En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Summary

El objetivo de este protocolo es esbozar el diseño y la realización de experimentos in vivo en Drosophila melanogaster para evaluar las consecuencias funcionales de las variantes genéticas raras asociadas con las enfermedades humanas.

Abstract

Los avances en la tecnología de secuenciación han hecho que los conjuntos de datos de genoma completo y de exoma completo sean más accesibles tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación en genética humana de vanguardia. Aunque se han desarrollado varios algoritmos in silico para predecir la patogenicidad de las variantes identificadas en estos conjuntos de datos, los estudios funcionales son críticos para determinar cómo las variantes genómicas específicas afectan la función proteica, especialmente por tener un sentido erróneo Variantes. En la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) y otros consorcios de investigación de enfermedades raras, organismos modelo (MO) incluyendo Drosophila, C. elegans,pez cebra y ratones se utilizan activamente para evaluar la función de la enfermedad humana putativa Variantes. Este protocolo describe un método para la evaluación funcional de variantes humanas raras utilizadas en el Centro de Detección de Organismos Modelo Drosophila Core de la UDN. El flujo de trabajo comienza con la recopilación de información humana y MO de múltiples bases de datos públicas, utilizando el recurso web MARRVEL para evaluar si la variante es probable que contribuya a la condición de un paciente, así como diseñar experimentos eficaces basados en disponibles conocimientos y recursos. A continuación, se generan herramientas genéticas (por ejemplo, líneas de ADNc humanos T2A-GAL4 y UAS) para evaluar las funciones de las variantes de interés en Drosophila. Tras el desarrollo de estos reactivos, se pueden realizar ensayos funcionales de dos puntas basados en experimentos de rescate y sobreexpresión para evaluar la función de las variantes. En la rama de rescate, los genes de la mosca endógena se "humanizan" reemplazando el gen de la Drosophila ortopéloga por transgenes humanos de referencia o variante. En la rama de sobreexpresión, las proteínas humanas de referencia y variante se impulsan exógenamente en una variedad de tejidos. En ambos casos, cualquier fenotipo escorable (por ejemplo, letalidad, morfología ocular, electrofisiología) se puede utilizar como lectura, independientemente de la enfermedad de interés. Las diferencias observadas entre los alelos de referencia y de variante sugieren un efecto específico de la variante, y por lo tanto probablemente la patogenicidad. Este protocolo permite evaluaciones rápidas e in vivo de variantes putativas causantes de enfermedades humanas de genes con funciones conocidas y desconocidas.

Introduction

Los pacientes con enfermedades raras a menudo se someten a un arduo viaje conocido como la "odisea diagnóstica" para obtener un diagnóstico preciso¹. Se cree que la mayoría de las enfermedades raras tienen un fuerte origen genético, lo que hace que los análisis genéticos/genómicos sean elementos críticos del estudio clínico. Además de la secuenciación de paneles genéticos candidatos y el análisis de variación de los números de copia basados en microarrays cromosómicos, las tecnologías de secuenciación de todo el exónmio (WES) y de secuenciación del genoma completo (WGS) se han convertido en herramientas cada vez más valiosas en la última década^{2, 3}. Actualmente, la tasa de diagnóstico para la identificación de una variante patógena conocida en WES y WGS es de 25% (mayor en casos pediátricos)^4,5. Para la mayoría de los casos que permanecen sin diagnosticar después del WES/WGS clínico, un problema común es que hay muchos genes y variantes candidatas. La secuenciación de próxima generación a menudo identifica variantes novedosas o ultra raras en muchos genes, y la interpretación de si estas variantes contribuyen a los fenotipos de la enfermedad es un reto. Por ejemplo, aunque se cree que la mayoría de las mutaciones sin sentido o en marcadas en los genes son alelos de pérdida de función (LOF) debido a la descomposición mediada por tonterías de la transcripción codificada, las mutaciones truncadas encontradas en los últimos exones escapan a este proceso y pueden funcionar como alelos benignos o de ganancia de función (GOF)⁶.

Por otra parte, predecir los efectos de un alelo de sentido erróneo es una tarea desalentadora, ya que puede dar lugar a una serie de diferentes escenarios genéticos como se describe por primera vez por Herman Muller en la década de 1930 (es decir, amorfo, hipómorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo o isomorfo)⁷ . Numerosos programas y metodologías en silico se han desarrollado para predecir la patogenicidad de variantes de mala detección basadas en la conservación evolutiva, el tipo de cambio de aminoácidos, la posición dentro de un dominio funcional, la frecuencia del alelo en la población general, y otros parámetros⁸. Sin embargo, estos programas no son una solución integral para resolver el complicado problema de la interpretación de variantes. Curiosamente, un estudio reciente demostró que cinco algoritmos de predicción de patogenicidad variante ampliamente utilizados (Polyphen⁹, SIFT¹⁰, CADD¹¹, PROVEAN¹², Mutation Taster) están de acuerdo en la patogenicidad -80% del tiempo⁸ . En particular, incluso cuando todos los algoritmos están de acuerdo, devuelven una predicción incorrecta de patogenicidad hasta el 11% del tiempo. Esto no sólo conduce a una interpretación clínica defectuosa, sino que también puede disuadir a los investigadores de dar seguimiento a nuevas variantes al enumerarlas falsamente como benignas. Una forma de complementar la limitación actual del modelado de silico es proporcionar datos experimentales que demuestren el efecto de la función variante in vitro, ex vivo (por ejemplo, células cultivadas, organoides) o in vivo.

Los estudios funcionales in vivo de variantes asociadas a enfermedades raras en MO tienen fortalezas únicas¹³ y han sido adoptados por muchas iniciativas de investigación de enfermedades raras en todo el mundo, incluyendo la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) en los Estados Unidos y Rare Redes de Modelos y Mecanismos de Enfermedades (RDMM) en Canadá, Japón, Europa y Australia¹⁴. Además de estos esfuerzos coordinados para integrar a los investigadores de MO en el flujo de trabajo de diagnóstico de enfermedades raras y estudios mecánicos a escala nacional, una serie de estudios de colaboración individuales entre investigadores clínicos y de MO han llevado al descubrimiento y la caracterización de muchos nuevos genes y variantes causantes de enfermedades humanas^82,83,84.

En la UDN, un Centro centralizado de Cribado de Organismos Modelo (MOSC) recibe presentaciones de genes y variantes candidatas con una descripción de la condición del paciente y evalúa si la variante es probable que sea patógena utilizando herramientas informáticas e in vivo Experimentos. En la Fase I (2015-2018) de la UDN, el MOSC comprendía un Núcleo Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] y Zebrafish Core (Universidad de Oregón) que trabajaba en colaboración para evaluar casos. Utilizando el análisis informático y una serie de estrategias experimentales diferentes en Drosophila y pez cebra, el MOSC ha contribuido hasta ahora al diagnóstico de 132 pacientes, identificación de 31 nuevos síndromes^55,descubrimiento de varios nuevos genes de la enfermedad (p. ej., EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) y expansión fenotípica de la enfermedad conocida genes (por ejemplo, CACNA1A²¹,ACOX1²²).

Además de los proyectos dentro de la UDN, los investigadores del MOSC Drosophila Core han contribuido a los nuevos descubrimientos genéticos de la enfermedad en colaboración con los Centros de Genómica Mendeliana y otras iniciativas (por ejemplo, ANKLE2²³, TM2D3 ²⁴, NRD1²⁵, OGDHL²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, DNMBP²⁹) utilizando el mismo conjunto de informática y genética estrategias desarrolladas para la UDN. Dada la importancia de los estudios de MO sobre el diagnóstico de enfermedades raras, el MOSC se amplió para incluir un núcleo de C. elegans y un segundo núcleo de pez cebra (ambos en la Universidad de Washington en St. Louis) para la Fase II (2018-2022) de la UDN.

Este manuscrito describe un protocolo de estudio funcional in vivo que se utiliza activamente en el núcleo de Drosophila UDN MOSC para determinar si las variantes de mala detección tienen consecuencias funcionales en la proteína de interés utilizando moscas transgénicas que expresan Proteínas. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores de MO a trabajar en colaboración con grupos de investigación clínica para proporcionar evidencia experimental de que una variante candidata en un gen de interés tiene consecuencias funcionales, facilitando así el diagnóstico clínico. Este protocolo es más útil en un escenario en el que un investigador de Drosophila es abordado por un investigador clínico que tiene un paciente de enfermedad rara con una variante candidata específica en un gen de interés.

Este protocolo se puede dividir en tres elementos: (1) recopilar información para evaluar la probabilidad de que la variante de interés sea responsable del fenotipo del paciente y la viabilidad de un estudio funcional en Drosophila,(2) herramientas genéticas existentes y el establecimiento de otras nuevas, y (3) realizar estudios funcionales in vivo. El tercer elemento se puede subdividir en dos subelementos en función de cómo se puede evaluar la función de una variante de interés (experimento de rescate o estrategias basadas en sobreexpresión). Es importante tener en cuenta que este protocolo puede adaptarse y optimizarse a muchos escenarios fuera de la investigación de enfermedades monogénicas raras (por ejemplo, enfermedades comunes, interacciones gene-ambiente y pantallas farmacológicas/genéticas para identificar dianas terapéuticas). La capacidad de determinar la funcionalidad y la patogenicidad de las variantes no sólo beneficiará al paciente de interés al proporcionar un diagnóstico molecular preciso, sino que también tendrá impactos más amplios en la investigación científica tanto traslacional como básica.

Protocol

1. Recopilación de información humana y MO para evaluar: Probabilidad de que una variante de interés sea responsable de los fenotipos de enfermedades y viabilidad de estudios funcionales en Drosophila

1. Realizar extensas búsquedas de bases de datos y literatura para determinar si los genes y variantes de interés específicos son buenos candidatos para explicar el fenotipo del paciente de interés. Específicamente, recopile la siguiente información.
   1. Evaluar si el gen de interés ha estado implicado previamente en otros trastornos genéticos (expansión fenotípica del gen de la enfermedad conocida) o se trata de un gen candidato a enfermedad completamente nuevo [variante genética de significación incierta (GVUS)].
   2. Evaluar la frecuencia del alelo de la variante de interés en las bases de datos de enfermedades o de control de la población.
   3. Evaluar si hay variaciones del número de copia (CNV) que incluyen este gen en las bases de datos de enfermedades o controlar las poblaciones.
   4. Evalúe cuáles son los genes ortólogos en diferentes especies de MO, incluyendo ratón, pez cebra, Drosophila, C. elegans, y levadura, luego investigue más a fondo las funciones conocidas y los patrones de expresión de estos genes ortologous.
   5. Evaluar si la variante de interés está presente en un dominio funcional de la proteína y si el aminoácido de interés se conserva evolutivamente.
      NOTA: Las respuestas a estas cinco preguntas (pasos 1.1.1-1.1.5) se pueden obtener accediendo a una serie de bases de datos humanas y MO individualmente o utilizando el recurso web MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (véase la Tabla de 1 para los recursos en línea)³⁰, que se describe en profundidad en un artículo³¹adjunto. Consulte la sección de resultados representativos para obtener ejemplos específicos. El sitio web³² de Monarch Initiative y Gene2Function³³ también proporcionan información útil.
2. Recopile información adicional para evaluar más a fondo si la variante es un buen candidato a la enfermedad desde el punto de vista de la estructura y la función proteica.
   1. Evalúe si se prevé que la variante de interés sea perjudicial en función de los algoritmos de predicción de sislicos.
      NOTA: Los algoritmos de patogenicidad variante han sido desarrollados por muchos grupos de investigación en los últimos 15 años, y algunos también se muestran en los resultados de búsqueda de MARRVEL. Los programas más recientes, incluidos los dos enumerados a continuación, combinan algoritmos de redicción de patogenicidad de múltiples variantes y enfoques de aprendizaje automático para generar una puntuación de patogenicidad. Para obtener más información sobre los algoritmos de predicción de variantes y su rendimiento, consulte Ghosh, et al.⁸. (i) CADD (agotamiento combinado dependiente de la anotación): herramienta de anotación integrativa construida a partir de más de 60 características genómicas, que proporciona puntuaciones para SNV humanos, así como inserciones y eliminaciones cortas¹¹. (ii) REVEL (aprendiz de conjunto de variantes de exoma raros): combina múltiples algoritmos de patogenicidad variante (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP y phastCons) para proporcionar una puntuación integrada para todas las posibles variantes de mala sensatez humana³⁴.
   2. Determinar si se ha demostrado que el gen/proteína humana de interés o sus ortologos MO interactúan genética o físicamente con genes/proteínas previamente vinculados a enfermedades genéticas. Si es así, evalúe si el paciente de interés presenta fenotipos superpuestos con estos trastornos.
      NOTA: Se han desarrollado varias herramientas para analizar las interacciones genéticas y proteínas-proteínas basadas en publicaciones de MO, así como proteómicaa a gran escala de múltiples pantallas de especies. STRING (herramienta de búsqueda para instancias recurrentes de genes vecinos)³⁵: una base de datos para interacciones proteína-proteína conocidas y predichas. Integra conjuntos de datos de interacción genética y coexpresión, así como herramientas de extracción de texto para identificar genes y proteínas que pueden funcionar juntos en una variedad de organismos. MIST (herramienta de búsqueda de interacción molecular)³⁶: una base de datos que integra datos genéticos y de interacción proteína-proteína de MA genéticas básicas (levadura, C. elegans, Drosophila,pez cebra, rana, rata, ratón) y humanos. También se muestra la predicción de interacciones inferidas a partir de genes/proteínas ortologos (interlogs).
   3. Determinar si la estructura 3D de la proteína de interés se ha resuelto o modelado. Si es así, determine dónde se asigna la variante de interés en relación con los dominios funcionales clave.
      NOTA: Las estructuras proteicas resueltas por cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía crioelectrónica se pueden encontrar en bases de datos públicas, incluyendo el PDB (banco de datos de proteínas) y EMDatabank³⁷. Aunque no existe una base de datos única para estructuras proteicas predichas/modeladas, haydisponibles para quelos usuarios realicen el modelado de proteínas.
3. Comunicarse con colaboradores clínicos para discutir la información recopilada de los análisis informáticos en las secciones 1.1-1.2. Si los colaboradores clínicos también sienten que la variante y el gen de interés son buenos candidatos para explicar los fenotipos observados en el paciente, proceda a la sección 2. Si hay preguntas específicas sobre el genotipo y el fenotipo del paciente, discuta con los colaboradores clínicos antes de seguir adelante.
   NOTA: Si se considera que es poco probable que la variante de interés explique el fenotipo de interés (por ejemplo, una variante idéntica que se encuentra en alta frecuencia en la población de control), discuta esto con los colaboradores clínicos para determinar si la variante es una buena candidato, ya que puede no haber la experiencia adecuada para interpretar fenotipos clínicos.

2. Reunir herramientas genéticas existentes y establecer nuevos reactivos para estudiar una variante específica de interés

NOTA: Una vez que la variante de interés se ha determinado un buen candidato para perseguir experimentalmente, reunir o generar reactivos para realizar estudios funcionales in vivo. Para los estudios funcionales descritos en este protocolo, se necesitan algunos reactivos clave de Drosophila melanogaster: 1) cepas transgénicas de ADN humanas reguladas por secuencia de activación ascendente que llevan la secuencia de referencia o variante, 2) una pérdida de función alelo de un gen de mosca de interés, y 3) una línea GAL4 que se puede utilizar para experimentos de rescate.

1. Generación de construcciones de ADNc humanos de la UAS y moscas transgénicas
   1. Identificar y obtener las construcciones humanas apropiadas. Muchos clones están disponibles en la MGC (colección de genes de mamíferos)⁴³ y se pueden comprar en vendedores seleccionados. Para los genes que se empalman alternativamente, compruebe qué adNC isoforme corresponde al uso de Ensembl o RefSeq.
      NOTA: Muchos cDNA están disponibles en reactivos compatibles con el sistema de clonación mediados por recombinación^44,lo que simplifica el paso de subclonación. Los cDNA pueden venir en un formato "abierto (sin stop codon)" o "cerrado (con codón de parada endógeno o artificial)". Mientras que los clones abiertos permiten el etiquetado C'de proteínas que son útiles para bioquímicos (por ejemplo, mancha occidental) y ensayos biológicos celulares (por ejemplo, inmunomanchado) para monitorear la expresión de la proteína de interés, puede interferir con la función proteica en algunos casos.
   2. Subclone la referencia y la variante cDNA en el vector transgénico Drosophila. Utilice el sistema de transgénesis mediado por C31, ya que esto permite que los CDNA de referencia y variante se integren en la misma ubicación en el genoma^45. Para este proyecto, el NÚCLEO drosophila MOSC utiliza rutinariamente el vector pGW-HA.attB⁴⁶.
      NOTA: Si el ADNc humano está en vectores compatibles con el sistema de clonación mediado por recombinas (por ejemplo, pDONR221, pENTR221), vaya a la sección 2.1.4, que explica las reacciones LR para subclonar los CDNA en pGW-HA.attB.
      1. Si el ADNc humano no está en un plásmido compatible con un sistema de clonación mediado por recombinas, subclone los CDNAs humanos en un vector de entrada Gateway utilizando técnicas biológicas moleculares estándar (un ejemplo de dicho protocolo se documenta a continuación).
         1. Realice un PCR de voladizo para introducir los brazos attB1 y attB2. La imprimación directa debe tener la secuencia attB1 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTTCACC-3' seguida de los primeros 22 nucleótidos del ADNC objetivo. La imprimación inversa debe tener la secuencia attB2 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' seguida del complemento inverso de los últimos 25 nucleótidos del ADNc de interés. Excluya el codón de parada del ADNc, luego agregue una etiqueta C' si desea "abrir" un clon, o agregue un codón stop para "cerrar" un clon.
         2. Preparar una mezcla de PCR de alta fidelidad de 100 ml que consista en 50 l de mezcla maestra de PCR de alta fidelidad, 36 ml de agua destilada, 5 l de cada imprimación delantera e inversa enumerada en el paso 2.1.2.1.1 diluido a 10 oM, y 4 l de ADNc objetivo (150 ng/L).
         3. Realice PCR utilizando el protocolo de mutagénesis estándar para agregar brazos attB1 y attB2 al ADNc de interés. Las condiciones variarán dependiendo de la construcción y las variantes de interés.
         4. Aísle el ADNc objetivo con brazos de homología añadidos a través de electroforesis de gel y extracción de gel. Crear 1% gel de agarosa y realizar electroforesis utilizando métodos estándar. Infórmele la banda que corresponde al tamaño del ADNc más la longitud adicional de los brazos de homología. Extraer ADN del gel a través de los métodos estándar⁹⁵. Los kits de extracción de gel comercial están disponibles en varias empresas.
         5. Realizar una reacción de recombinación in vitro basada en el protocolo de clonación mediada por recombinas de acuerdo con el sistema que se utiliza.
         6. Transforme la mezcla de reacción BP en células de E. coli químicamente competentes. Las celdas competentes se pueden hacer internamente o comprar a proveedores comerciales. Cultivo de las células transformadas durante la noche en una placa LB que contiene antibióticos apropiados para la selección de colonias. Al día siguiente, seleccione varias colonias y cultivarlas en cultivos líquidos independientes durante la noche.
         7. Aislar el ADN de los cultivos nocturnos a través de miniprep. Sanger secuencia los clones positivos para asegurarse de que el ADNc tiene la secuencia correcta⁹⁶. Mantener las células de los cultivos que son positivos para la secuencia deseada en 25% glicerol almacenado a -80 oC.
   3. Realice la mutagénesis dirigida por el sitio para introducir la variante de interés en el plásmido Gateway con el ADNC humano de referencia^97. Un protocolo detallado para este método se puede encontrar en el sitio web del proveedor^48,49. Validar la presencia de la variante en el plásmido mutado a través de la secuenciación de Sanger de todo el marco de lectura abierto (ORF) para asegurarse de que no hay variantes adicionales introducidas a través de este paso de mutagénesis.
   4. Subclone los CDNAs humanos de referencia y variante en el plásmido del donante (plásmidos de puerta de enlace con sitios attL1 y attL2) en el plásmido transgénico (por ejemplo, pGW-HA.attB con sitios attR1 y attR2) a través de una reacción de LR clonase.
      NOTA: Hay vectores UAS-C31 diseñados para la subclonación basada en enzimas de restricción convencional (por ejemplo, pUAST.attB⁵⁰) si se prefiere subclonar cDNas humanos a través de métodos de enzimas de restricción.
   5. Seleccione los sitios de acoplamiento C31 en los que integrar los transgenes de ADNc humanos UAS. Varios laboratorios han generado varios centros de atraque y están disponibles públicamente en los centros de stock^50,52,53.
      NOTA: Dado que es conveniente tener el transgén humano en un cromosoma que no contiene el ortolog mosca del gen de interés, se recomienda utilizar un segundo sitio de acoplamiento de cromosomas [VK37 (BDSC stock #24872] cuando el ortolog de la mosca está en la X , cromosomas terceros o cuartos, y utilizar un tercer sitio de acoplamiento de cromosomas [VK33 (BDSC stock #24871] cuando el ortolog de mosca está en el segundo cromosoma.
   6. Inyectar construcciones de ADNc humanos de la UAS en moscas que expresen una integrasa de C31 en su línea germinal (p. ej., vas-C31, nos-C31).
      NOTA: La microinyección se puede realizar internamente o enviarse a instalaciones centrales o entidades comerciales para la transgénesis. El protocolo detallado para generar moscas transgénicas se puede encontrar en el libro citado capítulo⁵¹.
   7. Establecer cepas transgénicas estables de los embriones inyectados. Inyectar 100-200 embriones por construcción⁹⁴. En la Figura 1Ase muestra un esquema de cruce representativo para una inserción transgénica en un segundo sitio de acoplamiento cromosómico (VK37). Consulte los libros citados^54,55 para obtener información básica sobre la genética Drosophila.
2. Obtener o generar una línea T2A-GAL4 que facilite ensayos funcionales basados en rescates (véase la Figura 2 y la sección 3.1).
   NOTA: Esta línea servirá para dos propósitos. En primer lugar, la mayoría de las líneas T2A-GAL4 probadas se comportan como alelos LOF fuertes al funcionar como un alelo de trampa genética. En segundo lugar, las líneas T2A-GAL4 funcionan como un controlador GAL4 que permite la expresión de construcciones UAS (por ejemplo, UAS-GFP, CDNAs humanos UAS) bajo los elementos de regulación endógena del gen de interés^56,57 (Figura2A-C).
   1. Busque en las colecciones de acciones públicas las líneas T2A-GAL4 disponibles, incluido el Proyecto de Disrupción Genética drosophila (PIB)^58, en el que se han generado⁵⁹líneas T2A-GAL4. Estas cepas están actualmente disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) y se pueden buscar a través de los sitios web del PIB y BDSC.
   2. Si no hay disponible una línea T2A-GAL4 para el gen de interés fly, compruebe si hay disponible una línea MiMIC (cassette de integración mediada porMinos)adecuada para su conversión en una línea T2A-GAL4 mediante el intercambio de casetes mediados por recombinas (RMCE) )⁶⁰ (Figura 2A).
      NOTA: RMCE permite que los elementos Intronic MiMIC que se encuentran entre dos exons de codificación se conviertan en una línea T2A-GAL4 a través de la microinyección de una construcción de donante (un ejemplo de un esquema de cruce se muestra en la Figura 1B)o en la serie de cruces, como se describe en detalle^57,59.
   3. Si una línea T2A-GAL4 no está disponible y no existe un MiMIC intrónico de codificación adecuado, explore la posibilidad de generar una línea T2A-GAL4 a través del sistema CRIMIC (cassette de integración mediado por CRISPR)⁵⁹.
      NOTA: Esta metodología utiliza la escisión de ADN mediada por CRISPR y la reparación dirigida por homología (HDR) para integrar un casete similar a MiMIC en un intrón de codificación en un gen de interés.
   4. Si el gen de interés carece de un intrón grande (>150 bp) o no tiene intrones, intente llamar a un transgén GAL4 en el gen de la mosca con el sistema CRISPR/Cas9 utilizando HDR como se describe^20,61,62.
      NOTA: Si la generación de un alelo de knock-in T2A-GAL4 o GAL4 es difícil, intente realizar experimentos de rescate utilizando estos alelos preexistentes o líneas RNAi y controladores GAL4 ubicuos o específicos de tejido como se describe⁹² (REF).

3. Realización de Análisis Funcional de La Variante Humana de Interés In Vivo en Drosophila

NOTA: Realizar un análisis basado en el rescate (sección 3.1) así como estudios de sobreexpresión (sección 3.2) utilizando las herramientas recogidas o generadas en la sección 2 para evaluar las consecuencias de la variante de interés in vivo en Drosophila. Considere la posibilidad de utilizar ambos enfoques, ya que los dos son complementarios.

1. Realización de análisis funcionales a través de experimentos basados en rescate
   Nota: Experimentos heterotemos basados en rescates enDrosophilael uso de proteínas humanas determina si la función molecular de los dos genes ortoxólogos se han conservado a lo largo de 500 millones de años de evolución. También evalúan la función de la variante en el contexto de la proteína humana⁶³. Aunque no se ha notificado un análisis sistemático que estudia cientos de pares de genes, varias docenas de genes humanos y mamíferos (por ejemplo, ratones) son capaces de reemplazar la función deDrosophilaGenes¹³.
   1. En el enfoque basado en el rescate, primero determine si hay fenotipos obvios, escorables y reproducibles en mutantes LOF en el ortolog de la mosca antes de evaluar las funciones de las variantes.
      NOTA: La literatura anterior sobre el gen de la mosca es un buen lugar para la mina de datos primero, y se puede encontrar utilizando bases de datos como FlyBase y PubMed. Bases de datos adicionales como MARRVEL, Monarch Initiative y Gene2Funcion también son útiles para recopilar esta información.
   2. Realizar un estudio global de fenotipos escorables en alelo homocigoto y hemizygous (alelo T2A-GAL4 sobre un animal con deficiencia cromosómica definida molecularmente, especialmente si el alelo T2A-GAL4 es la primera mutación que se caracteriza por un gen específico. Evaluar fenotipos como la letalidad, la esterilidad, la longevidad, morfológico (por ejemplo, el tamaño y la morfología del ojo) y el comportamiento (por ejemplo, cortejo, vuelo, escalada y defectos de sensibilidad a la explosión).
      NOTA: Si no hay fenotipos principales identificados en esta pantalla primaria, se pueden utilizar fenotipos más sutiles como defectos neurológicos medidos por grabaciones electrofisiológicas si son altamente reproducibles y específicos. Por ejemplo, los estudios funcionales con electroretinograma (ERG) se describen en el paso 3.2.3. Si no se detecta ningún fenotipo que se puede escorar, vaya a la sección 3.2 y realice el estudio funcional basado en sobreexpresión.
   3. Una vez que se identifica un fenotipo scorable en el mutante LOF mosca, pruebe si el ADNC humano de referencia puede reemplazar la función del ortolog mosca al intentar usar ADNc humano para rescatar la línea de mosca mutante. El ensayo fenotípico que se realizará aquí depende de los resultados del paso 3.1.2 y será específico del gen que se está estudiando.
      NOTA: Si la "humanización" del gen de la mosca tiene éxito, ahora hay una plataforma para comparar la eficiencia del rescate para la variante de interés en comparación con la contraparte de referencia. El rescate visto con ADNc humano de referencia no tiene que ser perfecto. El rescate parcial del fenotipo mutante mosca utilizando un ADNC humano todavía proporciona un punto de referencia para realizar estudios comparativos utilizando la cepa de ADNC humano variante.
   4. Usando el sistema de ensayo seleccionado en el paso 3.1.2, compare el rescate observado con el ADNc humano de referencia con el rescate observado con la variante de ADNC humano para determinar si la variante de interés tiene consecuencias en el gen de interés.
      NOTA: Si la variante de ADNC humano funciona peor que el alelo de referencia, esto sugiere que la variante de interés es perjudicial para la función proteica. Si la variante y la referencia no se pueden distinguir funcionalmente, entonces 1) el alelo puede ser un isomorfo (una variante que no afecta a la función proteica) o 2) el ensayo no es lo suficientemente sensible como para detectar diferencias sutiles.
   5. Si se encuentra que la variante es un alelo nocivo, evalúe más la expresión y la localización intracelular de las proteínas de referencia y variante de interés in vivo a través de la mancha occidental, la tinción de inmunofluorescencia u otros métodos^93.
      NOTA: Si el ADNC humano UAS se genera a partir de un clon abierto en un vector pGW-HA.attB, utilice un anticuerpo anti-HA para realizar estos ensayos bioquímicos y celulares. Si el clon original es un clon cerrado, pruebe si se pueden utilizar anticuerpos comerciales contra las proteínas humanas para estos ensayos. Una diferencia en los niveles de expresión y la localización intracelular puede revelar cómo la variante de interés afecta la función proteica.
2. Realización de análisis funcionales a través de estudios de sobreexpresión
   NOTA: La sobreexpresión ubicua o específica del tejido de los CDNa humanos en moscas de otro tipo salvaje puede proporcionar información que es complementaria a los experimentos basados en rescates que se tratan en la sección 3.1. Mientras que los ensayos basados en rescate están diseñados principalmente para detectar variantes LOF (amorfo, hipocófico), los ensayos basados en sobreexpresión también pueden revelar variantes de ganancia de función (GOF) que son más difíciles de evaluar (hipermórficas, antimórficas, neomórficas).
   1. Seleccione un conjunto de controladores GAL4 para sobreexpresar los CDNAs humanos de interés. Una serie de controladores GAL4 ubicuos y específicos de tejido/etapa están disponibles en los centros de valores públicos (por ejemplo, BDSC), algunos de los cuales se utilizan con más frecuencia que otros. Primero se centran en los conductores ubicuos y fenotipos fácilmente quelables (letalidad, esterilidad, fenotipos morfológicos), luego pasar a los factores específicos del tejido y fenotipos más específicos.
      NOTA: Valide la expresión de controladores GAL4 con una línea de reportera (por ejemplo, UAS-GFP) para confirmar patrones de expresión antes de su uso en los experimentos.
   2. Expresar los CDNAs humanos de referencia y variante utilizando el mismo conductor bajo la misma condición (por ejemplo, temperatura) cruzando 3-5 hembras vírgenes de la línea GAL4 (por ejemplo, ey-GAL4 para la expresión de disco imaginaal ocular) con 3-5 moscas macho de las líneas UAS [por ejemplo, UAS-TBX2(+) o UAS-TBX2(p.R305H) para el ejemplo mostrado en la sección 4.2] en un solo vial.
      1. Transfiera las cruces cada 2-3 días para que muchos animales se edivinen de una sola cruz.
   3. Examine la progenie y detecte cualquier diferencia entre las cepas de referencia y variantes (por ejemplo, morfología ocular) bajo un microscopio de disección. Imagen de las moscas usando una cámara conectada a un microscopio de disección para documentar el fenotipo.
      NOTA: Si un fenotipo sólo se ve en la referencia pero no en la línea variante, entonces la variante puede ser un amorfo o un alelo hipomórfico fuerte. Si el fenotipo se ve en ambos genotipos pero la referencia causa un defecto más fuerte, entonces la variante puede ser un alelos hipomórfico de leve a débil. Si la referencia no muestra un fenotipo o sólo exhibe un fenotipo débil pero la variante muestra un defecto fuerte, entonces la variante puede ser un alelo GOF.
   4. Si un fenotipo no se ve en condiciones de cultivo estándar (RT o a 25 oC, establezca las cruces a diferentes temperaturas que ostan entre 18 y 29 oC, ya que se sabe que el sistema UAS/GAL4 es sensible a la temperatura^64,65). Típicamente, la expresión de los transgenes UAS es mayor a temperaturas más altas.
3. Realizar estudios funcionales adicionales relacionados con los genes y la proteína de interés.
   Nota: Además de examinar defectos generales, se puede seleccionar un sistema de ensayo para sondear las funciones moleculares del gen y la variante. En un ejemplo discutido en los resultados representativos (TBX2registros ERG se utilizaron para determinar los efectos de la variante en la función del fotorreceptor, ya que el gen de la mosca de interés (bifid) se ha estudiado extensamente en el contexto del desarrollo del sistema visual. Protocolos detallados para ERG enDrosophilase pueden encontrar como se publicó anteriormente^66,67,68.
   1. Generar moscas para probar defectos funcionales en el sistema visual. Hembras vírgenes cruzadas de la línea Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 a machos con transgenes cDNA humanos UAS de referencia o variante para expresar las proteínas humanas de interés en los fotorreceptores R1-R6.
      NOTA: Cruzar 3-5 hembras vírgenes a 3-5 moscas macho en un solo vial y transferir las cruces cada 2-3 días para tener muchos animales que econtean de una sola cruz. Todos los cruces deben mantenerse en una incubadora a la temperatura experimental para obtener resultados consistentes.
   2. Una vez que las moscas comiencen a cerrar (a 25 oC, 10 días después de establecer la cruz inicial), recopile la progenie (Rh1-GAL4/+; UAS-humano cDNA/+) en viales frescos y colocarlos de nuevo en el conjunto de la incubadora a la temperatura experimental durante 3 días adicionales para que el sistema visual madure.
      NOTA: Aunque ERG se puede realizar en moscas de 1-2 días de edad, las moscas recién cerradas pueden tener grandes fluctuaciones en su señal ERG. Si se desea examinar un fenotipo dependiente de la edad, estas moscas pueden envejecer durante varias semanas siempre y cuando se transfieran regularmente (por ejemplo, cada 5 días) a un vial nuevo para evitar ahogarse en alimentos húmedos.
   3. Preparar las moscas para la grabación ERG anestesiando primero las moscas usando CO₂ o colocándolas en un vial sobre hielo. Pegue suavemente un lado de la mosca en un portaobjetos de microscopio de vidrio para inmovilizarlos.
      NOTA: Múltiples moscas de referencia y variantes se pueden pegar en una sola diapositiva. Coloque todas las moscas aproximadamente en la misma orientación con un ojo accesible para el electrodo de grabación. Tenga cuidado de no poner pegamento en el ojo y dejar la probóscía libre.
   4. Prepare los electrodos de grabación y de referencia. Coloque un capilar de vidrio de 1,2 mm en un tirador de agujay actívelo. Romper el tubo capilar para obtener dos electrodos cónicos afilados. Los electrodos resultantes deben ser huecos y tener diámetros finales de <0,5 mm.
   5. Llenar los capilares con solución salina (100 mM NaCl), asegurándose de que no haya burbujas de aire. Deslice los capilares de vidrio sobre el electrodo de alambre de plata (tanto el electrodo de grabación como el electrodo de referencia, consulte la Figura4) y fije los capilares en su lugar.
   6. Configure el estimulador y el amplificador. Una configuración detallada se puede encontrar en Lauwers, et al.⁶⁷. La configuración de UDN Drosophila MOSC consta de equipos enumerados en la sección de materiales.
      1. Ajuste el amplificador a filtro de paso alto de 0,1 Hz, filtro de paso bajo de 300 Hz y ganancia de 100.
      2. Ajuste el estimulador a 1 s de período, 500 ms de ancho de pulso, retardo de pulso de 500 ms, modo de funcionamiento y 7 amperios.
      3. Prepare la fuente de luz para la fotoestimulación. Utilice una fuente de luz halógena para activar los fotorreceptores de mosca.
      4. Prepare el software de grabación en un ordenador conectado a la configuración de ERG. Cree un protocolo de estimulación con el modelo de adquisición "eventos de longitud fija" y 20 s de duración.
   7. Aclimatar las moscas a la oscuridad completa antes de iniciar grabaciones ERG. Coloque las moscas en completa oscuridad durante al menos 10 minutos antes de comenzar el experimento.
      NOTA: Dado que las moscas no pueden detectar la luz roja, utilice una fuente de luz roja durante el período de habituación oscura.
   8. Coloque la corredera que contiene las moscas en el aparato de grabación y mueva los micromanipuladores que llevan los electrodos de referencia y de grabación a un punto cercano a la mosca de interés en la diapositiva. Observe la punta del electrodo y coloque cuidadosamente el electrodo de referencia en el tórax de la mosca (penetrar en la cutícula). Una vez insertado el electrodo de referencia de forma estable, coloque el electrodo de grabación en la superficie del ojo.
      NOTA: La posición exacta de este electrodo de referencia no tiene un impacto importante en la señal ERG. El electrodo de grabación debe colocarse en la superficie del ojo ya que ERG es una grabación potencial de campo en lugar de una grabación intracelular. La cantidad adecuada de presión aplicada al electrodo de registro causa un pequeño hoyuelo sin penetrar en el ojo.
   9. Apague todas las luces durante otros 3 minutos para aclimatar las moscas al entorno oscuro.
   10. Configure el software de grabación e inicie la grabación de la señal. Si utiliza una fuente de luz halógena con obturador manual, encienda la fuente de luz con el obturador cerrado. Comience a grabar la señal.
   11. Exponga los ojos de la mosca a la luz abriendo y cerrando el obturador cada 1 s durante los 20 s de duración de una sola carrera.
       NOTA: El encendido/apagado de la fuente de luz halógena se puede controlar manualmente o programar para automatizarse mediante una fuente de luz LED blanca. El ERG más robusto y fiable se puede obtener mediante el uso de una fuente de luz halógena en comparación con un LED de luz blanca, probablemente debido al espectro de luz más amplio emitido por la fuente de luz halógena.
   12. Registre los ERG de todas las moscas que se montan en el portaobjetos de vidrio. Realizar ERGs de 15 moscas por genotipo por condición.
       NOTA: Algunos parámetros que se pueden modificar para encontrar una condición que muestre diferencias sólidas entre los CDNa de referencia y las variantes pueden incluir temperatura, edad o condiciones ambientales (por ejemplo, criados en ciclos de luz oscura o luz/oscuridad constantes).
   13. Realizar análisis de datos: compare los ERG de la referencia, la variante y los controles para determinar si hay diferencias. Evalúe los datos ERG en busca de cambios en los transitorios, la despolorización, los off-transients y la repolarización⁶⁹ (Figura4B).
       NOTA: La despolarización y la repolarización reflejan la activación e inactivación de la cascada de fototransducción dentro de los fotorreceptores, mientras que las actividades de las células postsinápticas que reciben señales de los fotorreceptores. La disminución de la amplitud y la cinética alterada de la repolarización a menudo se asocian en defectos con la función y la salud del fotorreceptor, mientras que los defectos en los transitorios y de encendido se encuentran en mutantes con desarrollo, función o mantenimiento ^{de sinapsis defectuosa 70}.
   14. Tras la identificación de las diferencias en los fenotipos ERG con sobreexpresión de referencia frente a cDNa humanos variante, determinar si este fenotipo electrofisiológico está asociado con defectos estructurales y ultraestructurales en los fotorreceptores y sus sinapsis mediante la realización de análisis histológicos y microscopía electrónica de transmisión.
       NOTA: Se ha descrito previamente 69 se ha descrito previamente un debate adicional sobre la interpretación de los defectos del ERG y el análisis estructural/ultraestructural⁶⁹.

Representative Results

Estudio funcional de la variante de novo Missense en EBF3 Vinculado a Fenotipos de Neurodesarrollo
En un hombre de 7 años con fenotipos de neurodesarrollo incluyendo hipotonía, ataxia, retraso del desarrollo global y trastorno expresivo del habla, médicos y genetistas humanos en el Proyecto de Institutos Nacionales de Enfermedades No Diagnosticadas de Salud (UDP) identificó una variante de olfato de novo (p.R163Q) en EBF3 (Early B-Cell Factor 3)¹⁵, un gen que codifica un factor de transcripción de la familia COE (Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor). Este caso fue presentado al MOSC udN en marzo de 2016 para estudios funcionales. Para evaluar si este gen era un buen candidato para este caso, el MOSC reunió información genética y genómica humana de OMIM, ClinVar, ExAC (ahora ampliado a gnomAD), Geno₂MP, DGV y DECIPHER. Además, los genes ortoxólogos en especies clave de MO se identificaron utilizando la herramienta DIOPT. A continuación, se obtuvo la expresión génica y la información fenotípica de bases de datos MO individuales (por ejemplo, Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI). Los análisis informáticos realizados para EBF3 y otros estudios pioneros en el MOSC UDN constituyeron la base para el desarrollo posterior del recurso MARRVEL^30.

La información recopilada utilizando esta metodología indicaba que EBF3 no estaba asociada con ningún trastorno genético humano conocido en el momento del análisis, y se llegó a la conclusión de que la variante p.R163Q era un buen candidato basado en la siguiente información. (1) Esta variante no se había notificado previamente en las bases de datos de población de control (ExAC) y en la base de datos de población de enfermedades (Geno₂MP), lo que indica que se trata de una variante muy rara. (2) Basado en ExAC, la puntuación pLI (probabilidad de intolerancia LOF) de este gen es de 1.00 (puntuaciones pLI oscilan entre 0.00-1.00). Esto indica que hay una presión selectiva contra las variantes LOF en este gen en la población general y sugiere que la haploinsuficiencia de este gen puede causar enfermedad. Para obtener más información sobre la puntuación pLI y su interpretación, un artículo tutorial de MARRVEL adjunto en JoVE³¹ y documentos relacionados proporcionan detalles^30,71.

La variante p.R163Q también se consideró un buen candidato porque (3) se encuentra en el dominio de unión al ADN evolutivamente conservado de esta proteína, lo que sugiere que puede afectar la unión al ADN u otras funciones proteicas. (4) El residuo p.R163 se conserva evolutivamente de C. elegans y Drosophila a los seres humanos, lo que sugiere que puede ser crítico para las proteínas funcionales en todas las especies. (5) Los ortologs EBF3 se han implicado en el desarrollo neuronal en múltiples MO⁷² incluyendo C. elegans⁷³, Drosophila⁷⁴, Xenopus⁷⁵, y ratones⁷⁶. (6) Durante el desarrollo cerebral en ratones, se ha demostrado que Ebf3 funciona aguas abajo de Arx ( Caja dehogar relacionada con Aristaless)⁷⁷, un gen asociado con varias epilepsias y discapacidad intelectual síndromes en humanos⁷⁸. Por lo tanto, estos datos juntos sugieren que EBF3 es muy probable que sea crucial para el neurodesarrollo humano y que la variante p.R163Q puede tener consecuencias funcionales.

Para evaluar si p.R163Q afecta a la función EBF3, se generó una línea T2A-GAL4 para nudo (kn;el ortolog fly del humano EBF3⁷⁹⁾a través de RMCE de una inserción MiMIC intrónica de codificación¹⁵. La línea Kn^T2A-GAL4 es recesiva letal y no pudo complementar la letalidad de un alelo kn clásico (kn^col-1), así como la deficiencia definida molecularmente que cubre kn [Df(2R)BSC429]⁸⁰ . Los patrones de expresión del GAL4 también reflejaban patrones previamente reportados de expresión kn en el cerebro, así como en el disco imaginaal del ala^15. Las moscas transgénicas de la UAS se generaron entonces para permitir la expresión de referencia y variante humana EBF3 cDNA, así como de tipo salvaje mosca kn cDNA. Las tres proteínas fueron etiquetadas con una etiqueta C-terminal 3xHA. Es importante destacar que los transgenes de referencia de la mosca de tipo salvaje de la UAS (kn⁺) o el ser humano de referencia EBF3 (EBF3⁺) rescataron la letalidad de kn^T2A-GAL4/Df(2R)BSC429 en una medida similar ( Figura 3C, panel izquierdo)⁸¹.

Por el contrario, el transgén EBF3 humano de UAS con la variante p.R163Q (EBF3^p.R163Q) no fue capaz de rescatar a este mutante, lo que sugiere que la variante p.R163Q afecta a la función EBF3 in vivo¹⁵. Curiosamente, cuando se evaluó utilizando un anticuerpo anti-HA, la proteína EBF3^p.R163Q se expresó con éxito en los tejidos moscas, y sus niveles y localización subcelular (principalmente nuclear) fueron indistinguibles de los de EBF3⁺ y Kn⁺. Esto sugiere que la variante no está causando un fenotipo LOF debido a la inestabilidad de las proteínas o la localización incorrecta. Para evaluar aún más si la variante p.R163Q afectó a la función de activación transcripcional de EBF3, se realizó un ensayo de reportero basado en luciferasa en las células HEK293¹⁵. Este experimento en células humanas cultivadas reveló que la variante EBF3^p.R163Q no pudo activar la transcripción de las construcciones de reporteros, apoyando el modelo LOF obtenido de experimentos Drosophila.

Paralelamente a los estudios experimentales, las colaboraciones con médicos, genetistas humanos y asesores genéticos en BCM llevaron a la identificación de dos individuos adicionales con síntomas similares. Un paciente llevaba la variante p.R163Q idéntica, y otro llevaba una variante de mal sentido que afectaba al mismo residuo (p.R163L). La variante p.R163L tampoco pudo rescatar al mutante de la mosca^{kn 93} sugiriendo que este alelo también afectó la función EBF3. Curiosamente, este trabajo fue publicado de forma posterior con dos estudios independientes de genética humana que reportaron individuos adicionales con variantes de novo missense, nonsense, frameshift y splicing en EBF3 vinculadas a variantes similares fenotipos de neurodesarrollo^82,83. Posteriormente, se publicaron tres documentos adicionales en los que se informaban de casos adicionales de variantes de novo EBF3 y de eliminación del número de copia^84,85,86. Este novedoso síndrome del neurodesarrollo se conoce ahora como la hipotonía, la ataxia y el síndrome de desarrollo retardado (HADDS, MIM #617330) en la herencia mendeliana en línea en el hombre (OMIM, una base de datos autorizada para las relaciones genotipo-fenotipo en humanos).

Estudio funcional de la variante de missense heredada dominante en TBX2 vinculado a un trastorno sindrómico cardiovascular y esquelético del desarrollo
En una familia pequeña afectada con espectros superpuestos de dismorfismo craneofacial, anomalías cardíacas, malformación esquelética, deficiencia inmune, anomalías endocrinas y deterioro del desarrollo, el Sitio Clínico UdN Duke identificó una variante de sentido mal sentido (p.R20Q) en TBX2 que se separa con fenotipos de enfermedad⁸⁷. Tres (hijo, hija, madre) de los cuatro miembros de la familia se ven afectados por esta condición, y el hijo exhibió el fenotipo más grave. Clínicamente, se encontró con un diagnóstico de "síndrome completo de DiGeorge", una condición a menudo causada por la haploinsuficiencia de TBX1. Si bien no se identificaron mutaciones en tAQUIfi1 en esta familia, los médicos y genetistas humanos se centraron en una variante en TBX2, ya que estudios previos en ratones mostraron que estos genes tienen funciones superpuestas durante el desarrollo⁸⁸ . TBX1 y TBX2 pertenecen a la familia T-box (TBX) de factores de transcripción que pueden actuar como represores transcripcionales, así como activadores dependiendo del contexto.

Anteriormente, las variantes en 12 de los 17 miembros de los genes de la familia TBX estaban vinculadas a enfermedades humanas. El MOSC decidió perseguir experimentalmente esta variante sobre la base de la siguiente información recopilada a través de MARRVEL y otros recursos. (1) Esta variante se notificó sólo una vez en una cohorte de individuos de "control" de 90.000 euros en gnomAD (esta variante se filtró en una vista predeterminada, probablemente debido a lecturas de baja cobertura). Teniendo en cuenta la presentación fenotípica más leve de la madre, esto todavía puede ser considerado como una variante rara que puede ser responsable de los fenotipos de la enfermedad. (2) Las puntuaciones pLI de TBX2 en ExAC/gnomAD son 0,96/0,99, que son altas (máximo 1,00). Además, la puntuación de LOF o/e (observada/esperada) en gnomAD es 0,05 (sólo se observa la variante LOF esperada de 1/18,6 en gnomAD). Estas cifras sugieren que las variantes LOF en este gen se seleccionan contra la población general.

Además, (3) el p.R20 se conserva evolutivamente de C. elegans y Drosophila a los seres humanos, lo que sugiere que esto puede ser un residuo importante para la función TBX2. (4) Múltiples programas predicen que la variante es probablemente perjudicial (polifene: posiblemente / probablemente perjudicial, SIFT: perjudicial, puntuación CADD: 24.4, puntuación REVEL: 0.5). (5) Los mutantes MO presentan defectos en los tejidos afectados en los pacientes (por ejemplo, ratones noqueantes que presentan defectos en el sistema cardiovascular, sistemas digestivos/alimentarios, craneofaciales, extremidades/dígito). Por lo tanto, junto con los vínculos biológicos entre TBX1 y TBX2 y los vínculos fenotípicos entre estos pacientes y el síndrome de DiGeorge, fue óptimo realizar estudios funcionales de variantes en este gen utilizando Drosophila.

Para evaluar si la variante p.R20Q afecta a la función TBX2, se generó una línea T2A-GAL4 en bifid (bi; el ortolog Drosophila de TBX2humano), a través de RMCE de un MiMIC intronic de codificación (Figura2)⁸⁷. Este alelo, bi^T2A-GAL4,era recesivo pupal letal y se comportó como un fuerte mutante LOF, similar a los alelos bi LOF reportados anteriormente (por ejemplo, bi^D2, bi^D4; Figura 2 E). La letalidad de estos alelos bi clásicos y recién generados fue rescatada por una construcción de rescate genómico de 80 kb que transportaba todo el locus bi, lo que indica que estos reactivos son de hecho alelos LOF limpios. El patrón de expresión de GAL4 en la línea bi^T2A-GAL4 también coincidió bien con los patrones de bi expresión previamente reportados en múltiples tejidos, incluido en el disco imaginativo del ala (Figura2D).

Paralelamente, se generaron líneas transgénicas de UAS para TBX2 que llevan las secuencias de referencia o variante (p.R20Q). Desafortunadamente, ninguno de los transgénicos fue capaz de rescatar la letalidad de la línea bi^T2A-GAL4. Es importante destacar que un transgén UAS-bi mosca de tipo salvaje tampoco pudo rescatar al alelo bi^T2A-GAL4, probablemente debido a la sensibilidad a la dosis de este gen. De hecho, la sobreexpresión de UAS-bi⁺ y UAS-TBX2⁺ causó cierto grado de letalidad cuando se sobreexpresó en un animal de tipo salvaje. Este efecto tóxico de la sobreexpresión bi/TBX2 se utilizó como un ensayo funcional para evaluar si la variante p.R20Q puede afectar a la función TBX2. Dado que el gen Drosophila bi ha sido ampliamente estudiado en el contexto del sistema visual [el gen también se conoce como ciego optomotor (omb)], fenotipos relacionados con el sistema visual fueron investigados extensamente. Cuando la referencia TBX2 se expresó utilizando un controlador ey-GAL4 que expresa UAS-transgenes en el ojo y partes del cerebro relevantes para el sistema visual, 85% letalidad (Figura3C, panel derecho) y significativa se observó una reducción del tamaño de los ojos (Figura4B). Este fenotipo era más fuerte que el fenotipo observado cuando se expresaba un transgén UAS-bi mosca de tipo salvaje, lo que sugiere que el TBX2 humano es más perjudicial para la mosca cuando se sobreexpresa.

Curiosamente, el p.R20Q TBX2 fue menos potente al causar letalidad (Figura3C, panel derecho) e inducir un fenotipo ocular pequeño (Figura4B) utilizando el mismo controlador bajo la misma condición^87,lo que sugiere que la variante afecta la función proteica. Además, la función de los fotorreceptores que sobreexpresan la referencia y la variante TBX2 utilizando un controlador GAL4 diferente, (Rh1-GAL4) que expresa específicamente los transgenes UAS en fotorreceptores R1-R6, reveló que la variante TBX2 fenotipo ERG mucho más suave en comparación con la referencia TBX2 (Figura4B)⁸⁷. Curiosamente, la mayor parte de la proteína p.R20Q TBX2 todavía se encontró en el núcleo, similar a la proteína de referencia, lo que sugiere que la variante no afectó a la localización nuclear. Un ensayo de represión transcripcional basado en luciferasa en células HEK293T mostró que el p.R20Q no era capaz de reprimir eficazmente la transcripción de una construcción de reportero con sitios palindrómicos de cajas T^87. Además, se observaron disminuciones en los niveles proteicos de TBX2^p.R20Q en comparación con TBX2⁺, lo que sugiere que la variante puede afectar a la traducción o estabilidad proteica de TBX2, lo que a su vez afecta a su abundancia dentro de una célula.

Otros pacientes con variantes raras en TBX2 fueron identificados por médicos en el Sitio Clínico UDN Duke en paralelo con estos estudios experimentales.  Un niño de 8 años con una variante de de novo missense (p.R305H) de una familia no relacionada exhibió muchas de las características encontradas en la primera familia^87. Estudios funcionales adicionales en Drosophila y líneas celulares humanas revelaron que la variante p.R305H también afecta la función TBX2 y los niveles de proteína, lo que sugiere fuertemente que los defectos en este gen probablemente subyacen a muchos fenotipos encontrados en las dos familias. Este trastorno fue seleccionado recientemente como "anomalías vertebrales y disfunción endocrina y de células T variables" (VETD, MIM #618223) en OMIM. La identificación de individuos adicionales con variantes dañinas en TBX2 con fenotipos superpuestos es fundamental para comprender todo el espectro de relaciones genotipo-fenotipo para este gen en la enfermedad humana.

Figura 1 : Esquema de inyección y cruce para generar líneas UAS-humano cDNA y T2A-GAL4. (A) Generación de transgenes de ADNaNC humanos UAS a través de microinyecciones y cruces. El esquema de cruce para integrar los transgenes en un segundo sitio de acoplamiento cromosómico (VK37) utilizando moscas macho en la primera y segunda generación se muestra como ejemplo. Tras la inyección de la construcción transgénica de CDNA-C31 humana (pGW-HA.attB) en embriones tempranos que contienen una fuente germinal de la integrasa c31 (etiquetada con 3xP3-GFP y 3xP3-RFP) y el sitio de acoplamiento VK37 [etiquetado con un ^{amarillo +} ( y⁺ ), los eventos transgénicos se pueden seguir con el minigen blanco⁺ (w⁺) que está presente en el vector transgénico. Se recomienda tachar la integración de C31 seleccionando contra moscas con GFP y RFP. El stock estable final se puede mantener como homocigotos o como un stock equilibrado si el cromosoma lleva una mutación de golpe letal/estéril del segundo sitio. La presencia de mutaciones letales/estériles en el segundo sitio en construcciones transgénicas generalmente no afecta el resultado de los estudios funcionales, siempre y cuando estos transgenes se utilicen en un estado heterocigoto (Figura3). (B) Generación de líneas T2A-GAL4 a través de microinyección y cruces. El esquema de cruce para convertir una segunda inserción MiMIC cromosómica en un elemento T2A-GAL4 se muestra como ejemplo. Mediante la microinyección de un vector de expresión para el vector de integración C31 y RMCE para T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70, se selecciona un marco de lectura adecuado para el MiMIC de interés. Vea los siguientes documentos para más detalles^57,59 en embriones que llevan un MiMIC en un intrón de codificación en gen de interés, se puede convertir el MiMIC original en una línea T2A-GAL4. Figura 2 A muestra un diagrama esquemático de la conversión RMCE. El evento de conversión se puede seleccionar mediante la proyección contra el marcador y⁺ en el casete MiMIC⁶⁰original. Dado que RMCE puede ocurrir en dos direcciones, solo el 50% del evento de conversión exitoso conduce a la producción exitosa de GAL4, que puede ser detectado por un transgén de reportero UAS-GFP en la próxima generación. El stock estable final se puede mantener como homocigotos o como un stock equilibrado si el LOF del gen es letal/estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Conversión de elementos MiMIC en líneas T2A-GAL4 vía RMCE. (A) C31 integrase facilita la recombinación entre los dos sitios attP en la mosca (arriba) y dos sitios attB que flanquean un casete T2A-GAL4 mostrado como vector circular (abajo). (B) Los eventos RMCE exitosos conducen a la pérdida de un marcador seleccionable (amarillo+) y a la inserción del casete T2A-GAL4 en la misma orientación del gen de interés. Dado que el evento RMCE puede ocurrir en dos orientaciones, solo el 50% de la reacción RMCE produce un producto deseado. Un producto RMCE insertado en la orientación opuesta no funcionará como un alelo de captura genética o GAL4 expreso. La direccionalidad de la construcción debe confirmarse mediante la secuenciación de Sanger. (C) La transcripción (arriba) y la traducción (abajo) del gen de interés conducen a la generación de un ARNm truncado y una proteína debido a la señal poliA presente en el extremo 3' del casete T2A-GAL4. El T2A es una señal de salto ribosoma, que permite que el ribosoma parar y reiniciar la traducción después de esta señal. Esto se utiliza para generar un elemento GAL4 que no está unido covalentemente al producto genético truncado de interés. El GAL4 entrará en el núcleo y facilitará la transcripción de transgenes que están bajo control de los elementos de la UAS. UAS-GFP se puede utilizar como reportero de expresión génica, y el ADNC humano de UAS se puede utilizar para experimentos de rescate a través de la "humanización" del gen. (D) Se muestra un ejemplo de un elemento T2A-GAL4 en la expresión bi driving de UAS-GFP (superior). Este patrón de expresión se asemeja a una línea de trampa potenciadora generada previamente para el mismo gen (bi^omb-GAL4; inferior). (E) Comparación de alelo T2A-GAL4 de bi con alellos Bi LOF previamente notificados. Esta cifra ha sido adoptada y modificada de publicaciones anteriores^57,87. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Análisis funcional de variantes humanas utilizando estudios basados en rescate (izquierda) y basados en sobreexpresión (derecha). (A) (panel izquierdo): La función de las variantes EBF3 se evaluó con un análisis basado en el rescate del alelo LOF del nudo de mosca (kn) centrado en la letalidad/viabilidad; (panel derecho): la función de las variantes en TBX2 se evaluó realizando una sobreexpresión de transgenes TBX2 humanos en moscas de tipo salvaje, centrándose en la letalidad/viabilidad, morfología ocular y fenotipos electrofisiológicos (Figura 4) . (B) Esquemas de cruce para obtener las moscas a probar en los estudios funcionales. Se recomienda utilizar siempre un elemento UAS neutro (por ejemplo, UAS-lacZ, UAS-GFP)como un experimento de control. (C) El resultado del representante es el resultado de estudios funcionales de las variantes EBF3^p.R163Q y TBX2^p.R20Q, respectivamente, junto con los experimentos de control adecuados que son necesarios para interpretar los resultados. Tanto el análisis basado en rescate como los estudios de sobreexpresión revelan que las variantes se comportan como alelos amorfos o hipomórficos. Los datos de letalidad/viabilidad que se muestran aquí se basan en datos experimentales presentados en publicaciones anteriores^15,87. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Análisis funcional de una rara variante de missense en TBX2 humano basado en morfología ocular y electroretinograma en Drosophila. (A) Una imagen esquemática que muestra la colocación típica de los electrodos de grabación y de referencia en el ojo de la mosca, junto con un registro representativo del electroretinograma con cuatro componentes principales (en transitorio, despolarización, off-transient, repolarización). (B) La variante TBX2 (p.R20Q) funciona como un alelo LOF parcial basado en estudios de sobreexpresión en el ojo volador utilizando controladores GAL4 específicos del sistema visual (ey-GAL4 y Rh1-GAL4). Esto mostró que la referencia TBX2 causó un fenotipo morfológico y electrofisiológico fuerte en comparación con la proteína variante. (Paneles superiores): se ve una reducción grave en el tamaño de los ojos al sobrerexpressionar UAS-TBX2⁺ con ey-GAL4. UAS-TBX2^p.R20Q. Accionado con ey-GAL4 también causa un ojo más pequeño, pero el fenotipo es mucho más suave. (Paneles inferiores): cuando UAS-TBX2⁺ se expresa en fotorreceptores R1-R6 principales utilizando Rh1-GAL4, hay una pérdida de on- y off-transients, reducción de la despolarización, y gran despolarización prolongada anormal después del fenotipo potencial (PDA), que no se ve en las moscas de control. Estos fenotipos no son tan graves como cuando UAS-TBX2^p.R20Q se expresa utilizando el mismo Rh1-GAL4. Esta cifra ha sido adoptada y modificada de publicaciones anteriores^69,87. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Propósito	Herramienta	Url
Función de variante algoritmos de predicción	PolyPhen-2 Sift Cadd PROVEAN MutationTaster divertirse	http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 https://sift.bii.a-star.edu.sg https://cadd.gs.washington.edu http://provean.jcvi.org/index.php http://www.mutationtaster.org https://sites.google.com/site/revelgenomics
Raros y no diagnosticados investigación de enfermedades Consorcios	Udn RDMM IRUD SOLVE-RD AFGN	https://undiagnosed.hms.harvard.edu http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html http://solve-rd.eu https://www.functionalgenomics.org.au
Base de datos integrativa para humano y modelo organismo Información	MARRVEL Iniciativa Monarch Gene2Function Phenologs	http://marrvel.org https://monarchinitiative.org http://www.gene2function.org http://www.phenologs.org
Genética Humana y Bases de datos genómicas	Omim ClinVar ExAC gnomAD GenoMP Dgv Descifrar	https://www.omim.org/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ http://exac.broadinstitute.org/ http://gnomad.broadinstitute.org/ http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/ http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home https://decipher.sanger.ac.uk/
Herramienta de identificación de Ortolog	DIOPT	https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Organismo Modelo Bases de datos y biomédica Búsqueda de literatura	WormBase (C elegans) FlyBase (Drosophila) ZFIN (pez cebra) MGI (ratón) Pubmed	https://www.wormbase.org http://flybase.org https://zfin.org http://www.informatics.jax.org https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genética y proteica bases de datos de interacción	Cadena niebla	https://string-db.org http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Estructura proteica bases de datos y herramientas de modelado	WWPBD SWISS-MODEL Modelador Phyre2	http://www.wwpdb.org https://swissmodel.expasy.org/ https://salilab.org/modeller/ http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Emparejamiento de pacientes Plataformas	Intercambio de emparejadores GeneMatcher Archivo AGHA Matchbox Descifrar MyGene2 Phenome Central	http://www.matchmakerexchange.org https://www.genematcher.org https://mme.australiangenomics.org.au/#/home https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox https://decipher.sanger.ac.uk https://www.mygene2.org/MyGene2 https://phenomecentral.org
Transcripción humana anotación y ADNc información de clon	Colección de genes de mamíferos Ensembl Refseq	https://genecollections.nci.nih.gov/MGC http://useast.ensembl.org http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tabla 1: Recursos en línea relacionados con este protocolo.

Discussion

Los estudios experimentales con Drosophila melanogaster proporcionan un sistema de ensayo robusto para evaluar las consecuencias de las variantes humanas asociadas a la enfermedad. Esto se debe a la gran cantidad de conocimiento y diversas herramientas genéticas que han sido generadas por muchos investigadores en el campo de la mosca durante el siglo^{pasado 89.} Al igual que cualquier otro sistema experimental, sin embargo, es importante reconocer las advertencias y limitaciones que existen.

Advertencias asociadas con la minería de datos
Aunque el primer paso de este protocolo es extraer bases de datos para obtener información relativa a un gen de interés, es importante utilizarlo sólo como punto de partida. Por ejemplo, aunque en la predicción de silico de la función variante proporciona información valiosa, estos datos siempre deben interpretarse con precaución. Hay algunos casos en los que todos los algoritmos principales predicen que una variante humana es benigna, pero estudios funcionales en Drosophila demostraron claramente la naturaleza perjudicial de dicha variante²⁴. Del mismo modo, aunque las interacciones proteína-proteína, la coexpresión y los datos de modelado estructural son todos datos de información perspicaces, puede haber información pseudopositiva y pseudonegativa presente en estos grandes conjuntos de datos de omics. Por ejemplo, algunas de las interacciones proteica-proteína previamente identificadas o predichas pueden ser artificiales o solo se observan en ciertos tipos de células y tejidos.

Además, puede haber muchas interacciones negativas falsas no capturadas en estos conjuntos de datos, ya que ciertas interacciones proteína-proteína son transitorias (por ejemplo, interacciones enzima-sustrato). La validación experimental es fundamental para demostrar que ciertos genes o proteínas interactúan genética o físicamente in vivo en el contexto biológico de interés. Del mismo modo, las estructuras predichas basadas en el modelado homtológico deben tratarse como un modelo en lugar de una estructura resuelta. Aunque esta información puede ser útil si se encuentra que un aminoácido de interés está presente en una parte estructuralmente importante de la proteína, los datos negativos no descartan la posibilidad de que la variante pueda ser perjudicial. Por último, parte de la información de genotipo-fenotipo notificada anteriormente también debe tratarse con precaución, ya que es posible que algunas informaciones archivadas en bases de datos públicas no sean precisas. Por ejemplo, parte de la información contenida en las bases de datos MO se basa en experimentos que han sido bien controlados y realizados rigurosamente, mientras que otros pueden provenir de un papel de pantalla grande sin más estudios de seguimiento y controles estrictos.

Experimentos de "Humanización" con estrategia T2A-GAL4 no siempre exitosos
Si bien los estudios funcionales basados en la sobreexpresión y el rescate que utilizan cDNas humanos permiten la evaluación de variantes en el contexto de la proteína humana, este enfoque no siempre es exitoso. Si un ADNC humano de referencia no puede rescatar el fenotipo mutante mosca, hay dos explicaciones probables. La primera posibilidad es que la proteína humana no sea funcional o haya reducido significativamente la actividad en el contexto de una célula voladora. Esto puede deberse a 1) expresión de proteínas reducida, estabilidad, actividad y/o localización o 2) una falta de compatibilidad con proteínas volantes que funcionan en un complejo multiproteico. Dado que el sistema UAS/GAL4 es sensible a la temperatura, las moscas se pueden elevar a una temperatura relativamente alta (por ejemplo, 29 oC) para ver la posibilidad de un rescate en esta condición. Además, se puede generar una construcción de ADNc con mosca UAS y un transgén como un control positivo. Si la variante de interés afecta a un aminoácido conservado, la variante análoga se puede introducir en la mosca cDNA para el estudio funcional de la variante en el contexto del ortolog mosca. Aunque esto no es necesario, ayuda en gran medida al estudio en casos que el uso de líneas transgénicas de ADNc humano da resultados negativos o no concluyentes (Figura3).

La segunda posibilidad es que la expresión de la proteína humana cause cierta toxicidad a nivel celular u organismo. Esto puede deberse a antimórficos (por ejemplo, actuando como una proteína negativa dominante), hipermórfico (por ejemplo, demasiada actividad) o neomórfico (por ejemplo, ganancia de una función tóxica novedosa como la agregación de proteínas que no siempre está relacionada con la función endógena del gen de intereses). En este caso, mantener las moscas a baja temperatura (p. ej., 18 oC) puede aliviar algunos de estos problemas. Por último, hay algunos escenarios en los que la sobreexpresión de un cDNA mosca puede no rescatar la línea T2A-GAL4 de la mosca como se ve en el ejemplo TBX2, probablemente debido a la dependencia de dosis de ttrict del producto genético. Para evitar la sobreexpresión de una proteína de interés, el gen de la mosca de interés se puede modificar directamente a través de CRISPR, se puede diseñar una construcción de rescate genómico que contenga la variante de interés, o los experimentos de rescate se pueden realizar utilizando un alelo LOF²¹. Para los genes pequeños, se puede considerar "humanizar" la construcción de rescate genómico de mosca para probar variantes humanas que afectan a los aminoácidos no conservados^24. En resumen, se deben considerar estrategias alternativas cuando el experimento de humanización no permite la evaluación funcional de la variante de interés.

Interpretación de resultados negativos y positivos
Si 1) tanto la referencia como la variante de los CDNAs humanos rescatan los fenotipos mutantes de la mosca en un grado similar y 2) no hay diferencia observada en todas las condiciones probadas, entonces se puede suponer que la variante es funcionalmente indistinguible en Drosophila en vivo. Es importante señalar, sin embargo, que esta información no es suficiente para descartar que la variante de interés no sea patógena, ya que el ensayo de Drosophila puede no ser lo suficientemente sensible o capturar todas las funciones potenciales del gen/proteína de interés relevantes para los seres humanos. Los datos positivos, por otro lado, son una fuerte indicación de que la variante tiene consecuencias perjudiciales sobre la función proteica, pero estos datos por sí solos todavía no son suficientes para reclamar patogenicidad. El Colegio Americano de Genética Médica y Genómica (ACMG) ha publicado un conjunto de normas y directrices para clasificar las variantes en los genes asociados a enfermedades humanas en "benignos", "probablemente benignos", "variante de significación desconocida (VUS)", "probablemente patógeno", y "patógeno"⁹⁰. Aunque esta clasificación sólo se aplica a los genes asociados a enfermedades establecidos y no es directamente aplicable a las variantes en "genes de importancia incierta" (GUS), se recomienda encarecidamente a todos los individuos involucrados en estudios funcionales de variantes humanas adherirse a esta directriz al notificar la función de variante.

Extraer información biológica útil cuando los fenotipos MO no modelan una condición de enfermedad humana
Es importante tener en cuenta que los ensayos funcionales basados en sobreexpresión tienen limitaciones, especialmente porque algunos de los fenotipos que se puntúan pueden tener poca relevancia para la condición de interés de la enfermedad. Del mismo modo, los fenotipos que se evalúan mediante experimentos de rescate pueden no tener ninguna relevancia directa para la enfermedad de interés. Dado que estos experimentos se llevan a cabo fuera de los contextos endógenos en un sistema de invertebrados, no deben considerarse modelos de enfermedad, sino más bien como una prueba de función génica utilizando Drosophila como un "tubo de ensayo vivo".

Incluso si el organismo modelo no imita una condición de enfermedad humana, los fenotipos que se pueden usar en experimentos de rescate a menudo pueden proporcionar información biológica útil sobre las condiciones de la enfermedad. El concepto de "fenotipos homólogos no evidentes)"⁹¹ se puede utilizar para determinar aún más las conexiones moleculares subyacentes entre Drosophila y los fenotipos humanos. Por ejemplo, los fenotipos morfológicos en el ala volante, el tórax, las piernas y los ojos son excelentes lecturas fenotípicas para los defectos en la vía de señalización de Notch, una vía evolutivamente conservada vinculada a muchos trastornos congénitos, incluyendo defectos cardiovasculares en humanos⁶². Al comprender la lógica molecular detrás de ciertos fenotipos en Drosophila,es posible identificar vínculos biológicos ocultos entre genes y fenotipos en humanos que aún no se entienden.

Comunicación continua con colaboradores clínicos
Cuando se trabaja con médicos para estudiar la función de una variante rara que se encuentra en el paciente, es importante establecer una relación de colaboración fuerte. Aunque los investigadores biomédicos clínicos y básicos pueden compartir intereses en los mismos genes/vías genéticas, existe una gran brecha cultural y linguística (por ejemplo, la jerga médica, la nomenclatura específica del organismo modelo) entre los campos clínico sclínico y científico. Una relación sólida y basada en la confianza entre las dos partes se puede construir a través de una amplia comunicación. Además, la comunicación bidireccional es fundamental para establecer y mantener esta relación. Por ejemplo, en los dos casos descritos en la sección de resultados representativos, la identificación de pacientes adicionales con genotipos y fenotipos similares, así como un estudio funcional posterior, fueron críticos para probar la patogenicidad de las variantes de interés. Incluso con datos funcionales sólidos, los investigadores y los médicos a menudo tienen dificultades para convencer a los genetistas humanos de que una variante identificada en los casos de "n 1" es la verdadera causa de la enfermedad.

Una vez que el investigador del MOD identifica que una variante de interés es perjudicial, es fundamental comunicarse de nuevo con los colaboradores clínicos tan pronto como sea posible para que puedan tratar activamente de identificar los casos coincidentes mediante la creación de redes con otros médicos y genetistas humanos. Herramientas como Geno₂MP [Genotipos a fenotipos mendelianos: una base de datos no identificada de 9.650 personas inscritas en el Centro de Genómica Mendeliana^{41 de}la Universidad de Washington; incluye pacientes y familiares sospechosos de con trastornos genéticos] se puede buscar para evaluar a las personas que pueden tener el mismo trastorno. A continuación, se puede contactar con el médico principal mediante una función de mensajería.

Alternativamente, Se puede utilizar GeneMatcher, que es un sitio web de emparejamiento para médicos, investigadores básicos y pacientes que comparten intereses en los mismos genes para identificar pacientes adicionales que llevan variantes raras. Dado que GeneMatcher forma parte de una red integrativa más grande de sitios web de emparejamiento llamado Matchmaker Exchange^42,se pueden buscar bases de datos adicionales en todo el mundo, incluyendo el Archivo de Pacientes de australiana de la Alianza para la Salud de La Genómica, Broad Matchbox , DECIPHER, MyGene2 y PhenomeCentral en una sola presentación de genes GeneMatcher. Aunque la participación en GeneMatcher es posible como "investigador", se recomienda que los científicos básicos utilicen este sitio web con sus colaboradores clínicos, ya que la comunicación con otros médicos después de un partido requiere ciertos niveles de Experiencia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster)	BDSC	#24871	Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster)	BDSC	#24872	Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector	Thermo Fisher	#12536-017	Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector	Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)		Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose	Sigma-Aldrich	#A2790	Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli)	Thermo Fisher	#18265017	Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit	Thermo Fisher	#K210012	Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit	Qiagen	#27104	Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase	NEB	#M0491	Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system	Thermo Fisher	#11789020	Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system	Thermo Fisher	#11791100	Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit	Agilent	#200523	Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis	Molecular Devices	N/A	Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection	LabX	#R150358	Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator	Astro-Med	#S48	Specific Reagent: Square Pulse Stimulator