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Genetics

在Vivo功能研究的疾病相关的稀有人类变异使用果蝇

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

该协议的目的是概述在果蝇黑色素体内实验的设计和性能，以评估与人类疾病相关的罕见基因变异的功能后果。

Abstract

测序技术的进步使全基因组和全外体数据集更易于用于临床诊断和尖端人类遗传学研究。尽管已经开发了许多silico算法来预测这些数据集中识别的变异的致病性，但功能研究对于确定特定基因组变异如何影响蛋白质功能至关重要，尤其是对于感知错误变异。在未诊断疾病网络（UDN）和其他罕见疾病研究联盟中，模型生物（MO），包括果蝇、甲鱼、斑马鱼和小鼠，被积极用于评估假定的人类疾病引起功能变异。该协议描述了一种用于UDN的模拟生物筛选中心果蝇核心的罕见人类变异的功能评估方法。工作流从从多个公共数据库收集人工和 MO 信息开始，使用 MARRVEL Web 资源评估变体是否可能导致患者病情，并根据可用情况设计有效的实验知识和资源。接下来，生成遗传工具（例如T2A-GAL4和UAS-人cDNA线），以评估果蝇感兴趣的变异的功能。在开发这些试剂后，可以进行基于抢救和过度表达实验的双管齐下的功能测定，以评估变异功能。在抢救分支中，内源性苍蝇基因通过用参考或变异人类转基因取代正交果蝇基因而"人性化"。在过度表达分支中，参考和变异的人类蛋白质在各种组织中被外向驱动。在这两种情况下，任何可感染的表型（例如，杀伤性、眼睛形态学、电生理学）都可以用作读出，而不管感兴趣的疾病如何。参考和变异等位基因之间的差异表明存在变异特异性效应，因此可能具有致病性。该协议允许快速，在体内评估具有已知和未知功能的基因的假定人类致病变异。

Introduction

患有罕见疾病的患者往往经历一段被称为"诊断奥德赛"的艰难旅程，以获得准确的诊断1。大多数罕见疾病被认为有很强的遗传来源，使得遗传/基因组分析成为临床工作的关键要素。除了基于染色体微阵列的候选基因面板测序和拷贝数变异分析外，全外显体 （WES） 和全基因组测序 （WGS） 技术在过去十年中已成为越来越有价值的工具2 3.目前，在WES和WGS中识别已知致病变异的诊断率为+25%（在儿科病例中较高）4，5。对于大多数在临床WES/WGS后仍未确诊的病例，一个常见的问题是有许多候选基因和变异。下一代测序通常能够识别许多基因中的新奇或超罕见变异，而解释这些变异是否导致疾病表型是具有挑战性的。例如，尽管基因中的大多数无意义突变或帧移突变被认为是功能丧失 （LOF） 等位基因，因为编码转录本的无意义介导衰减，但截断最后一个外源区中发现的突变会逃脱此过程，并可能充当良性或函数增益 （GOF） 等位各位数6.

此外，预测一个误感等位基因的影响是一项艰巨的任务，因为它可能导致许多不同的遗传场景，正如赫尔曼·穆勒在20世纪30年代首次描述的那样（即异构、低态、超态、反变形、新变形或异构）7.在silico计划和方法已经开发了许多预测误感变异的致病性基于进化保护，氨基酸变化的类型，在功能域的位置，等位基因频率在一般人群中，和其他参数8。然而，这些程序不是解决变体解释这一复杂问题的全面解决方案。有趣的是，最近的一项研究表明，五种广泛使用的变异致病性预测算法（Polyphen9，SIFT 10，CADD11，PROVEAN12，突变味觉）同意致病性 +80% 的时间 80%8.值得注意的是，即使所有算法都同意，它们也会在 11% 的时间内返回对致病性的错误预测。这不仅导致有缺陷的临床解释，而且还可能劝阻研究人员跟进新的变种，错误地列出他们为良性。补充目前硅酮建模限制的一个方法是提供实验数据，证明体外、体外（如培养细胞、有机体）或体内变异功能的效果。

对MO中罕见疾病相关变异的体内功能研究具有独特的优势13，已被世界各地的许多罕见疾病研究倡议所采用，包括美国的未诊断疾病网络（UDN）和稀有疾病模型和机制 （RDMM） 网络在加拿大，日本， 欧洲和澳大利亚14.除了这些协调的努力，将MO研究人员纳入全国范围的罕见疾病诊断和机械研究工作流程，临床和MO研究人员之间的一些单独合作研究已导致发现和许多新的人类致病基因和变异的表征82，83，84。

在UDN中，一个集中的模型生物筛选中心（MOSC）接收候选基因和变异的提交，并描述患者的病情，并评估该变异是否可能是病原菌使用信息学工具和体内实验。在UDN的第一阶段（2015-2018年），MOSC由果蝇核心[贝勒医学院（BCM）]和斑马鱼核心（俄勒冈大学）组成，他们合作评估病例。MOSC利用信息学分析和在果蝇和斑马鱼中的若干不同实验策略，迄今已为132名患者的诊断、31种新综合征的识别、发现几种新人类做出了贡献。疾病基因（例如，EBF315、ATP5F1D 16、TBX2 17、IRF2BPL 18、COG4 19、WDR37 20）和已知疾病的型皮扩张基因（例如，CACNA1A21，ACOX122）。

除了UDN内的项目外，MOSC果蝇核心研究人员还与孟德尔基因组学中心和其他倡议（例如，ANKLE223，TM2D3）合作，为新的疾病基因发现做出了贡献。 24， NRD125， OGDHL25， ATAD3A26， ARIH127， MARK328， DNMBP29） 使用相同的信息学和遗传学集为UDN制定的战略。鉴于MO研究对罕见疾病诊断的重要性，MOSC已扩大到包括UDN第二阶段（2018-2022年）的C.elegans核心和第二斑马鱼核心（均位于圣路易斯华盛顿大学）。

本手稿描述了在UDN MOSC果蝇核中积极使用的体内功能研究方案，以确定误感变异是否对使用表达人类的转基因苍蝇感兴趣的蛋白质产生功能影响蛋白质。该协议的目的是帮助MO研究人员与临床研究组合作，提供实验证据，证明感兴趣的基因中的候选变异具有功能性后果，从而促进临床诊断。在果蝇研究人员与一名临床研究人员接触的情况下，此协议最有用，该患者有一个罕见疾病患者，其基因中具有特定的候选变体。

该协议可以分为三个要素：（1） 收集信息以评估兴趣变异对患者表型负责的可能性，以及在果蝇中进行功能性研究的可行性，（2） 收集现有的遗传工具和建立新的，和（3）在体内进行功能研究。第三个要素可以根据如何评估利益变式的功能（救援实验或基于过度表达的策略）进一步细分为两个子元素。需要注意的是，该协议可以针对罕见单源疾病研究以外的许多情况进行调整和优化（例如，常见疾病、基因环境相互作用和药理学/基因筛选，以确定治疗靶点）。确定变异的功能和致病性的能力不仅通过提供准确的分子诊断使感兴趣的患者受益，而且还将对转化和基础科学研究产生更广泛的影响。

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Protocol

1. 收集人类和MO信息进行评估：利益变异对疾病表型负责的可能性和果蝇功能研究的可行性

  1. 执行广泛的数据库和文献搜索，以确定感兴趣的特定基因和变体是否是解释感兴趣的患者表型的好候选者。具体而言，收集以下信息。
    1. 评估感兴趣的基因以前是否涉及其他遗传疾病（已知疾病基因的表型扩张），或者这是一个全新的疾病候选基因[具有不确定意义的基因变异（GVUS）]。
    2. 评估疾病或控制人口数据库中感兴趣的变体的等位基因频率。
    3. 评估是否存在在疾病或控制人群数据库中包含此基因的拷贝数变异 （CNV）。
    4. 评估不同MO物种（包括小鼠、斑马鱼、果蝇、叶蓝素和酵母）的正交基因，然后进一步研究这些正交基因的已知功能和表达模式。
    5. 评估感兴趣的变体是否存在于蛋白质的功能领域，以及感兴趣的氨基酸是否进化保存。
      注：可通过单独访问多个人类和 MO 数据库或使用 MARRVEL（用于稀有变体探索的模型生物体聚合资源）Web 资源（参见表）获得以下五个问题的答案（步骤 1.1.1-1.1.5） 1代表在线资源）30，在随附的第31条中对此进行了深入描述。有关具体示例，请参阅代表性结果部分。君主倡议网站32和Gene2功能33也提供了有用的信息。
  2. 从蛋白质功能和结构角度进一步评估该变异是否是良好的疾病候选者，可收集其他信息。
    1. 根据 silico 预测算法，评估预期感兴趣的变体是否具有破坏性。
      注：变异致病性算法在过去15年中由许多研究小组开发，有些算法还显示在MARRVEL搜索结果中。较新的程序，包括下面列出的两个程序，结合多个变异致病性重组算法和机器学习方法，生成致病性分数。有关变体预测算法及其性能的更多信息，请参阅 Ghosh 等8。（i） CADD（综合注释依赖损耗）：由60多个基因组特征构建的综合注释工具，为人类SNV提供分数，以及短插入和删除11。（ii） REVEL（罕见的外显体变异合奏学习者）：组合多个变异致病性算法（MutPred、FATHMM、VEST、PolyPhen、SIFT、PROVEAN、突变评估器、突变器、轻轨、GERP、SiPhy、phyloP和phastCons），以提供综合评分所有可能的人类误解变种34。
    2. 确定感兴趣的人类基因/蛋白质或其MO正畸是否被证明与以前与遗传疾病相关的基因/蛋白质在基因或物理上相互作用。如果是这样，评估感兴趣的患者是否表现出与这些疾病重叠的表型。
      注：基于MO出版物以及来自多个物种屏幕的大规模蛋白质组学，已经开发出几种工具来分析遗传和蛋白质-蛋白质相互作用。STRING（寻找邻近基因的反复实例的工具）35：已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。它集成了基因相互作用和共表达数据集以及文本挖掘工具，用于识别可能在各种生物体中共同作用的基因和蛋白质。MIST（分子相互作用搜索工具）36：一个数据库，整合来自核心遗传M（酵母、叶蓝根、果蝇、斑马鱼、青蛙、老鼠、老鼠）和人类的基因和蛋白质相互作用数据。还显示从正交基因/蛋白质（间结）推断的相互作用的预测。
    3. 确定感兴趣的蛋白质的三维结构是否已求解或建模。如果是这样，请确定相对于关键功能域的兴趣映射变体的位置。
      注：通过X射线晶体学、核磁共振（NMR）和低温电子显微镜解决的蛋白质结构可以在公共数据库中找到，包括PDB（蛋白质数据库）和EMDatabank37。虽然没有预测/建模的蛋白质结构的单一数据库，但用户可以执行蛋白质建模，许多算法（即瑞航-MODEL 38、Modeller39和 Phyre240）。
  3. 与临床合作者沟通，讨论从信息学分析中收集到的信息，第 1.1-1.2 节。如果临床合作者也觉得感兴趣的变异和基因是很好的候选者来解释在患者身上看到的表型，继续第2节。如果有关于患者的基因型和表型的具体问题，在前进之前与临床合作者讨论。
    注：如果认为兴趣的变体不太可能解释感兴趣的表型（例如，在控制人群中的高频发现的相同变体），与临床合作者讨论，以确定该变体是否良好候选人，因为可能没有适当的专业知识来解释临床表型。

2. 收集现有遗传工具和建立新的试剂，研究感兴趣的特定变异

注：一旦兴趣的变体被确定为进行实验性、收集或生成试剂以进行体内功能研究的好候选者。对于本协议中描述的功能研究，需要一些关键的果蝇黑色素试剂：1）上游活化序列调节的人类cDNA转基因菌株携带参考或变异序列，2）功能丧失感兴趣的苍蝇基因的等位基因，以及3）一个GAL4线，可用于救援实验。

  1. UAS-人cDNA构造和转基因苍蝇的生成
    1. 识别并获取适当的人类 cDNA 构造。许多克隆可从MGC（哺乳动物基因收集）43，并可以从选定的供应商购买。对于交替拼接的基因，检查哪种等形 cDNA 对应于使用 Ensembl 或 RefSeq。
      注：许多cDNA可用于重组酶介导的克隆系统兼容试剂44，这简化了亚克隆步骤。cDNA 可能采用"打开（不停止科顿）"或"关闭（具有内源性或人工停止科顿）"格式。开放克隆允许对可用于生化（如西方印迹）和细胞生物学（例如免疫染色）的蛋白质进行 C'标记，以监测感兴趣的蛋白质的表达，但在某些情况下，它可能会干扰蛋白质功能。
    2. 将参考和变异cDNA分克隆到果蝇转基因载体中。使用#C31介导的成因系统，因为这允许参考和变异cDNA集成到基因组45的同一位置。对于这个项目，MOSC果蝇核心通常使用pGW-HA.attB向量46。
      注：如果人类cDNA处于重组酶介导的克隆系统中兼容的载体（例如，pDONR221，pENTR221），跳到第2.1.4节，其中解释LR对将cDNA子克隆到pGW-HA.atb的反应。
      1. 如果人类cDNA不在重组酶介导的克隆系统中相容质粒，则使用标准分子生物学技术将人类cDNA子克隆到网关输入载体中（此类协议的例子如下所述）。
        1. 执行悬垂 PCR 以引入attB1和attB2臂。前进引物应具有attB1序列5'-GGGGAAAAAAAAAAAAAAGCTCTTC-3'，然后是目标cDNA的前22个核苷酸。反向引物应具有attB2序列 5'-GGGGACCATATAAAGCTGCTCTCTCTCTTA-3' ，然后是感兴趣的 cDNA 最后 25 个核苷酸的反向补量。排除 cDNA 的停止子，然后添加 C' 标记，如果需要"打开"克隆，或添加停止科顿以"关闭"克隆。
        2. 制备 100 μL 的高保真 PCR 混合物，包括 50 μL 的高保真 PCR 主混合物、36 μL 蒸馏水、步骤 2.1.2.1.1 中列出的每个正向和反向底漆的 5 μL 稀释至 10 μM，以及 4 μL 的目标 cDNA （150 纳克/μL）。
        3. 使用标准诱变协议执行 PCR，将attB1和attB2臂添加到感兴趣的 cDNA 上。条件将因所关注的构造和变体而异。
        4. 通过凝胶电泳和凝胶提取，通过添加同源臂分离目标cDNA。创建 1% 胶合，并使用标准方法进行电泳。切除对应于 cDNA 大小加上同源臂的额外长度的带。通过标准方法从凝胶中提取DNA95。多家公司提供商业凝胶提取试剂盒。
        5. 根据所使用的系统，根据重组酶介导的克隆方案执行体外重组酶反应。
        6. 将 BP 反应混合物转化为具有化学能力的大肠杆菌细胞。合格的电池可以在内部制造，也可以从商业供应商处购买。在含有适当抗生素的LB板上一夜之间培养转化的细胞，用于菌落选择。第二天，选择几个殖民地，并在独立的液体培养物中生长过夜。
        7. 通过小型制备从隔夜培养物中分离DNA。桑格对阳性克隆进行测序，以确保cDNA具有正确的序列96。在-80°C储存的25%甘油中，保持培养物对所需序列呈阳性的细胞。
    3. 执行位点定向诱变，将感兴趣的变异引入网关质粒与参考人类cDNA97。此方法的详细协议可以在供应商的网站48，49中找到。通过整个开放读取帧 （ORF） 的 Sanger 测序验证变异质粒中是否存在，以确保没有通过此突变步骤引入的其他变异。
    4. 通过LR克隆酶反应将供体质粒中的参考物和变异人类cDNA（具有attL1和atL2位点的网关质粒）分克隆到转基因质粒中（例如，pGW-HA.atb与atR1和atR2位点）。
      注：如果倾向于通过限制性酶方法对人cDNA进行子克隆，则有UAS +C31载体，用于传统的限制性酶亚克隆（例如，pUAST.attB50）。
    5. 选择 #C31 停靠点，在其中集成 UAS-人 cDNA 转基因。多个实验室已经产生了一些对接点，从库存中心50、52、53公开提供。
      注意：由于在染色体上使用人类转基因，而该染色体上不包含感兴趣的基因的苍蝇正交，因此建议在飞行正交仪位于X上时使用第二个染色体对接位点[VK37（BDSC股票#24872]。，第三，或第四染色体，并使用第三染色体对接位点[VK33（BDSC股票#24871]时，飞行正交科在第二染色体上。
    6. 将UAS-人cDNA结构注入在生殖系中表达[C31整数的苍蝇中》（例如，vas-C31，nos-C31）。
      注：微注射可以在内部进行，也可以发送到核心设施或商业实体进行转世。产生转基因苍蝇的详细方案见所引用的书第51章。
    7. 从注射的胚胎中建立稳定的转基因菌株。注射+100-200个胚胎每个构造94。图 1A描述了一个将转基因插入第二个染色体对接位点（ VK37 ）的代表叉方案。参考引用的书籍54，55了解果蝇遗传的基本信息。
  2. 获得或生成 T2A-GAL4 系列，便于基于救援的功能检测（参见图 2和第 3.1 节）。
    注：此行将用于两个目的。首先，大多数被测试的T2A-GAL4线通过作为基因陷阱等位基因的功能，表现与强LOF等位基因一样强。其次，T2A-GAL4线作为GAL4驱动器，允许表达UAS构造（例如UAS-GFP，UAS-人cDNA）在感兴趣的基因的内源调控元素（图2A-C）。
    1. 搜索公共库存集合，查找可用的 T2A-GAL4 线，包括果蝇基因破坏项目 （GDP）58，其中已生成 1，000 个 T2A-GAL4 线59。这些菌株目前可从布卢明顿果蝇库存中心 （BDSC） 获得，并且可通过 GDP 和 BDSC 网站进行搜索。
    2. 如果感兴趣的苍蝇基因的T2A-GAL4线不可用，请检查是否有合适的编码在电子MiMIC（Minos介导的集成盒）线路可用于转换成T2A-GAL4线使用重组酶介导的盒式交换（RMCE））60 （图 2A）
      注：RMCE 允许通过供体构造的显微注入（交叉方案示例如图1B所示）或系列，将位于两个编码外显子之间的 intronic MiMIC 元件转换为 T2A-GAL4 线。十字架，如详细描述57，59。
    3. 如果 T2A-GAL4 线路不可用，并且不存在在电子 MiMIC 中的适当编码，请探讨通过 CRIMIC（CRISPR 介导的集成盒）系统59生成 T2A-GAL4 线路的可能性。
      注：该方法使用CRISPR介导的DNA裂解和同源定向修复（HDR），将类似MiMIC的盒式磁带集成到感兴趣的基因的编码内创中。
    4. 如果感兴趣的基因缺乏大内创（>150 bp）或没有内创体，尝试使用HDR使用CRISPR/Cas9系统将GAL4转基因输入苍蝇基因，如描述20，61，62。
      注：如果T2A-GAL4或GAL4敲式等位基因的生成困难，请尝试使用这些预先存在的等位基因或RNAi线以及无所不在或组织特定的GAL4驱动器进行救援实验，如描述92（REF）。

3. 对果蝇中感兴趣的人类变异进行功能分析

注：使用第2节中收集或生成的工具，对果蝇体内的兴趣变异进行评估，以评估基于救援的分析（第3.1节）以及过度表达研究（第3.2节）。考虑使用这两种方法，因为两者是相辅相成的。

  1. 通过基于救援的实验执行功能分析
    注意： 异构救援实验Drosophila使用人类蛋白质确定两个正交基因的分子功能是否已保存超过5亿年的进化。他们还评估变异在人类蛋白质的上下文中的功能63.虽然研究数百个基因对的系统分析尚未报告，但几十个人类和哺乳动物（如小鼠）基因能够取代Drosophila基因13.
    1. 在基于救援的方法中，首先确定在飞行正交仪中的LOF突变体中是否存在明显、可腐蚀和可重复的表型，然后再评估变型的功能。
      注：以前关于苍蝇基因的文献是先进行数据挖掘的好地方，可以使用包括FlyBase和PubMed在内的数据库找到它。其他数据库（如 MARRVEL、君主倡议和 Gene2Funcion）也可用于收集此信息。
    2. 对同源体和血吸虫中的可溶性表型进行全球调查（T2A-GAL4等位基因对分子定义的染色体缺陷动物，特别是如果T2A-GAL4等位基因是特定基因特征的第一个突变）。评估表型，如致命性、不育性、寿命、形态（例如眼睛的大小和行为）和行为（例如求爱、飞行、攀爬和爆炸敏感性缺陷）。
      注：如果从这个主屏幕中未识别主要表型，则使用更微妙的表型，如电生理记录测量的神经缺陷，如果它们具有很高的可重复性和特异性。例如，步骤 3.2.3 描述了使用电热表 （ERG） 的功能研究。如果未能检测到任何可检测的表型，则移动到第 3.2 节并执行基于过度表达的功能研究。
    3. 一旦在苍蝇LOF突变体中识别出可检测的表型，通过尝试使用人类cDNA来拯救突变苍蝇线来测试参照人类cDNA是否可以取代飞行正交的功能。此处执行的型型测定取决于步骤 3.1.2 的结果，并且将特定于所研究的基因。
      注：如果"人性化"的苍蝇基因成功，现在有一个平台来比较救援效率的变异的兴趣相比，参考对应。参照人类cDNA的救援不一定是完美的。使用人类cDNA部分抢救苍蝇突变表型，仍为使用变异人类cDNA菌株进行比较研究提供了参考点。
    4. 使用步骤 3.1.2 中选择的检测系统，将使用参考人类 cDNA 观察到的救援与变异人类 cDNA 的救援进行比较，以确定兴趣变体是否对感兴趣的基因产生影响。
      注：如果变异人类cDNA的表现比参考等位基因差，这表明感兴趣的变异对蛋白质功能有害。如果变异和参考在功能上无法区分，则 1） 等位基因可以是同构体（不影响蛋白质功能的变体）或 2）， 检测不够灵敏，无法检测细微差异。
    5. 如果发现该变异是有害的等位基因，则通过西印迹、免疫荧光染色或其他方法，进一步评估体内感兴趣的参考蛋白和变异蛋白的表达和细胞内定位。
      注：如果UAS-人cDNA是从pGW-HA.attB载体中的开放克隆产生的，则使用抗HA抗体进行这些生化和细胞测定。如果原始克隆是封闭克隆，则测试针对人类蛋白质的商业抗体是否可以用于这些检测。表达水平和细胞内定位的差异可能揭示兴趣变异如何影响蛋白质功能。
  2. 通过过度表达研究执行功能分析
    注：在野生型苍蝇中，人类cDNA的通用或组织特异性过度表达可以提供与第3.1节讨论的基于救援的实验互补的信息。虽然基于救援的检测主要设计用于检测LOF变异（非形态、低态），但基于表达的测定也可能揭示出更难评估的功能增益（GOF）变异（变形、反形态、新形态）。
    1. 选择一组 GAL4 驱动程序以过度表达感兴趣的人类 cDNA。公共库存中心（例如 BDSC）提供了许多无处不在且特定于组织/阶段的 GAL4 驱动器，其中一些驱动器比其他类型使用更频繁。首先关注无处不在的驱动因素和易于收缩的表型（致命性、无菌性、形态表型），然后转向组织特定的驱动因素和更具体的表型。
      注：在实验中使用GAL4驱动程序（例如UAS-GFP）验证GAL4驱动程序的表达，以确认表达模式。
    2. 在相同条件下（例如温度），使用同一驱动器（例如温度）使用同一驱动器，通过从GAL4线跨越3-5只处女（例如，ey-GAL4用于眼睛象形圆盘表达），与来自UAS线路的3-5只雄蝇交叉，以表达参考和变异人类cDNA。UAS-TBX2（+）或UAS-TBX2（p.R305H），用于第4.2节*中所示的单个小瓶中的示例。
      1. 每2-3天转移十字架，让许多动物从单个十字架上分离。
    3. 在解剖显微镜下检查后代并检测参考菌株和变异菌株（例如眼睛形态学）之间的任何差异。使用连接到解剖显微镜的照相机对苍蝇进行成像，以记录表型。
      注：如果表型仅在参考中看到，而未在变体行中看到，则变体可以是非态或强低态等位基因。如果表型在两个基因型中都出现，但参考导致更强的缺陷，则变异可能是轻度到弱的低态等位基因。如果参考未显示表型或仅显示弱表型，但变体显示强缺陷，则变体可能是 GOF 等位基因。
    4. 如果在标准培养条件下（RT 或 25°C 下）看不到表型，则在 18-29 °C 的不同温度下设置十字架，因为 UAS/GAL4 系统已知对温度敏感64，65。通常，UAS 转基因的表达在较高温度下较高。
  3. 执行与感兴趣的基因和蛋白质相关的其他功能研究。
    注意：除了检查一般缺陷外，还可以选择检测系统来探讨基因和变异的分子功能。在代表结果中讨论的一个示例中（TBX2的情况下），ERG记录用于确定变异对光受体功能的影响，因为感兴趣的飞行基因（bifid）在视觉系统开发方面进行了广泛的研究。ERG 的详细协议Drosophila可以找到以前发布的66,67,68.
    1. 生成苍蝇以测试视觉系统中的功能缺陷。从罗多普辛1（Rh1）-GAL4线交叉处女到具有参考或变异UAS-人cDNA转基因的雄性，以表达R1-R6光受体中感兴趣的人类蛋白质。
      注：交叉3-5处女到3-5雄性苍蝇在一个单一小瓶和转移十字架每2-3天，让许多动物从一个单一的十字架。所有十字架必须保存在实验温度下设置的培养箱中，以获得一致的结果。
    2. 一旦苍蝇开始离闭（在25°C，在设置初始十字架后10天），收集后代（Rh1-GAL4/+;UAS-人cDNA/+）放入新鲜的小瓶中，在实验温度下将其放回培养箱中，再延长3天，使视觉系统成熟。
      注：虽然ERG可以在1-2天老苍蝇上执行，但新封闭的苍蝇ERG信号可能会有较大的波动。如果需要检查一种与年龄相关的表型，这些苍蝇可以老化几个星期，只要它们定期（例如，每5天）转移到一个新的小瓶，以避免溺死在潮湿的食物中。
    3. 首先使用CO2对苍蝇进行麻醉，或将它们放入冰上小瓶中，为苍蝇准备ERG记录。轻轻地将苍蝇的一侧粘附在玻璃显微镜幻灯片上，以固定它们。
      注：多个参考和变种苍蝇可以粘在一张幻灯片上。将所有苍蝇以大致相同的方向放置，一只眼睛可进入记录电极。小心不要粘在眼睛上，让眼部自由。
    4. 准备录音和参考电极。将 1.2 mm 玻璃毛细管放入针拔器中并激活。打破毛细管，获得两个锋利的锥形电极。生成的电极应为空心电极，最终直径为 <0.5 mm。
    5. 用盐水溶液（100 mM NaCl）填充毛细管，确保没有气泡。将玻璃毛细管滑过银线电极（记录电极和参考电极，参见图4），并将毛细管固定到位。
    6. 配置刺激器和放大器。在劳沃斯等人67中可以找到详细的设置。UDN果蝇MOSC 设置由材料部分列出的设备组成。
      1. 将放大器设置为 0.1 Hz 高通滤波器、300 Hz 低通滤波器和 100 增益。
      2. 将刺激器设置为 1 s 周期、500 ms 脉冲宽度、500 ms 脉冲延迟、运行模式和 7 安培。
      3. 准备光源以进行光刺激。使用卤素光源激活飞行光感受器。
      4. 在连接到 ERG 设置的计算机上准备录制软件。创建具有采集模型"固定长度事件"和 20 s 持续时间的激励协议。
    7. 在开始 ERG 录音之前，使苍蝇适应完全黑暗。在开始实验之前，将苍蝇置于完全黑暗中至少10分钟。
      注：由于苍蝇无法检测到红光，因此在黑暗习惯期间使用红光源。
    8. 将包含苍蝇的幻灯片放在记录装置上，将携带参考和记录电极的微型操纵器移到靠近幻灯片上感兴趣的苍蝇的点上。观察电极的尖端，小心地将参考电极放入苍蝇的胸腔（穿透角质）。将参考电极固定插入后，将记录电极放在眼睛表面。
      注：此参考电极的确切位置对 ERG 信号没有重大影响。记录电极应放置在眼睛表面，因为 ERG 是场势记录，而不是细胞内记录。施加在记录电极上的适当压力会导致小酒窝而不穿透眼睛。
    9. 关闭所有灯 3 分钟，使苍蝇适应黑暗环境。
    10. 设置录制软件并开始录制信号。如果使用带手动快门的卤素光源，请打开快门关闭的光源。开始录制信号。
    11. 在一次跑步的 20 小时内，每 1 s 打开和关闭一次快门，将飞眼暴露在光线下。
      注：卤素光源的开/关可以手动控制或编程，以便使用白色 LED 光源实现自动化。与白光 LED 相比，使用卤素光源可获得更坚固、更可靠的 ERG，这可能是因为卤素光源发射的光谱较宽。
    12. 记录安装在玻璃幻灯片上的所有苍蝇的 ERG。执行每个条件从15个苍蝇的ERG每个基因型。
      注：一些参数可以更改以查找显示参考和变体 cDNA之间强强差异的条件可能包括温度、年龄或环境条件（例如，在浅暗循环或恒定的光/暗中饲养）。
    13. 执行数据分析：比较引用、变体和控件中的 ERG，以确定是否存在差异。评估 ERG 数据，以找出瞬变、去寡头化、非瞬态和重极化69的变化（图 4B）。
      注：脱极化和再极化反映了光受体内光转导级联的激活和失活，而开体和瞬变是接收信号的突触后细胞活动的量度光感受器。复极化的振幅减小和动力学变化通常与光感受器功能和健康的缺陷有关，而在具有缺陷突触发育、功能或维护的突变体中，在开瞬态和外瞬态的缺陷中被发现70.
    14. 在识别ERG表型的差异时，与变异的人类cDNA不同，确定这种电生理表型是否与光感受器的结构缺陷和超结构缺陷有关，以及其通过执行组织学分析和透射电子显微镜进行突触。
      注：关于ERG缺陷解释和结构/超结构分析的进一步讨论，先前已述及69。

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Representative Results

EBF3中与神经发育表型相关的新感变异的功能研究
国家卫生研究院未确诊疾病项目（UDP）的医生和人类遗传学家在7岁男性患有神经发育表型，包括肌张力障碍、失语症、全球发育迟缓和言语障碍。在EBF3（早期B细胞因子3）15中识别出一个错误感变异（p.R163Q），这是一种编码COE（Collier/Olfactory-1/早期B细胞因子）家族转录因子的基因。该案于2016年3月提交UDN MOSC进行功能研究。为了评估该基因是否是本病例的良好候选基因，MOSC 从OMIM、ClinVar、ExAC（现已扩展到gnomAD）、Geno2MP、DGV和DECIPHER收集了人类遗传和基因组信息。此外，使用DIOPT工具确定了关键MO物种的正交基因。然后从单个MO数据库（例如蠕虫库、飞碱、ZFIN、MGI）获得基因表达和表型信息。为EBF3进行信息学分析，以及UDN MOSC中的其他开创性研究，为MARRVEL资源30的后期开发奠定了基础。

使用这种方法收集的信息表明，EBF3在分析时与任何已知的人类遗传性疾病无关，根据以下信息得出结论，p.R163Q变异是一个很好的候选者。（1） 控制人口数据库（ExAC）和疾病人口数据库（Geno2MP）以前没有报告过这一变种，这表明这是一个非常罕见的变种。（2） 根据ExAC，该基因的pLI（LOF不耐受概率）得分为1.00（pLI分数范围为0.00-1.00）。这表明，在一般人群中，该基因中的LOF变异存在选择性压力，并表明该基因的单倍不全可能导致疾病。有关 pLI 分数及其解释的更多信息，JoVE31中的 MARRVEL 教程文章和相关论文提供了详细信息30，71。

p.R163Q变异也被认为是一个很好的候选，因为它位于这种蛋白质的进化保守的DNA结合领域，这表明它可能会影响DNA结合或其他蛋白质功能。（4） p.R163残留物从C.elegans和果蝇进化保存到人类，表明它可能对跨物种的蛋白质功能至关重要。（5）EBF3正交仪在多个MO72中涉及神经元发育，包括C.elegans 73、Drosofia 74、Xenopus75和小鼠76。（6） 在小鼠大脑发育期间，Ebf3已被证明在Arx（与Aristaless相关的家庭箱）77的下游起作用，Arx（与Aristaless相关的家庭箱）77，一种与几个癫痫和智力残疾相关的基因人类综合征78。因此，这些数据共同表明，EBF3很可能对人类神经发育至关重要，p.R163Q变异可能具有功能性后果。

为了评估p.R163Q是否影响EBF3功能，通过电子MiMIC插入15的编码RMCE生成了T2A-GAL4线（kn;人类EBF379的飞交射自理）。knT2A-GAL4系列具有隐性杀伤力，无法补充经典kn等位基因 （kncol-1）的杀伤力，以及涵盖kn [Df（2R）BSC429]80的分子定义缺陷. GAL4的表达模式也反映了以前报道的kn表达模式在大脑以及翅膀想象光盘15。然后生成UAS转基因苍蝇，以允许表达参考和变异人类EBF3 cDNA以及野生型苍蝇kn cDNA。所有三种蛋白质都标有C-终端3xHA标签。重要的是，UAS野生型苍蝇kn （kn+） 或参考人类EBF3 （EBF3+） 转基因拯救了knT2A-GAL4/Df（2R） BSC429的杀伤力到类似程度 （ 图3C，左侧面板）81。

相比之下，具有p.R163Q变体（EBF3p.R163Q）的UAS-人EBF3转基因无法挽救这种突变体，这表明p.R163Q变异影响EBF3在体内15的功能。有趣的是，当使用抗HA抗体进行评估时，EBF3p.R163Q蛋白在飞组织中被成功表达，其水平和亚细胞定位（主要是核）与EBF3+ 和Kn=.这表明该变异不是由于蛋白质不稳定或定位错误而导致LOF表型的。为了进一步评估p.R163Q变异是否影响EBF3的转录激活功能，在HEK293细胞15中进行了基于荧光酶的测试。这项在培养的人体细胞中的实验表明，EBF3p.R163Q变体未能激活报告器构造的转录，支持了从果蝇实验中获得的LOF模型。

在实验研究的同时，BCM与医生、人类遗传学家和遗传顾问合作，确定了另外两名症状相似的个体。一名患者携带相同的 p.R163Q 变体，另一名患者携带影响相同残留物的误感变体（p.R163L）。p.R163L变种也未能拯救苍蝇kn突变体93，这表明这种等位基因也影响了EBF3功能。有趣的是，这一工作与两个独立的人类遗传学研究连续发表，报告在EBF3中，有其他与类似相似基因有关的人，具有错误感、废话、换帧和拼接变异。神经发育表型82，83。随后，又发表了三篇论文，报告增加了de novo EBF3变型和抄号删除84、85、86的案例。这种新的神经发育综合征现在被称为肌张力障碍，阿氏症，和延迟发育综合征（HADDS，MIM #617330）在人类在线孟德尔遗传（OMIM，一个权威的数据库的基因型-表型关系在人类）。

TBX2中与合成心血管和骨骼发育障碍相关的显性遗传误感变异的功能研究
在一个小家庭受颅面畸形重叠谱，心脏异常，骨骼畸形，免疫缺陷，内分泌异常，发育障碍影响，UDN杜克临床站点识别一个误感变种（p.R20Q）在TBX2中，与疾病表型87分离。四个家庭成员中有三个（儿子、女儿、母亲）受此情况影响，儿子表现出最严重的表型。临床上，他遇到了"完全DiGeorge综合征"的诊断，这个病症通常是由TBX1的单倍素引起的。虽然在这个家族中TBX1中没有发现突变，但临床医生和人类遗传学家专注于TBX2的变异，因为以前在小鼠身上的研究表明，这些基因在发育过程中具有重叠的功能88.TBX1 和 TBX2 都属于 T 盒 （TBX） 系列的转录因子，可作为转录抑制器以及激活器，具体取决于上下文。

以前，TBX家族基因17个成员中有12个变异与人类疾病有关。MOSC决定根据通过MARRVEL和其他资源收集的以下信息，试验性地采用这一变体。（1） 在 gnomAD 中的 90，000 名"控制"个体中，仅报告过此变体一次（此变体在默认视图中被过滤掉，可能是由于覆盖率读取较低）。考虑到母亲的温和表型表现，这仍然可以被认为是一种罕见的变种，可能负责疾病表型。（2） ExAC/gnomAD 中的TBX2的 pLI 分数为 0.96/0.99，该分数较高（最大值 = 1.00）。此外，在gnomAD中的o/e（观察/预期）LOF分数为0.05（在gnomAD中只观察到1/18.6预期LOF变异）。这些数字表明，这种基因中的LOF变异是在一般人群中选择的。

此外，（3）p.R20从C.elegans和果蝇进化保存到人类，这表明这可能是TBX2功能的重要残留物。（4） 多个程序预测该变体可能具有破坏性（多面体：可能/可能具有破坏性，SIFT：有害，CADD 分数：24.4，REVEL 分数：0.5）。（5） MO突变体在患者受影响的组织中表现出缺陷（例如，在心血管系统、消化/消化系统、颅面、四肢/数字方面表现出缺陷的敲除小鼠）。因此，结合TBX1和TBX2之间的生物联系，以及这些患者与DiGeorge综合征之间的型板状链接，最好使用果蝇对该基因的变异进行功能研究。

为了评估p.R20Q变型是否影响TBX2功能，在bifid（bi;人类TBX2的果蝇正交）中的T2A-GAL4线是通过在电子MiMIC编码的RMCE生成的（图2）87。这种等位基因，双T2A-GAL4，是隐性的普宝致命，并表现作为一个强大的LOF突变体，类似于先前报道的双LOF等位基因（例如，bi D2，bi D4; 图 2E.这些经典和新生成的双等位基因的致命性是由一个+80 kb的基因组救援结构，携带整个双位点，表明这些试剂确实是干净的LOF等位基因。双T2A-GAL4线中的 GAL4 表达模式也与先前报告的多个组织中的双表达模式（包括翼形圆盘）很好地匹配（图 2D）。

同时，为TBX2生成了携带参考或变量（p.R20Q）序列的UAS转基因线。不幸的是，两个转基因都未能挽救双T2A-GAL4线的致命性。重要的是，野生型苍蝇UAS-bi转基因也未能挽救双T2A-GAL4等位基因，可能是由于该基因的剂量敏感性。事实上，UAS-bi和UAS-TBX2的过度表达在野生型动物中过度表达时，造成了一定程度的杀伤力。双/TBX2过度表达的这种毒性效应被用作功能测定，以评估 p.R20Q 变体是否可能影响 TBX2 功能。由于果蝇双基因在视觉系统（基因也称为光动盲（omb））的背景下进行了广泛的研究，因此对与视觉系统相关的表型进行了广泛的研究。当参考TBX2使用ey-GAL4驱动程序表示UAS-基因在眼睛和大脑中与视觉系统相关的部分，+85%的致死率（图3C，右面板）和显著观察到眼睛尺寸的减小 （图 4B） .这种表型比野生型苍蝇UAS-双转基因时观察到的表型强，这表明人类TBX2在过度表达时对苍蝇更有害。

有趣的是，p.R20Q TBX2在造成致命性（图3C，右面板）和诱导小眼表型（图4B）使用相同的条件87下，在导致致命性方面不太有效，建议变异影响蛋白质功能。此外，光感受器使用不同的GAL4驱动器（Rh1-GAL4）过度表达参考和变异TBX2的功能，该驱动器在R1-R6光感受器中专门表示UAS转基因，表明该变异TBX2表现出与参考TBX2（图4B）87相比，ERG表型要温和得多。有趣的是，大多数p.R20Q TBX2蛋白仍然存在于核中，类似于参考蛋白，这表明该变异不影响核定位。HEK293T细胞中基于荧光酶的转录抑制测定表明，p.R20Q不能有效地抑制用palindromicT-box位点87构造的报文转录。此外，与TBX2相比，TBX2p.R20Q的蛋白质水平下降，表明该变异可能影响TBX2的转化或蛋白质稳定性，进而影响细胞内的丰度。

在UDN杜克临床基地的临床医生在这些实验研究的同时，还发现了TBX2中罕见变异的其他患者。 一个8岁的男孩与一个不相关的家庭，与德诺诺错感（p.R305H）变种展示了许多在第一家庭87中发现的功能。在果蝇和人类细胞系的其他功能研究表明，p.R305H变异也影响TBX2功能和蛋白质水平，强烈表明，该基因的缺陷可能是在两个家族中发现的许多表型的基础。这种疾病最近被策划为"椎骨异常和可变内分泌和T细胞功能障碍"（VETD，MIM#618223）在OMIM。识别TBX2中具有破坏性变异和重叠表型的其他个体对于了解人类疾病中该基因的全谱基因型-表型关系至关重要。

Figure 1
图 1：注入和交叉方案，生成UAS-人cDNA和T2A-GAL4线。（A） 通过微注射和交叉生成UAS-人cDNA转基因。例如，在第一代和第二代用雄性苍蝇将转基因集成到第二个染色体对接位点（VK37）中。将人类cDNA[C31转基因结构]（pGW-HA.attB）注入含有[C31整体（标有3xP3-GFP和3xP3-RFP）的生殖系源]的早期胚胎（标有黄色+（y=）和VK37基块[标带黄色+（y=）]时，再注入早期胚胎。 标记*，转基因事件可以跟随在转基因载体中存在的白色+ （w+） 微基因。建议通过使用 GFP 和 RFP 对苍蝇进行选择来划掉 #C31 整形。如果染色体携带第二个位点致命/无菌命中突变，则最终的稳定股票可以作为同源物或平衡库存保留。转基因结构上存在第二位致命/无菌突变通常不会影响功能研究的结果，只要这些转基因在异质状态下使用（图3）。（B） 通过显微注射和交叉生成 T2A-GAL4 线。例如，将第二个染色体 MiMIC 插入转换为 T2A-GAL4 元素的交叉方案。通过为T2A-GAL4（pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70）的#C31整数和RMCE向量进行显微注入，为感兴趣的MiMIC选择适当的读量。见以下论文详情57，59成胚胎携带MiMIC在编码的内创基因感兴趣的，一个人可以转换原来的MiMIC到T2A-GAL4线。图 2A显示了 RMCE 转换的示意图。转换事件可以通过筛选对原始MiMIC盒60中的y+标记进行筛选来选择。由于 RMCE 可以双向发生，因此只有 50% 的成功转换事件能够成功生产 GAL4，下一代 UAS-GFP 检测器转基因可以检测到 GAL4。如果基因的LOF是致命的/无菌的，则最终的稳定股票可以作为同源物或平衡库存保存。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2：通过RMCE将MiMIC元件转换为T2A-GAL4线。（A） [C31 整数促进在飞（上）和两个 attB站点之间的重组，两个attB站点两侧是 T2A-GAL4 盒式，显示为圆形矢量（底部）。（B） 成功的RMCE事件导致可选择的标记（黄色+）丢失，并将T2A-GAL4盒插入与感兴趣基因相同的方向。由于 RMCE 事件可以双向发生，因此只有 50% 的 RMCE 反应产生所需的产品。插入相反方向的 RMCE 产品不能用作基因陷阱等位基因或表达 GAL4。必须通过桑格测序来确认构造的方向性。（C） 由于 T2A-GAL4 盒的 3' 端处存在聚A 信号，因此对感兴趣的基因的转录（顶部）和翻译（底部）导致产生截断的 mRNA 和蛋白质。T2A 是核糖体跳跃信号，它允许核糖体在此信号后停止并重新启动转换。这用于生成一个 GAL4 元素，该元素不以共价方式附加到感兴趣的截断基因产品。GAL4将进入细胞核，并便利UAS元素控制的转基因转录。UAS-GFP可用作基因表达报告器，UAS-人cDNA可通过基因"人性化"进行抢救实验。（D） 图示是 UAS-GFP（顶部）Bi驱动表达式中的 T2A-GAL4 元素示例。 此表达模式类似于以前生成的相同基因的增强器陷阱线（biomb-GAL4;底部）。（E）比较T2A-GAL4 二等位基因与先前报告的 LOF双等位基因。这个数字已由以往的刊物57、87采用及修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3：使用基于救援（左）和基于表达（右）的研究对人类变异进行功能分析。（A） （左面板）：EBF3变型的功能通过基于救援的分析对飞行结（kn）LOF等位基因进行评估，重点是杀伤力/生存能力; （右面板）：通过对野生型苍蝇进行人类TBX2转基因的过度表达，对TBX2变异的功能进行评估，重点是杀伤性/活力、眼睛形态和电生理学表型（图4）.（B） 交叉计划，使苍蝇在功能研究中进行测试。建议始终使用中性UAS元素（例如，UAS-lacZ，UAS-GFP）作为对照实验。 （C） 代表性的结果分别来自EBF3p.R163Q和TBX2p.R20Q变型的功能研究，以及解释结果所需的适当控制实验。基于救援的分析和过度表达研究都表明，变异表现为非形态或低态等位基因。此处显示的致命性/可生存性数据基于先前出版物15、87中提出的实验数据。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4：基于果蝇眼形态和电热表谱的人类TBX2中一种罕见的误感变异的功能分析。（A） 显示记录和参考电极在飞眼上的典型位置的示意图图像，以及具有四个主要组件（瞬态、去极化、瞬态、瞬态、重极化）。（B） TBX2变型（p.R20Q）功能作为部分LOF等位基因，基于在飞眼中使用特定于视觉系统的GAL4驱动器（ey-GAL4和Rh1-GAL4）的过度表达研究。 结果表明，与变异蛋白相比，参考TBX2引起较强的形态和电生理表型。（顶部面板）：在UAS-TBX2的过度表达时，眼睛尺寸会严重缩小，而ey-GAL4。UAS-TBX2p.R20Q.与ey-GAL4驱动也会导致较小的眼睛，但表型要温和得多。（底部面板）：当UAS-TBX2=在使用Rh1-GAL4的核心R1-R6光感受器中表示时，存在开和关瞬变损失、去极化减少以及电位（PDA）表型后大异常长期去极化，这在控制苍蝇中是看不到的。这些表型不像使用同一Rh1-GAL4表示的UAS-TBX2p.R20Q那样严重。这个数字已由以往的69、87号刊物采用和修改。请点击此处查看此图的较大版本。

目的 工具 Url
变体函数
预测算法		 聚苯-2
筛选
CADD
普罗兰
突变者
陶醉		 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
罕见和未确诊
疾病研究
财团		 UDN
RDMM
国际发展新发展
解路
AFGN		 https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https : / / irudbeyond . . ac . jp / en / index . html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
集成数据库
人和模型
有机体信息		 马尔维尔
君主倡议
基因2功能
酚罗格		 http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
人类遗传和
基因组学数据库		 OMIM
克林瓦尔
EXAC
格诺姆阿德
吉诺姆
DGV
破译		 https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
正交识别工具 DIOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
模型有机体
数据库和生物医学
文献搜索		 蠕虫库 （C elegans）
飞行基地 （果蝇）
ZFIN（斑马鱼）
MGI（鼠标）
Pubmed		 https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
遗传和蛋白质
交互数据库		 字符串
雾		 https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
蛋白质结构
数据库和
建模工具		 WWPBD
瑞士模式
建模器
植物2 		http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
患者匹配
平台		 媒人交换
基因匹配器
AGHA 存档
火柴 盒
破译
MyGene2
现象中心		 http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
人类成绩单
注释和 cDNA
克隆信息		 哺乳动物基因集合
恩塞姆布尔
里夫塞克		 https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

表 1：与此协议相关的联机资源。

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Discussion

使用果蝇黑色素的实验性研究提供了一个强大的测定系统，以评估与疾病相关的人类变异的后果。这是由于在过去的一个世纪里，许多在飞行领域的研究人员产生了大量的知识和多样化的基因工具。然而，就像任何其他实验系统一样，承认存在的警告和限制是很重要的。

与数据挖掘相关的注意事项
虽然该协议的第一步是挖掘数据库，以获取有关相关基因的信息，但重要的是仅将其用作起点。例如，尽管在变体函数的 silico 预测中提供了有价值的见解，但应始终谨慎解释这些数据。在某些情况下，所有主要算法都预测人类变异是良性的，但果蝇的功能研究清楚地表明了这种变异24的破坏性。同样，尽管蛋白质-蛋白质相互作用、共表达和结构建模数据都是有见地的信息片段，但这些大组数据集中可能存在伪正和伪负面信息。例如，一些先前确定或预测的蛋白质-蛋白质相互作用可能是人工的，或者只在某些细胞和组织类型中看到。

此外，这些数据集中可能未捕获许多错误的负相互作用，因为某些蛋白质-蛋白质相互作用是瞬态的（例如，酶-基质相互作用）。实验验证对于证明某些基因或蛋白质在感兴趣的生物环境中在体内进行基因或物理相互作用至关重要。同样，基于同源建模预测的结构应视为模型，而不是求解结构。尽管如果发现蛋白质的结构重要部分存在感兴趣的氨基酸，此信息可能很有用，但负面数据不排除该变异可能有害的可能性。最后，以前报告的一些基因型表型信息也应谨慎对待，因为公共数据库中存档的某些信息可能不准确。例如，MO 数据库中的某些信息基于经过良好控制和严格执行的实验，而其他信息可能来自没有进一步后续研究和严格控制的大屏幕纸。

使用T2A-GAL4策略的"人性化"实验并不总是成功的
虽然使用人类cDNA的基于救援和过度表达的功能研究允许评估人类蛋白质背景下的变异，但这种方法并不总是成功的。如果参考人类cDNA不能拯救苍蝇突变表型，有两种可能的解释。第一种可能性是，人类蛋白质在苍蝇细胞中是功能性的或显著减少的活性。这可能是由于 1） 蛋白质表达、稳定性、活动和/或本地化减少，或 2） 与在多蛋白复合物中工作的苍蝇蛋白缺乏兼容性。由于 UAS/GAL4 系统对温度敏感，因此苍蝇可以在相对较高的温度（例如 29 °C）下升高，以查看在此条件下进行救援的可能性。此外，还可以生成 UAS-fly cDNA 构造和转基因作为正对照。如果感兴趣的变体影响保存的氨基酸，则类似的变体可以引入飞 cDNA，用于在飞行正交中对变异进行功能研究。虽然这是没有必要的，但它极大地有助于研究在使用人类cDNA转基因线给阴性或无结论的结果的情况下（图3）。

第二种可能性是，人类蛋白质的表达会引起一些细胞或有机体级别的毒性。这可能是由于抗形态（例如，作为主要阴性蛋白质）、多态性（例如，活动过多）或新形态（例如，获得一种新的毒性功能，如蛋白质聚合，并不总是与基因的内源性功能相关。兴趣）效果。在这种情况下，保持苍蝇在低温（例如，18 °C）可以缓解其中一些问题。最后，在某些情况下，苍蝇cDNA的过度表达可能无法挽救在TBX2示例中看到的苍蝇T2A-GAL4线，这可能是由于基因产物的三次剂量依赖。为了避免感兴趣的蛋白质的过度表达，感兴趣的苍蝇基因可以通过CRISPR直接修改，基因组救援结构可以设计，包含感兴趣的变异，或救援实验可以使用LOF等位基因21进行。对于小基因，"人性化"的苍蝇基因组救援结构可以考虑测试影响非保守氨基酸的人类变异24。总之，当人性化实验不允许对兴趣变体进行功能评估时，应考虑替代策略。

解释负面和积极的结果
如果 1） 参考和变异人类 cDNA 都将苍蝇突变表型的抢救到相似程度，2） 在测试的所有条件下均无差异，则可以假定该变异在功能上无法区分。体内。然而，需要注意的是，这些信息不足以排除感兴趣的变异是非致病性的，因为果蝇测定可能不够敏感或捕获感兴趣的基因/蛋白质的所有潜在功能与人类有关。另一方面，正数据是一个强有力的迹象，表明该变异对蛋白质功能有破坏性后果，但仅凭这些数据仍不足以声称致病性。美国医学遗传学和基因组学院（ACMG）公布了一套标准和准则，将人类疾病相关基因的变异分类为"良性"、"可能良性"、"未知意义变异（VUS）"、"可能致病性"，以及"致病"90。虽然这种分类仅适用于已建立的疾病相关基因，并不直接适用于"具有不确定意义的基因"（GUS）中的变异，但强烈建议所有参与人类变异功能研究的个人报告变体功能时遵守此准则。

提取有用的生物信息时，MO表型不模型人类疾病状况
重要的是要记住，基于表达的功能检测有局限性，特别是因为一些被评分的表型可能与感兴趣的疾病状况没有多大关系。同样，通过救援实验评估的表型可能与相关疾病没有任何直接联系。由于这些实验是在无脊椎动物系统中的内源性背景之外进行的，因此不应被视为疾病模型，而应作为基因功能测试，使用果蝇作为"活试管"。

即使模型生物体不模仿人类疾病状况，在救援实验中使用的可灼性表型通常也能为疾病状况提供有用的生物学见解。"酚类（非明显的同源表型）"91的概念可用于进一步确定果蝇与人类表型之间的潜在分子联系。例如，飞翼、胸、腿和眼睛的形态表型是诺奇信号通路缺陷的优秀表型读出物，这是一种与许多先天性疾病（包括心血管缺陷）相关的进化保护途径在人类62。通过了解果蝇中某些表型背后的分子逻辑，可以识别人类尚未理解的基因和表型之间的隐藏生物联系。

与临床合作者的持续沟通
当与临床医生合作研究患者中一种罕见的变异的机位时，建立牢固的协作关系非常重要。虽然临床和基础生物医学研究人员可能分享对同一基因/基因通路的兴趣，但临床和科学领域之间存在巨大的文化和语言（如医学术语、模型生物体特异性命名法）差距。双方可以通过广泛的沟通建立牢固的、基于信任的关系。此外，双向通信对于建立和维护这种关系至关重要。例如，在代表性结果部分描述的两个病例中，识别具有类似基因型和表型的其他患者，以及随后的功能研究，对于证明感兴趣的变异的致病性至关重要。即使有强大的功能数据，研究人员和临床医生也常常难以说服人类遗传学家，即"n = 1"病例中确定的变异是疾病的真正原因。

一旦MO研究人员发现兴趣的变种是有害的，尽快与临床合作者沟通至关重要，这样他们可以通过与其他临床医生和人类遗传学家联网来积极尝试识别匹配病例。诸如Geno2MP [基因型到孟德尔现象型：华盛顿大学孟地基因组研究中心41中登记的9，650人的去识别数据库;包括被怀疑有遗传性疾病*可以搜索来评估可能患有相同疾病的个人。然后，可以使用消息功能联系首席临床医生。

或者，可以使用GeneMatcher，这是一个匹配网站，供临床医生、基础研究人员和患者共享相同基因的兴趣，以识别携带罕见变异的其他患者。由于 GeneMatcher 是名为 Matchmaker Exchange42的匹配网站的大型集成网络的一部分，因此可以搜索世界各地的其他数据库，包括澳大利亚基因组健康联盟患者档案、广泛匹配盒，在一个单一的GeneMatcher基因提交中，密码，MyGene2和PhenomeCentral。虽然作为"研究人员"可以参与GeneMatcher，但建议基础科学家利用这个网站与他们的临床合作者，因为比赛后与其他临床医生的沟通需要一定的医疗水平专业知识。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢何塞·萨拉萨尔、王朱莉娅和卡伦·舒尔兹博士对手稿的批判性阅读。我们感谢刘宁博士和罗希博士对这里讨论的TBX2变异的功能特性。未诊断疾病网络模型生物筛选中心通过国家卫生研究院（NIH）共同基金（U54 NS093793）提供支持。H.T.C. 得到了NIH[CNCDP-K12和NINDS（1K12 NS098482）]、美国神经学学会（神经科学研究资助）、伯罗斯·惠康基金（医学科学家职业奖）、儿童神经学学会和儿童神经学基金会（） 的进一步支持。PERF Elterman 奖）和 NIH 主任早期独立奖 （DP5 OD026426）。M.F.W.得到了西蒙斯基金会（SFARI奖：368479）的进一步支持。S. Y. 得到了NIH（R01 DC014932）、西蒙斯基金会（SFARI奖：368479）、阿尔茨海默氏症协会（新调查员研究补助金：15-364099）、纳曼家庭基础研究基金和卡罗琳·威斯法律研究基金的支持。分子医学。BCM 的共聚焦显微镜部分由 NIH Grant U54HD083092 支持给智力和发育障碍研究中心 （IDDRC） 神经可视化核心。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

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