Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av Drosophila

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Målet med detta protokoll är att beskriva utformningen och utförandet av in vivo-experiment i Drosophila melanogaster för att bedöma de funktionella konsekvenserna av sällsynta genvarianter förknippade med mänskliga sjukdomar.

Abstract

Framsteg inom sekvenserings teknik har gjort hela-genomet och hela-exome dataset mer tillgängliga för både klinisk diagnos och avancerad humangenetik forskning. Även om ett antal i silico-algoritmer har utvecklats för att förutsäga patogeniteten hos varianter som identifierats i dessa dataset, är funktionella studier avgörande för att fastställa hur specifika genomiska varianter påverkar protein funktionen, särskilt för genom Varianter. I nätverket för odiagnostiserade sjukdomar (UDN) och andra forsknings konsorer för sällsynta sjukdomar, modellorganismer (MO) inklusive Drosophila, C. elegans, zebrafisk och möss används aktivt för att bedöma funktionen hos den förmodade humana Varianter. Detta protokoll beskriver en metod för funktionell bedömning av sällsynta humana varianter som används i modellorganismerna screening Center Drosophila kärna av UDN. Arbetsflödet börjar med att samla in Human-och MO-information från flera offentliga databaser, med hjälp av MARRVEL-webbresursen för att bedöma om varianten sannolikt kommer att bidra till patientens tillstånd samt utforma effektiva experiment baserade på tillgängliga kunskap och resurser. Därefter genereras genetiska verktyg (t. ex. T2A-GAL4 och UAS-Human cDNA-linjer) för att bedöma funktionerna hos varianter av intresse i Drosophila. Vid utveckling av dessa reagenser, två-pronged funktionella analyser baserade på räddning och överuttryck experiment kan utföras för att bedöma variant funktion. I räddnings grenen är de endogena fluggener "humaniserade" genom att ersätta den ortologösa Drosophila genen med referens eller variant mänskliga transgener. I överuttryck grenen, referens och variant mänskliga proteiner är exogent drivs i en mängd olika vävnader. I båda fallen kan varje och fenotyp (t. ex. dödlighet, ögonmorfologi, elektrofysiologi) användas som en avläsnings bar, oberoende av den sjukdom av intresse. Skillnader observerade mellan referens och variant alleler föreslå en variant-specifik effekt, och därmed sannolik patogenicitet. Detta protokoll möjliggör snabba, in vivo-bedömningar av förmodade sjukdomsframkallande varianter av gener med kända och okända funktioner.

Introduction

Patienter med sällsynta sjukdomar genomgår ofta en mödosam resa kallad "Diagnostic Odyssey" för att få en korrekt diagnos1. De flesta sällsynta sjukdomar tros ha ett starkt genetiskt ursprung, vilket gör genetiska/genomiska analyser kritiska delar av den kliniska workup. Förutom kandidat gen panel sekvensering och kopiera nummer variation analys baserad på kromosomala mikromatriser, hela-exome (WES) och hela-Genome sekvensering (WGS) teknik har blivit alltmer värdefulla verktyg under det senaste decenniet2, 3. För närvarande, diagnostisk frekvens för att identifiera en känd patogena variant i Wes och WGS är ~ 25% (högre i pediatriska fall)4,5. För de flesta fall som förblir odiagnostiserade efter klinisk WES/WGS, ett vanligt problem är att det finns många kandidat gener och varianter. Nästa generations sekvensering identifierar ofta nya eller Ultra-ovanliga varianter i många gener, och att tolka om dessa varianter bidrar till sjukdoms fenotyper är utmanande. Till exempel, även om de flesta nonsens eller frameshift mutationer i gener tros vara förlust av funktion (LOF) alleler på grund av nonsens-medierad förfall av kodade transkription, trunkera mutationer som finns i den sista exonerna undkomma denna process och kan fungera som godartad eller Gain-of-funktion (GOF) alleler6.

Dessutom, förutsäga effekterna av en genom allel är en skrämmande uppgift, eftersom det kan resultera i ett antal olika genetiska scenarier som först beskrivs av Herman Muller på 1930-talet (dvs., amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, eller isomorph)7 . Många i silico program och metoder har utvecklats för att förutsäga patogeniteten hos genom varianter baserat på evolutions bevarande, typ av aminosyraförändring, position inom en funktionell domän, allel frekvens i den allmänna befolkningen, och andra parametrar8. Men dessa program är inte en heltäckande lösning för att lösa det komplicerade problemet med variant tolkning. Intressant, en nyligen studie visade att fem i stort sett används variant patogenitet förutsägelse algoritmer (Polyphen9, SIFT10, CADD11, Provean12, mutation taster) överens om patogenicitet ~ 80% av tiden8 . I synnerhet, även när alla algoritmer är överens, returnerar de en felaktig förutsägelse av patogenicitet upp till 11% av tiden. Detta leder inte bara till bristfällig klinisk tolkning utan kan också avskräcka forskare från att följa upp nya varianter genom att felaktigt lista dem som godartade. Ett sätt att komplettera den nuvarande begränsningen i silico modellering är att ge experimentella data som visar effekten av variant funktion in vitro, ex vivo (t. ex., odlade celler, organoider), eller in vivo.

In vivo funktionella studier av sällsynta sjukdomsassocierade varianter i MO har unika styrkor13 och har antagits av många sällsynta sjukdoms forskning initiativ runt om i världen, inklusive odiagnostiserade sjukdomar nätverk (UDN) i USA och sällsynta Sjukdomar modeller & mekanismer (RDMM) nätverk i Kanada, Japan, Europa och Australien14. Utöver dessa samordnade insatser för att integrera MO-forskare i arbetsflödet för diagnostik av sällsynta sjukdomar och mekanistiska studier på nationell nivå har ett antal individuella samarbetsprojekt mellan kliniska forskare och MO-forskarna lett till upptäckten och karakterisering av många nya mänskliga sjukdomsframkallande gener och varianter82,83,84.

I UDN, en centraliserad modell organismer screening Center (MOSC) mottar inlagor av kandidat gener och varianter med en beskrivning av patientens tillstånd och bedömer om varianten är sannolikt att vara patogena med hjälp av informatik verktyg och in vivo Experiment. I fas I (2015-2018) av UDN, MOSC består av en Drosophila kärna [Baylor College of Medicine (BCM)] och Zebrafish Core (University of Oregon) som arbetade tillsammans för att bedöma fall. Med hjälp av informatik analys och ett antal olika experimentella strategier i Drosophila och Zebrafish har Mosc hittills bidragit till diagnosen 132 patienter, identifiering av 31 nya syndrom55, upptäckten av flera nya mänskliga sjukdomsgener (t. ex. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) och fenotypisk expansion av känd sjukdom gener (t. ex. CACNA1AACOX122).

Förutom projekt inom UDN har MOSC Drosophila Core forskare bidragit till nya sjukdomsgen upptäckter i samarbete med centra för Mendelian genomik och andra initiativ (t. ex. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) med samma uppsättning av informatik och genetiska strategier som utvecklats för UDN. Med tanke på betydelsen av MO studier om sällsynta sjukdomar diagnos, MOSC utökades till att omfatta en C. elegans kärna och andra Zebrafish kärna (båda vid Washington University vid St Louis) för fas II (2018-2022) av UDN.

Detta manuskript beskriver ett in vivo funktionella studieprotokoll som aktivt används i UDN Mosc Drosophila Core för att avgöra om genom varianter har funktionella konsekvenser för proteinet av intresse med transgena flugor som uttrycker mänskliga Proteiner. Målet med detta protokoll är att hjälpa MO-forskare att samarbeta med kliniska forskargrupper för att ge experimentella belägg för att en kandidat variant i en gen av intresse har funktionella konsekvenser, vilket underlättar klinisk diagnos. Detta protokoll är mest användbart i ett scenario där en Drosophila forskare kontaktas av en klinisk utredare som har en sällsynt sjukdom patient med en specifik kandidat variant i en gen av intresse.

Detta protokoll kan delas upp i tre delar: (1) samla in information för att bedöma sannolikheten för att den variant av intresse som ansvarar för patientens fenotyp och genomförbarheten av en funktionell studie i Drosophila, (2) insamling befintliga genetiska verktyg och etablera nya, och (3) utföra funktionella studier in vivo. Den tredje delen kan delas upp i två del element som bygger på hur en variant av intresse kan bedömas (räddnings experiment eller överuttrycksbaserade strategier). Det är viktigt att notera att detta protokoll kan anpassas och optimeras till många scenarier utanför sällsynt monogen sjukdom forskning (t. ex., vanliga sjukdomar, gen-miljö interaktioner, och farmakologiska/genetiska skärmar för att identifiera terapeutiska mål). Möjligheten att fastställa varianternas funktionalitet och patogenicitet kommer inte bara att gynna patienten av intresse genom att tillhandahålla korrekt molekylär diagnos utan också ha bredare effekter på både translationell och grundläggande vetenskaplig forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. insamling av human-och MO-information för att bedöma sannolikheten för att en variant av intresset är ansvarig för sjukdomens fenotyper och genomförbarheten av funktionella studier i Drosophila

  1. Utföra omfattande databas-och litteratursökningar för att avgöra om de specifika gener och varianter av intresse är bra kandidater för att förklara fenotyp av patienten av intresse. Samla in följande information specifikt.
    1. Bedöma om genen av intresse har tidigare varit inblandad i andra genetiska sjukdomar (fenotypisk expansion av känd sjukdomsgen) eller detta är en helt ny sjukdom kandidat gen [Genvariant av osäker betydelse (GVUS)].
    2. Bedöma allelefrekvensen för den variant av intresse för sjukdom eller kontroll befolknings databaser.
    3. Bedöma om det finns Kopiera nummer variationer (CNVs) som inkluderar denna gen i sjukdom eller kontroll befolknings databaser.
    4. Bedöm vad de ortologösa generna är i olika MO arter inklusive mus, zebrafisk, Drosophila, C. elegans och jäst, sedan ytterligare undersöka de kända funktioner och uttrycksmönster av dessa ortologösa gener.
    5. Bedöma om den variant av intresse är närvarande i en funktionell domän av proteinet och om aminosyran av intresse är evolutionärt bevaras.
      Anmärkning: svar på dessa fem frågor (steg 1.1.1-1.1.5) kan erhållas genom att få tillgång till ett antal human-och Mo-databaser individuellt eller genom att använda MARRVEL (modellorganismens aggregerade resurser för sällsynt variant utforskning) webbresurs (se tabell 1 för onlineresurser)30, som beskrivs ingående i en medföljande artikel31. Se avsnittet representativa resultat för specifika exempel. Monarch Initiative webbplats32 och Gene2Function33 ger också användbar information.
  2. Samla in ytterligare information för att ytterligare bedöma om varianten är en bra sjukdoms kandidat från en proteinfunktion och struktur Point-of-view.
    1. Bedöm om den variant av intresse förutspås vara skadlig baserat på i silico förutsägelse algoritmer.
      Anmärkning: variant patogenicitet algoritmer har utvecklats av många forskargrupper under de senaste ~ 15 år, och vissa visas också i MARRVEL sökresultaten. Nyare program, inklusive de två listade nedan, kombinera flera variant pathogenicitetsrediction algoritmer och maskininlärning metoder för att generera en pathogenicitetspoäng. Mer information om algoritmer för variantförutsägelse och deras prestanda finns i Ghosh, et al.8. (i) CADD (kombinerad anteckning-beroende utarmning): integrativ anteckningsverktyg byggt från mer än 60 genomisk funktioner, som ger betyg för mänskliga snvs samt korta infogningar och borttagningar11. (II) frossa (sällsynt Helexomanalyserna variant Ensemble elev): kombinerar flera variant patogenicitetsalgoritmer (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP, och phastCons) för att ge en integrerad Poäng för alla möjliga mänskliga genom varianter34.
    2. Bestäm om den mänskliga genen/proteinet av intresse eller dess MO ortologgar har visat sig genetiskt eller fysiskt interagera med gener/proteiner som tidigare kopplats till genetiska sjukdomar. Om så är det, bedöma om patienten av intresse uppvisar överlappande fenotyper med dessa sjukdomar.
      Obs: flera verktyg har utvecklats för att analysera genetiska och protein-proteininteraktioner baserade på Mo-publikationer samt storskaliga proteomik från flera arter skärmar. STRING (sökverktyg för återkommande förekomster av angränsande gener)35: en databas för kända och förväntade protein-proteininteraktioner. Det integrerar genetisk interaktion och co-Expression dataset samt text-mining verktyg för att identifiera gener och proteiner som kan fungera tillsammans i en mängd olika organismer. MIST (molekylär interaktion sökverktyg)36: en databas som integrerar genetiska och protein-protein interaktionsdata från Core genetiska Mos (jäst, C. elegans, Drosophila, zebrafisk, groda, råtta, mus) och människor. Prediktion av interaktioner som härletts från ortologösa gener/proteiner (interlogs) visas också.
    3. Bestäm om 3-D strukturen av proteinet av intresse har lösts eller modelleras. Om så är det, avgöra var den variant av intresse karta i förhållande till viktiga funktionella domäner.
      Anmärkning: proteinstrukturer som löses genom röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) och Cryo-elektronmikroskopi finns i offentliga databaser inklusive det preliminära budgetförslaget (protein data banken) och EMDatabank37. Även om det inte finns någon enskild databas för förväntade/modellerade proteinstrukturer, ett antal algoritmer (dvs., SWISS-MODEL38, modeller39, och Phyre240) är tillgängliga för användare att utföra protein modellering.
  3. Kommunicera med kliniska medarbetare för att diskutera information som samlats in från informations analyserna i avsnitten 1.1-1.2. Om kliniska medarbetare också känner att den variant och gen av intresse är bra kandidater för att förklara fenotyper ses i patienten, gå vidare till avsnitt 2. Om det finns specifika frågor om patientens genotyp och fenotyp, diskutera dem med de kliniska medarbetare innan du går vidare.
    Anmärkning: om det är troligt att den variant av intresse är osannolikt att förklara fenotyp av intresse (t. ex. identisk variant som finns i hög frekvens i kontroll populationen), diskutera detta med kliniska medarbetare att avgöra om varianten är en bra eftersom det inte kan finnas lämplig expertis för att tolka kliniska fenotyper.

2. insamling av befintliga genetiska verktyg och inrättande av nya reagenser för att studera en specifik variant av intresse

Obs: när den variant av intresse har fastställts en bra kandidat att bedriva experimentellt, samla in eller generera reagenser för att utföra in vivo funktionella studier. För funktionella studier som beskrivs i detta protokoll behövs några viktiga Drosophila melanogaster -reagens: 1) uppströms aktiveringssekvens-reglerade humana cDNA-transgena stammar som bär referens-eller variantsekvensen, 2) en förlust av funktion allel av en fluga gen av intresse, och 3) en GAL4 linje som kan användas för räddnings experiment.

  1. Generering av UAS-mänskliga cDNA konstruktioner och transgena flugor
    1. Identifiera och erhålla lämpliga humana cDNA-konstruktioner. Många kloner finns tillgängliga från MGC (däggdjurs gen samling)43 och kan köpas från utvalda Venders. För gener som alternativt skarvas, kontrollera vilken isoform cDNA motsvarar att använda Ensembl eller RefSeq.
      Obs: många cdnas finns i driver-medierade klonings system kompatibla reagenser44, vilket förenklar subkloningen steg. cDNAs kan komma i ett "öppet (no stop Codon)" eller "stängt (med endogent eller konstgjord stoppkodon)" format. Medan öppna kloner tillåta C'-märkning av proteiner som är användbara för biokemiska (t. ex., västra blot) och cellbiologiska (t. ex., immunofärgning) analyser för att övervaka uttrycket av proteinet av intresse, det kan störa protein funktionen i vissa fall.
    2. Sub-klon referens och variant cDNA i Drosophila transgena vektor. Använd det φc31-medierade transgenetik-systemet, eftersom det gör att referens-och variant-cdnas kan integreras på samma plats i arvsmassan45. För detta projekt använder MOSC Drosophila Core rutinmässigt PGW-ha. attb Vector46.
      Anmärkning: om den mänskliga cDNA är i driver-medierad kloning system kompatibla vektorer (t. ex., pDONR221, pENTR221), hoppa till avsnitt 2.1.4, vilket förklarar LR reaktioner att subklona den cdnas i PGW-ha. attb.
      1. Om den mänskliga cDNA inte är i en driver-medierad kloning system kompatibel plasmid, subklona den mänskliga cdnas i en gateway post vektor med hjälp av standard molekylärbiologisk teknik (ett exempel på sådana protokoll dokumenteras nedan).
        1. Utför en överhäng PCR för att introducera attB1 och attB2 armar. Den främre primer bör ha attB1 sekvens 5 '-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACC-3 ' följt av de första 22 nukleotider av målet cDNA. Den omvända primer bör ha attB2 sekvens 5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3 ' följt av omvänd komplement av de sista 25 nukleotider av cDNA av intresse. Utesluta stopp kodon av cDNA, sedan lägga till en C ' tagg om det önskas att "öppna" en klon, eller lägga till en stop kodon att "stänga" en klon.
        2. Förbered en 100 μL High Fidelity-PCR-blandning bestående av 50 μL High Fidelity PCR Master Mix, 36 μL destillerat vatten, 5 μL av varje framåtriktad och omvänd primers som listas i steg 2.1.2.1.1 späddes till 10 μM och 4 μL mål-cDNA (150 ng/μL).
        3. Utför PCR med standard mutagenes Protocol för att lägga till attB1 och AttB2 armar på cDNA av intresse. Förhållandena varierar beroende på konstruktion och varianter av intresse.
        4. Isolera målet cDNA med tillsatt homologi armar via gel elektrofores och gel utvinning. Skapa 1% agaros gel och utför elektrofores med standardmetoder. Punktskatter bandet som motsvarar storleken på cDNA plus ytterligare längd homologi armarna. Extrahera DNA från gelen genom standardmetoder95. Kommersiella gel Extraction Kits finns från flera företag.
        5. Utför en in vitro-driver reaktion baserad på det driver-medierade klonings protokollet enligt det system som används.
        6. Omvandla BP-reaktionsmixen till kemiskt kompetenta E. coli -celler. Kompetenta celler kan göras in-House eller köpas från kommersiella leverantörer. Odla de transformerade cellerna över natten på en LB-platta som innehåller lämplig antibiotika för kolonival. Nästa dag, Välj flera kolonier och odla dem i oberoende flytande kulturer över natten.
        7. Isolera DNA från över natten kulturer genom miniprep. Sanger sekvensera de positiva klonerna för att säkerställa att cDNA har rätt sekvens96. Behåll celler från de kulturer som är positiva för den önskade sekvensen i 25% glycerol lagrad vid-80 ° c.
    3. Utföra platsriktade mutagenes att införa den variant av intresse i Gateway Plasmid med referens Human cDNA97. Ett detaljerat protokoll för den här metoden finns på leverantörens webbplats48,49. Validera förekomsten av varianten i den muterade plasmid via Sanger-sekvensering av hela den öppna avläsnings ramen (ORF) för att säkerställa att inga ytterligare varianter införs genom detta mutagenes steg.
    4. Subclone referens och variant Human cDNAs i donator plasmid (Gateway plasmider med attL1 och attL2 platser) i transgena plasmid (t. ex., PGW-ha. attb med attR1 och attR2 platser) via en LR clonase reaktion.
      Obs: det finns UAS φc31 vektorer avsedda för konventionell begränsning enzymbaserad subkloning (t. ex. puast. attb50) om det är att föredra att subklona Human cdnas via begränsnings enzym metoder.
    5. Välj φC31 dockningsplatser där UAS-humana cDNA-transgener ska integreras. Ett antal dockningsplatser har genererats av flera laboratorier och är offentligt tillgängliga från lager centra50,52,53.
      Obs: eftersom det är bekvämt att ha den mänskliga transgenen på en kromosom som inte innehåller flyga ortoolog av genen av intresse, det rekommenderas att använda en andra kromosom docknings plats [VK37 (bdsc Stock #24872] när flyga ortholog är på X , tredje eller fjärde kromosomer, och använda en tredje kromosom docknings plats [VK33 (BDSC Stock #24871] när flug ortoolog är på den andra kromosomen.
    6. Injicera UAS-Human cDNA konstruerar i flugor som uttrycker φc31 integras i sin köns Cells (t. ex. vas-φc31, nos-φc31).
      Obs: mikroinjektion kan utföras i egen eller skickas till Core anläggningar eller kommersiella enheter för transgenesis. Detaljerat protokoll för generering av transgena flugor finns i den citerade boken kapitel51.
    7. Upprätta stabila transgena stammar från de injicerade embryona. Injicera ~ 100-200 embryon per konstruktion94. Ett representativt passagesystem för en transgen som sätts in i en andra kromosom docknings plats (VK37) avbildas i figur 1a. Se de citerade böckerna54,55 för grundläggande Drosophila Genetics information.
  2. Skaffa eller generera en T2A-GAL4-linje som underlättar räddningsbaserade funktionella analyser (se figur 2 och avsnitt 3,1).
    Obs: denna linje kommer att tjäna två syften. Först, de flesta T2A-GAL4 linjer testade beter sig som starka LOF alleler genom att fungera som en Gene trap allele. För det andra, T2A-GAL4 linjer fungerar som en GAL4 förare som tillåter uttryck av UAS konstruktioner (t. ex. UAS-GFP, UAS-mänskliga cdnas) enligt den endogena regleringen delar av genen av intresse56,57 (figur 2a-C).
    1. Sök offentliga lager samlingar för tillgängliga T2A-GAL4 linjer inklusive Drosophila gen störningar projektet (bnp)58 där ~ 1 000 T2A-GAL4 linjer har genererats59. Dessa stammar är för närvarande tillgängliga från Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc) och är sökbara via både GDP och bdsc webbplatser.
    2. Om en T2A-GAL4 linje för fly gen av intresse inte är tillgänglig, kontrollera om en lämplig kodning intronic MiMIC (Minos-medierad integration kassett) linje är tillgänglig för omvandling till en T2A-GAL4 linje med driver-medierad kassett utbyte (rmce )60 (figur 2a).
      Anmärkning: rmce tillåter Intronic härma element som finns i mellan två kodning exoner som skall omvandlas till en T2A-GAL4 linje genom mikroinjektion av en givare konstruktion (ett exempel på ett övergångsordning visas i figur 1B) eller serie av kors, som beskrivs i detalj57,59.
    3. Om en T2A-GAL4 linje inte är tillgänglig och en lämplig kodning intronic härma inte existerar, utforska möjligheten att generera en T2A-GAL4 linje via CRIMIC (CRISPR-medierad integration kassett) system59.
      Anmärkning: denna metod använder CRISPR-MEDIERAD DNA klyvning och Homology-riktad reparation (HDR) för att integrera en härma-liknande kassett i en kodning intron i en gen av intresse.
    4. Om genen av intresse saknar en stor intron (> 150 BP) eller har inga introner, försök att slå in en GAL4 transgenens i fluga genen med CRISPR/Cas9 systemet med hjälp av HDR som beskrivs20,61,62.
      Anmärkning: om generering av en T2A-GAL4 eller GAL4 Knock-in allel är svårt, försök att utföra räddnings experiment med dessa befintliga alleler eller RNAi linjer och allestädes närvarande eller vävnad-specifika GAL4 förare som beskrivs92 (Ref).

3. utföra funktionell analys av Human variant av intresse in vivo i Drosophila

Anmärkning: utför en räddningsbaserad analys (avsnitt 3,1) och överuttrycks studier (avsnitt 3,2) med hjälp av de verktyg som samlats in eller genererats i avsnitt 2 för att bedöma konsekvenserna av den variant av intresset in vivo i Drosophila. Överväg att använda båda metoderna, eftersom de två kompletterar varandra.

  1. Utföra funktionell analys genom räddningsbaserade experiment
    Observera: Heterologous räddningsaktion-baserade experiment iDrosophilaanvända mänskliga proteiner avgöra om den molekylära funktionen hos de två ortologösa gener har bevarat över ~ 500 000 000 år av evolution. De bedömer också funktionen av varianten i sammanhanget av människa proteinet63. Även om en systematisk analys som studerar hundratals genpar inte har rapporterats, kan flera dussin människor och däggdjur (t. ex. mus) gener ersätta funktionen avDrosophilaGener13.
    1. I den räddningsaktion-baserade metoden, först avgöra om det finns uppenbara, scorable, och reproducerbara fenotyper i LOF mutanter i fluga ortoolog innan man bedömer funktioner av varianter.
      Anmärkning: tidigare litteratur om fly genen är ett bra ställe att data gruvan först, och det kan hittas med hjälp av databaser inklusive flybase och PubMed. Ytterligare databaser som MARRVEL, Monarch Initiative och Gene2Funcion är också användbara för att samla in denna information.
    2. Utföra en global undersökning av och fenotyper i homozygot och hemizygot (T2A-GAL4 allel över en molekylärt definierade kromosomala brist djur, särskilt om T2A-GAL4 allel är den första mutation som skall kännetecknas för en specifik gen. Bedöma fenotyper såsom dödlighet, sterilitet, livslängd, morfologiska (t. ex. storlek och morfologi i ögat) och beteende (t. ex., uppvaktning, flygning, klättring, och Bang känslighet defekter).
      Anmärkning: om det inte finns några större fenotyper identifierade från denna primära skärm, mer subtila fenotyper såsom neurologiska defekter mätt med elektrofysiologiska inspelningar kan användas om de är mycket reproducerbara och specifika. Som ett exempel, funktionella studier med elektroretinogram (ERG) beskrivs i steg 3.2.3. Om det inte finns någon och fenotyp, gå till avsnitt 3,2 och utför den överuttrycksbaserade funktionella studien.
    3. När en och fenotyp identifieras i flugan LOF Mutant, testa om referens Human cDNA kan ersätta funktionen av flyga ortoolog genom att försöka använda humant cDNA att rädda Mutant fluglinan. Den fenotypiska analysen som ska utföras här beror på resultaten från steg 3.1.2 och kommer att vara specifika för den gen som studeras.
      Anmärkning: om "humanisering" av fly genen är framgångsrik, det finns nu en plattform för att jämföra effektiviteten i räddning för den variant av intresse jämfört med referens motsvarigheten. Räddningen som ses med hänvisa till människa cDNA, behöver inte att vara perfekt. Partiell räddning av fluga Mutant fenotyp med hjälp av en mänsklig cDNA fortfarande ger en referenspunkt för att utföra jämförande studier med hjälp av den variant mänsklig cDNA stam.
    4. Med hjälp av det analyssystem som valdes i steg 3.1.2, jämför den räddning som observerats med referens Human cDNA till den räddning som observerats med varianten Human cDNA för att avgöra om den variant av intresse har konsekvenser för genen av intresse.
      Anmärkning: om varianten Human cDNA presterar sämre än referens allelen, tyder detta på att den variant av intresse är skadliga för protein funktionen. Om variant och referens inte kan särskiljas funktionellt, då 1) allelen kan vara en isomorph (en variant som inte påverkar proteinfunktion) eller 2) analysen är inte tillräckligt känslig för att upptäcka subtila skillnader.
    5. Om varianten befinns vara en skadlig allel, sedan ytterligare bedöma uttrycket och intracellulära lokalisering av referens och variant proteiner av intresse in vivo via Western blot, immunofluorescensfärgning, eller andra metoder93.
      Anmärkning: om UAS-Human cDNA genereras från en öppen klon i en PGW-ha. attb vektor, använda en anti-ha antikropp för att utföra dessa biokemiska och cellulära analyser. Om den ursprungliga klon är en sluten klon, testa om kommersiella antikroppar mot mänskliga proteiner kan användas för dessa analyser. En skillnad i uttrycks nivåer och intracellulär lokalisering kan avslöja hur den variant av intresse påverkar proteinfunktion.
  2. Utföra funktionell analys genom överuttrycks studier
    Anmärkning: ubiquitous eller vävnadsspecifikt överuttryck av mänskliga cdnas i annars Wild-Type flugor kan ge information som kompletterar de räddningsbaserade experiment som diskuteras i avsnitt 3,1. Medan räddningsbaserade analyser främst är utformade för att detektera LOF-varianter (amorfiska, hypomophic), kan överuttrycksbaserade analyser också avslöja Gain-of-function (GOF) varianter som är svårare att bedöma (hypermorfiska, antimorfiska, neomorfiska).
    1. Välj en uppsättning GAL4 drivrutiner för att överuttrycka den mänskliga cDNAs av intresse. Ett antal allestädes närvarande och Tissue-/Stage-specifika GAL4 drivrutiner finns tillgängliga från offentliga lager centra (t. ex., bdsc), av vilka några används oftare än andra. Först fokusera på allestädes närvarande förare och lätt och fenotyper (dödlighet, sterilitet, morfologiska fenotyper), sedan gå vidare till vävnads-specifika drivrutiner och mer specifika fenotyper.
      Obs: validera uttrycket av GAL4 Drivers med en reporter linje (t. ex., UAS-GFP) för att bekräfta uttrycksmönster före användning i experimenten.
    2. Uttryck referens och variant Human cDNAs med samma förare under samma förhållanden (t. ex. temperatur) genom att korsa 3-5 jungfru honor från GAL4-linjen (t. ex. ey-GAL4 för uttrycket Eye imaginal Disc) med 3-5 hane flugor från UAS-linjerna [t. ex. UAS-TBX2 (+) eller UAS-TBX2 (p. R305H) för exemplet som visas i avsnitt 4,2] i en enda injektionsflaska.
      1. Överför kors varje 2-3 dagar att ha många djur estängning från ett enda kors.
    3. Undersök avkomman och detektera eventuella skillnader mellan referens-och variantstammar (t. ex. ögonmorfologi) under ett dissekundersmikroskop. Bild flugorna med hjälp av en kamera ansluten till en dissektion Mikroskop för att dokumentera fenotyp.
      Anmärkning: om en fenotyp endast ses i referensen, men inte i variantlinjen, kan varianten vara en sot eller en stark hypomorfisk allel. Om fenotypen ses i båda genotyperna men hänvisningen orsakar en starkare defekt, då varianten kan vara en mild till svag hypomorphic allel. Om hänvisningen inte visar en fenotyp eller endast uppvisar en svag fenotyp men varianten visar en stark defekt, då varianten kan vara en GOF allele.
    4. Om en fenotyp inte ses i standard odlingsförhållanden (RT eller vid 25 ° c, Ställ sedan korsen vid olika temperaturer som varierar 18-29 ° c, eftersom UAS/GAL4 systemet är känt för att vara temperaturkänsligt64,65). Typiskt, uttrycket av UAS transgener är högre vid högre temperaturer.
  3. Utföra ytterligare funktionella studier relaterade till gener och protein av intresse.
    Observera: Förutom att undersöka allmänna defekter, kan ett analyssystem väljas för att sond till molekylära funktioner av genen och variant. I ett exempel som diskuterades i de representativa resultaten (TBX2var ERG inspelningar används för att bestämma effekterna av varianten på Rostnings funktion, eftersom fly genen av intresse (bifid) hade studerats ingående i samband med visuell systemutveckling. Detaljerade protokoll för ERG iDrosophilakan hittas som tidigare publicerade66,67,68.
    1. Generera flugor för att testa funktionella defekter i det visuella systemet. Cross Virgin honor från rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 linje till män med referens eller variant UAS-mänskliga cDNA transgener att uttrycka de mänskliga proteiner av intresse i R1-R6 fotoreceptorer.
      Anmärkning: Cross 3-5 Virgin honor till 3-5 hane flugor i en enda flaska och överföra kors varje 2-3 dagar att ha många djur estängning från ett enda kors. Alla korsningar måste förvaras i en inkubator inställd på försöks temperaturen för att uppnå konsekventa resultat.
    2. När flugor börjar eclose (vid 25 ° c, ~ 10 dagar efter inställning av det initiala korset), samla avkomman (Rh1-GAL4/+; UAS-Human cDNA/+) i färska flaskor och placera tillbaka dem i inkubatorn inställd på försöks temperaturen i ytterligare 3 dagar för det visuella systemet att mogna.
      Obs: även om ERG kan utföras på 1-2 dag gamla flugor, kan nyligen eclosed flugor har stora svängningar i deras ERG signal. Om det önskas att undersöka en åldersberoende fenotyp, dessa flugor kan åldras i flera veckor så länge de är regelbundet (t. ex., varje ~ 5 dagar) överförs till en ny injektionsflaska för att undvika drunkning i våt mat.
    3. Förbered flugorna för ERG inspelning genom att först anesthetizing flugorna med hjälp av CO2 eller placera dem i en flaska på is. Limma försiktigt ena sidan av flugan på ett glas Mikroskop glida för att immobilisera dem.
      Obs: flera referens och variant flugor kan limmas på en enda bild. Placera alla flugor i ungefär samma orientering med ett öga är tillgänglig för inspelningen elektroden. Var noga med att inte få lim på ögat och att lämna snabel gratis.
    4. Förbered inspelnings-och referens elektroderna. Placera en 1,2 mm glas kapillär i en nål avdragare och aktivera. Bryt kapillärröret för att få två skarpa avsmalnande elektroder. De resulterande elektroderna ska vara ihåliga och ha en slutlig diameter på < 0,5 mm.
    5. Fyll kapillärerna med saltlösning (100 mM NaCl), se till att det inte finns några luftbubblor. Skjut glas kapillärerna över silvertråd elektroder (både inspelnings elektrod och referenselektrod, se figur 4) och säkra kapillärerna på plats.
    6. Konfigurera stimulatorn och förstärkaren. En detaljerad uppsättning finns i Lauwers, et al.67. UDN Drosophila Mosc-set-up består av utrustning som listas i material sektionen.
      1. Ställ in förstärkaren på 0,1 Hz högpassfilter, 300 Hz lågpassfilter, och 100 Gain.
      2. Ställ in stimulatorn till 1 s period, 500 ms Pulse Width, 500 ms puls fördröjning, körningsläge och 7 amp.
      3. Förbered ljuskällan för fotostimulering. Använd en halogenljuskällan för att aktivera fly-fotoreceptorerna.
      4. Förbered inspelningsprogrammet på en dator som är ansluten till ERG-uppsättningen. Skapa ett stimuleringsprotokoll med förvärvs modellen "fasta längd händelser" och 20 s varaktighet.
    7. Acclimate flugorna för att slutföra mörkret innan ERG inspelningar påbörjas. Placera flugorna i fullständigt mörker i minst 10 minuter innan experimentet påbörjas.
      Eftersom flugor inte kan detektera rött ljus, Använd en röd ljuskälla under perioden av mörk tillvändan.
    8. Placera bilden som innehåller flugorna på inspelningsapparaten och flytta de micromanipulatorer som transporterar referens-och inspelnings elektroderna till en punkt nära flyg av intresse på bilden. Titta på spetsen av elektroden och försiktigt placera referenselektroden i bröstkorgen i flugan (penetrera nagelbanden). När referenselektroden är stabilt insatt, placera inspelnings elektroden på ögats yta.
      Anmärkning: den exakta positionen för denna referenselektrod har ingen större inverkan på ERG-signalen. Inspelnings elektroden bör placeras på ögats yta eftersom ERG är en fält potentiell inspelning snarare än en intracellulär inspelning. Den rätt mängd tryck som appliceras på inspelnings elektroden orsakar en liten grop utan att tränga in i ögat.
    9. Stäng av alla lampor för en annan 3 min att vänja flugor till den mörka miljön.
    10. Ställ in inspelningsprogrammet och påbörja inspelningen av signalen. Om du använder en halogenljuskällan med manuell slutare, slå på ljuskällan med slutaren stängd. Börja spela insignalen.
    11. Exponera flyga ögon för ljus genom att öppna och stänga slutaren varje 1 s för 20 s varaktigheten av en enda körning.
      Anmärkning: på/av för halogenljuskällan kan styras manuellt eller programmeras att automatiseras med en vit LED-ljuskällan. Mer robust och pålitlig ERG kan erhållas genom att använda en halogenljuskällan jämfört med en vit ljus LED, sannolikt på grund av det bredare ljusspektrum som avges från halogenljuskällan.
    12. Spela in ERGs från alla flugor som är monterade på glas bilden. Utför ERGs från 15 flugor per genotyp per tillstånd.
      Obs: vissa parametrar som kan ändras för att hitta ett villkor som visar robusta skillnader mellan referens-och variant-cdnas kan innefatta temperatur, ålder eller miljöförhållanden (t. ex. uppfödda i ljus-mörk cykel eller konstant ljus/mörker).
    13. Utför dataanalys: jämför ERGs från referens, variant och kontroller för att avgöra om det finns skillnader. Utvärdera ERG-data för förändringar i transienter, depolorisering, off-transienter och repolarisering69 (figur 4B).
      Anmärkning: depolarisering och repolarisering återspeglar aktivering och inaktivering av ljusöverledningen kaskaden inom fotoreceptorer, medan on-och off-transienter är åtgärder av verksamheten i post-synaptiska celler som tar emot signaler från fotoreceptorerna. Minskad amplitud och förändrad kinetik av repolarisering är ofta förknippade med defekter med fotoreceptor funktion och hälsa, medan defekter i on-och off-transienter finns i mutanter med defekt synapsen utveckling, funktion, eller underhåll 70.
    14. Vid identifiering av skillnader i ERG fenotyper med överuttryck av referens kontra variant Human cDNAs, Bestäm om denna elektrofysiologiska fenotyp är förknippad med strukturella och ultrastrukturella defekter i fotoreceptorer och deras synapser genom att utföra histologisk analys och transmissionselektronmikroskopi.
      Anmärkning: vidare diskussion om tolkningen av ERG-defekter och strukturell/ultrastrukturell analys har beskrivits tidigare69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Funktionell studie av de Novo missense variant i EBF3 kopplad till neuroutvecklingsrelaterade fenotyper
I en 7-årig hane med neuroutvecklande fenotyper inklusive hypotoni, ataxi, global utvecklingsförsening, och expressiv talsvårigheter, läkare och mänskliga genetiker vid National Institutes of Health odiagnostiserade sjukdomar Project (UDP) identifierade en de Novo genom variant (p. R163Q) i EBF3 (tidig b-cells faktor 3)15, en gen som kodar en Coe (Collier/Olfactory-1/Early b-cells Factor) familj transkription faktor. Detta fall lämnades in till UDN MOSC i mars 2016 för funktionella studier. För att bedöma om denna gen var en bra kandidat för detta fall, samlades MOSC mänskliga genetiska och genomisk information från OMIM, ClinVar, ExAC (nu utvidgas till gnomAD), geno2MP, DGV och dechiffrera. Dessutom identifierades de ortologösa generna i viktiga MO-arter med hjälp av DIOPT-verktyget. Genuttryck och fenotypisk information från enskilda MO-databaser (t. ex. Wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) erhölls då. De informations analyser som utfördes för EBF3 och andra banbrytande studier i UDN Mosc utgjorde grunden för den senare utvecklingen av MARRVEL-resursen30.

Den information som samlats in med hjälp av denna metod indikerade EBF3 var inte förknippad med någon känd mänsklig genetisk störning vid tidpunkten för analysen, och det drogs slutsatsen att p. R163Q varianten var en bra kandidat baserat på följande information. (1) denna variant hade inte tidigare rapporterats i kontroll populationen databaser (ExAC) och sjukdoms population databas (geno2MP), vilket tyder på att detta är en mycket sällsynt variant. (2) baserat på ExAC, den pLI (sannolikhet för LOF intolerans) poäng av denna gen är 1,00 (pLI poängintervall från 0,00-1,00). Detta indikerar att det finns selektivt tryck mot LOF-varianter i denna gen i den allmänna populationen och tyder på att haploinsufficiens av denna gen kan orsaka sjukdom. För mer information om PLI score och dess tolkning, en medföljande marrvel tutorial artikel i jove31 och relaterade papper ger information30,71.

Den p. R163Q variant ansågs också vara en bra kandidat eftersom (3) det ligger i den evolutionärt bevaras DNA-bindande domän av detta protein, vilket tyder på att det kan påverka DNA-bindning eller andra proteiner funktioner. (4) den p. R163 rester är evolutionärt bevaras från C. elegans och Drosophila till människor, vilket tyder på att det kan vara avgörande för protein funktionella över arter. (5) EBF3 ortologgar har varit inblandade i neuronala utveckling i flera Mo72 inklusive C. elegans73, Drosophila74, Xenopus75, och möss76. (6) under hjärnans utveckling hos möss, Ebf3 har visat sig fungera nedströms ARX (aristaless-relaterade HomeBox)77, en gen som är associerad med flera epilepsi och intellektuella funktionshinder syndrom hos människor78. Därför, dessa data tillsammans tyder på att EBF3 är mycket sannolikt att vara avgörande för mänsklig neuroutveckling och att p. R163Q varianten kan ha funktionella konsekvenser.

För att bedöma om p. R163Q påverkar EBF3 funktion, en T2A-GAL4 linje för Knut (KN, the fly ortholog av human EBF379) genererades via rmce av en kodning intronic härma insättning15. KNT2A-GAL4 linjen är recessiv dödlig och misslyckats med att komplettera dödlighet av en klassisk KN allel (KNCol-1) samt molekylärt definierade brist som täcker KN [DF (2r) BSC429]80 . Uttrycks mönstren i GAL4 reflekterade också tidigare rapporterade mönster av KN -uttryck i hjärnan samt i Wing imaginal Disc15. UAS transgena flugor genererades då för att tillåta uttrycket av referens och variant Human EBF3 cDNA samt Wild-Type fly KN cDNA. Alla tre proteiner var märkta med en C-Terminal 3xHA tagg. Viktigare, UAS Wild-Type fluga KN (KN+) eller referens Human EBF3 (EBF3+) transgener räddade dödlighet i KNT2A-GAL4/DF (2r) BSC429 i liknande utsträckning ( Figur 3C, vänster panel)81.

Däremot, UAS-Human EBF3 transgenens med p. R163Q variant (EBF3p. R163Q) kunde inte rädda denna Mutant, vilket tyder på att p. R163Q variant påverkar EBF3 funktion in vivo15. Intressant, när bedömas med hjälp av en anti-HA antikropp, den EBF3p. R163Q protein framgångsrikt uttrycks i flugan vävnader, och dess nivåer och subcellulära lokalisering (främst nukleära) var omöjlig att skilja från de av EBF3+ och KN+. Detta tyder på att varianten inte orsakar en LOF fenotyp på grund av proteininstabilitet eller mis-lokalisering. För att ytterligare bedöma om p. R163Q variant påverkade transkriptionella aktiveringsfunktionen hos EBF3utfördes en luciferase-baserad reporter analys i HEK293 celler15. Detta experiment i odlade mänskliga celler avslöjade att EBF3p. R163Q varianten misslyckats med att aktivera transkription av reportern konstruktioner, stödja LOF modell som erhållits från Drosophila experiment.

Parallellt med de experimentella studierna ledde samarbeten med läkare, mänskliga genetiker och genetiska rådgivare vid BCM till identifiering av ytterligare två personer med liknande symtom. En patient bar den identiska p. R163Q-varianten, och en annan bar en genom-variant som påverkade samma rester (s. R163L). Den p. R163L variant också misslyckats med att rädda flyga KN Mutant93 tyder på att denna ALLEL också påverkat EBF3 funktion. Intressant, detta arbete publicerades back-to-back med två oberoende humangenetik studier som rapporterade ytterligare personer med de Novo missense, nonsens, frameshift och skarvning varianter i EBF3 kopplade till liknande neuroutvecklingsrelaterade fenotyper82,83. Därefter publicerades ytterligare tre uppsatser som rapporterade fler fall av de Novo EBF3 varianter och kopiera nummer radering84,85,86. Denna roman neuroutvecklingssyndrom är nu känd som hypotoni, ataxi, och fördröjd utveckling syndrom (HADDS, MIM #617330) i online-Mendelian arv i man (OMIM, en auktoritativ databas för genotyp-fenotyp relationer hos människor).

Funktionell studie av Dominantly ärftlig missense variant i TBX2 kopplad till en Syndromic kardiovaskulära och skelettutveckling störning
I en liten familj som drabbats av överlappande spektrum av kraniofacial dysmorphism, hjärt anomalier, skelettmissbildningar, immunbrist, endokrina avvikelser, och utvecklingsstörning, identifierade UDN Duke klinisk plats en genom variant (p. R20Q) i TBX2 som segregerar med sjukdomfenotyper87. Tre (son, dotter, mor) av de fyra familjemedlemmar påverkas av detta villkor, och sonen uppvisade de allvarligaste fenotyp. Kliniskt, träffade han en diagnos av "komplett DiGeorge Syndrome", ett tillstånd som ofta orsakas av haploinsufficiens av TBX1. Även om det inte fanns några mutationer identifierade i TBX1 i denna familj, klinikerna och mänskliga genetiker fokuserade på en variant i TBX2, eftersom tidigare studier på möss visade att dessa gener har överlappande funktioner under utveckling88 . TBX1 och TBX2 båda tillhör T-Box (TBX) familj av transkription faktorer som kan fungera som transkriptionella repressorer samt aktivatorer beroende på sammanhanget.

Tidigare, varianter i 12 av 17 medlemmar av TBX familjen gener var kopplade till mänskliga sjukdomar. Den MOSC beslutat att experimentellt fullfölja denna variant baserat på följande information som samlats in genom MARRVEL och andra resurser. (1) denna variant rapporterades endast en gång i en kohort av ~ 90 000 "kontroll" individer i gnomAD (denna variant filtrerades ut i en standardvy, sannolikt på grund av låg täckning läsningar). Med tanke på den mildare fenotypiska presentationen av modern, detta kan fortfarande betraktas som en sällsynt variant som kan vara ansvarig för sjukdomen fenotyper. (2) pLI-poängen för TBX2 i exac/gnomAD är 0,96/0,99, vilket är högt (maximum = 1,00). Dessutom är den o/e (observerade/förväntade) LOF score i gnomAD 0,05 (endast 1/18,6 förväntad LOF-variant observeras i gnomAD). Dessa numrerar föreslår att LOF variants i denna gen är utvald mot i den allmänna befolkningen.

Dessutom (3) den p. R20 är evolutionärt bevaras från C. elegans och Drosophila till människor, vilket tyder på att detta kan vara en viktig restsubstanser för TBX2 funktion. (4) flera program förutsäga att varianten är sannolikt skadliga (polyphen: möjligen/förmodligen skadligt, SÅLLA: deleterious, CADD Poäng: 24,4, REVEL Poäng: 0,5). (5) MO mutanter uppvisar defekter i vävnader som påverkas hos patienter (t. ex. knockout-möss som uppvisar defekter i hjärt-kärlsystemet, mag-/alimentsystem, kraniofacial, extremiteter/siffror). Därför, tillsammans med de biologiska kopplingarna mellan TBX1 och TBX2 och fenotypiska kopplingar mellan dessa patienter och DiGeorge syndrom, var det optimalt att utföra funktionella studier av varianter i denna gen med hjälp av Drosophila.

För att bedöma om p. R20Q variant påverkar TBX2 funktion, en T2A-GAL4 linje i KLYVD (bi; Drosophila ortholog mänskliga TBX2), genererades via rmce av en kodning intronic härma (figur 2)87. Denna allel, biT2A-GAL4, var recessiv Pupp dödlig och uppförde sig som en stark LOF Mutant, liknande tidigare rapporterade bi LOF alleler (t. ex., biD2, biD4; Figur 2 E). den dödlighet av dessa klassiska och nyligen genererade bi alleler räddades av en ~ 80 KB genomisk räddning konstruera bär hela bi Locus, vilket tyder på att dessa reagenser är verkligen rena LOF alleler. Uttrycksmönstret för GAL4 i raden biT2A-GAL4 matchade också väl med tidigare rapporterade bi -uttryck i flera vävnader, inklusive i Wing imaginal Disc (figur 2D).

Parallellt genererade UAS-transgena linjer för TBX2 som transporterar referens-eller variant (p. R20Q) sekvenser. Tyvärr kunde varken transgenens rädda dödlighet i biT2A-GAL4 linjen. Viktigt, en vild-typ flyga UAS-bi transgenens också misslyckats med att rädda biT2A-GAL4 allele, sannolikt på grund av dosering-känslighet av denna gen. Faktum är att överuttryck av UAS-bi+ och UAS-TBX2+ orsakat en viss grad av dödlighet när överuttrycks i ett vildtyp djur. Denna toxiska effekt av bi/TBX2 överuttryck utnyttjades som en funktionell analys för att bedöma om p. R20Q varianten kan påverka TBX2 funktion. Eftersom Drosophila bi -genen har studerats utförligt inom ramen för det visuella systemet [genen kallas även optomotor blind (OMB)], har fenotyper relaterade till det visuella systemet undersökts utförligt. När referens TBX2 uttrycktes med hjälp av en ey-GAL4 förare som uttrycker UAS-transgener i ögat och delar av hjärnan som är relevanta för det visuella systemet, ~ 85% dödlighet (figur 3C, höger panel) och betydande minskning av ögon storlek (figur 4B) observerades. Denna fenotyp var starkare än den fenotyp som observerades när en Wild-Type fly UAS-bi transgenens uttrycktes, vilket tyder på att den mänskliga TBX2 är mer skadligt för flugan när överuttryckt.

Intressant, p. R20Q TBX2 var mindre potent i orsakar dödlighet (figur 3C, höger panel) och inducera en liten öga fenotyp (figur 4B) med samma förare under samma villkor87, vilket tyder på att varianten påverkar protein funktionen. Dessutom, funktionen av fotoreceptorer överuttrycker referens och variant TBX2 med hjälp av en annan GAL4 förare, (Rh1-GAL4) som uttryckligen uttrycker UAS transgener i R1-R6 fotoreceptorer, visade att varianten TBX2 uppvisade en mycket mildare ERG fenotyp jämfört med referens TBX2 (figur 4B)87. Intressant, de flesta av p. R20Q TBX2 protein hittades fortfarande i kärnan, liknar referensproteinet, vilket tyder på att varianten inte påverkade nukleär lokalisering. En luciferase-baserade transkriptionella repression assay i HEK293T celler visade att p. R20Q inte kunde effektivt förtränga transkription av en reporter konstruera med palindrom T-Box platser87. Dessutom, minskningar i proteinnivåer av TBX2p. R20Q observerades jämfört med TBX2+, vilket tyder på att varianten kan påverka översättningen eller protein stabiliteten hos TBX2, vilket i sin tur påverkar dess överflöd i en cell.

Ytterligare patienter med sällsynta varianter i TBX2 identifierades av kliniker vid UDN-hertigen klinisk plats parallellt med dessa experimentella studier.  En 8-årig pojke med en de Novo genom (p. R305H) variant från en närstående familj uppvisade många av de funktioner som finns i den första familjen87. Ytterligare funktionella studier i Drosophila och mänskliga cellinjer visade att p. R305H varianten också påverkar TBX2 funktion och proteinnivåer, starkt tyder på att defekter i denna gen sannolikt ligger bakom många fenotyper som finns i de två familjerna. Denna störning var nyligen curated som "vertebrala anomalier och varierande endokrina och T-cells dysfunktion" (VETD, MIM #618223) i OMIM. Identifiering av ytterligare personer med skadliga varianter i TBX2 med överlappande fenotyper är avgörande för att förstå hela spektrumet av genotyp-fenotyp relationer för denna gen i mänskliga sjukdomar.

Figure 1
Figur 1 : Injektion och passagesystem för att generera UAS-Human cDNA och T2A-GAL4 linjer. A) generering av UAS-humana cDNA-transgener genom mikroinjektioner och kors. Passagesystem för att integrera transgener i en andra kromosom docknings plats (VK37) med hjälp av manliga flugor i första och andra generationen visas som ett exempel. Vid injektion av den humana cDNA φc31 transgena konstruktionen (PGW-ha. attb) i tidiga embryon som innehåller en köns cells källa till φc31 integras (märkt med 3xp3-GFP och 3xp3-RFP) och VK37 docknings plats [märkt med en gul+ (y+ ), kan transgena händelser följas med den vita+ (w+)-minigenen som finns i den transgena vektorn. Det rekommenderas att korsa ut φC31 integrashämmare genom att välja mot flugor med GFP och RFP. Den sista stabila beståndet kan hållas som homozygoter eller som en balanserad lager om kromosomen bär en andra plats dödliga/sterila träff mutation. Förekomst av andra platsen dödliga/sterila mutationer på en transgena konstruktioner vanligtvis inte påverkar resultatet av funktionella studier så länge dessa transgener används i en heterozygot tillstånd (figur 3). (B) generering av T2A-GAL4 linjer genom mikroinjektion och korsningar. Passagesystem för att konvertera en andra kromosom efterlikna insättning i ett T2A-GAL4 element visas som ett exempel. Genom att mikroinjicera en uttrycks vektor för φC31 integrashämmare och RMCE-vektor för T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70 väljs en lämplig läsram för den härma av intresse. Se följande papper för detaljer57,59 till embryon som transporterar en härma i en kodning intron i genen av intresse, kan man konvertera den ursprungliga härma i en T2A-GAL4 linje. Figur 2 A visar ett Schematiskt diagram över rmce-konverteringen. Konverteringshändelsen kan väljas genom att avskärma mot y+ -markören i den ursprungliga MiMIC-kassetten60. Eftersom RMCE kan förekomma i två riktningar, endast 50% av den lyckade omvandlingen händelsen leder till framgångsrik produktion av GAL4, som kan upptäckas av en UAS-GFP reporter transgenens i nästa generation. Det slutliga stabila beståndet kan hållas som homozygoter eller som en balanserad lager om LOF av genen är dödlig/steril. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Omvandling av härma element till T2A-GAL4 linjer via RMCE. (A) φc31 integras underlättar rekombinationen mellan de två attP -platserna i flugan (överst) och två attb -platser som flör en T2A-GAL4 kassett som visas som en cirkulär vektor (botten). (B) lyckade rmce händelser leda till en förlust av en valbar markör (gul +) och insättning av T2A-GAL4 kassetten i samma orientering av genen av intresse. Eftersom RMCE händelsen kan ske i två riktningar, endast 50% av RMCE reaktionen ger en önskad produkt. En rmce produkt infogas i motsatt riktning kommer inte att fungera som en gen-trap allel eller Express GAL4. Konstruktionen måste bekräftas med hjälp av sanger-sekvensering. (C) transkription (överst) och översättning (botten) av genen av intresse leder till generering av en stympad mRNA och protein på grund av Polya signalen finns vid 3 ' änden av T2A-GAL4 kassett. Den T2A är en Ribosomen hoppande signal, som gör att ribosom att stoppa och initiera översättningen efter denna signal. Detta används för att generera ett GAL4 element som inte är kovalent knutna till den trunkerade genprodukten av intresse. Den GAL4 kommer in i kärnan och kommer att underlätta transkription av transgener som är under kontroll av UAS element. UAS-GFP kan användas som en gen Expression reporter, och UAS-Human cDNA kan användas för räddnings experiment via Gene "humanisering". (D) visas är ett exempel på ett T2A-GAL4 element i bi kör uttryck av UAS-GFP (överst). Detta uttrycksmönster liknar en tidigare genererad Enhancer trap-linje för samma gen (biOMB-GAL4; nederst). E) jämförelse av T2A-GAL4 allel av bi med tidigare rapporterade LOF bi -alleler. Denna siffra har antagits och modifierats från tidigare publikationer57,87. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Funktionell analys av humana varianter med hjälp av räddnings-baserade (vänster) och överuttrycksbaserade (höger) studier. (A) (vänster panel): funktionen av EBF3 varianter bedömdes med en räddningsaktion-baserad analys av flugknut (KN) LOF allel med fokus på dödlighet/lönsamhet; (höger panel): funktionen av varianter i TBX2 bedömdes genom att utföra överuttryck av mänskliga TBX2 transgener i Wild-Type flugor, med fokus på dödlighet/lönsamhet, ögonmorfologi och elektrofysiologi fenotyper (figur 4) . Bövergångsordningar för att erhålla de flugor som skall provas i funktions studierna. Det rekommenderas att alltid använda en neutral UAS element (t. ex., UAS-lacZ, UAS-GFP) som ett kontroll experiment. C) representativa resultat från funktionella studier av EBF3p. R163Q respektive TBX2p. R20Q varianter, tillsammans med lämpliga kontroll experiment som är nödvändiga för att tolka resultaten. Både räddningsbaserad analys och överuttrycks studier visar att varianterna beter sig som amorfiska eller hypomorfiska alleler. Uppgifterna om dödlighet/lönsamhet som visas här är baserade på experimentella data som presenteras i tidigare publikationer15,87. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Funktionell analys av en sällsynt genom variant i human TBX2 baserad på ögonmorfologi och elektroretinogram i Drosophila. A) enSchematisk bild som visar den typiska placeringen av inspelnings-och referenselektroder på flugögat, tillsammans med ett representativt elektroretinogram som registrerar med fyra huvudkomponenter (på övergående, depolarisering, av-övergående, repolarisering). (B) TBX2 variant (p. R20Q) fungerar som en partiell LOF-allel baserad på överuttrycks studier i flug ögat med hjälp av GAL4 drivrutiner som är specifika för det visuella systemet (ey-GAL4 och Rh1-GAL4). Detta visade att referens TBX2 orsakade en stark morfologisk och Elektrofysiologisk fenotyp jämfört med variantproteinet. (Top paneler): en kraftig minskning av ögon storlek ses vid överuttryck av UAS-TBX2+ med ey-GAL4. UAS-TBX2s. R20Q. Driven med ey-GAL4 orsakar också ett mindre öga, men fenotyp är mycket mildare. (Botten paneler): När UAS-TBX2+ uttrycks i core R1-R6-fotoreceptorer med Rh1-GAL4, finns det en förlust av on-och off-transienter, reducerad depolarisering och stor onormal långvarig depolarisering efter potentiell (PDA) fenotyp. som inte syns i kontroll flugor. Dessa fenotyper är inte lika allvarliga som när UAS-TBX2p. R20Q uttrycks med samma Rh1-GAL4. Denna siffra har antagits och modifierats från tidigare publikationer69,87. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Syfte Verktyg Url
Variant funktion
algoritmer för förutsägelse		 PolyPhen-2
Sålla
CADD
PROVEAN
MutationTaster
Frossa		 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
Sällsynta och odiagnostiserade
sjukdoms forskning
Konsortier		 Udn
RDMM
IRUD
SOLVE-RD
AFGN		 https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
Integrativ databas för
människa och modell
organismens information		 MARRVEL
Monarch Initiative
Gene2Function
Fenostockar		 http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
Mänskliga genetiska och
Genomics-databaser		 OMIM
ClinVar
ExAC
gnomAD
GenoMP
V
Dechiffrera		 https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Ortholog identifieringsverktyg DIOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Modellorganism
Databaser och biomedicinska
Litteratursökning		 WormBase (C elegans)
FlyBase (Drosophila)
ZFIN (Zebrafish)
MGI (mus)
Pubmed		 https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genetiska och protein
interaktions databaser		 Sträng
Dimma		 https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Protein struktur
databaser och
modelleringsverktyg		 WWPBD
SWISS-MODEL
Umbrello modeller
Phyre2 		http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Patientens matchmaking
Plattformar		 Matchmaker utbyte
GeneMatcher
AGHA Arkiv
Matchbox
Dechiffrera
MyGene2
Phenome Central		 http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
Mänsklig avskrift
anteckning och cDNA
klona information		 Insamling av däggdjurs gener
Häckning
RefSeq		 https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tabell 1: onlineresurser relaterade till detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Experimentella studier med Drosophila melanogaster ger ett robust analyssystem för att bedöma konsekvenserna av sjukdomsassocierade mänskliga varianter. Detta beror på den stora mängden kunskap och olika genetiska verktyg som har genererats av många forskare i flug fältet under det senaste århundradet89. Precis som alla andra experimentella system är det dock viktigt att erkänna de förbehåll och begränsningar som finns.

Varningar i samband med data utvinning
Även om det första steget i detta protokoll är att bryta databaser för information som hänför sig till en gen av intresse, är det viktigt att använda den endast som utgångspunkt. Till exempel, även om i silico förutsägelse av variant-funktionen ger värdefulla insikter, bör dessa data alltid tolkas med försiktighet. Det finns några fall där alla större algoritmer förutspår att en mänsklig variant är godartad, men funktionella studier i Drosophila visade tydligt den skadliga karaktären hos sådan variant24. Likaså, även protein-protein interaktioner, Co-uttryck, och strukturella modelleringsdata är alla insiktsfulla bitar av information, kan det finnas pseudo-positiv och pseudo-negativ information som finns i dessa stora-omics datamängder. Till exempel, några av de tidigare identifierade eller förväntade protein-protein interaktioner kan vara konstgjorda eller bara ses i vissa cell-och vävnadstyper.

Dessutom, det kan finnas många falska negativa interaktioner inte fångas i dessa datamängder, eftersom vissa protein-protein interaktioner är övergående (t. ex., enzym-substrat interaktioner). Experimentell validering är avgörande för att visa att vissa gener eller proteiner genetiskt eller fysiskt interagerar in vivo i det biologiska sammanhanget av intresse. Likaså, strukturer förutspådde baserat på homologi modellering bör behandlas som en modell snarare än löst struktur. Även om denna information kan vara användbar om det konstateras att en aminosyra av intresse finns i en strukturellt viktig del av proteinet, utesluter negativa data inte möjligheten att varianten kan vara skadligt. Slutligen bör en del av den tidigare rapporterade informationen om genotyp-fenotyp också behandlas med försiktighet, eftersom viss information som arkiveras i offentliga databaser kanske inte är korrekt. Till exempel baseras viss information i MO-databaser på experiment som har kontrollerats och utförts rigoröst, medan andra kan komma från ett stort skärm papper utan ytterligare uppföljningsstudier och stränga kontroller.

"Humanisering" experiment med T2A-GAL4 strategi inte alltid framgångsrik
Medan räddnings-och overexpression-baserade funktionella studier med mänskliga cDNAs tillåta bedömning av varianter i samband med det mänskliga proteinet, är denna metod inte alltid framgångsrik. Om en referens människa cDNA inte kan rädda flugan Mutant fenotyp, det finns två sannolika förklaringar. Den första möjligheten är att det mänskliga proteinet är fungerar inte eller har signifikant minskad aktivitet i samband med en flugcell. Detta kan bero på 1) minskat proteinuttryck, stabilitet, aktivitet och/eller lokalisering eller 2) bristande kompatibilitet med flug proteiner som fungerar i ett multiproteinkomplex. Eftersom UAS/GAL4-systemet är temperaturkänsligt kan flugorna höjas vid en relativt hög temperatur (t. ex. 29 ° c) för att se möjligheten till en räddning i detta tillstånd. Dessutom kan en UAS-fly cDNA konstruera och transgenens som en positiv kontroll genereras. Om den variant av intresse påverkar en bevarad aminosyra, kan den analoga varianten införas i fluga cDNA för funktionell studie av varianten i samband med fluga ortoolog. Även om detta inte är nödvändigt, det hjälper i hög grad studien i fall att med hjälp av humana cDNA transgena linjer ger negativa eller ofullständiga resultat (figur 3).

Den andra möjligheten är att uttrycket av humant protein orsakar vissa cellulära-eller organism-nivå toxicitet. Detta kan bero på antimorfiska (t. ex. som ett dominerande negativt protein), hypermorf (t. ex. för mycket aktivitet) eller neomorf (t. ex. få en ny toxisk funktion såsom protein aggregering som inte alltid är relaterad till den endogena funktionen hos genen räntor) effekter. I detta fall, att hålla flugor i en låg temperatur (t. ex., 18 ° c) kan lindra vissa av dessa problem. Slutligen finns det några scenarier där överuttryck av en fluga cDNA inte kan rädda flyga T2A-GAL4 linje som ses i TBX2 exempel, sannolikt på grund av färdigt dosering beroende av genprodukten. För att undvika överuttryck av ett protein av intresse, kan fly gen av intresse ändras direkt via CRISPR, en genomisk räddning konstruera kan konstrueras som innehåller den variant av intresse, eller räddnings experiment kan utföras med hjälp av en LOF allel21. För små gener, "humaniserande" flyga genomisk räddning konstruera kan anses testa mänskliga varianter som påverkar icke-bevarade aminosyror24. Sammanfattnings, alternativa strategier bör övervägas när humanisering experimentet inte tillåter funktionell bedömning av den variant av intresse.

Tolka negativa och positiva resultat
Om 1) både referens och variant humant cDNAs rädda flugmuterade fenotyper till en liknande grad och 2) det finns ingen skillnad observeras i alla testade tillstånd, då kan man anta att varianten är funktionellt omöjlig att särskilja i Drosophila i Vivo. Det är dock viktigt att notera att denna information inte är tillräcklig för att utesluta att en variant av intresset är icke-patogen, eftersom Drosophila -analysen kanske inte är tillräckligt känslig eller fångar upp alla potentiella funktioner hos genen/proteinet av intresse relevanta för människor. Positiva data, å andra sidan, är en stark indikation på att varianten har skadliga konsekvenser för protein funktionen, men enbart dessa data är fortfarande inte tillräckliga för att göra anspråk på patogenicitet. American College of Medical genetik and Genomics (ACMG) har publicerat en uppsättning standarder och riktlinjer för att klassificera varianter i mänskliga sjukdomsassocierade gener till "benign", "sannolikt godartad", "variant av okänd betydelse (VUS)", "sannolikt patogena", och "patogena"90. Även om denna klassificering endast gäller för etablerade sjukdomsrelaterade gener och inte är direkt tillämplig på varianter i "gener av osäker betydelse" (GUS), uppmuntras alla individer som är involverade i funktionella studier av Human variant starkt att Följ denna riktlinje när du rapporterar variant funktion.

Extrahera användbar biologisk information när MO fenotyper inte modellera ett mänskligt sjukdomstillstånd
Det är viktigt att hålla i minnet att overexpression-baserade funktionella analyser har begränsningar, särskilt eftersom några av de fenotyper som görs kan ha liten relevans för sjukdomstillstånd av intresse. På samma sätt kan fenotyper som bedöms genom räddnings experiment inte ha någon direkt relevans för den sjukdom som är av intresse. Eftersom dessa experiment bedrivs utanför de endogena kontexterna i ett ryggradslöst system bör de inte betraktas som sjukdomsmodeller utan snarare som ett gen funktionstest med hjälp av Drosophila som ett "levande provrör".

Även om modellorganismen inte härmar en mänsklig sjukdomstillstånd, kan och fenotyper som används i räddnings experiment ofta ge användbara biologiska insikter i sjukdomstillstånd. Begreppet "fenostockar (icke-uppenbara homolog fenotyper)"91 kan användas för att ytterligare fastställa underliggande molekylära samband mellan Drosophila och humana fenotyper. Till exempel, morfologiska fenotyper i flygel, Thorax, ben och ögon är utmärkta fenotypiska avläsning för defekter i notch signalering väg, en evolutionärt bevarad väg kopplad till många medfödda sjukdomar, inklusive kardiovaskulära defekter hos människa62. Genom att förstå den molekylära logiken bakom vissa fenotyper i Drosophila, är det möjligt att identifiera dolda biologiska kopplingar mellan gener och fenotyper hos människor som ännu inte är förstådda.

Kontinuerlig kommunikation med kliniska medarbetare
När man arbetar med kliniker för att studera funktionen hos en sällsynt variant som finns hos patienten är det viktigt att etablera ett starkt samarbets förhållande. Även om kliniska och grundläggande biomedicinska forskare kan dela intressen i samma gener/genetiska vägar, finns det en stor kulturell och språklig (t. ex. medicinsk jargong, modell organism-specifik nomenklatur) gap mellan de kliniska och vetenskapliga områden. En stark, förtroendebaserad relation mellan de två parterna kan byggas genom omfattande kommunikation. Dessutom är dubbelriktad kommunikation avgörande för att etablera och underhålla denna relation. Till exempel, i de två fall som beskrivs i avsnittet representativa resultat, identifiering av ytterligare patienter med liknande genotyper och fenotyper, samt efterföljande funktionell studie, var avgörande för att bevisa patogenicitet av varianter av intresse. Även med starka funktionella data, forskare och kliniker ofta har svårt att övertyga mänskliga genetiker att en variant som identifierats i "n = 1" fall är den verkliga orsaken till sjukdomen.

När MO-forskaren upptäcker att en variant av intresset är skadlig, är det viktigt att kommunicera tillbaka till kliniska medarbetare så snart som möjligt så att de aktivt kan försöka identifiera matchande fall genom nätverk med andra kliniker och mänskliga genetiker. Verktyg som geno2MP [genotypes till Mendelian fenotyper: en avidentifierade databas med 9 650 individer inskrivna vid University of Washingtons centrum för Mendelian Genomics studie41; omfattar patienter och familjemedlemmar som misstänks att ha genetiska sjukdomar] kan sökas för att bedöma individer som kan ha samma sjukdom. Sedan kan lead-klinikern kontaktas med hjälp av en meddelandefunktion.

Alternativt kan GeneMatcher användas, vilket är en matchmaking webbplats för kliniker, grundläggande forskare, och patienter som delar intressen i samma gener för att identifiera ytterligare patienter som bär sällsynta varianter. Eftersom GeneMatcher är en del av en större integrativ nätverk av matchmaking webbplatser som kallas matchmaker Exchange42, ytterligare databaser runt om i världen kan sökas, inklusive Australian Genomics Health Alliance patient Arkiv, Broad matchbox , DECHIFFRERA, MyGene2, och PhenomeCentral i en enda GeneMatcher gen underkastelse. Även om deltagande i GeneMatcher är möjligt som en "forskare", det rekommenderas att grundläggande forskare utnyttja denna webbplats med sina kliniska medarbetare, eftersom kommunikationen med andra kliniker efter en match kräver vissa nivåer av medicinsk Expertis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Jose Salazar, Julia Wang, och Dr Karen Schulze för kritisk läsning av manuskriptet. Vi erkänner DRS. ning LiU och XI Luo för funktionell karakterisering av de TBX2 varianter som diskuteras här. Odiagnostiserade sjukdomar nätverk modell organismer screening Center stöddes genom National Institutes of Health (NIH) gemensamma fonden (U54 NS093793). H. T. C. stöddes ytterligare av NIH [CNCDP-K12 och NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (neurovetenskap Research Grant), Burroughs Wellcome Fund (karriär pris för medicinska forskare), Child neurologi Society och Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) och NIH-direktörens tidiga självständighets utmärkelse (DP5 OD026426). M. F. W. stöddes ytterligare av Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. stöddes ytterligare av NIH (R01 DC014932), The Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer ' s Association (ny utredare forskningsstipendium: 15-364099), Naman familj Fund för grundforskning, och Caroline Wiess Law Fund för forskning i Molekylär medicin. Konfokalmikroskopi på BCM stöds delvis av NIH Grant U54HD083092 till intellektuella och utvecklingsstörning Research Center (IDDRC) Neurovisualisering kärna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

Genetik fråga 150 humangenetik och genomik Mendeliska sjukdomar sällsynta och odiagnostiserade sjukdomar nätverk av odiagnostiserade sjukdomar Drosophila melanogaster variant av okänd betydelse VUS gen av osäker betydelse Gus funktionell genomik transgena flugor UAS/GAL4 system T2A-GAL4 elektroretinogram ERG
In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao,… More

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter