 e possono essere acquistati da venditori selezionati. Per i geni che sono alternativamente uniti, controllare quale cDNA isoforme corrisponde all'utilizzo di Ensembl o RefSeq.
NOTA: Molti cDNA sono disponibili nei reagenti 44 compatibili con il sistema di clonazione con supporto ricombinano44, il che semplifica il passaggio di subclonazione. i cDNA possono essere disponibili in un formato "aperto (no stop codon)" o "chiuso (con codon di arresto endogeno o artificiale)". Mentre i cloni aperti consentono il marcatura C di proteine utili per i saggi biochimici (ad esempio, le macchie occidentali) e le cellule biologiche (ad esempio, immunostaining) per monitorare l'espressione della proteina di interesse, in alcuni casi può interferire con la funzione proteica. - Sub-clone il riferimento e variante cDNA nel vettore transgenico Drosophila. Utilizzare il sistema di transgenesi mediata da C31, poiché ciò consente di integrare i cDNA di riferimento e variante nella stessa posizione nel genoma45. Per questo progetto, il MOSC Drosophila Core utilizza abitualmente il vettore pGW-HA.attB46.
NOTA: Se il cDNA umano è in vettori compatibili con il sistema di clonazione mediato in ricombinante (ad esempio, pDONR221, pENTR221), passare alla sezione 2.1.4, che spiega le reazioni LR per sottoclonare i cDNA in pGW-HA.attB.- Se il cDNA umano non si trova in un sistema di clonazione compatibile con ricombinasi compatibile, sottoclone dei cDNA umani in un vettore di ingresso Gateway utilizzando tecniche biologiche molecolari standard (un esempio di tale protocollo è documentato di seguito).
- Eseguire una pcR di sporgenza per introdurre i bracci attB1 e attB2. Il primer in avanti dovrebbe avere la sequenza attB1 5'-GGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCT-3', seguita dai primi 22 nucleotidi del cDNA target. Il primer inverso dovrebbe avere la sequenza attB2 5'-GGACCACTTGTACAAGAAAGCTGGCTCTCTCCTA-3' seguita dal complemento inverso degli ultimi 25 nucleotidi del cDNA di interesse. Escludere il codon di arresto del cDNA, quindi aggiungere un tag C' se si desidera "aprire" un clone o aggiungere un codone di arresto per "chiudere" un clone.
- Preparare una miscela PCR ad alta fedeltà composta da 50 -L di miscela master PCR ad alta fedeltà, 36 l di acqua distillata, 5 ll di ogni primer in avanti e inverso elencati al passo 2.1.2.1.1 di diluito a 10 m e 4 -L di bersaglio cDNA (150 ng/L).
- Eseguire la PCR utilizzando il protocollo di mutagenesi standard per aggiungere braccia attB1 e attB2 sul cDNA di interesse. Le condizioni variano a seconda del costrutto e delle varianti di interesse.
- Isolare il cDNA bersaglio con i bracci di omologia aggiunti tramite elettroforesi gel ed estrazione gel. Creare 1% gel di agarose ed eseguire l'elettroforesi utilizzando metodi standard. Asciso la banda che corrisponde alla dimensione del cDNA più la lunghezza aggiuntiva dei bracci di omologia. Estrarre il DNA dal gel attraverso i metodi standard95. Kit di estrazione gel commerciali sono disponibili da diverse aziende.
- Eseguire una reazione ricombinante in vitro basata sul protocollo di clonazione recombinano-mediato secondo il sistema utilizzato.
- Trasformare il mix di reazione BP in cellule E. coli chimicamente competenti. Le celle competenti possono essere fatte internamente o acquistate da fornitori commerciali. Coltura le cellule trasformate durante la notte su una piastra LB contenente antibiotici appropriati per la selezione della colonia. Il giorno successivo, selezionare diverse colonie e farle crescere in culture liquide indipendenti durante la notte.
- Isolare il DNA dalle culture notturne attraverso il miniprep. Sequenziare i cloni positivi per garantire che il cDNA abbia la sequenza corretta96. Mantenere le cellule delle colture che sono positive per la sequenza desiderata nel 25% glicerolo memorizzato a -80 gradi centigradi.
- Se il cDNA umano non si trova in un sistema di clonazione compatibile con ricombinasi compatibile, sottoclone dei cDNA umani in un vettore di ingresso Gateway utilizzando tecniche biologiche molecolari standard (un esempio di tale protocollo è documentato di seguito).
- Eseguire la mutagenesi diretta dal sito per introdurre la variante di interesse nel plasmide Gateway con il riferimento umano cDNA97. Un protocollo dettagliato per questo metodo è disponibile nel sito Web del fornitore48,49. Convalidare la presenza della variante nel plasmide mutato tramite sequenziamento di Sanger dell'intero frame di lettura aperto (ORF) per assicurarsi che non ci siano varianti aggiuntive introdotte attraverso questa fase di mutagenesi.
- Sottoclone i cDNA umani di riferimento e variante nel plasmide del donatore (plasmidi di porta con siti attL1 e attL2) nel plasmide transgenico (ad esempio, pGW-HA.attB con siti attR1 e attR2) attraverso una reazione di clonasi LR.
NOTA: Ci sono vettori UASC31 progettati per la subclonazione basata su enzimi di restrizione convenzionali (ad esempio, pUAST.attB50) se si preferisce sottoclonare cDNA umani tramite metodi di enzimi di restrizione. - Selezionare i siti di ancoraggio C31 in cui integrare i transgeni cDNA UAS-umani. Un certo numero di siti di attracco sono stati generati da diversi laboratori e sono disponibili pubblicamente dai centri di magazzinaggio50,52,53.
NOTA: Poiché è conveniente avere il transgene umano su un cromosoma che non contiene l'ortologo fly del gene di interesse, si consiglia di utilizzare un secondo sito di aggancio cromosomi [VK37 (scorta BDSC #24872] quando l'ortologo fly è sulla X , terzo o quarto cromosoma, e utilizzare un terzo sito di attracco cromosomico [VK33 (stock BDSC #24871] quando l'ortologo fly è sul secondo cromosoma. - Iniettare i costrutti di cDNA UAS-human nelle mosche che esprimono l'integrasi CC31 nella loro linea germinale (ad es. vas-C31, nos-C31).
NOTA: La microiniezione può essere eseguita internamente o inviata a strutture di base o entità commerciali per la transgenesi. Il protocollo dettagliato per la generazione di mosche transgeniche può essere trovato nel capitolo51del libro citato. - Stabilire ceppi transgenici stabili dagli embrioni iniettati. Iniettare 100-200 embrioni per costrutto94. Uno schema di attraversamento rappresentativo per l'inserimento di un transgene in un secondo sito di attracco cromosomico (VK37) è illustrato nella Figura 1A. Fare riferimento ai libri citati54,55 per informazioni di base sulla genetica della Drosophila.
- Identificare e ottenere i costrutti cDNA umani appropriati. Molti cloni sono disponibili presso la MGC (collezione di geni mammiferi)43 e possono essere acquistati da venditori selezionati. Per i geni che sono alternativamente uniti, controllare quale cDNA isoforme corrisponde all'utilizzo di Ensembl o RefSeq.
- Ottenere o generare una linea T2A-GAL4 che facilita i saggi funzionali basati sul salvataggio (vedere la Figura 2 e la sezione 3.1).
NOTA: Questa linea servirà a due scopi. In primo luogo, la maggior parte delle linee T2A-GAL4 testate si comportano come forti alleli LOF funzionando come un allele trappola genica. In secondo luogo, le linee T2A-GAL4 funzionano come un driver GAL4 che consente l'espressione di costrutti UAS (ad esempio UAS-GFP, UAS-human cDNA) in base agli elementi di regolazione endogeni del gene di interesse56,57 (Figura 2A-C).- Cerca nelle raccolte di azioni pubbliche le linee T2A-GAL4 disponibili, tra cui il Drosophila Gene Disruption Project (PIL)58 in cui sono state generate 1.000 linee T2A-GAL459. Questi ceppi sono attualmente disponibili presso il Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) e sono ricercabili attraverso i siti web del PIL e BDSC.
- Se non è disponibile una linea T2A-GAL4 per il gene fly di interesse, verificare se una linea MiMIC intronica di codifica adatta(Minos-mediated integration cassette) è disponibile per la conversione in una linea T2A-GAL4 utilizzando lo scambio di cassette mediato ricombinante (RMCE )60 (Figura 2A).
NOTA: RMCE consente di convertire gli elementi MiMIC intronici che si trovano tra due esoni di codifica in una linea T2A-GAL4 attraverso la microiniezione di un costrutto donatore (un esempio di schema di attraversamento è illustrato nella Figura 1B) o in una serie di come descritto nel dettaglio57,59. - Se non è disponibile una linea T2A-GAL4 e non esiste un MiMIC di codifica appropriato, esplorare la possibilità di generare una linea T2A-GAL4 tramite il sistema59DELLA cassetta di integrazione mediata CRIMR (CRISPR).
NOTA: Questa metodologia utilizza la scissione del DNA mediata da CRISPR e la riparazione diretta dall'omologia (HDR) per integrare una cassetta simile a MiMIC in un intron codificante in un gene di interesse. - Se il gene di interesse manca di un grande intron (>150 bp) o non ha introni, tentare di inserire una transgene GAL4 nel gene fly con il sistema CRISPR/Cas9 utilizzando HDR come descritto20,61,62.
NOTA: se la generazione di un allele A battesimo T2A-GAL4 o GAL4 è difficile, tentare di eseguire esperimenti di salvataggio utilizzando questi alleli preesistenti o linee RNAi e driver GAL4 onnipresenti o specifici del tessuto come descritto92 (REF).
3. Esecuzione di analisi funzionale della variante umana di interesse in vivo in Drosophila
NOTA: Eseguire un'analisi basata sul salvataggio (sezione 3.1) e studi di sovraespressione (sezione 3.2) utilizzando gli strumenti raccolti o generati nella sezione 2 per valutare le conseguenze della variante di interesse in vivo in Drosophila. Considerare l'utilizzo di entrambi gli approcci, dal momento che i due sono complementari.
- Esecuzione di analisi funzionali attraverso esperimenti basati sul salvataggio
nota: Esperimenti eterologi basati sul salvataggioDrosophilal'uso di proteine umane determina se la funzione molecolare dei due geni ortologhi è stata conservata nell'arco di 500 milioni di anni di evoluzione. Valutano anche la funzione della variante nel contesto della proteina umana63. Sebbene non sia stata riportata un'analisi sistematica che ha studiato centinaia di coppie di geni, diverse decine di geni umani e mammiferi (ad esempio, il topo) sono in grado di sostituire la funzione diDrosophilaGeni13.- Nell'approccio basato sul salvataggio, determinare innanzitutto se esistono fenotipi evidenti, scorable e riproducibili nei mutanti LOF nell'ortologo di mosca prima di valutare le funzioni delle varianti.
NOTA: La letteratura precedente sul gene fly è un buon posto per estrarre i dati prima, e può essere trovato utilizzando database tra cui FlyBase e PubMed. Ulteriori database come MARRVEL, Monarch Initiative e Gene2Funcion sono utili anche per raccogliere queste informazioni. - Eseguire un'indagine globale sui fenotipi setorosibili nell'omozigoma e nell'emizigoso (T2A-GAL4 allele su un gene cromosomico definito molecolarmente, soprattutto se l'allele T2A-GAL4 è la prima mutazione da caratterizzare per un gene specifico. Valutare fenotipi come letalità, sterilità, longevità, morfologica (ad esempio, dimensioni e morfologia dell'occhio) e comportamento (ad esempio, corteggiamento, volo, arrampicata e difetti di sensibilità bang).
NOTA: Se non ci sono fenotipi principali identificati da questo schermo primario, possono essere utilizzati fenotipi più sottili come i difetti neurologici misurati dalle registrazioni elettrofisiologiche se sono altamente riproducibili e specifici. Ad esempio, gli studi funzionali che utilizzano l'elettroretinogramma (ERG) sono descritti nel passaggio 3.2.3. In caso di mancata rilevanza di fenotipo, passare alla sezione 3.2 ed eseguire lo studio funzionale basato sulla sovraespressione. - Una volta identificato un fenotipo coroso nel mutante LOF volante, verificare se il cDNA umano di riferimento può sostituire la funzione dell'ortologo della mosca tentando di utilizzare il cDNA umano per salvare la linea di mosca mutante. Il saggio fenotipica da eseguire qui dipende dai risultati del passaggio 3.1.2 e sarà specifico del gene studiato.
NOTA: Se l'"umanizzazione" del gene della mosca ha successo, ora esiste una piattaforma per confrontare l'efficienza del salvataggio per la variante di interesse rispetto alla controparte di riferimento. Il salvataggio visto con riferimento cDNA umano non deve essere perfetto. Il salvataggio parziale del fenotipo mutante di mosca utilizzando un cDNA umano fornisce ancora un punto di riferimento per eseguire studi comparativi utilizzando la variante ceppo cDNA umano. - Utilizzando il sistema di analisi selezionato al passo 3.1.2, confrontare il salvataggio osservato con il cDNA umano di riferimento con il salvataggio osservato con la variante cDNA umano per determinare se la variante di interesse ha conseguenze sul gene di interesse.
NOTA: Se la variante cDNA umana funziona peggio dell'allele di riferimento, ciò suggerisce che la variante di interesse è deleteria per la funzione proteica. Se la variante e il riferimento non possono essere distinti funzionalmente, allora 1) l'allele può essere un isomorfo (una variante che non influenza la funzione della proteina) o 2) l'analisi non è abbastanza sensibile per rilevare sottili differenze. - Se la variante risulta essere un allele deleterio, valuta ulteriormente l'espressione e la localizzazione intracellulare delle proteine di riferimento e variante di interesse in vivo tramite macchia occidentale, colorazione immunofluorescenza o altri metodi93.
NOTA: Se il cDNA umano UAS viene generato da un clone aperto in un vettore pGW-HA.attB, utilizzare un anticorpo anti-HA per eseguire questi saggi biochimici e cellulari. Se il clone originale è un clone chiuso, verificare se gli anticorpi commerciali contro le proteine umane possono essere utilizzati per questi saggi. Una differenza nei livelli di espressione e nella localizzazione intracellulare può rivelare come la variante di interesse influenzi la funzione proteica.
- Nell'approccio basato sul salvataggio, determinare innanzitutto se esistono fenotipi evidenti, scorable e riproducibili nei mutanti LOF nell'ortologo di mosca prima di valutare le funzioni delle varianti.
- Esecuzione di analisi funzionali attraverso studi di sovraespressione
NOTA: la sovraespressione susida o specifica dei tessuti dei cDNA umani in mosche di tipo altrimenti selvatico può fornire informazioni complementari agli esperimenti basati sul salvataggio discussi nella sezione 3.1. Mentre i saggi basati sul salvataggio sono progettati principalmente per rilevare le varianti LOF (amorfiche, ipomofici), i saggi basati su sovraespressione possono anche rivelare varianti di guadagno-di-funzione (GOF) che sono più difficili da valutare (ipermorfico, antimorfico, neomorfico).- Selezionare un set di driver GAL4 per sovraesprimere i cDNA umani di interesse. Un certo numero di driver GAL4 onnipresenti e specifici dei tessuti sono disponibili presso centri di stock pubblici (ad esempio, BDSC), alcuni dei quali sono più frequentemente utilizzati rispetto ad altri. In primo luogo concentrarsi su driver onnipresenti e fenotipi facilmente coetbuabili (letalità, sterilità, fenotipi morfologici), poi passare a driver specifici del tessuto e fenotipi più specifici.
NOTA: convalidare l'espressione dei driver GAL4 con una linea reporter (ad esempio, UAS-GFP) per confermare i modelli di espressione prima dell'utilizzo negli esperimenti. - Esprimere il riferimento e la variante di cDNA umani utilizzando lo stesso driver nelle stesse condizioni (ad esempio, temperatura) incrociando 3-5 femmine vergini dalla linea GAL4 (ad esempio, ey-GAL4 per l'espressione del disco visivo) con 3-5 moscerini maschi dalle linee UAS [ad esempio, UAS-TBX2() o UAS-TBX2(p.R305H) per l'esempio illustrato nella sezione 4.2] in una singola flaconcia.
- Trasferire le croci ogni 2-3 giorni per avere molti animali che si estacono da una singola croce.
- Esaminare la progenie e rilevare eventuali differenze tra i ceppi di riferimento e varianti (ad esempio, morfologia degli occhi) al microscopio di dissezione. Immagine delle mosche utilizzando una telecamera collegata a un microscopio di dissezione per documentare il fenotipo.
NOTA: Se un fenotipo è visto solo nel riferimento ma non nella linea di variante, allora la variante può essere un allele amorfico o ipomorfico forte. Se il fenotipo è visto in entrambi i genotipi, ma il riferimento provoca un difetto più forte, allora la variante può essere un allele ipomorfico da lieve a debole. Se il riferimento non mostra un fenotipo o mostra solo un fenotipo debole, ma la variante mostra un forte difetto, allora la variante può essere un allele GOF. - Se un fenotipo non si vede in condizioni di coltura standard (RT o a 25 gradi centigradi), impostare le croci a temperature diverse che vanno 18-29 gradi centigradi, poiché il sistema UAS/GAL4 è noto per essere sensibile alla temperatura64,65). Tipicamente, l'espressione dei transgeni UAS è più alta a temperature più elevate.
- Selezionare un set di driver GAL4 per sovraesprimere i cDNA umani di interesse. Un certo numero di driver GAL4 onnipresenti e specifici dei tessuti sono disponibili presso centri di stock pubblici (ad esempio, BDSC), alcuni dei quali sono più frequentemente utilizzati rispetto ad altri. In primo luogo concentrarsi su driver onnipresenti e fenotipi facilmente coetbuabili (letalità, sterilità, fenotipi morfologici), poi passare a driver specifici del tessuto e fenotipi più specifici.
- Eseguire ulteriori studi funzionali relativi ai geni e alle proteine di interesse.
nota: Oltre ad esaminare i difetti generali, è possibile selezionare un sistema di analisi per sondare le funzioni molecolari del gene e della variante. In un esempio discusso nei risultati rappresentativi (TBX2caso), le registrazioni ERG sono state utilizzate per determinare gli effetti della variante sulla funzione fotorettutto, poiché il gene a mosca di interesse (bifid) era stato studiato a fondo nel contesto dello sviluppo del sistema visivo. Protocolli dettagliati per ERG inDrosophilapuò essere trovato come pubblicato in precedenza66,67,68.- Generare mosche per verificare la ricerca di difetti funzionali nel sistema visivo. Le femmine vergini incrociate della linea Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 ai maschi con riferimenti o varianti transgeni cDNA umani UAS per esprimere le proteine umane di interesse nei fotorecettori R1-R6.
NOTA: Cross 3-5 femmine vergini a 3-5 maschio vola in una singola fiala e trasferire le croci ogni 2-3 giorni per avere molti animali che si estavano da una singola croce. Tutte le croci devono essere tenute in un'incubatrice fissata alla temperatura sperimentale per ottenere risultati coerenti. - Una volta che le mosche iniziano a chiudere (a 25 gradi centigradi, 10 giorni dopo aver impostato la croce iniziale), raccogliere la progenie (Rh1-GAL4 / s; UAS-umano cDNA / )in fiale fresche e rimetterli nell'incubatrice impostata alla temperatura sperimentale per altri 3 giorni per il sistema visivo a maturare.
NOTA: Anche se ERG può essere eseguita su mosche di 1-2 giorni, le mosche appena echiuse possono avere grandi fluttuazioni nel loro segnale ERG. Se si desidera esaminare un fenotipo dipendente dall'età, queste mosche possono essere invecchiate per diverse settimane, purché siano regolarmente (ad es. ogni 5 giorni) trasferite in una nuova fiala per evitare l'annegamento negli alimenti umidi. - Preparare le mosche per la registrazione ERG aerando prima le mosche utilizzando CO2 o mettendole in una fiala sul ghiaccio. Incollare delicatamente un lato della mosca su uno scivolo al microscopio di vetro per immobilizzarli.
NOTA: Più mosche di riferimento e variante possono essere incollate su una singola diapositiva. Posizionare tutte le mosche nello stesso orientamento con un occhio accessibile per l'elettrodo di registrazione. Fare attenzione a non ottenere la colla sull'occhio e a lasciare la proboscide libera. - Preparare gli elettrodi di registrazione e di riferimento. Mettere un capillare di vetro da 1,2 mm in un tiro ad ago e attivarlo. Rompere il tubo capillare per ottenere due elettrodi affettiti taglienti. Gli elettrodi risultanti devono essere vuoti e avere diametri finali di <0,5 mm.
- Riempire i capillari con soluzione salina (100 mM NaCl), assicurandosi che non ci siano bolle d'aria. Far scorrere i capillari di vetro sopra gli elettrodi di filo d'argento (sia l'elettrodo di registrazione che l'elettrodo di riferimento, vedi Figura 4) e fissare i capillari in posizione.
- Configurare lo stimolatore e l'amplificatore. Un set-up dettagliato può essere trovato a Lauwers, et al.67. L'USN Drosophila MOSC set-up è costituito da attrezzature elencate nella sezione materiali.
- Impostare l'amplificatore su un filtro a passaggio alto da 0,1 Hz, un filtro a passa-basso a 300 Hz e un guadagno di 100.
- Impostare lo stimolatore su 1 s periodo, 500 ms larghezza impulso, 500 ms ritardo impulso, modalità di esecuzione, e 7 Amp.
- Preparare la sorgente luminosa per la fotostimolazione. Utilizzare una fonte di luce alogena per attivare i fotorecettori di mosca.
- Preparare il software di registrazione su un computer collegato alla configurazione ERG. Creare un protocollo di stimolazione con il modello di acquisizione "eventi a lunghezza fissa" e la durata di 20 s.
- Acclimata le mosche per completare l'oscurità prima di iniziare le registrazioni ERG. Mettere le mosche nel buio completo per almeno 10 minuti prima di iniziare l'esperimento.
NOTA: Poiché le mosche non sono in grado di rilevare la luce rossa, utilizzare una fonte di luce rossa durante il periodo di assuefazione scura. - Posizionare il vetrino contenente le mosche sull'apparato di registrazione e spostare i micromanipolatori che trasportano gli elettrodi di riferimento e di registrazione in un punto vicino al volo di interesse sul vetrino. Osservare la punta dell'elettrodo e posizionare con attenzione l'elettrodo di riferimento nel torace della mosca (penetrare la cuticola). Una volta inserito stabilmente l'elettrodo di riferimento, posizionare l'elettrodo di registrazione sulla superficie dell'occhio.
NOTA: La posizione esatta di questo elettrodo di riferimento non ha un impatto significativo sul segnale ERG. L'elettrodo di registrazione deve essere posizionato sulla superficie dell'occhio poiché ERG è una registrazione potenziale sul campo piuttosto che una registrazione intracellulare. La giusta quantità di pressione applicata all'elettrodo di registrazione provoca una piccola fossetta senza penetrare l'occhio. - Spegnere tutte le luci per altri 3 min per acclimatare le mosche all'ambiente buio.
- Impostare il software di registrazione e iniziare la registrazione del segnale. Se si utilizza una sorgente luminosa alogena con otturatore manuale, accendere la sorgente luminosa con l'otturatore chiuso. Iniziare a registrare il segnale.
- Esporre gli occhi di mosca alla luce aprendo e chiudendo l'otturatore ogni 1 s per la durata di 20 s di una singola corsa.
NOTA: L'accensione/spegnimento della sorgente luminosa alogena può essere controllata manualmente o programmata per diventare automatizzata utilizzando una sorgente luminosa LED bianca. ERG più robusto e affidabile può essere ottenuto utilizzando una fonte di luce alogeno rispetto a un LED a luce bianca, probabilmente a causa dello spettro di luce più ampio emesso dalla fonte di luce alogeno. - Registrare gli ERG di tutte le mosche montate sullo scivolo di vetro. Eseguire eRG da 15 mosche per genotipo per condizione.
NOTA: Alcuni parametri che possono essere modificati per trovare una condizione che mostra solide differenze tra i cDNA di riferimento e di variante possono includere la temperatura, l'età o le condizioni ambientali (ad esempio, allevati in ciclo luce-scuro o luce/oscurità costante). - Eseguire l'analisi dei dati: confrontare gli ERG dal riferimento, variant e controlli per determinare se esistono differenze. Valutare i dati ERG per le modifiche apportate ai cambiamenti nei dati in relazione ai transitori, al depolorizzazione, ai cambiamenti e alla ripolarizzazione69 (Figura 4B).
NOTA: La depolarizzazione e la ripolarizzazione riflettono l'attivazione e l'inattivazione della cascata di fototrasduzione all'interno dei fotorecettori, mentre i cambiamenti on e off-transienti sono misure delle attività delle cellule post-sinaptiche che ricevono segnali da fotorecettori. La diminuzione dell'ampiezza e la cinetica alterata della ripolarizzazione sono spesso associate in difetti con la funzione fotorecettore e la salute, mentre i difetti nei mutanti on e off-transienti si trovano nei mutanti con sviluppo di sinapsi difettose, funzione o manutenzione 70. - Dopo l'identificazione delle differenze nei fenotipi ERG con sovraespressione dei cDNA umani di riferimento rispetto alle varianti, determinare se questo fenotipo elettrofisiologico è associato a difetti strutturali e ultrastrutturali nei fotorecettori e nei loro sinapsi eseguendo analisi istologiche e microscopia elettronica di trasmissione.
NOTA: Un'ulteriore discussione sull'interpretazione dei difetti ERG e l'analisi strutturale/ultrastrutturale è stata descritta in precedenza69.
- Generare mosche per verificare la ricerca di difetti funzionali nel sistema visivo. Le femmine vergini incrociate della linea Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 ai maschi con riferimenti o varianti transgeni cDNA umani UAS per esprimere le proteine umane di interesse nei fotorecettori R1-R6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studio funzionale della variante missense de novo in EBF3 collegato ai fenotipi neurosviluppo
In un maschio di 7 anni con fenotipi di neurosviluppo tra cui ipotonia, atassia, ritardo dello sviluppo globale e disturbi del linguaggio espressivo, medici e genetisti umani presso il National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) identificato una variante di errore de novo (p.R163Q) in EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, un gene che codifica un fattore di trascrizione della famiglia COE (Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor). Questo caso è stato sottoposto all'UDN MOSC nel marzo 2016 per studi funzionali. Per valutare se questo gene fosse un buon candidato per questo caso, il MOSC ha raccolto informazioni genetiche e genomiche umane da OMIM, ClinVar, ExAC (ora esteso a gnomAD), Geno2MP, DGV e DECIPHER. Inoltre, i geni ortologhi nelle specie chiave di MO sono stati identificati utilizzando lo strumento DIOPT. Sono state quindi ottenute l'espressione genica e le informazioni fenotipiche provenienti da singoli database MO (ad esempio, Wormbase, FlyBase, .FIN, MGI). Le analisi informatiche eseguite per L'EBF3 e altri studi pionieristici nel MOSC UDN hanno costituito la base per lo sviluppo successivo della risorsa MARRVEL30.
Le informazioni raccolte utilizzando questa metodologia indicavano che l'EBF3 non era associato ad alcuna malattia genetica umana nota al momento dell'analisi, e si è concluso che la variante p.R163Q era un buon candidato sulla base delle seguenti informazioni. (1) Questa variante non era stata precedentemente riportata nelle banche dati sulla popolazione di controllo (ExAC) e nel database della popolazione delle malattie (Geno2MP), indicando che si tratta di una variante molto rara. (2) Sulla base di ExAC, il punteggio di pLI (probabilità di intolleranza LOF) di questo gene è 1,00 (i punteggi di PLI vanno da 0,00-1,00). Ciò indica che c'è una pressione selettiva contro le varianti LOF in questo gene nella popolazione generale e suggerisce che l'aploinsufficienza di questo gene può causare malattie. Per ulteriori informazioni sul punteggio pLI e la sua interpretazione, un articolo tutorial MARRVEL di accompagnamento in JoVE31 e documenti correlati forniscono i dettagli30,71.
La variante p.R163Q è stata anche considerata un buon candidato perché (3) si trova nel dominio evolutivamente conservato del DNA di questa proteina, suggerendo che può influenzare il legame del DNA o altre funzioni proteiche. (4) Il residuo di p.R163 è conservato evolutivamente da C. elegans e Drosophila all'uomo, suggerendo che può essere critico per le proteine funzionali tra le specie. (5) Gli ortologhi EBF3 sono stati implicati nello sviluppo neuronale in più MO72 tra cui C. elegans73, Drosophila74, Xenopus75e topi76. (6) Durante lo sviluppo cerebrale nei topi, è stato dimostrato che Ebf3 funziona a valle di Arx (Homebox correlata ad Aristaless)77, un gene associato a diverse epilessia e disabilità intellettiva sindromi nell'uomo78. Quindi, questi dati insieme suggeriscono che EBF3 è altamente probabile che sia cruciale per il neurosviluppo umano e che la variante p.R163Q può avere conseguenze funzionali.
Per valutare se p.R163Q influisce sulla funzione EBF3, è stata generata una linea T2A-GAL4 per nodo (kn; l'ortologo fly dell'uomo EBF379) tramite RMCE di un inserimento MiMIC intronico di codifica15. La linea kn T2A-GAL4 è recessiva letale e non è riuscita a completare la letalità di un classico allele kn (kncol-1) così come la carenza molecolare definita che copre kn [Df(2R)BSC429]80 . I modelli di espressione del GAL4 riflettevano anche modelli di espressione kn precedentemente segnalati nel cervello e nel disco imaginale dell'ala15. Le mosche transgeniche UAS sono state poi generate per consentire l'espressione di riferimento e variante umana EBF3 cDNA così come wild-type fly kn cDNA. Tutte e tre le proteine sono state etichettate con un tag 3xHA terminale C. È importante sottolineare che i transgeni umani EBF3 (EBF3)di tipo selvaggio UAS hanno salvato la letalità della knT2A-GAL4/Df(2R)BSC429 in misura simile ( Figura 3C, pannello sinistro)81.
Al contrario, il transgene UAS-umano EBF3 con la variante p.R163Q (EBF3p.R163Q) non è stato in grado di salvare questo mutante, suggerendo che la variante p.R163Q colpisce la funzione EBF3 in vivo15. È interessante notare che, quando valutata utilizzando un anticorpo anti-HA, la proteina EBF3p.R163Q è stata espressa con successo nei tessuti volanti, e i suoi livelli e localizzazione subcellulare (principalmente nucleare) erano indistinguibili da quelli di EBF3 e Kn. Ciò suggerisce che la variante non sta causando un fenotipo LOF a causa di instabilità delle proteine o cattiva localizzazione. Per valutare ulteriormente se la variante p.R163Q ha influenzato la funzione di attivazione trascrizionale di EBF3, un test reporter basato su luciferate è stato eseguito nelle celle HEK29315. Questo esperimento nelle cellule umane coltivate ha rivelato che la variante EBF3p.R163Q non è riuscita ad attivare la trascrizione dei costrutti dei reporter, sostenendo il modello LOF ottenuto dagli esperimenti della Drosophila.
Parallelamente agli studi sperimentali, le collaborazioni con medici, genetisti umani e consulenti genetici al BCM hanno portato all'identificazione di due individui aggiuntivi con sintomi simili. Un paziente portava la variante identica p.R163Q, e un altro portava una variante errata che influenzava lo stesso residuo (p.R163L). La variante p.R163L non è riuscita a salvare il mutante fly kn 93 suggerendo che questo allele ha colpito anche la funzione EBF3. È interessante notare che questo lavoro è stato pubblicato back-to-back con due studi di genetica umana indipendenti che hanno segnalato ulteriori individui con missense de novo, sciocchezze, frameshift, e le varianti di giunzione in EBF3 legati a simili fenotipi del neurosviluppo82,83. Successivamente, sono stati pubblicati tre articoli aggiuntivi che riportano ulteriori casi di varianti de novo EBF3 e cancellazione del numero di copie84,85,86. Questa nuova sindrome del neurosviluppo è ora conosciuta come Ipotonia, Ataxia e Sindrome dello Sviluppo Ritardato (HADDS, MIM #617330) nell'Ereditarietà Mendeliana online nell'uomo (OMIM, un database autorevole per le relazioni genotipo-fenotipo negli esseri umani).
Studio funzionale della variante missense ereditata dominante in TBX2 collegata a un disturbo dello sviluppo cardiovascolare sdromatico
In una piccola famiglia colpita da spettri sovrapposti di dismorfismo craniofacciale, anomalie cardiache, malformazione scheletrica, carenza immunitaria, anomalie endocrine e compromissione dello sviluppo, il sito clinico UDN Duke ha identificato una variante missense (p.R20Q) in TBX2 che si segrega con fenotipi della malattia87. Tre (figlio, figlia, madre) dei quattro membri della famiglia sono affetti da questa condizione, e il figlio ha mostrato il fenotipo più grave. Clinicamente, ha incontrato una diagnosi di "sindrome completa di DiGeorge", una condizione spesso causata dalla aploinsufficienza di TBX1. Sebbene non vi siano state mutazioni identificate in TBX1 in questa famiglia, i medici e i genetisti umani si sono concentrati su una variante in TBX2, poiché studi precedenti sui topi hanno dimostrato che questi geni hanno funzioni sovrapposte durante lo sviluppo88 . TBX1 e TBX2 appartengono entrambi alla famiglia T-box (TBX) di fattori di trascrizione che possono fungere da repressori trascrizionali e attivatori a seconda del contesto.
In precedenza, le varianti in 12 dei 17 membri dei geni della famiglia TBX erano collegate alle malattie umane. Il MOSC ha deciso di perseguire sperimentalmente questa variante sulla base delle seguenti informazioni raccolte attraverso MARRVEL e altre risorse. (1) Questa variante è stata riportata solo una volta in una coorte di individui "controllo" da 90.000 dollari in gnomAD (questa variante è stata filtrata in una vista predefinita, probabilmente a causa di letture a bassa copertura). Considerando la presentazione fenotipica più lieve della madre, questo può ancora essere considerato come una variante rara che può essere responsabile per i fenotipi della malattia. (2) I punteggi pLI di TBX2 in ExAC/gnomAD sono 0,96/0,99, che è alto (massimo 1,00). Inoltre, il punteggio LOF o/e (osservato/previsto) in gnomAD è 0,05 (solo 1/18.6 prevista variante LOF è osservato in gnomAD). Questi numeri suggeriscono che le varianti LOF in questo gene sono selezionate contro nella popolazione generale.
Inoltre, (3) il p.R20 è evolutivamente conservato da C. elegans e Drosophila agli esseri umani, suggerendo che questo può essere un residuo importante per la funzione TBX2. (4) Più programmi prevedono che la variante è probabilmente dannosa (pophen: possibilmente/probabilmente dannosa, SIFT: deleterio, punteggio CADD: 24.4, punteggio REVEL: 0.5). (5) I mutanti MO presentano difetti nei tessuti colpiti dai pazienti (ad esempio, topi knockout che presentano difetti nel sistema cardiovascolare, sistemi digestivi/alimentari, craniofacciali, arti/cifra). Quindi, insieme ai collegamenti biologici tra TBX1 e TBX2 e ai legami fenotipici tra questi pazienti e alla sindrome di DiGeorge, è stato ottimale eseguire studi funzionali sulle varianti in questo gene utilizzando la Drosophila.
Per valutare se la variante p.R20Q influisce sulla funzione TBX2, è stata generata una linea T2A-GAL4 in bifid (bi; l'ortologo della Drosophila del TBX2umano ), tramite RMCE di un MiMIC intronico di codifica (Figura 2)87. Questo allele, biT2A-GAL4, era ripugnato letale e si comportava come un forte mutante LOF, simile agli alleli bi LOF precedentemente segnalati (ad esempio, biD2, biD4; Figura 2 E). La letalità di questi alleli classici e appena generati è stata salvata da un costrutto di salvataggio genomico da 80 kb che trasportava l'intero bi locus, indicando che questi reagenti sono effettivamente alleli LOF puliti. Il modello di espressione di GAL4 nella linea biT2A-GAL4 corrispondeva bene anche ai modelli di bi espressione segnalati in precedenza in più tessuti, incluso nel disco immaginario dell'ala (Figura 2D).
Parallelamente, sono state generate linee transgeniche UAS per TBX2 con sequenze di riferimento o variante (p.R20Q). Sfortunatamente, nessuno dei due transgeni è stato in grado di salvare la letalità della linea biT2A-GAL4. È importante sottolineare che un transgene UAS-bi di tipo selvaggio non è riuscito a salvare l'allele biT2A-GAL4, probabilmente a causa della sensibilità al dosaggio di questo gene. Infatti, la sovraespressione di UAS-bi e UAS-TBX2 ha causato un certo grado di letalità quando sovraespresso in un animale selvatico. Questo effetto tossico della sovraespressione bi/TBX2 è stato utilizzato come un test funzionale per valutare se la variante p.R20Q può influenzare la funzione TBX2. Poiché il gene Drosophila bi è stato ampiamente studiato nel contesto del sistema visivo [il gene è noto anche come optomotor blind (omb)], i fenotipi correlati al sistema visivo sono stati studiati ampiamente. Quando il riferimento TBX2 è stato espresso utilizzando un driver ey-GAL4 che esprime UAS-transgenes nell'occhio e parti del cervello rilevanti per il sistema visivo, letalità dell'85% (Figura3C, pannello destro) e significativo riduzione delle dimensioni degli occhi (Figura4B). Questo fenotipo era più forte del fenotipo osservato quando è stato espresso un transgene UAS-bi di tipo selvatico, suggerendo che il TBX2 umano è più dannoso per il volo quando sovraespresso.
È interessante notare che il p.R20Q TBX2 era meno potente nel causare letalità (Figura 3C, pannello destro) e nell'indurre un piccolo fenotipo oculare (Figura 4B) utilizzando lo stesso driver sotto la stessa condizione87, suggerendo suggerendo che la variante influisce sulla funzione delle proteine. Inoltre, la funzione dei fotorecettori sovraesprimendo riferimento e variante TBX2 utilizzando un driver GAL4 diverso, (Rh1-GAL4) che esprime specificamente transgeni UAS nei fotorecettori R1-R6, ha rivelato che la variante TBX2 fenotipo ERG molto più mite rispetto al riferimento TBX2 (Figura4B)87. È interessante notare che la maggior parte della proteina p.R20Q TBX2 si trovava ancora nel nucleo, simile alla proteina di riferimento, suggerendo che la variante non influenzava la localizzazione nucleare. Un saggio di repressione trascrizionale basato su luciferasi nelle cellule HEK293T ha mostrato che il p.R20Q non era in grado di reprimere efficacemente la trascrizione di un costrutto reporter con siti palindromici T-box87. Inoltre, sono state osservate diminuzioni nei livelli proteici di TBX2p.R20Q rispetto a TBX2 , suggerendo che la variante può influenzare la traduzione o la stabilità proteica di TBX2, che a sua volta influisce sulla sua abbondanza all'interno di una cellula.
Ulteriori pazienti con varianti rare in TBX2 sono stati identificati dai medici del sito clinico UDN Duke in parallelo con questi studi sperimentali. Un bambino di 8 anni con una variante de novo missense (p.R305H) di una famiglia non imparentata ha esposto molte delle caratteristiche della prima famiglia87. Ulteriori studi funzionali nella Drosophila e nelle linee cellulari umane hanno rivelato che la variante p.R305H colpisce anche la funzione TBX2 e i livelli di proteine, suggerendo fortemente che i difetti in questo gene probabilmente sono alla base di molti fenotipi trovati nelle due famiglie. Questo disturbo è stato recentemente curato come "anomalie vertebrali e disfunzione delle cellule endocrine variabili" (VETD, MIM #618223) in OMIM. L'identificazione di individui aggiuntivi con varianti dannose in TBX2 con fenotipi sovrapposti è fondamentale per comprendere l'intero spettro delle relazioni genotipo-fenotipo per questo gene nella malattia umana.
Figura 1 : schema di iniezione e attraversamento per generare linee UAS-human cDNA e T2A-GAL4. (A) Generazione di transgeni cDNA UAS-umani attraverso microiniezioni e croci. Lo schema di incrocio per integrare le transgenie in un secondo sito di attracco cromosomico (VK37) utilizzando mosche maschili nella prima e seconda generazione sono mostrati come esempio. Dopo l'iniezione del costrutto transgenico cDNA umano (pGW-HA.attB) in embrioni precoci che contengono una fonte germinale di c31 integrase (etichettato con 3xP3-GFP e 3xP3-RFP) e sito di attracco VK37 [etichettato con un sito di attracco giallo ( ) marcatore], gli eventi transgenici possono essere seguiti con il minigene bianco (w)presente nel vettore transgenico. Si consiglia di cancellare l'integrasi C31 selezionando contro le mosche con GFP e RFP. Lo stock stabile finale può essere mantenuto come omozigoti o come stock equilibrato se il cromosoma porta una mutazione di colpo letale/sterile secondo sito. La presenza di mutazioni letali/sterili del secondo sito su un costrutto transgenico di solito non influisce sull'esito degli studi funzionali, purché questi transgeni vengano utilizzati in uno stato eterozigo (Figura3). (B) Generazione di linee T2A-GAL4 attraverso microiniezione e croci. Lo schema di intersezione per convertire un secondo inserimento cromosoma MiMIC in un elemento T2A-GAL4 è mostrato come esempio. Con il microinieta di un vettore di espressione per l'integrasi C31 e il vettore RMCE per T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70), viene selezionato un frame di lettura appropriato per il MiMIC di interesse. Vedere i seguenti documenti per i dettagli57,59 in embrioni che trasportano un MiMIC in un intron codificante in gene di interesse, si può convertire il MiMIC originale in una linea T2A-GAL4. Figura 2 A mostra un diagramma schematico della conversione RMCE. L'evento di conversione può essere selezionato mediante screening sul marcatore ynella cassetta MiMIC60originale. Poiché RMCE può verificarsi in due direzioni, solo il 50% dell'evento di conversione riuscito porta alla produzione di successo di GAL4, che può essere rilevata da un transgene reporter UAS-GFP nella generazione successiva. Lo stock stabile finale può essere mantenuto come omozigoti o come stock equilibrato se il lof del gene è letale/sterile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Conversione di elementi MiMIC in linee T2A-GAL4 tramite RMCE. (A) L'integrase di C31 facilita la ricombinazione tra i due siti attP nel fly (in alto) e due siti attB che fiancheggiano una cassetta T2A-GAL4 mostrata come vettore circolare (in basso). (B) Gli eventi RMCE riusciti portano alla perdita di un marcatore selezionabile (giallo) e all'inserimento della cassetta T2A-GAL4 nello stesso orientamento del gene di interesse. Poiché l'evento RMCE può avvenire in due orientamenti, solo il 50% della reazione RMCE produce un prodotto desiderato. Un prodotto RMCE inserito nell'orientamento opposto non funzionerà come allele gene-trap o esprimere GAL4. La direzionalità del costrutto deve essere confermata tramite sequenziamento sanger. (C) La trascrizione (in alto) e la traduzione (in basso) del gene di interesse portano alla generazione di un mRNA e di una proteina troncati a causa del segnale poliA presente alla fine del 3' della cassetta T2A-GAL4. Il T2A è un segnale di salto ribosoma, che permette al ribosoma di arrestare e reinizializzare la traduzione dopo questo segnale. Viene utilizzato per generare un elemento GAL4 che non è collegato in modo covalente al prodotto genetico troncato di interesse. Il GAL4 entrerà nel nucleo e faciliterà la trascrizione dei transgeni che sono sotto il controllo degli elementi UAS. L'UAS-GFP può essere usato come reporter dell'espressione genica, e il cDNA UAS-umano può essere usato per esperimenti di salvataggio tramite "umanizzazione" genica. (D) Mostrato è un esempio di elemento T2A-GAL4 nell'espressione bi-guida di UAS-GFP (top). Questo modello di espressione è simile a una linea di trappola avanzata generata in precedenza per lo stesso gene (biomb-GAL4; bottom). (E) Confronto tra l'allele T2A-GAL4 di bi con i bi alleli precedentemente segnalati. Questa cifra è stata adottata e modificata dalle pubblicazioni precedenti57,87. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi funzionale delle varianti umane mediante studi basati sul salvataggio (a sinistra) e sulla sovraespressione (a destra). (A) (pannello sinistro): La funzione delle varianti EBF3 è stata valutata con un'analisi basata sul salvataggio del nodo di mosca (kn) LOF incentrato sulla letalità/vitalità; (pannello destro): la funzione delle varianti in TBX2 è stata valutata eseguendo la sovraespressione dei transgeni umani TBX2 nei moscerini selvatici, concentrandosi sulla letalità/viabilità, sulla morfologia degli occhi e sui fenotipi elettrofisiologici (Figura 4) . (B) Schemi di incrocio per ottenere le mosche da testare negli studi funzionali. Si consiglia di utilizzare sempre un elemento UAS neutro (ad esempio, UAS-lac , UAS-GFP) come esperimento di controllo. (C) Il rappresentante è il risultato di studi funzionali sulle varianti EBF3p.R163Q e TBX2p.R20Q, rispettivamente, insieme a opportuni esperimenti di controllo necessari per interpretare i risultati. Sia l'analisi basata sul salvataggio che gli studi di sovraespressione rivelano che le varianti si comportano come alleli amorfici o ipomorfici. I dati di letalità/viabilità qui illustrati si basano su dati sperimentali presentati nelle precedenti pubblicazioni15,87. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi funzionale di una rara variante di missense in TBX2 umana basata sulla morfologia degli occhi e sull'elettroretinogramma in Drosophila. (A) Un'immagine schematica che mostra il posizionamento tipico degli elettrodi di registrazione e di riferimento sull'occhio di mosca, insieme a una registrazione elettroretinogramma rappresentativa con quattro componenti principali (on-transient, depolarizzazione, off-transient, ripolarizzazione). (B) La variante TBX2 (p.R20Q) funziona come un allele LOF parziale basato su studi di sovraespressione nel fly eye utilizzando driver GAL4 specifici per il sistema visivo (ey-GAL4 e Rh1-GAL4). Ciò ha dimostrato che il riferimento TBX2 ha causato un forte fenotipo morfologico ed elettrofisiologico rispetto alla proteina variante. (pannelli superiori): una grave riduzione delle dimensioni degli occhi si osserva in base alla sovraespressione di UAS-TBX2 - con ey-GAL4. UAS-TBX2p.R20Q. Guidato con ey-GAL4 provoca anche un occhio più piccolo, ma il fenotipo è molto più mite. (pannelli inferiori): quando UAS-TBX2è espresso nei fotorecettori di base R1-R6 utilizzando Rh1-GAL4, c'è una perdita di on- e off-transients, depolarizzazione ridotta, e grande anormale depolarizzazione prolungata dopo potenziale (PDA) fenotipo, che non si vede nelle mosche di controllo. Questi fenotipi non sono così gravi come quando UAS-TBX2p.R20Q viene espresso utilizzando lo stesso Rh1-GAL4. Questa cifra è stata adottata e modificata dalle pubblicazioni precedenti69,87. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| di proposito | attrezzo | Url |
| Funzione Variant algoritmi di previsione |
Pophen-2 Sift Cadd PROVENO MutationTaster divertirsi |
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 https://sift.bii.a-star.edu.sg https://cadd.gs.washington.edu http://provean.jcvi.org/index.php http://www.mutationtaster.org https://sites.google.com/site/revelgenomics |
| Raro e non diagnosticato ricerca sulle malattie Consorzi |
UDN (Nome dall'utente) RDMM IRUD (IRUD) SOLVE-RD AFGN |
https://undiagnosed.hms.harvard.edu http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html http://solve-rd.eu https://www.functionalgenomics.org.au |
| Database integrativo per umano e modello organismo Informazioni |
MARRVEL Iniziativa Monarch Gene2Funzione Fenologhi |
http://marrvel.org https://monarchinitiative.org http://www.gene2function.org http://www.phenologs.org |
| Genetica umana e Database genomici |
Omim ClinVar ExAC gnomAD GenoMP DGV decifrare |
https://www.omim.org/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ http://exac.broadinstitute.org/ http://gnomad.broadinstitute.org/ http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/ http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home https://decipher.sanger.ac.uk/ |
| Strumento di identificazione Ortholog | DIOPTA | https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl |
| Organismo modello Database e Biomedici Ricerca di letteratura |
WormBase (C elegans) FlyBase (Drosophila) FIN (pesce zebra) MGI (mouse) Pubmed |
https://www.wormbase.org http://flybase.org https://zfin.org http://www.informatics.jax.org https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ |
| Genetico e proteine database di interazione |
spago nebbia |
https://string-db.org http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/ |
| Struttura proteica banche dati e strumenti di modellazione |
WWPBD MODELLO SVIZZERO Modeller Phyre2 |
http://www.wwpdb.org https://swissmodel.expasy.org/ https://salilab.org/modeller/ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2 |
| Matchmaking per pazienti Piattaforme |
Scambio di Matchmaker GeneMatcher Archivio AGHA scatola di fiammiferi decifrare MyGene2 Centrale Di Faro |
http://www.matchmakerexchange.org https://www.genematcher.org https://mme.australiangenomics.org.au/#/home https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox https://decipher.sanger.ac.uk https://www.mygene2.org/MyGene2 https://phenomecentral.org |
| Trascrizione umana annotazione e cDNA clonare le informazioni |
Collezione Gene Mammaliana Ensembl Affinseq |
https://genecollections.nci.nih.gov/MGC http://useast.ensembl.org http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq |
Tabella 1: Risorse online relative a questo protocollo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studi sperimentali che utilizzano la Drosophila melanogaster forniscono un robusto sistema di analisi per valutare le conseguenze delle varianti umane associate alla malattia. Ciò è dovuto al grande corpus di conoscenze e ai diversi strumenti genetici che sono stati generati da molti ricercatori nel campo del volo nel corso dell'ultimo secolo89. Proprio come qualsiasi altro sistema sperimentale, tuttavia, è importante riconoscere le avvertenze e le limitazioni che esistono.
Avvertenze associate al data mining
Anche se il primo passo in questo protocollo è quello di estrarre banche dati per informazioni relative a un gene di interesse, è importante utilizzarlo solo come punto di partenza. Ad esempio, anche se nella previsione in silico della funzione variant fornisce informazioni preziose, questi dati devono sempre essere interpretati con cautela. Ci sono alcuni casi in cui tutti i principali algoritmi prevedono che una variante umana sia benigna, ma studi funzionali in Drosophila hanno chiaramente dimostrato la natura dannosa di tale variante24. Allo stesso modo, anche se le interazioni proteina-proteina, la co-espressione e i dati di modellazione strutturale sono tutti pezzi di informazioni approfondite, ci possono essere informazioni pseudo-positive e pseudo-negative presenti in questi grandi set di dati -omici. Ad esempio, alcune delle interazioni proteina-proteina precedentemente identificate o previste possono essere artificiali o osservate solo in determinati tipi di cellule e tessuti.
Inoltre, ci possono essere molte false interazioni negative non catturate in questi set di dati, poiché alcune interazioni proteina-proteina sono transitorie (ad esempio, interazioni enzimatico-substrato). La convalida sperimentale è fondamentale per dimostrare che alcuni geni o proteine interagiscono geneticamente o fisicamente in vivo nel contesto biologico di interesse. Analogamente, le strutture previste in base alla modellazione omologia devono essere trattate come un modello piuttosto che come una struttura risolta. Anche se queste informazioni possono essere utili se si scopre che un aminoacido di interesse è presente in una parte strutturalmente importante della proteina, i dati negativi non esclude la possibilità che la variante possa essere dannosa. Infine, alcune delle informazioni sul genotipo-fenotipo precedentemente riportate dovrebbero essere trattate con cautela, poiché alcune informazioni archiviate nelle banche dati pubbliche potrebbero non essere accurate. Ad esempio, alcune informazioni contenute nei database MO si basano su esperimenti che sono stati ben controllati ed eseguiti in modo rigoroso, mentre altre possono provenire da un grande documento su schermo senza ulteriori studi di follow-up e controlli rigorosi.
Esperimenti di "umanizzazione" con strategia T2A-GAL4 non sempre riusciti
Mentre gli studi funzionali basati sul salvataggio e sulla sovraespressione che utilizzano cDNA umani consentono la valutazione delle varianti nel contesto della proteina umana, questo approccio non sempre ha successo. Se un cDNA umano di riferimento non può salvare il fenotipo mutante di mosca, ci sono due probabili spiegazioni. La prima possibilità è che la proteina umana non sia funzionale o abbia ridotto significativamente l'attività nel contesto di una cella di mosca. Ciò può essere dovuto alla riduzione dell'espressione, della stabilità, dell'attività e/o della localizzazione delle proteine o 2) della mancanza di compatibilità con le proteine a mosca che funzionano in un complesso multiproteico. Poiché il sistema UAS/GAL4 è sensibile alla temperatura, le mosche possono essere sollevate ad una temperatura relativamente elevata (ad esempio, 29 gradi centigradi) per vedere la possibilità di un salvataggio in queste condizioni. Inoltre, può essere generato un costrutto CDNA UAS-fly e transgene come controllo positivo. Se la variante di interesse colpisce un aminoacido conservato, la variante analoga può essere introdotta nel cDNA fly per lo studio funzionale della variante nel contesto dell'ortologo della mosca. Anche se questo non è necessario, aiuta notevolmente lo studio nei casi in cui l'uso di linee transgeniche cDNA umane danno risultati negativi o inconcludenti (Figura 3).
La seconda possibilità è che l'espressione della proteina umana provochi una certa tossicità a livello di cellula o di organismo. Ciò può essere dovuto ad antimorfici (ad esempio, che agiscono come una proteina negativa dominante), ipermorfiche (ad esempio, troppa attività) o neomorfiche (ad esempio, il guadagno di una nuova funzione tossica come l'aggregazione proteica che non è sempre correlata alla funzione endogena del gene interessi). In questo caso, mantenere le mosche a bassa temperatura (ad es., 18 gradi centigradi) può alleviare alcuni di questi problemi. Infine, ci sono alcuni scenari in cui la sovraespressione di un cDNA di mosca non può salvare la linea T2A-GAL4 di mosca come si vede nell'esempio TBX2, probabilmente a causa della dipendenza da dosaggio trict del prodotto genetico. Per evitare la sovraespressione di una proteina di interesse, il gene della mosca di interesse può essere modificato direttamente tramite CRISPR, un costrutto di salvataggio genomico può essere progettato che contiene la variante di interesse, o esperimenti di salvataggio possono essere eseguiti utilizzando un allele LOF21. Per i piccoli geni, "umanizzare" il costrutto di salvataggio genomico della mosca può essere considerato per testare varianti umane che colpiscono gli amminoacidi non conservati24. In sintesi, le strategie alternative dovrebbero essere prese in considerazione quando l'esperimento di umanizzazione non consente la valutazione funzionale della variante di interesse.
Interpretazione dei risultati negativi e positivi
Se 1) sia i cDNA umani di riferimento che quelli variante salvano i fenotipi mutanti di mosca a un grado simile e 2) non vi è alcuna differenza osservata in tutte le condizioni testate, allora si può presumere che la variante sia funzionalmente indistinguibile nella Drosophila in vivo. È importante notare, tuttavia, che queste informazioni non sono sufficienti a escludere che la variante di interesse non sia patogena, poiché il saggio della Drosophila potrebbe non essere sufficientemente sensibile o catturare tutte le potenziali funzioni del gene/proteina di interesse rilevanti per l'uomo. I dati positivi, d'altra parte, sono una forte indicazione che la variante ha conseguenze dannose sulla funzione proteica, ma questi dati da soli non sono ancora sufficienti a rivendicare la patogenicità. L'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) ha pubblicato una serie di standard e linee guida per classificare le varianti nei geni associati alle malattie umane in "benigni", "probabilmente benigni", "variante di significato sconosciuto (VUS)", "probabile patogeno" e "patogeno"90. Sebbene questa classificazione si applichi solo ai geni associati alla malattia stabiliti e non sia direttamente applicabile alle varianti in "geni di importanza incerta" (GUS), tutti gli individui coinvolti negli studi funzionali sulle varianti umane sono fortemente incoraggiati a rispettare questa linea guida quando si segnala la funzione variante.
Estrazione di informazioni biologiche utili quando i fenotipi MO non modellano una condizione di malattia umana
È importante tenere presente che i saggi funzionali basati sulla sovraespressione hanno dei limiti, soprattutto perché alcuni dei fenotipi classificati possono avere poca rilevanza per la condizione di malattia di interesse. Allo stesso modo, i fenotipi che vengono valutati attraverso esperimenti di salvataggio potrebbero non avere alcuna rilevanza diretta per la malattia di interesse. Poiché questi esperimenti sono condotti al di fuori dei contesti endogeni in un sistema invertebrato, non dovrebbero essere considerati modelli di malattia, ma piuttosto come un test di funzione genica utilizzando la Drosophila come "provetta vivente".
Anche se l'organismo modello non imita una condizione di malattia umana, fenotipi giocabili utilizzati negli esperimenti di salvataggio possono spesso fornire utili informazioni biologiche sulle condizioni della malattia. Il concetto di "fenologi (fenotipi omologhi non evidenti)"91 può essere utilizzato per determinare ulteriormente le connessioni molecolari sottostanti tra la Drosophila e i fenotipi umani. Ad esempio, i fenotipi morfologici nell'ala della mosca, nel torace, nelle gambe e negli occhi sono eccellenti letture fenotipiche per i difetti nella via della segnalazione di Notch, un percorso evolutivamente conservato legato a molti disturbi congeniti, tra cui difetti cardiovascolari negli esseri umani62. Comprendendo la logica molecolare alla base di alcuni fenotipi nella Drosophila,è possibile identificare i legami biologici nascosti tra geni e fenotipi negli esseri umani che non sono ancora compresi.
Comunicazione continua con i Collaboratori Clinici
Quando si lavora con i medici per studiare la funzione di una variante rara trovata nel paziente, è importante stabilire una forte relazione collaborativa. Anche se i ricercatori clinici e biomedici di base possono condividere interessi negli stessi geni/percorsi genetici, esiste un ampio divario culturale e linguistico (ad esempio, gergo medico, nomenclatura elettronica-organismo specifico) tra i campi clinici e scientifici. Una forte relazione basata sulla fiducia tra le due parti può essere costruita attraverso una comunicazione estesa. Inoltre, la comunicazione bidirezionale è fondamentale per stabilire e mantenere questa relazione. Ad esempio, nei due casi descritti nella sezione dei risultati rappresentativi, l'identificazione di ulteriori pazienti con genotipi e fenotipi simili, nonché il successivo studio funzionale, sono stati fondamentali per dimostrare la patogenicità delle varianti di interesse. Anche con forti dati funzionali, ricercatori e clinici hanno spesso difficoltà a convincere i genetisti umani che una variante identificata nei casi di "n - 1" è la vera causa della malattia.
Una volta che il ricercatore MO identifica che una variante di interesse è dannosa, è fondamentale comunicare ai collaboratori clinici il più presto possibile in modo che possano cercare attivamente di identificare i casi corrispondenti mettendo in rete altri medici e genetisti umani. Strumenti come Geno2MP [Genotypes to Mendelian Phenotypes: un database de-identificato di 9.650 individui iscritti allo Studio di Genomica Mendeliana dell'Università di Washington41; comprende pazienti e familiari sospettati di disturbi genetici] può essere cercato per valutare gli individui che possono avere lo stesso disturbo. Quindi, il medico capo può essere contattato utilizzando una funzione di messaggistica.
In alternativa, può essere utilizzato GeneMatcher, che è un sito web di matchmaking per medici, ricercatori di base e pazienti che condividono interessi negli stessi geni per identificare ulteriori pazienti che portano varianti rare. Dal momento che GeneMatcher fa parte di una più ampia rete integrativa di siti web di matchmaking chiamata Matchmaker Exchange42, è possibile cercare ulteriori database in tutto il mondo, tra cui l'Australian Genomics Health Alliance Patient Archive, Broad Matchbox , DECIPHER, MyGene2 e PhenomeCentral in un'unica sottomissione genica GeneMatcher. Anche se la partecipazione a GeneMatcher è possibile come "ricercatore", si raccomanda che gli scienziati di base utilizzino questo sito web con i loro collaboratori clinici, poiché la comunicazione con altri medici dopo una partita richiede determinati livelli di competenza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Jose Salazar, Julia Wang e la dottoressa Karen Schulze per la lettura critica del manoscritto. Riconosciamo i dottori Ning Liu e Xi Luo per la caratterizzazione funzionale delle varianti TBX2 discusse qui. Undiagnosed Diseases Network Model Screening Center è stato supportato attraverso il National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. è stato inoltre sostenuto dal NIH[CNCDP-K12 and NINDS (1K12 NS098482)], dall'American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), dal Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), dalla Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman) e il NIH Director's Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. è stato inoltre sostenuto dalla Simons Foundation (Premio SFARI: 368479). S. Y. è stato inoltre sostenuto dalla NIH (R01 DC014932), dalla Simons Foundation (Premio SFARI: 368479), dall'Alzheimer(New Investigator Research Grant: 15-364099), dal Naman Family Fund for Basic Research e dal Caroline Wiess Law Fund for Research in Medicina molecolare. La microscopia confocale al BCM è supportata in parte da NIH Grant U54HD083092 al Nucleo di Neurovisualizzazione dell'Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (IDDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
| Plasmid DNA | |||
| Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
| Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
| Molecular biology kits and reagents | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
| Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
| DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
| DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
| High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
| Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
| Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
| Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
| Electroretinogram Rig related equipment | |||
| ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
| ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
| ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |
References
- Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
- Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
- Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
- Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
- Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
- Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
- Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
- Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
- Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
- Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
- Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
- Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
- Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
- Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
- Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
- Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
- Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
- Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
- Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
- Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
- Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
- Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
- Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
- Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
- Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
- Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
- Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
- Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
- Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
- Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
- Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
- Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
- Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
- Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
- Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
- Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
- Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
- Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
- Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
- Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
- Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
- Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
- Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
- Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
- Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
- Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
- Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
- Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
- Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
- Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
- Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
- Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
- Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
- Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
- Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
- Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
- Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
- Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
- Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
- Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
- Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
- Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
- Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
- Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
- Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
- McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
- Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
- Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
- Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
- Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).
