Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Published: August 20, 2019 doi: 10.3791/59658
Automatic Translation
*1, *2, 1,3,4,5, 1,2,4, 1,2,4,5
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokolün amacı, insan hastalıkları ile ilişkili nadir gen varyantlarının fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için Drosophila melanogaster'deki in vivo deneylerin tasarımını ve performansını ana hatlarını ortaya çıkarmaktır.

Abstract

Sıralama teknolojisindeki gelişmeler, hem klinik tanı hem de son teknoloji insan genetiği araştırmaları için tüm genom ve tüm eknom veri kümelerini daha erişilebilir hale getirmiştir. Bu veri kümelerinde tanımlanan varyantların patojenitesini tahmin etmek için silico algoritmalarında bir dizi siliko algoritma geliştirilmiş olsa da, fonksiyonel çalışmalar, özellikle yanlış anlama için, spesifik genomik varyantların protein fonksiyonunu nasıl etkilediğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Türev -leri. Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı 'nda (UDN) ve diğer nadir hastalık araştırma konsorsiyumlarında, Drosophila, C. elegans, zebra balığı ve fareler dahil olmak üzere model organizmalar (MO) aktif olarak putatif insan hastalığına neden olan fonksiyonu değerlendirmek için kullanılır Türev -leri. Bu protokol, UDN'nin Model Organizmalar Tarama Merkezi Drosophila Core'da kullanılan nadir insan varyantlarının fonksiyonel değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlamaktadır. İş akışı, birden fazla genel veritabanlarından insan ve MO bilgilerini toplamak, marrvel web kaynağını kullanarak varyantın hastanın durumuna katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmek ve mevcut temele dayalı etkili deneyler tasarlamak ile başlar. bilgi ve kaynaklar. Daha sonra, genetik araçlar (örneğin, T2A-GAL4 ve UAS-insan cDNA hatları) Drosophilailgi varyantlarının işlevlerini değerlendirmek için oluşturulur. Bu reaktiflerin geliştirilmesi üzerine, varyant işlevini değerlendirmek için kurtarma ve aşırı ifade deneylerine dayalı iki uçlu fonksiyonel tahliller yapılabilir. Kurtarma dalında, endojen sinek genleri referans veya varyant insan transgenleri ile ortolog Drosophila gen yerine "insancıl" vardır. Aşırı ifade dalında, referans ve varyant insan proteinleri dışsal dokuların çeşitli tahrik vardır. Her iki durumda da, herhangi bir çatlanabilir fenotip (örneğin, öldürücülük, göz morfolojisi, elektrofizyoloji) ilgi hastalığı ne olursa olsun, bir okuma olarak kullanılabilir. Referans ve varyant aleller arasında gözlenen farklılıklar varyanta özgü bir etki ve dolayısıyla büyük olasılıkla patojenite yi düşündürmektedir. Bu protokol, bilinen ve bilinmeyen işlevleri olan genlerin putatif insan hastalığına neden olan varyantlarının hızlı ve in vivo değerlendirmelerine olanak sağlar.

Introduction

Nadir hastalığı olan hastalar genellikle doğru bir tanı elde etmek için "tanı odyssey" olarak adlandırılan zorlu bir yolculuk geçmesi1. En nadir hastalıkların güçlü bir genetik kökene sahip olduğu düşünülmektedir, klinik çalışma kritik unsurları genetik / genomik analizler yapma. Aday gen paneli dizileme ve kromozom mikrodizileri, bütün ekzom (WES) ve tüm genom dizileme (WGS) teknolojileri dayalı kopya numarası varyasyon analizi ek olarak son on yıl içinde giderek daha değerli araçlar haline gelmiştir2, 3 . Şu anda, WES ve WGS bilinen bir patojenik varyant ı belirlemek için tanı oranı ~ 25% (pediatrik vakalarda daha yüksek)4,5. Klinik WES/WGS'den sonra tanı konmamış olan vakaların çoğunda, yaygın bir sorun birçok aday gen ve varyantolmasıdır. Yeni nesil sıralama genellikle birçok gende yeni veya ultra nadir varyantları tanımlar ve bu varyantların hastalık fenomenilerine katkıda bulunup bulunmadığını yorumlamak zordur. Örneğin, genlerdeki çoğu saçma veya kare kayma mutasyonunun, kodlanmış transkriptin saçma aracılı çürümesi nedeniyle fonksiyon kaybı (LOF) alelleri olduğu düşünülse de, son ekonlarda bulunan kesilen mutasyonlar bu süreçten kaçar ve iyi huylu veya fonksiyon kazancı (GOF)alel6 .

Ayrıca, yanlış algılamalı alelin etkilerini tahmin etmek yıldırıcı bir görevdir, çünkü ilk olarak Herman Muller tarafından 1930'larda (yani, amorf, hipomorf, hipermorf, antimorf, neomorf veya izomorf) açıklandığı gibi farklı genetik senaryolar bir dizi neden olabilir 7 . Evrimsel koruma, amino asit değişiminin türü, fonksiyonel etki alanı içindeki konumu, genel popülasyondaki alel frekansı, ve diğer parametreler8. Ancak, bu programlar varyant yorumlama karmaşık sorunu çözmek için kapsamlı bir çözüm değildir. İlginçtir, yeni bir çalışmada beş yaygın olarak kullanılan varyant patojenik tahmin algoritmaları (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutasyon Taster) patojenite ~ 8% katılıyorum gösterdi . Özellikle, tüm algoritmalar kabul etse bile, patojenite nin %11'ine kadar yanlış bir tahminde bulunurlar. Bu sadece kusurlu klinik yorumlanmasına yol açmakla kalmıyor, aynı zamanda araştırmacıları yanlış bir şekilde iyi huylu olarak listeleyerek yeni varyantları takip etmekten caydırabilir. Silico modellemede mevcut sınırlamayı tamamlamanın bir yolu, varyant fonksiyonunun in vitro, ex vivo (örn. kültürlü hücreler, organoidler) veya in vivo etkisini gösteren deneysel veriler sağlamaktır.

MO nadir hastalık ilişkili varyantları in vivo fonksiyonel çalışmalar benzersiz güçlü13 var ve Amerika Birleşik Devletleri'nde Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı (UDN) ve Nadir dahil olmak üzere dünya çapında birçok nadir hastalık araştırma girişimleri tarafından kabul edilmiştir Hastalıklar Modelleri ve Mekanizmaları (RDMM) Ağları Kanada, Japonya, Avrupa ve Avustralya14. MO araştırmacılarını ulusal ölçekte nadir hastalık tanısı ve mekanistik çalışmaların iş akışına entegre etmek için yapılan bu eşgüdümlü çabalara ek olarak, klinik ve MO araştırmacıları arasında yapılan bir dizi bireysel işbirliği çalışması keşfe yol açmıştır. ve birçok yeni insan hastalığı neden gen ve varyantları82,83,84karakterizasyonu .

UDN'de, merkezi bir Model Organizmalar Tarama Merkezi (MOSC) aday gen ve varyantların sunumlarını hastanın durumunun tanımıyla alır ve varyantın enformatik araçlar kullanılarak patojenik olup olmadığını değerlendirir ve in vivo Deney. UDN'nin Faz I'inde (2015-2018) MOSC, vakaları değerlendirmek için işbirliği içinde çalışan Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] ve Zebrafish Core'dan (Oregon Üniversitesi) oluşuyordu. Drosophila ve zebrabalığı nda bilişim analizi ve farklı deneysel stratejiler bir dizi kullanarak, MOSC şimdiye kadar 132 hastanın tanısına katkıda bulunmuştur, 31 yeni sendromlar belirlenmesi55, birkaç yeni insan keşfi hastalık genleri (örneğin, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) ve bilinen hastalığın fenotipik genişlemesi genler (örneğin, CACNA1A21, ACOX122).

MOSC Drosophila Core araştırmacıları, UDN içindeki projelere ek olarak, Mendelian Genomik Merkezleri ve diğer girişimlerle işbirliği içinde yeni hastalık gen keşiflerine katkıda bulunmuştur (örn. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) bilişim ve genetik aynı seti kullanarak UDN için geliştirilen stratejiler. Nadir hastalık tanısı üzerine MO çalışmalarının önemi göz önüne alındığında, MOSC UDN Faz II (2018-2022) için bir C. elegans Core ve ikinci Zebrafish çekirdek (Her ikisi de Washington Üniversitesi'nde St Louis) içerecek şekilde genişletildi.

Bu el yazması, udn MOSC Drosophila Core'da aktif olarak kullanılan in vivo fonksiyonel çalışma protokolünü açıklar. Protein. Bu protokolün amacı, MO araştırmacılarının klinik araştırma gruplarıyla işbirliği içinde çalışarak, ilgi çeken bir gendeki bir aday varyantın fonksiyonel sonuçları olduğuna dair deneysel kanıtlar sunarak klinik tanıyı kolaylaştırmaktır. Bu protokol en çok, drosophila araştırmacısının, ilgi çeken bir gende belirli bir aday varyantı olan nadir bir hastalık hastası olan bir klinik araştırmacı tarafından yaklaşıldığı bir senaryoda yararlıdır.

Bu protokol üç unsura ayrılabilir: (1) hasta fenotip ve Drosophilafonksiyonel bir çalışmanın fizibilite sorumlu olan ilgi varyantı olasılığını değerlendirmek için bilgi toplama , (2) toplama mevcut genetik araçlar ve yenilerini kurmak ve (3) in vivo fonksiyonel çalışmalar yapmak. Üçüncü öğe, bir ilgi varyantının işlevinin nasıl değerlendirilebileceğine (kurtarma deneyi veya aşırı ifade tabanlı stratejiler) göre iki alt öğeye ayrılabilir. Bu protokolün nadir monojenik hastalık araştırmaları dışında birçok senaryoya uyarlanabildiği ve optimize edilebildiği unutulmamalıdır (örn. yaygın hastalıklar, gen-çevre etkileşimleri ve terapötik hedefleri belirlemek için farmakolojik/genetik ekranlar). Varyantların işlevselliğini ve patojenliğini belirleyebilme becerisi sadece doğru moleküler tanı sağlayarak ilgi çeken hastaya fayda sağlamakla kalmamış, aynı zamanda hem çevirisel hem de temel bilimsel araştırmalar üzerinde daha geniş etkilere de yol açacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Değerlendirmek için İnsan ve MO Bilgi Toplama: Bir İlgi Varyantı Hastalık Fenotipler ve Drosophila Fonksiyonel Çalışmaların Fizibilite Sorumlu Olma Olasılığı

  1. İlgi çekici hastanın fenotipini açıklamak için belirli genve türevlerin iyi adaylar olup olmadığını belirlemek için kapsamlı veritabanı ve literatür aramaları gerçekleştirin. Özellikle, aşağıdaki bilgileri toplayın.
    1. İlgi geninin daha önce diğer genetik bozukluklara (bilinen hastalık geninin henotipik genişlemesi) mi karıştığını veya bunun tamamen yeni bir hastalık adayı gen [belirsiz önemi gen varyantı (GVUS)] olup olmadığını değerlendirin.
    2. Hastalık veya kontrol nüfus veritabanları ilgi varyantı alel sıklığını değerlendirin.
    3. Hastalıkta bu geni içeren kopya numarası varyasyonları (CNV' ler) olup olmadığını değerlendirin veya nüfus veritabanlarını kontrol edin.
    4. Fare, zebra balığı, Drosophila, C. elegans ve maya gibi farklı MO türlerinde ortolog genlerin ne olduğunu değerlendirin, daha sonra bu ortolog genlerin bilinen işlevlerini ve ifade kalıplarını daha fazla araştırın.
    5. İlgi varyantının proteinin fonksiyonel etki alanında mevcut olup olmadığını ve ilginin amino asitinin evrimsel olarak korunup korunmadığını değerlendirin.
      NOT: Bu beş sorunun yanıtları (1.1.1-1.1.5 adımları) bir dizi insan ve MO veritabanlarına tek tek erişerek veya MARRVEL (Nadir Varyant Keşfi için Model organizma Toplu Kaynaklar) web kaynağı kullanılarak elde edilebilir (Bkz. Tablo 1 online kaynaklar için)30, hangi eşlik eden bir makalede derinlemesine açıklanan31. Belirli örnekler için temsili sonuçlar bölümüne bakın. Monarch Girişimi web sitesi32 ve Gene2Function33 de yararlı bilgiler sağlar.
  2. Varyantın bir protein fonksiyonu ndan ve yapı-of-view iyi bir hastalık adayı olup olmadığını daha fazla değerlendirmek için ek bilgi toplamak.
    1. Silico tahmin algoritmalarına dayalı olarak ilgi nin varyantının zarar verici olduğu tahmin edilip edilmeyeceğini değerlendirin.
      NOT: Varyant patojenite algoritmaları son ~15 yıl içinde birçok araştırma grubu tarafından geliştirilmiştir ve bazıları da MARRVEL arama sonuçlarında gösterilmiştir. Aşağıda listelenen iki program da dahil olmak üzere daha yeni programlar, patojenite skoru oluşturmak için birden fazla varyant patojenasyon rediction algoritmaları ve makine öğrenme yaklaşımları birleştirir. Varyant tahmin algoritmaları ve performansları hakkında daha fazla bilgi içinGhosh, ve ark. 8'e bakın. (i) CADD (kombine ek açıklama bağımlı tükenme): insan SNVs yanı sıra kısa eklemeler ve silme 11 için puanları sağlar 60'tanfazla genomik özellikleri, inşa tümleştirici ek açıklama aracı. (ii) REVEL (nadir exome varyant topluluk öğrenci): entegre bir puan sağlamak için birden fazla varyant patojenite algoritmaları (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutasyonAssessor, MutasyonTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP ve phastCons) birleştirir tüm olası insan yanlış algı varyantlarıiçin 34.
    2. İlgi çekici insan geni/proteininin veya MO ortholojisinin daha önce genetik hastalıklarla bağlantılı genlerle/proteinlerle genetik veya fiziksel olarak etkileşime girildiğini belirleyin. Eğer öyleyse, ilgi hasta bu bozukluklar ile örtüşen fenotipler sergiler eğer değerlendirin.
      NOT: MO yayınlarına dayalı genetik ve protein-protein etkileşimlerini ve birden fazla tür ekranından gelen büyük ölçekli proteomikleri analiz etmek için çeşitli araçlar geliştirilmiştir. STRING (komşu genlerin yinelenen örnekleri için arama aracı)35: bilinen ve tahmin protein-protein etkileşimleri için bir veritabanı. Genetik etkileşim ve ortak ifade veri kümelerinin yanı sıra çeşitli organizmalarda birlikte çalışabilen gen ve proteinleri tanımlamak için metin madenciliği araçlarını da entegre eder. MIST (moleküler etkileşim arama aracı)36: çekirdek genetik MOs (maya, C. elegans, Drosophila,zebrabalığı, kurbağa, sıçan, fare) ve insanlardan gelen genetik ve protein-protein etkileşim verilerini birleştiren bir veritabanı. Ortologgenlerden/proteinlerden (interlogs) kaynaklanan etkileşimlerin tahmini de görüntülenir.
    3. İlgi çekici proteinin 3-B yapısının çözülüp çözülmediğini veya modellendiğini belirleyin. Bu durumda, önemli işlevsel etki alanlarıile göre ilgi alanı nın varyantının nerede olduğunu belirleyin.
      NOT: X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve kriyo-elektron mikroskobu ile çözülen protein yapıları PDB (protein veri bankası) ve EMDatabank37dahil olmak üzere genel veritabanlarında bulunabilir. Tahmin edilen/modellenmiş protein yapıları için tek bir veritabanı olmamasına rağmen, kullanıcıların protein modellemesi yapabilmeleri için bir dizi algoritma (yani, SWISS-MODEL38, Model39ve Phyre240)mevcuttur.
  3. Bölüm 1.1-1.2'deki bilişim analizlerinden elde edilen bilgileri tartışmak için klinik işbirlikçilerle iletişim kurun. Klinik işbirlikçiler de varyant ve ilgi gen hastada görülen fenotipleri açıklamak için iyi adaylar olduğunu düşünüyorsanız, bölüm 2'ye devam edin. Hastanın genotip ve fenotip hakkında özel sorular varsa, ilerlemeden önce klinik işbirlikçileri ile bunları tartışın.
    NOT: İlgi varyantının ilginin fenotipini açıklama olasılığının düşük olduğu hissedilirse (örneğin, kontrol popülasyonunda yüksek frekansta bulunan özdeş varyant), varyantın iyi olup olmadığını belirlemek için bunu klinik işbirlikçilerle görüşür klinik fenotipleri yorumlamak için uygun uzmanlık olmayabilir.

2. Mevcut Genetik Araçların Toplanması ve İlginin Belirli Bir Varyantını İncelemek Için Yeni Reaktiflerin Oluşturulması

NOT: İlgi varyantı belirlendikten sonra deneysel olarak takip etmek, vivo fonksiyonel çalışmalar yapmak için reaktif toplamak veya oluşturmak için iyi bir aday dır. Bu protokolde açıklanan fonksiyonel çalışmalar için, bazı anahtar Drosophila melanogaster reaktiflere ihtiyaç vardır: 1) referans veya varyant dizisini taşıyan upstream aktivasyon dizisi düzenlenmiş insan cDNA transgenik suşları, 2) fonksiyon kaybı ilgi bir sinek gen in alel ve 3) kurtarma deneyleri için kullanılabilecek bir GAL4 hattı.

  1. UAS-insan cDNA yapıları ve transgenik sineklerin üretimi
    1. Uygun insan cDNA yapılarını tanımlayın ve elde edin. Birçok klonlar MGC mevcuttur (memeli gen koleksiyonu)43 ve seçilen venders satın alınabilir. Alternatif olarak birleştirilmiş genler için, hangi isoform cDNA'nın Ensembl veya RefSeq kullanılarak karşılık geldiğini kontrol edin.
      NOT: Birçok cDNA rekombinaz aracılı klonlama sistemi uyumlu reaktifler mevcuttur44, hangi subklonlama adımı kolaylaştırır. cDNA'lar "açık (stop kodonu yok)" veya "kapalı (endojen veya yapay stop kodonu ile)" biçiminde gelebilir. Açık klonlar biyokimyasal (örneğin, batı leke) ve hücre biyolojik (örneğin, immünboyama) için yararlı proteinlerin C'-etiketleme izin ilgi protein ekspresyonu izlemek için, bazı durumlarda protein fonksiyonu ile müdahale edebilir.
    2. Drosophila transgenik vektöriçine referans ve varyant cDNA alt klon. ΦC31 aracılı transgenez sistemini kullanın, çünkü bu referans ve varyant cDNA'ların genom45'teaynı konuma entegre edilmesine izin verir. Bu proje için, MOSC Drosophila Core rutin pGW-HA.attB vektör46kullanır.
      NOT: Eğer insan cDNA'sı rekombinaz aracılı klonlama sistemi uyumlu vektörlerde (örneğin, pDONR221, pENTR221) varsa, cDNA'ları pGW-HA.attB'ye sokmak için LR reaksiyonlarını açıklayan bölüm 2.1.4'e atlayın.
      1. Eğer insan cDNA'sı rekombinaz aracılı klonlama sistemi uyumlu plazmid de değilse, standart moleküler biyolojik teknikler kullanarak insan CD'lerini Gateway giriş vektörüne sokmayın (bu protokolün bir örneği aşağıda belgelenmiştir).
        1. AttB1 ve attB2 kollarını tanıtmak için bir çıkıntı PCR gerçekleştirin. İleri astar attB1 dizisi 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAAAAAGCAGGCTTCACC-3' hedef cDNA ilk 22 nükleotit ler takip olmalıdır. Ters astar attB2 dizisi 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' ilgi cDNA son 25 nükleotit ters kompleman takip olmalıdır. CDNA'nın dur kodonunu hariç tonu, bir klon "açmak" isteniyorsa C' etiketi ekleyin veya bir klon "kapatmak" için bir stop kodonu ekleyin.
        2. 50 μL yüksek kaliteli PCR ana karışımı, 36 μL distile su, adım 2.1.2.1.1 ile seyreltilmiş 2.1.2.1.1 adımda listelenen her bir ileri ve ters astardan oluşan 100 μL'lik yüksek kaliteli PCR karışımı (150 ng/μL) hazırlayın.
        3. İlgi cDNA üzerine attB1 ve attB2 silah eklemek için standart mutagenez protokolü kullanarak PCR gerçekleştirin. Koşullar, yapıya ve ilginin varyantlarına bağlı olarak değişir.
        4. Jel elektroforez ve jel ekstraksiyon uğrama yoluyla ilave homoloji kolları ile hedef cDNA izole. % 1 agarose jel oluşturun ve standart yöntemlerle elektroforez gerçekleştirin. CDNA'nın büyüklüğüne ve homoloji kollarının ek uzunluğuna karşılık gelen bandı boşaltın. Standart yöntemlerle jelDNA ayıklayın95. Ticari jel çıkarma kitleri çeşitli şirketlerden temin edilebilir.
        5. Kullanılan sisteme göre rekombinaz aracılı klonlama protokolüne dayalı in vitro rekombinaz reaksiyonu gerçekleştirin.
        6. BP reaksiyon karışımını kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. Yetkili hücreler şirket içinde yapılabilir veya ticari satıcılardan satın alınabilir. Kültür koloni seçimi için uygun antibiyotikler içeren bir LB plaka üzerinde bir gecede dönüştürülmüş hücreleri. Ertesi gün, birkaç koloni seçin ve bir gecede bağımsız sıvı kültürlerde onları büyümek.
        7. DNA'yı miniprep aracılığıyla gece kültürlerinden izole edin. Sanger dizisi pozitif klonlar cDNA doğru sıra96 olduğundan emin olmak için . -80 °C'de depolanan %25 gliserolde istenilen diziiçin pozitif olan kültürlerden hücreleri koruyun.
    3. Referans insan cDNA97ile Gateway plazmid içine ilgi varyantı tanıtmak için site yönettiği mutagenezi gerçekleştirin. Bu yöntem için ayrıntılı bir protokol satıcının web sitesinde bulunabilir48,49. Bu mutagenez adımı ile tanıtılan ek varyantlar olmadığından emin olmak için tüm açık okuma çerçevesi (ORF) Sanger sıralama yoluyla mutasyona uğramış plazmid varyantvarlığını doğrulayın.
    4. Bir LR klonaz reaksiyonu ile transgenik plazmid (örneğin, pGW-HA.attB attR1 ve attR2 siteleri) içine donör plazmid (attL1 ve attL2 siteleri ile Gateway plazmid) referans ve varyant insan cDNA'ları subclone.
      NOT: Konvansiyonel konstrasyon enzim bazlı subklonlama (örneğin, pUAST.attB50) için tasarlanmış UAS φC31 vektörleri vardır.
    5. UAS-insan cDNA transgenlerini entegre etmek için φC31 yerleştirme alanlarını seçin. Yerleştirme siteleri bir dizi çeşitli laboratuvarlar tarafından oluşturulan ve stok merkezleri50,52,53kamuya açıktır.
      NOT: İlgi geninin sinek ortoloğunu içermeyen bir kromozomüzerinde insan transgeninin olması uygun olduğundan, sinek ortologu X'te yken ikinci bir kromozom yerleştirme alanı [VK37 (BDSC stok #24872] kullanılması tavsiye edilir. , üçüncü veya dördüncü kromozomlar, ve sinek ortholog ikinci kromozom üzerinde ise üçüncü bir kromozom yerleştirme sitesi [VK33 (BDSC stok #24871] kullanın.
    6. UAS-insan cDNA yapılarını mikroplarında φC31 integrase ifade eden sineklere enjekte edin (örn. vas-φC31, nos-φC31).
      NOT: Mikroenjeksiyon şirket içinde yapılabilir veya transgenez için çekirdek tesislere veya ticari kuruluşlara gönderilebilir. Transgenik sinekler üretmek için ayrıntılı protokol atıf kitap bölüm51bulunabilir.
    7. Enjekte edilen embriyolardan kararlı transgenik suşlar oluşturmak. Yapı94başına ~100-200 embriyo enjekte edin. İkinci bir kromozom yerleştirme alanına (VK37) transgen yerleştirme için temsili bir geçiş şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir. Temel Drosophila genetik bilgi için atıf kitaplar54,55 bakın.
  2. Kurtarma tabanlı fonksiyonel tahlilleri kolaylaştıran bir T2A-GAL4 hattı edinin veya oluşturun (bkz. Şekil 2 ve bölüm 3.1).
    NOT: Bu satır iki amacla hizmet edecektir. İlk olarak, test edilen çoğu T2A-GAL4 hattı gen kapanı alel olarak çalışarak güçlü LOF alelleri gibi çalışır. İkinci olarak, T2A-GAL4 hatları, ilgi geninin endojen düzenleme elemanları altında UAS yapılarının (örneğin UAS-GFP, UAS-human CNA'ları) ifade sini sağlayan bir GAL4 sürücüsü olarak işlev görür56,57 (Şekil 2A-C).
    1. Drosophila Gen Bozulması Projesi (GSYİh)58 hangi ~ 1.000 T2A-GAL4 hatları59oluşturulmuş olan dahil olmak üzere mevcut T2A-GAL4 hatları için kamu stok koleksiyonları arayın. Bu suşlar şu anda Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC) mevcuttur ve GSYİh ve BDSC web siteleri hem de aranabilir.
    2. İlgi çeken sinek geni için bir T2A-GAL4 hattı yoksa, rekombinasearacılı kaset değişimi (RMCE) kullanılarak T2A-GAL4 hattına dönüştürülmek için uygun bir kodlama intronic MiMIC (Minos-aracılı entegrasyon kaseti) hattının kullanılabilir olup olmadığını kontrol edin )60 (Şekil 2A).
      NOT: RMCE, iki kodlama ekzosu arasında yer alan intronik MiMIC elemanlarının bir donör yapının mikroenjeksiyonu ile T2A-GAL4 hattına dönüştürülmesini sağlar (Şekil 1B'de bir geçiş şeması örneği gösterilir) veya haçlar, ayrıntılı olarak açıklandığı gibi57,59.
    3. Bir T2A-GAL4 hattı mevcut değilse ve uygun bir kodlama intronic MiMIC yoksa, CRIMIC (CRISPR aracılı entegrasyon kaseti) sistemi 59üzerinden bir T2A-GAL4 hattı oluşturma olasılığını keşfedin.
      NOT: Bu metodoloji, mimic benzeri bir kaseti ilgi çeken bir gende kodlama intronuna entegre etmek için CRISPR aracılı DNA dekoltesi ve homoloji ye yönelik onarımı (HDR) kullanır.
    4. İlgi geni büyük bir intron yoksunsa (>150 bp) veya intronları yoksa, açıklandığı gibi HDR 20 ,61,62kullanarak CRISPR/Cas9 sistemi ile bir GAL4 transgeni sinek genine çarpmaya çalış .
      NOT: Bir T2A-GAL4 veya GAL4 knock-in alel üretimi zorsa,92 (REF) tanımlandığı gibi bu önceden varolan aleller veya RNAi hatları ve her yerde veya dokuya özgü GAL4 sürücüleri kullanarak kurtarma deneyleri yapmaya çalışın.

3. Drosophila'da Vivo'daki İnsan Varyantının Fonksiyonel Analizinin Analizi

NOT: Drosophila'davivo'ya ilgi nin varyantının sonuçlarını değerlendirmek için bölüm 2'de toplanan veya oluşturulan araçları kullanarak kurtarma tabanlı analiz (bölüm 3.1) ve aşırı ifade çalışmaları (bölüm 3.2) gerçekleştirin. Her iki yaklaşımdan da yararlanmayı düşünün, çünkü ikisi birbirini tamamlıyor.

  1. Kurtarma tabanlı deneyler le fonksiyonel analiz yapmak
    Not: Heterolog kurtarma tabanlı deneylerDrosophilainsan proteinlerinin kullanılması, iki ortolog genin moleküler işlevinin ~500 milyon yıllık evrimin içinde korunup korunmadığını belirler. Ayrıca insan proteini bağlamında varyantın işlevini de değerlendirirler.63. Yüzlerce gen çiftini inceleyen sistematik bir analiz rapor edilmese de, birkaç düzine insan ve memeli (örneğin, fare) genlerininDrosophilaGen13.
    1. Kurtarma tabanlı yaklaşımda, varyantların işlevlerini değerlendirmeden önce, ilk olarak sinek ortologundaki LOF mutantlarında açık, korunabilir ve tekrarlanabilir fenotipler olup olmadığını belirleyin.
      NOT: Sinek geni ile ilgili önceki literatür, önce veri madeni için iyi bir yerdir ve FlyBase ve PubMed gibi veritabanları kullanılarak bulunabilir. MARRVEL, Monarch Initiative ve Gene2Funcion gibi ek veritabanları da bu bilgilerin toplanmasında yararlıdır.
    2. Homozigot ve hemizygous (T2A-GAL4 alel moleküler tanımlanmış kromozom eksikliği hayvanlar üzerinde, özellikle T2A-GAL4 alel belirli bir gen için karakterize ilk mutasyon ise, korunabilir fenotipler küresel bir anket gerçekleştirin. Öldürücülük, kısırlık, uzun ömür, morfolojik (örneğin, gözün büyüklüğü ve morfolojisi) ve davranışı (örn. kur yapma, uçuş, tırmanma ve patlama hassasiyeti kusurları) gibi fenotipleri değerlendirin.
      NOT: Bu primer ekrandan saptanan majör fenotip yoksa, elektrofizyolojik kayıtlarla ölçülen nörolojik bozukluklar gibi daha ince fenotipler, yüksek oranda tekrarlanabilir ve spesifik ise kullanılabilir. Örnek olarak, elektroretinogram (ERG) kullanılarak yapılan fonksiyonel çalışmalar 3.2.3. Herhangi bir çatlanabilir fenotip tespit edilememesi durumunda, bölüm 3.2'ye geçin ve aşırı ifade tabanlı fonksiyonel çalışmayı gerçekleştirin.
    3. Bir kez scorable fenotip sinek LOF mutant tespit edilir, referans insan cDNA mutant sinek hattı kurtarmak için insan cDNA kullanmaya çalışarak sinek ortholog işlevini değiştirip değiştiremeyeceğini test edin. Burada yapılacak olan henotibik tahkikat, 3.1.2.adımın sonuçlarına bağlıdır ve incelenmekte olan genin spesifik olacaktır.
      NOT: Sinek geninin "insancıllaşması" başarılı olursa, artık referans muadili ile karşılaştırıldığında ilgi varyantı için kurtarma verimliliğini karşılaştırmak için bir platform vardır. Referans insan cDNA ile görülen kurtarma mükemmel olmak zorunda değildir. Bir insan cDNA kullanarak sinek mutant fenotip kısmi kurtarma hala varyant insan cDNA suş kullanarak karşılaştırmalı çalışmalar yapmak için bir referans noktası sağlar.
    4. Adım 3.1.2'de seçilen test sistemini kullanarak, gözlenen kurtarma ile gözlenen kurtarma yı, ilgi nin varyantının ilgi geni üzerinde sonuçları olup olmadığını belirlemek için insan cDNA'sı ile gözlenen kurtarma ile karşılaştırın.
      NOT: Varyant insan cDNA referans alel daha kötü gerçekleştirir, bu ilgi varyantı protein fonksiyonu için zararlı olduğunu göstermektedir. Varyant ve referans işlevsel olarak ayırt edilemiyorsa, o zaman 1) alel bir izomorf (protein fonksiyonunu etkilemeyen bir varyant) veya 2) tetkik ince farklılıkları tespit etmek için yeterince hassas değildir.
    5. Varyant zararlı bir alel olduğu tespit edilirse, daha sonra daha fazla ifade ve batı leke, immünükopesans boyama, ya da diğer yöntemler le vivo ilgi referans ve varyant proteinlerin hücre içi lokalizasyon değerlendirmek93.
      NOT: Eğer UAS-insan cDNA bir pGW-HA.attB vektörü açık bir klon dan oluşturulur, bu biyokimyasal ve hücresel tahlilleri gerçekleştirmek için bir anti-HA antikor kullanın. Orijinal klon kapalı bir klon ise, insan proteinlerine karşı ticari antikorlar bu tahliller için kullanılabilir olup olmadığını test edin. İfade düzeyleri ve hücre içi lokalizasyon farkı, ilgi varyantının protein fonksiyonunu nasıl etkilediğini ortaya çıkarabilir.
  2. Aşırı ifade çalışmaları ile fonksiyonel analiz yapmak
    NOT: Aksi takdirde yabani sineklerde insan CD'lerinin her yerde veya dokuya özgü aşırı ekspresyonu, bölüm 3.1'de tartışılan kurtarma temelli deneyleri tamamlayıcı olan bilgiler sağlayabilir. Kurtarma tabanlı tahliller öncelikle LOF varyantlarını (amorfik, hipomofik) saptamak için tasarlanmış olsa da, aşırı ekspresyon tabanlı tahliller de değerlendirmek daha zor olan işlev kazanım (GOF) varyantları ortaya çıkarabilir (hipermorfik, antimorfik, neomorfik).
    1. İlgi çekici insan cdNA'larını aşırı ifade etmek için gal4 sürücüleri kümesini seçin. Her yerde bulunan ve dokuya/evreye özgü GAL4 sürücüleri, bazıları diğerlerinden daha sık kullanılan kamu stok merkezlerinden (örneğin, BDSC) temin edilebilir. Önce her yerde bulunan sürücülere ve kolayca çatlabilen fenotiplere (öldürücülük, sterilite, morfolojik fenotipler) odaklanın, sonra dokuya özgü sürücülere ve daha spesifik fenotiplere geçin.
      NOT: Denemelerde kullanılmadan önce ifade desenlerini onaylamak için GAL4 sürücülerinin ifadesini bir muhabir satırıyla (örneğin, UAS-GFP) doğrulayın.
    2. Aynı koşulda aynı sürücüyü kullanarak referans ve varyant insan CDNA'larını (örn. sıcaklık) GAL4 hattından 3-5 bakire dişiyi geçerek (örn. göz hayali disk ekspresyonu için ey-GAL4) UAS hatlarından 3-5 erkek sinek ile ifade edin [örn. Bölüm 4.2'de gösterilen örnek için Tek bir şişede UAS-TBX2(+) veya UAS-TBX2(p.R305H).
      1. Tek bir haç tan eclosing birçok hayvan için her 2-3 günde bir haç transfer.
    3. Bir diseksiyon mikroskobu altında döllenmiş soyundan gelenleri inceleyin ve referans ve varyant suşları (örneğin, göz morfolojisi) arasındaki farkları tespit edin. Fenotip belgelemek için bir diseksiyon mikroskobuna bağlı bir kamera kullanarak sinekler görüntü.
      NOT: Bir fenotip sadece referansta görülürse, ancak varyant satırında görülmezse, varyant amorfik veya güçlü bir hipomorfik alel olabilir. Fenotip her iki genotipte de görülürse ancak referans daha güçlü bir defekte neden oluyorsa, varyant hafif-zayıf hipomorfik alel olabilir. Başvuru fenotip göstermiyorsa veya sadece zayıf bir fenotip gösteriyorsa, ancak varyant güçlü bir kusur gösteriyorsa, varyant GOF alel olabilir.
    4. Standart kültür koşullarında (RT veya 25 °C'de) bir fenotip görülmüyorsa, UAS/GAL4 sisteminin ısıya duyarlıolduğubilindiği için haçları 18-29 °C arasında değişen farklı sıcaklıklardaayarlayın. Tipik olarak, UAS transgenes ekspresyonu daha yüksek sıcaklıklarda daha yüksektir.
  3. Genler ve ilgi proteinile ilgili ek fonksiyonel çalışmalar yapın.
    Not: Genel kusurların incelenmesine ek olarak, gen ve varyantın moleküler fonksiyonlarını araştırmak için bir bir araştırma sistemi seçilebilir. Temsili sonuçlarda tartışılan bir örnekte (TBX2olgu), ERG kayıtları, varyantın fotoreseptör fonksiyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılmıştır, çünkü ilgi nin sinek geni (bifid) görsel sistem gelişimi bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. ERG için ayrıntılı protokollerDrosophiladaha önce yayınlanmış olarak bulunabilir66,67,68.
    1. Görsel sistemdeki işlevsel hataları test etmek için sinekler oluşturun. R1-R6 fotoreseptörlerinde insan proteinlerini ifade etmek için referans veya varyant UAS-insan cDNA transgenes ile erkeklere Rodopsin 1 (Rh1)-GAL4 hattından çapraz bakire dişiler.
      NOT: 3-5 bakire dişiden 3-5 erkek tek bir şişede sinekler ile çapraz uçarak her 2-3 günde bir haçları tek bir haçtan eclosing için aktarın. Tutarlı sonuçlar elde etmek için tüm haçlar deneysel sıcaklıkta bir kuvözde tutulmalıdır.
    2. Sinekler kapanmaya başladıktan sonra (ilk haçı ayarladıktan 10 gün sonra 25 °C'de, ~10 gün sonra) soyundan gelenleri toplarlar(Rh1-GAL4/+; UAS-insan cDNA /+) taze şişeler içine ve görme sisteminin olgunlaşması için ek bir 3 gün boyunca deneysel sıcaklıkta belirlenen inkübatör e tekrar yerleştirin.
      NOT: ERG 1-2 günlük sineklerde yapılabilse de, yeni e-kapalı sineklerin ERG sinyallerinde büyük dalgalanmalar olabilir. Yaşa bağlı bir fenotip incelemek isteniyorsa, bu sinekler düzenli olarak (örneğin, her ~5 günde bir) ıslak gıdalarda boğulmayı önlemek için yeni bir şişeye aktarıldığı sürece birkaç hafta yaşlanabilir.
    3. Sinekleri ILK olarak CO2 kullanarak veya buz üzerinde bir şişeye yerleştirerek ERG kaydı için hazırlayın. Yavaşça onları hareketsizleştirmek için bir cam mikroskop slayt üzerine sinek bir tarafı yapıştırın.
      NOT: Çoklu referans ve varyant sinekler tek bir slayt üzerine yapıştırılmış olabilir. Kayıt elektrotiçin tek göz erişilebilir olan yaklaşık aynı yönde tüm sinekler yerleştirin. Göze tutkal almak ve hortum ücretsiz bırakmak için dikkatli olun.
    4. Kayıt ve referans elektrotlarını hazırlayın. Bir iğne çekmeceiçine 1,2 mm cam kılcal yerleştirin ve etkinleştirin. İki keskin konik elektrot elde etmek için kılcal tüpü kırın. Ortaya çıkan elektrotlar boş olmalı ve son çapları <0.5 mm olmalıdır.
    5. Kılcal damarları tuzlu çözelti (100 mM NaCl) ile doldurun ve hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Cam kılcal damarları gümüş tel elektrotların üzerine kaydırın (hem kayıt elektrodu hem de referans elektrot, bkz. Şekil4) ve kılcal damarları yerinde sabitle.
    6. Uyarıcı ve amplifikatör yapılandırır. Ayrıntılı bir kurulum Lauwers, ve ark.67 bulunabilir. UDN Drosophila MOSC kurulumu, malzeme bölümünde listelenen ekipmanlardan oluşmaktadır.
      1. Amplifikatörün 0,1 Hz yüksek geçiş filtresi, 300 Hz düşük geçiş filtresi ve 100 kazanç olarak ayarlayın.
      2. Uyarıcıyı 1 s periyodu, 500 ms darbe genişliği, 500 ms darbe gecikmesi, çalışma modu ve 7 Amp'e ayarlayın.
      3. Işık kaynağını fotostimülasyona hazırlayın. Sinek fotoreseptörlerini etkinleştirmek için halojen ışık kaynağı kullanın.
      4. Kayıt yazılımını ERG kurulumuna bağlı bir bilgisayarda hazırlayın. Edinme modeli "sabit uzunlukta olaylar" ve 20 s süresi ile bir uyarım protokolü oluşturun.
    7. ERG kayıtlarını başlatmadan önce sinekleri karanlığı tamamlamak için alıştırın. Denemeye başlamadan önce sinekleri en az 10 dakika boyunca karanlığa yerleştirin.
      NOT: Sinekler kırmızı ışığı algılayamadığıiçin, karanlık alışma döneminde kırmızı ışık kaynağı kullanın.
    8. Sinekleri içeren kaydırağı kayıt cihazına yerleştirin ve referans ve kayıt elektrotlarını taşıyan mikromanipülatörleri slayttaki ilgi sineğine yakın bir noktaya taşıyın. Elektrotun ucunu izleyin ve referans elektrotunu dikkatlice sineğin toraksına yerleştirin (miteyi delin). Referans elektrot sert bir şekilde yerleştirildikten sonra, kayıt elektrotunun göz yüzeyine yerleştirin.
      NOT: Bu referans elektrotun tam konumu ERG sinyali üzerinde büyük bir etkiye sahip değildir. ERG hücre içi kayıt tan ziyade bir alan potansiyeli kaydı olduğundan kayıt elektrodu gözün yüzeyine yerleştirilmelidir. Kayıt elektrotuna uygulanan uygun basınç miktarı göze girmeden küçük bir gamzeye neden olur.
    9. Karanlık ortama sinekler acclimate için başka bir 3 dakika için tüm ışıkları kapatın.
    10. Kayıt yazılımını ayarlayın ve sinyali kaydetmeye başlayın. Manuel deklanşörlü halojen ışık kaynağı kullanıyorsanız, deklanşör kapalı ışık kaynağını açın. Sinyali kaydetmeye başla.
    11. Tek bir koşunun 20 s süresi boyunca deklanşörü her 1'de bir açıp kapatarak sinek gözlerini ışığa maruz bırak.
      NOT: Halojen ışık kaynağının açık/kapalı kullanımı manuel olarak kontrol edilebilir veya beyaz LED ışık kaynağı kullanılarak otomatikleştirilmeye programlanabilir. Daha sağlam ve güvenilir ERG beyaz ışık LED ile karşılaştırıldığında bir halojen ışık kaynağı kullanılarak elde edilebilir, halojen ışık kaynağından yayılan geniş ışık spektrumu nedeniyle büyük olasılıkla.
    12. Cam kaydırağa monte edilen tüm sineklerden ERG'leri kaydedin. Durum başına genotip başına 15 sinekten ERG'leri gerçekleştirin.
      NOT: Referans ve varyant CDNA'ları arasında sağlam farklar gösteren bir durum bulmak için değiştirilebilen bazı parametreler sıcaklık, yaş veya çevre koşullarını içerebilir (örn. açık-koyu çevrimde veya sabit ışık/karanlıkta yetiştirilen).
    13. Veri analizi gerçekleştirin: Fark olup olmadığını belirlemek için referans, varyant ve denetimlerden ERG'leri karşılaştırın. ErG verilerini geçici değişiklikler, depocuizasyon, geçici olmayan lar ve repolarizasyon69 için değerlendirin (Şekil 4B).
      NOT: Depolarizasyon ve repolarizasyon fotoreseptörler içinde fototransdüksiyon kaskad aktivasyonu ve inaktivasyonu yansıtır, on- ve off-transients sinyalleri alan post-sinaptik hücrelerin faaliyetlerinin ölçüleri ise fotoreseptörler. Repolarizasyonda azalmış genlik ve değiştirilmiş kinetikler genellikle fotoreseptör fonksiyonu ve sağlığı ile ilgili bozukluklarda bulunurken, transeksyen ve geçici bozukluklar kusurlu sinaps gelişimi, fonksiyonu veya bakımı olan mutantlarda bulunur. 70'e kadar.
    14. ERG fenotiplerindeki farklılıkların referans ve varyant insan cDNA'larının aşırı ekspresyonu ile belirlenmesi üzerine, bu elektrofizyolojik fenotipin fotoreseptörlerdeki yapısal ve ultrayapısal bozukluklarla ilişkili olup olmadığını ve histolojik analiz ve iletim elektron mikroskopisi yaparak sinapslar.
      NOT: ERG kusurlarının yorumlanması ve yapısal/ultrayapısal analiz ler hakkında daha fazla tartışma daha önce69olarak tanımlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nörogelişimsel Fenotilere Bağlı EBF3'te De novo Missense Varyantının Fonksiyonel Çalışması
Hipotoni, ataksi, küresel gelişimsel gecikme ve anlamlı konuşma bozukluğu gibi nörogelişimsel fenotipleri olan 7 yaşındaki bir erkek, Ulusal Sağlık Enstitüleri Tanı konulmamış Hastalıklar Projesi'nde (UDP) hekimler ve insan genetikçileri EBF3'te (Erken B-Hücre Faktörü3) 15'te bir de novo missense varyantı (p.R163Q) saptandırılır, coe (Collier/Olfactory-1/Early B-Cell Factor) aile transkripsiyon faktörünü kodlayan bir gendir. Bu dava mart 2016'da fonksiyonel çalışmalar için UDN MOSC'ye sunulmuştur. Bu genin bu vaka için iyi bir aday olup olmadığını değerlendirmek için MOSC, OMIM, ClinVar, ExAC (şimdi gnomAD'a genişletilmiş), Geno2MP, DGV ve DECIPHER'den insan genetik ve genomik bilgilerini topladı. Buna ek olarak, önemli MO türlerinde ortolog genler DIOPT aracı kullanılarak tanımlanmıştır. Daha sonra tek tek MO veritabanlarından (wormbase, FlyBase, ZFIN, MGI) gen ekspresyonu ve hevoppik bilgiler elde edildi. EBF3 için yapılan bilişim analizleri ve UDN MOSC'deki diğer öncü çalışmalar MARRVEL kaynağının daha sonra geliştirilmesi için temel oluşturmuştur30.

Bu metodoloji kullanılarak toplanan bilgiler, EBF3'ün analiz sırasında bilinen herhangi bir insan genetik bozukluğu ile ilişkili olmadığını göstermiştir ve p.R163Q varyantının aşağıdaki bilgilere dayanarak iyi bir aday olduğu sonucuna varMıştır. (1) Bu varyant daha önce kontrol popülasyon veritabanları (ExAC) ve hastalık nüfus veritabanı (Geno2MP), bu çok nadir bir varyant olduğunu gösteren rapor edilmemişti. (2) ExAC'a göre bu genin pLI (LOF intoleransı olasılığı) skoru 1.00'dır (pLI skorları 0.00-1.00 arasında değişmektedir). Bu durum, genel popülasyonda bu gende LOF varyantlarına karşı seçici basınç olduğunu gösterir ve bu genin haploinsufficilik hastalığa neden olabileceğini düşündürmektedir. PLI puanı ve yorumu hakkında daha fazla bilgi için, JoVE31 ve ilgili kağıtları eşlik eden MARRVEL öğretici makale ayrıntıları30,71sağlar .

P.R163Q varyantı da iyi bir aday olarak kabul edildi çünkü (3) bu proteinin evrimsel olarak korunmuş DNA bağlayıcı etki alanında yer alır ve dna bağlanmasını veya diğer protein fonksiyonlarını etkileyebileceğini düşündürmektedir. (4) P.R163 kalıntısı evrimsel olarak C. elegans ve Drosophila'dan insanlara korunmuştur ve bu da türler arasında protein fonksiyonelliği açısından kritik olabileceğini düşündürmektedir. (5) EBF3 orthologlar c. elegans73dahil olmak üzere birden fazla MO72 nöronal gelişim karıştığı olmuştur , Drosophila74, Xenopus75, ve fareler76. (6) Farelerde beyin gelişimi sırasında, Ebf3 Arx aşağı fonksiyonu gösterilmiştir (Aristaless ile ilgili homebox)77, birkaç epilepsi ve entelektüel özürlülük ile ilişkili bir gen insanlarda sendromlar78. Bu nedenle, bu veriler birlikte EBF3 insan nörogelişimi için çok önemli olması muhtemeldir ve p.R163Q varyant fonksiyonel sonuçları olabileceğini düşündürmektedir.

p.R163Q'nun EBF3 fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için, düğüm için bir T2A-GAL4 hattı (kn; insan EBF379'unsinek ortologu) RMCE ile bir kodlama intronic MiMIC ekleme15oluşturuldu. KnT2A-GAL4 hattı çekinik öldürücüdür ve klasik kn alelinin öldürücülüğünü tamamlayamadı(kncol-1) ve kn [Df(2R)BSC429]80'i kapsayan moleküler tanımlanmış eksikliği . GAL4'ün ekspresyon desenleri de beyinde daha önce bildirilen kn ekspresyonu desenleri yanı sıra kanat imaginal disk15yansıtılır. UAS transgenik sinekler daha sonra referans ve varyant insan EBF3 cDNA yanı sıra vahşi tip sinek kn cDNA ifade sağlamak için oluşturuldu. Her üç protein de C-terminal 3xHA etiketiyle etiketlendi. Daha da önemlisi, UAS yabani tip sinek kn (kn+) veya referans insan EBF3 (EBF3+) transgenes knT2A-GAL4/ Df (2R)BSC429 ölümcül kurtardı benzer bir ölçüde ( Şekil 3C, sol panel)81.

Buna karşılık, p.R163Q varyantı ile UAS-insan EBF3 transgene(EBF3p.R163Q) bu mutant kurtarmak mümkün değildi, p.R163Q varyant ı vivo EBF3 fonksiyonunu etkiler düşündüren15. İlginçtir ki, bir anti-HA antikor kullanılarak değerlendirildiğinde, EBF3p.R163Q protein başarıyla sinek dokularında ifade edildi ve düzeyleri ve hücre altı lokalizasyonu (öncelikle nükleer) EBF3+ ve ayırt edilemez edildi Kn+. Bu varyant protein istikrarsızlığı veya yanlış lokalizasyon nedeniyle bir LOF fenotip neden olmadığını göstermektedir. P.R163Q varyantının EBF3'üntranskripsiyonel aktivasyon fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini daha fazla değerlendirmek için HEK293 hücrelerinde luciferase tabanlı muhabir analizi yapıldı15. Kültürlü insan hücrelerindeki bu deney, EBF3p.R163Q varyantının Drosophila deneylerinden elde edilen LOF modelini destekleyerek muhabir yapılarının transkripsiyonlarını etkinleştiremediğini ortaya çıkardı.

Deneysel çalışmalara paralel olarak, BCM'deki hekimler, insan genetikçileri ve genetik danışmanlarla yapılan işbirlikleri benzer semptomlara sahip iki bireyin daha belirlenmesine yol açmıştır. Bir hasta aynı p.R163Q varyantını taşıdı ve diğeri aynı kalıntıyı etkileyen yanlış bir varyant taşıdı (p.R163L). P.R163L varyantı da bu alel de EBF3 fonksiyonu etkilenen düşündüren fly kn mutant93 kurtarmak için başarısız oldu. İlginçtir, bu çalışma arka arkaya iki bağımsız insan genetiği çalışmaları ile de novo yanlış, saçma, frameshift ve ebf3 benzer bağlantılı birleştirme varyantları ile ek bireyler rapor yayınlandı nörogelişimsel fenotipler82,83. Daha sonra, de novo EBF3 varyantları ve kopya numarası silme84,85,86ek durumlarda raporlama üç ek makale yayınlandı . Bu yeni nörogelişimsel sendrom artık Hipotoni, Ataksi ve Gecikmiş Gelişim Sendromu (HADDS, MIM #617330) Olarak bilinir.

Sindromik Kardiyovasküler ve İskelet Gelişimsel Bozukluğuna Bağlı TBX2'de Dominant Kalıtsal Missense Varyantının Fonksiyonel Çalışması
Kraniyofasiyal dismorfizm, kardiyak anomaliler, iskelet malformasyonu, immün yetmezlik, endokrin anormallikler ve gelişimsel bozukluk spektrumları ile etkilenen küçük bir ailede, UDN Duke Klinik Sitesi yanlış bir varyant ı saptandır. (p.R20Q) TBX2 bu hastalık fenotipleri ile ayırır87. Dört aile üyesinden üçü (oğlu, kızı, annesi) bu durumdan etkilenir ve oğlu en şiddetli fenotipi sergilemiştir. Klinik olarak, o "tam DiGeorge sendromu" tanısı bir araya geldi, genellikle TBX1haploinsufficiency neden olduğu bir durum . Bu ailede TBX1'de tanımlanmış mutasyon bulunmamakla birlikte, klinisyenler ve insan genetikçileri TBX2'de bir varyanta odaklanmıştır, çünkü farelerüzerinde yapılan önceki çalışmalar bu genlerin gelişim sırasında çakışma işlevleri olduğunu göstermiştir88 . TBX1 ve TBX2, transkripsiyonel baskılayıcılar ve bağlamlarına bağlı olarak aktivatörler olarak hareket edebilen transkripsiyon faktörleri ailesine aittir.

Daha önce, TBX aile genlerinin 17 üyesinin 12'sinde varyantlar insan hastalıklarıile bağlantılıydı. MOSC, MARRVEL ve diğer kaynaklar aracılığıyla toplanan aşağıdaki bilgilere dayanarak bu varyantı deneysel olarak sürdürmeye karar verdi. (1) Bu varyant gnomAD ~90.000 "kontrol" bireylerin bir kohort sadece bir kez bildirilmiştir (bu varyant varsayılan bir görünümde filtreedildi, büyük olasılıkla düşük kapsama okumanedeniyle). Annenin daha hafif fenotipik sunumu göz önüne alındığında, bu yine de hastalık fenotipleri sorumlu olabilir nadir bir varyant olarak kabul edilebilir. (2) ExAC/gnomAD'daki TBX2 pLI puanları 0.96/0.99 olup yüksektir (maksimum = 1.00). Buna ek olarak, gnomAD'da o/e (gözlenen/beklenen) LOF skoru 0,05 'dir (gnomAD'da sadece 1/18,6 beklenen LOF varyantı gözlenir). Bu sayılar, bu gendeki LOF varyantlarının genel popülasyonda karşı seçildiğini göstermektedir.

Ayrıca, (3) p.R20 evrimsel c. elegans ve Drosophila insanlar için korunmuş, bu TBX2 fonksiyonu için önemli bir kalıntı olabileceğini düşündürmektedir. (4) Birden fazla program varyantBüyük olasılıkla zarar olduğunu tahmin (polyphen: muhtemelen / muhtemelen zarar, SIFT: zararlı, CADD puanı: 24.4, REVEL puanı: 0.5). (5) MO mutantları hastalarda etkilenen dokularda bozukluklar sergilerler (örneğin, kardiyovasküler sistemde kusur lar gösteren nakavt fareler, sindirim/alimentary sistemleri, kraniyofasiyal, ekstremiteler/basamak). Bu nedenle, birlikte TBX1 ve TBX2 ve bu hastalar ve DiGeorge Sendromu arasındaki fenotipik bağlantılar arasındaki biyolojik bağlantıları ile, Drosophilakullanarak bu gen varyantları fonksiyonel çalışmalar yapmak için en uygun oldu .

p.R20Q varyantının TBX2 fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için, bifid'de bir T2A-GAL4 hattı (bi ; insan TBX2'nin Drosophila ortologu), kodlama intronic MiMIC'in RMCE'si ile üretildi (Şekil 2)87. Bu alel, biT2A-GAL4, çekinik pupal ölümcül ve güçlü bir LOF mutant olarak, daha önce bildirilen bi LOF alel benzer (örneğin, biD2, biD4; Şekil 2 E). Bu klasik ve yeni üretilen bi alel öldürücü bir ~ 80 kb genomik kurtarma yapısı tüm bi locus taşıyan tarafından kurtarıldı, Bu reaktifler gerçekten temiz LOF alel olduğunu belirten. BiT2A-GAL4 hattındaki GAL4'ün ifade deseni, kanat imaginal diski de dahil olmak üzere birden fazla dokuda daha önce bildirilen bi ekspresyon desenleriyle de uyumludur (Şekil 2D).

Buna paralel olarak, referans veya varyant (p.R20Q) dizilerini taşıyan TBX2 için UAS-transgenik çizgiler oluşturuldu. Ne yazık ki, ne transgen biT2A-GAL4 hattının ölümcül kurtarmak mümkün değildi. Daha da önemlisi, bir vahşi tip sinek UAS-bi transgene de biT2A-GAL4 alel kurtarmak için başarısız oldu, muhtemelen bu genin dozaj duyarlılığı nedeniyle. Gerçekten de, UAS-bi+ ve UAS-TBX2+ aşırı ifade zaman vahşi bir hayvan aşırı ifade ölümcül bir dereceye kadar neden oldu. Bi/TBX2 aşırı ekspresyonunun bu toksik etkisi, p.R20Q varyantının TBX2 fonksiyonunu etkileyip etkilemeyeceğini değerlendirmek için fonksiyonel bir tetkik olarak kullanılmıştır. Drosophila bi geni görsel sistem bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir [gen aynı zamanda optomotor kör olarak da bilinir (omb )], görme sistemi ile ilgili fenotipler kapsamlı olarak araştırıldı. Referans TBX2 göz ve görme sistemi ile ilgili beyin parçaları UAS-transgenes ifade eden bir ey-GAL4 sürücüsü kullanılarak ifade edildiğinde, ~ 85% öldürücülük (Şekil3C, sağ panel) ve önemli göz büyüklüğünün küçültülmesi (Şekil4B) gözlendi. Bu fenotip, yabani tip bir sinek UAS-bi transgene ifade edildiğinde gözlenen fenotipten daha güçlüydü, bu da insan TBX2'nin aşırı ifade edildiğinde sinek için daha zararlı olduğunu düşündürmektedir.

İlginçtir, p.R20Q TBX2 öldürücülük neden daha az güçlü oldu (Şekil3C, sağ panel) ve küçük bir göz fenotip indükleme (Şekil4B) aynı koşul altında aynı sürücü kullanarak87, düşündüren varyantın protein fonksiyonunu etkilediğini. Ayrıca, farklı bir GAL4 sürücüsü (Rh1-GAL4) kullanarak referans ve varyant TBX2 aşırı ifade fotoreseptörlerin fonksiyonu, özellikle R1-R6 fotoreseptörlerinde UAS transgenleri ifade, varyant TBX2 sergilenen ortaya referans TBX2 ile karşılaştırıldığında çok daha hafif ERG fenotip (Şekil 4B)87. İlginçtir ki, p.R20Q TBX2 proteininin çoğu hala çekirdekte bulundu, referans proteinbenzer, varyant nükleer lokalizasyonu etkilemediğini düşündürmektedir. HEK293T hücrelerinde bir luciferase tabanlı transkripsiyon baskısı test p.R20Q etkili palindromik T-box siteleri ile bir muhabir in transkripsiyon bastırmak mümkün olmadığını gösterdi87. Buna ek olarak, TBX2p.R20Q protein düzeylerinde düşüşler TBX2+ile karşılaştırıldığında gözlenmiştir , varyant ın tbx2'nin çevirisini veya protein stabilitesini etkileyebileceğini düşündürmektedir, bu da hücre içindeki bolluğunu etkiler.

TBX2'de nadir varyantları olan ek hastalar udn duke klinik sitesindeki klinisyenler tarafından bu deneysel çalışmalara paralel olarak saptandı.  Alakasız bir aileden bir de novo missense (p.R305H) varyantı ile 8 yaşındaki bir çocuk ilk aile87bulunan özellikleri birçok sergiledi . Drosophila ve insan hücre hatlarında yapılan ek fonksiyonel çalışmalar, p.R305H varyantının TBX2 fonksiyonunu ve protein düzeylerini de etkilediğini ortaya koymuştur ve bu gendeki kusurların iki ailede bulunan birçok fenotipin altında olduğunu ileri sürmüştür. Bu bozukluk son zamanlarda OMIM'de "vertebral anomaliler ve değişken endokrin ve T hücre disfonksiyonu" (VETD, MIM #618223) olarak değerlendirildi. TBX2'de çakışan fenotiplerle zarar verici varyantları olan ek bireylerin belirlenmesi, insan hastalığında bu gen için genotip-fenotip ilişkilerinin tüm spektrumunun anlaşılması açısından önemlidir.

Figure 1
Şekil 1 : UAS-insan cDNA ve T2A-GAL4 hatları oluşturmak için enjeksiyon ve geçiş şeması. (A) Mikroenjeksiyonlar ve haçlar yoluyla UAS-insan cDNA transgenes üretimi. Transgenleri ikinci bir kromozom yerleştirme alanına (VK37) entegre etme şeması, birinci ve ikinci nesil erkek sinekleri kullanılarak örnek gösterilmiştir. İnsan cDNA φC31 transgenik yapı (pGW-HA.attB) φC31 integrase bir germline kaynağı içeren erken embriyolar içine enjeksiyon üzerine (3xP3-GFP ve 3xP3-RFP ile etiketlenmiş) ve VK37 yerleştirme sitesi [sarı ile etiketlenmiş + (y+ ) marker], transgenik olaylar transgenik vektörde bulunan beyaz+ (w+) minigeni ile takip edilebilir. GFP ve RFP ile sineklere karşı seçerek φC31 integrase çapraz önerilir. Kromozom öldürücü/steril vuruş mutasyonu ikinci bir site taşıyorsa, son kararlı stok homozigot veya dengeli bir stok olarak tutulabilir. Transgenik yapılarda ikinci bölge öldürücü/steril mutasyonların varlığı genellikle bu transgenler heterozigot bir durumda kullanıldığı sürece fonksiyonelçalışmaların sonucunu etkilemez (Şekil 3). (B) Mikroenjeksiyon ve haçlar yoluyla T2A-GAL4 hatlarının üretimi. İkinci bir kromozom MiMIC eklemesini T2A-GAL4 elementine dönüştürme şeması örnek olarak gösterilmiştir. T2A-GAL4 (pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70) için φC31 integrase ve RMCE vektörü için bir ifade vektörü mikroenjekte edilerek, ilgi mimic için uygun bir okuma çerçevesi seçilir. Ayrıntılar için aşağıdaki kağıtlara bakın57,59 ilgi gen bir kodlama intron bir MiMIC taşıyan embriyolar içine, bir T2A-GAL4 hattına orijinal MiMIC dönüştürebilirsiniz. Şekil 2 A, RMCE dönüştürmenin şematik diyagramını gösterir. Dönüştürme olayı, orijinal MiMIC kaset60'taki y+ işaretçisi ile taranarak seçilebilir. RMCE iki yönde gerçekleşebildiği için, başarılı dönüşüm olayının sadece %50'si, gelecek nesilde uas-GFP muhabiri transgeni tarafından tespit edilebilen gal4'ün başarılı üretimine yol açar. Genin LOF'su öldürücü/steril ise son kararlı stok homozigot veya dengeli bir stok olarak tutulabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2 : MiMIC elemanlarının RMCE ile T2A-GAL4 hatlarına dönüştürülmesi. (A) φC31 integrase, dairesel vektör (altta) olarak gösterilen T2A-GAL4 kasetini çevreleyen sinekteki iki attP sitesi (üst) ve iki attB sitesi arasındaki rekombinasyonkolaylaştırır. (B) Başarılı RMCE olayları seçilebilir bir belirteç kaybına(sarı+) ve T2A-GAL4 kasetinin ilgi geninin aynı yönelimine yerleştirilmesine yol açar. RMCE olayı iki yönde gerçekleşebildiği için, RMCE reaksiyonunun sadece %50'si istenilen ürünü verir. Ters yönde yerleştirilen bir RMCE ürünü gen kapanı alel veya ekspres GAL4 işlevi görmeyecek. Yapının yönlülüğü Sanger dizilimi ile teyit edilmelidir. (C) İlgi geninin transkripsiyon (üst) ve çevirisi (alt) T2A-GAL4 kasetinin 3' ucunda bulunan poliA sinyali nedeniyle kesilmiş bir mRNA ve protein insidansına yol açar. T2A ribozom atlama sinyalidir, bu da ribozomun bu sinyalden sonra çeviriyi durdurmasını ve yeniden başlatmasını sağlar. Bu, ilgi çeken kesilmiş gen ürününe kovalent olarak bağlı olmayan bir GAL4 elemanı oluşturmak için kullanılır. GAL4 çekirdeğe girecek ve UAS elemanlarının kontrolü altında olan transgenlerin transkripsiyonunu kolaylaştıracak. UAS-GFP gen ekspresyonu muhabiri olarak kullanılabilir ve UAS-insan cDNA gen "insanlaşma" yoluyla kurtarma deneyleri için kullanılabilir. (D) Gösterilen UAS-GFP (üst) bi sürüş ifade bir T2A-GAL4 elemanı bir örnektir. Bu ifade deseni aynı gen için daha önce oluşturulmuş bir arttırıcı tuzak çizgisini andırır (biomb-GAL4; alt). (E) Daha önce bildirilen LOF bi alel ile bi T2A-GAL4 alellerinin karşılaştırılması. Bu rakam önceki yayınlardan 57,87olarak kabul edilmiş ve değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3 : İnsan varyantlarının kurtarma tabanlı (sol) ve aşırı ifade tabanlı (sağda) çalışmalar la fonksiyonelanalizi. (A) (sol panel): EBF3 varyantlarının işlevi, öldürücülük/canlılık üzerine odaklanan sinek düğümü (kn) LOF alelinin kurtarma tabanlı analizi ile değerlendirildi; (sağ panel): TBX2'deki varyantların işlevi, insan TBX2 transgenlerinin vahşi uçlarda aşırı ekspresyonu, öldürücü/canlılık, göz morfolojisi ve elektrofizyoloji fenotiplerine odaklanarak değerlendirildi (Şekil 4) . (B) Fonksiyonel çalışmalarda test edilecek sinekler elde etmek için geçiş şemaları. Her zaman bir kontrol deneyi olarak nötr bir UAS elemanı (örneğin, UAS-lacZ, UAS-GFP)kullanmanız önerilir. (C) EBF3p.R163Q ve TBX2p.R20Q varyantlarının fonksiyonel çalışmalarından ve sonuçları yorumlamak için gerekli olan uygun kontrol deneylerinden elde edilen sonuçları temsil eder. Hem kurtarma tabanlı analiz hem de aşırı ekspresyon çalışmaları varyantların amorfik veya hipomorfik aleller olarak izlerinin geldiğini ortaya koymaktadır. Burada gösterilen öldürücülük/canlılık verileri önceki yayınlarda sunulan deneysel verilere dayanmaktadır15,87. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4 : Drosophila'dagöz morfolojisi ve elektroretinograma dayalı insan Tüberküloz2'de nadir görülen bir yanlış anlamlıvaryantın fonksiyonel analizi. (A) Kayıt ve referans elektrotların sinek gözüne tipik yerleşimini gösteren şematik bir görüntü, dört ana bileşene sahip temsili bir elektroretinogram kaydı (geçici, depolarizasyon, geçici olmayan, repolarizasyon). (B) TBX2 varyantı (p.R20Q) görsel sisteme özgü GAL4 sürücüleri (ey-GAL4 ve Rh1-GAL4)kullanarak sinek gözündeki aşırı ekspresyon çalışmalarına dayalı kısmi LOF alel işlevi görür. Bu referans TBX2 varyant protein ile karşılaştırıldığında güçlü bir morfolojik ve elektrofizyolojik fenotip neden olduğunu gösterdi. (Üst paneller): ey-GAL4ile UAS-TBX2+ aşırı ekspresyonu üzerine göz boyutunda ciddi bir azalma görülür. UAS-TBX2s.R20Q. Ey-GAL4 ile tahrik de daha küçük bir göz neden olur, ama fenotip çok daha hafiftir. (Alt paneller): UAS-TBX2+ Rh1-GAL4 kullanılarak çekirdek R1-R6 fotoreseptörlerinde ifade edildiğinde, açık ve kapalı geçici, azaltılmış depolarizasyon ve potansiyel (PDA) fenotip ten sonra büyük anormal uzatılmış depolarizasyon kaybı vardır, hangi kontrol sinekler görülmez. Bu fenotipler UAS-TBX2p.R20Q aynı Rh1-GAL4kullanılarak ifade edildiğinde olduğu kadar şiddetli değildir. Bu rakam önceki yayınlardan 69,87olarak kabul edilmiş ve değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Amaç Aracı Url
Varyant fonksiyonu
tahmin algoritmaları		 Polifen-2
Elemek
Çakır
PROVEAN
MutasyonTaster
Revel		 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2
https://sift.bii.a-star.edu.sg
https://cadd.gs.washington.edu
http://provean.jcvi.org/index.php
http://www.mutationtaster.org
https://sites.google.com/site/revelgenomics
Nadir ve tanı konulmamış
hastalık araştırmaları
Konsorsiyum		 Udn
RDMM
IRUD
ÇÖZÜM-RD
AFGN		 https://undiagnosed.hms.harvard.edu
http://www.rare-diseases-catalyst-network.ca
https://irudbeyond.nig.ac.jp/en/index.html
http://solve-rd.eu
https://www.functionalgenomics.org.au
Için tümleştirici veritabanı
insan ve model
organizma Bilgi		 MARRVEL
Monarch Girişimi
Gene2Fonksiyonu
Fenomenologlar		 http://marrvel.org
https://monarchinitiative.org
http://www.gene2function.org
http://www.phenologs.org
İnsan Genetiği ve
Genomik Veri Tabanları		 OMIM
ClinVar
ExAC
gnomAD
GenoMP
DGV
De -şifre		 https://www.omim.org/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
http://exac.broadinstitute.org/
http://gnomad.broadinstitute.org/
http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/#/
http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
https://decipher.sanger.ac.uk/
Ortholog Tanımlama Aracı DiOPT https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Model Organizma
Veritabanları ve Biyomedikal
Edebiyat Arama		 WormBase (C elegans)
FlyBase (Drosophila)
ZFIN (Zebra balığı)
MGI (Fare)
Pubmed		 https://www.wormbase.org
http://flybase.org
https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Genetik ve protein
etkileşim veritabanları		 Dize
Sis		 https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
Protein yapısı
veritabanları ve
modelleme araçları		 WWPBD
İsviçre MODELI
Modelcisi
Phyre2 		http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
Hasta eşleştirme
Platform		 Çöpçatan Değişimi
GeneMatcher
AGHA Arşivi
Matchbox
De -şifre
MyGene2
Fenom Merkezi		 http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
İnsan transkripti
ek açıklama ve cDNA
klon bilgileri		 Memeli Gen Koleksiyonu
Ensembl
Refseq		 https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

Tablo 1: Bu protokolle ilgili çevrimiçi kaynaklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drosophila melanogaster kullanarak deneysel çalışmalar hastalık la ilişkili insan varyantları sonuçlarını değerlendirmek için sağlam bir araştırma sistemi sağlar. Bu bilgi ve son yüzyılda sinek alanında birçok araştırmacı tarafından oluşturulan çeşitli genetik araçların büyük vücut kaynaklanmaktadır89. Diğer deneysel sistem gibi, ancak, var olan uyarılar ve sınırlamalar kabul etmek önemlidir.

Veri Madenciliği ile İlişkili Uyarılar
Bu protokolün ilk adımı, ilgi çeken bir genle ilgili bilgiler için veritabanlarını oluşturmak olsa da, bunu yalnızca bir başlangıç noktası olarak kullanmak önemlidir. Örneğin, varyant işlevinin silico tahmini değerli öngörüler sağlasa da, bu veriler her zaman dikkatli bir şekilde yorumlanmalıdır. Tüm büyük algoritmalar bir insan varyantı iyi huylu olduğunu tahmin bazı durumlar vardır, Drosophila henüz fonksiyonel çalışmalar açıkça bu varyant24zarar doğasını gösterdi . Benzer şekilde, protein-protein etkileşimleri, ortak ifade ve yapısal modelleme verileri tüm anlayışlı bilgi parçaları olsa da, bu büyük omik veri kümelerinde psödo-pozitif ve sözde negatif bilgi bulunabilir. Örneğin, önceden tanımlanmış veya tahmin edilen protein-protein etkileşimlerinden bazıları yapay olabilir veya sadece belirli hücre ve doku tiplerinde görülebilir.

Buna ek olarak, bazı protein-protein etkileşimleri geçici olduğundan (örn. enzim-substrat etkileşimleri) bu veri kümelerinde yakalanan pek çok yanlış negatif etkileşim olabilir. Deneysel doğrulama, bazı gen lerin veya proteinlerin biyolojik ilgi bağlamında in vivo'ya genetik veya fiziksel olarak etkileşimde olduğunu göstermek için çok önemlidir. Benzer şekilde, homoloji modellemeye dayalı olarak öngörülen yapılar, çözülmüş yapı yerine bir model olarak ele alınmalıdır. Bu bilgiler proteinin yapısal olarak önemli bir bölümünde bir amino asit bulunduğu tespit edilirse yararlı olabilir, ancak negatif veriler varyantın zarar verici olabileceği ihtimalini göz ardı etmez. Son olarak, daha önce bildirilen genotip-fenotip bilgilerinden bazıları da dikkatli davranılmalıdır, çünkü genel veritabanlarında arşivlenen bazı bilgiler doğru olmayabilir. Örneğin, MO veritabanlarındaki bazı bilgiler iyi denetlenen ve titizlikle gerçekleştirilen denemelere dayanırken, diğerleri daha fazla takip çalışması ve sıkı denetimleri olmayan büyük bir ekran kağıdından gelebilir.

T2A-GAL4 Stratejisi ni kullanan "İnsanlaştırma" Deneyleri Her Zaman Başarılı Değil
İnsan CD'leri kullanılarak yapılan kurtarma ve aşırı ifade temelli fonksiyonel çalışmalar, insan proteini bağlamında varyantların değerlendirilmesini sağlarken, bu yaklaşım her zaman başarılı değildir. Eğer bir referans insan cDNA sinek mutant fenotip kurtaramaz, iki olası açıklamalar vardır. İlk olasılık, insan proteininin işlevsiz olması veya bir sinek hücresi bağlamında aktivitesini önemli ölçüde azaltmış olmasıdır. Bu 1) azaltılmış protein ekspresyonu, stabilite, aktivite ve / veya lokalizasyon veya 2) bir çok protein kompleksi çalışan sinek proteinleri ile uyumluluk eksikliği nedeniyle olabilir. UAS/GAL4 sistemi ısıya duyarlı olduğundan, sinekler bu durumda bir kurtarma olasılığını görmek için nispeten yüksek sıcaklıkta (örneğin, 29 °C) yükseltilebilir. Buna ek olarak, bir UAS-fly cDNA yapı ve pozitif kontrol olarak transgene oluşturulabilir. Eğer ilgi varyantı korunmuş bir amino asidi etkiliyorsa, benzer varyant sinek ortolog bağlamında varyantın fonksiyonel çalışması için sinek cDNA'sına getirilebilir. Bu gerekli olmamakla birlikte, insan cDNA transgenik hatlarının kullanılmasının olumsuz veyasonuçsuz sonuçlar verdiği durumlarda çalışmaya büyük ölçüde yardımcı olur (Şekil 3).

İkinci olasılık ise insan proteininin ekspresyonu bazı hücresel veya organizma düzeyinde toksisiteye neden olamaz. Bunun nedeni antimorfik (örn. baskın negatif protein gibi hareket), hipermorfik (örn. çok fazla aktivite), ya da neomorfik (örn. protein toplama gibi yeni bir toksik fonksiyonun kazanılması, her zaman genin endojen fonksiyonu ile ilişkili değildir. ilgi) etkileri. Bu durumda, sinekleri düşük sıcaklıkta tutmak (örn. 18 °C) bu sorunlardan bazılarını hafifletebilir. Son olarak, bir sinek cDNA aşırı ekspresyonu tbx2 örneğinde görüldüğü gibi sinek T2A-GAL4 hattı kurtarmak olmayabilir bazı senaryolar vardır, muhtemelen gen ürünün trict dozaj bağımlılığı nedeniyle. İlgi bir proteinaşırı önlemek için, ilgi sinek gen crispr üzerinden doğrudan değiştirilebilir, bir genomik kurtarma yapısı ilgi varyantı içeren tasarlanmış olabilir, ya da kurtarma deneyleri bir LOF alel kullanılarak yapılabilir21. Küçük genler için, "insancıl" sinek genomik kurtarma yapısı olmayan korunmuş amino asitler etkileyen insan varyantları test etmek için düşünülebilir24. Özetle, insanlaştırma deneyi ilgi varyantının işlevsel olarak değerlendirilmesini sağlamadığında alternatif stratejiler göz önünde bulundurulmalıdır.

Olumsuz ve Olumlu Sonuçların Yorumlanması
Eğer 1) hem referans hem de varyant insan cDNA'ları sinek mutant fenomenini benzer bir dereceye kadar kurtarırsa ve 2) test edilen tüm koşullarda herhangi bir fark yoktur, o zaman varyantın Drosophila'da işlevsel olarak ayırt edilemez olduğu varsayılabilir. Vivo. Ancak, Drosophila testi yeterince hassas olmayabilir veya ilgi gen / protein tüm potansiyel fonksiyonları yakalamak, ilgi varyantı patojenik olmadığını ekarte etmek için bu bilgilerin yeterli olmadığını belirtmek önemlidir insanlarla ilgilidir. Pozitif veriler ise varyantın protein fonksiyonu üzerinde zararlı sonuçlar doğurdu¤una dair güçlü bir göstergedir, ancak bu veriler tek başına patojenite iddiası için yeterli değildir. American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), insan hastalığı ile ilişkili genlerdeki varyantları "iyi huylu", "muhtemel iyi huylu", "bilinmeyen öneme sahip (VUS)", "muhtemel patojenik" olarak sınıflandırmak için bir dizi standart ve kılavuz yayımladı ve "patojenik"90. Bu sınıflandırma sadece yerleşik hastalıkla ilişkili genler için geçerli olsa da ve "belirsiz öneme sahip genler" (GUS) varyantları için doğrudan geçerli olmasa da, insan varyant fonksiyonel çalışmalarda yer alan tüm bireyler varyant işlevini raporederken bu kılavuza uyun.

MO Fenotipler Bir İnsan Hastalığı Durumu Model yok zaman Yararlı Biyolojik Bilgiler Ayıklama
Özellikle atılan bazı fenotiplerin hastalık durumuyla çok az ilgisi olabileceğinden, aşırı ifade tabanlı fonksiyonel tahlillerin sınırlamaları olduğunu unutmamak gerekir. Benzer şekilde, kurtarma deneyleri yoluyla değerlendirilmekte olan fenotiplerin de ilgi çekici hastalıkla doğrudan bir ilgisi olmayabilir. Bu deneyler omurgasız bir sistemde endojen bağlamlar dışında yapıldığından, hastalık modelleri olarak değil, Drosophila'yı "yaşayan bir test tüpü" olarak kullanan bir gen fonksiyon testi olarak düşünülmelidir.

Model organizma bir insan hastalığı durumunu taklit etmese bile, kurtarma deneylerinde kullanılan köreltilebilir fenotipler genellikle hastalık koşullarına yararlı biyolojik bilgiler sağlayabilir. "Fenologlar (belirgin olmayan homolog fenotipler)" kavramı91, Drosophila ve insan fenotipleri arasındaki temel moleküler bağlantıları daha da belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, sinek kanadı, toraks, bacaklar ve gözlerde morfolojik fenotipler, Kardiyovasküler bozukluklar da dahil olmak üzere birçok konjenital bozukluklara bağlı evrimsel olarak korunmuş bir yol olan Çentik sinyal yolundaki bozukluklar için mükemmel fenotipik okumalardır. insanlarda62. Drosophilabazı fenotiplerin arkasındaki moleküler mantığı anlayarak, henüz anlaşılamayan insanlarda genler ve fenotipler arasındaki gizli biyolojik bağlantıları belirlemek mümkündür.

Klinik İşbirlikçilerle Sürekli İletişim
Hastada bulunan nadir bir varyantın işlevini incelemek için klinisyenlerle çalışırken, güçlü bir işbirlikçi ilişki kurmak önemlidir. Klinik ve temel biyomedikal araştırmacılar aynı genler/ genetik yollar ilgi lerini paylaşabilirsiniz rağmen, klinik ve bilimsel alanlar arasında büyük bir kültürel ve dilsel (örneğin, tıbbi jargon, model organizmaya özgü terminoloji) boşluk vardır. İki taraf arasında güçlü, güvene dayalı bir ilişki kapsamlı iletişim yoluyla kurulabilir. Ayrıca, çift yönlü iletişim bu ilişkinin kurulması ve sürdürülmesi için çok önemlidir. Örneğin, temsili sonuçlar bölümünde açıklanan iki olguda, benzer genotiplere ve fenotiplere sahip ek hastaların belirlenmesi ve sonraki fonksiyonel çalışma, ilgi varyantlarının patojenliğini kanıtlamak için kritik öneme sahip ydi. Güçlü fonksiyonel verilerle bile, araştırmacılar ve klinisyenler genellikle insan genetikçileri "n = 1" olgularında tanımlanan bir varyantın hastalığın gerçek nedeni olduğuna ikna etmekte güçlük çekerler.

Mo araştırmacısı bir ilgi varyantının zarar verdiğini belirledikten sonra, diğer klinisyenler ve insan genetikçilerle ağ oluşturarak eşleşen vakaları aktif olarak belirlemeye çalışabilmeleri için klinik işbirlikçilerle mümkün olan en kısa sürede iletişim kurmak önemlidir. Geno2MP [Genotipler Mendelian Fenotipler gibi araçlar: Washington Üniversitesi Mendelian Genomik Çalışması41'ekayıtlı 9.650 kişinin tanımdan arındırılmış veritabanı; genetik bozukluklar] aynı bozukluğu olan bireyleri değerlendirmek için aranabilir. Daha sonra, baş klinisyen bir mesajlaşma özelliği kullanılarak temasa geçilebilir.

Alternatif olarak, GeneMatcher klinisyenler, temel araştırmacılar ve nadir varyantları taşıyan ek hastaları belirlemek için aynı genler ilgi lerini paylaşan hastalar için bir çöpçatanlık web sitesi olan kullanılabilir. GeneMatcher Matchmaker Exchange42adlı çöpçatanlık web sitelerinin daha büyük bir bütünleştirici ağının bir parçası olduğundan, Avustralya Genomik Sağlık İttifakı Hasta Arşivi, Geniş Matchbox dahil olmak üzere dünya çapında ek veritabanları aranabilir , DECIPHER, MyGene2, ve PhenomeCentral tek bir GeneMatcher gen gönderme. GeneMatcher'a katılım bir "araştırmacı" olarak mümkün olsa da, bir maçtan sonra diğer klinisyenlerle iletişim belirli düzeyde tıbbi gerektirdiğinden, temel bilim adamlarının bu web sitesini klinik işbirlikçileriyle birlikte kullanmaları tavsiye edilir. Uzmanlık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Jose Salazar, Julia Wang ve Dr. Karen Schulze'ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Ning Liu ve Xi Luo'yu burada tartışılan TBX2 varyantlarının fonksiyonel karakterizasyonu için kabul ediyoruz. Teşhis Edilemeyen Hastalıklar Ağ Modeli Organizmatarama Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ortak Fonu (U54 NS093793) aracılığıyla desteklendi. H. T. C. daha NIH [CNCDP-K12 ve NINDS (1K12 NS098482)], Amerikan Nöroloji Akademisi (Nörobilim Araştırma hibe), Burroughs Wellcome Fonu (Kariyer Ödülü Tıp Bilim Adamları için Kariyer Ödülü), Çocuk Nöroloji Derneği ve Çocuk Nöroloji Vakfı tarafından desteklendi ( PERF Elterman hibe ve NIH Direktörü Erken Bağımsızlık Ödülü (DP5 OD026426). M. F. W. simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479) tarafından daha da desteklenmiştir. S. Y. daha NIH (R01 DC014932), Simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479), Alzheimer Derneği (Yeni Araştırmacı Araştırma Hibe: 15-364099), Naman Aile Fonu Temel Araştırma ve Caroline Wiess Hukuk Fonu araştırma tarafından desteklendi Moleküler Tıp. BCM'de konfokal mikroskopi kısmen NIH Grant U54HD083092 tarafından Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi (IDDRC) Nörogörüntüleme Çekirdeği'ne desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

Genetik Sayı 150 insan genetiği ve genomik Mendelian hastalıklar nadir ve tanı konulmamış hastalıklar Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı Drosophila melanogaster,bilinmeyen önemi varyantı VUS belirsiz önemi gen GUS fonksiyonel genomik transgenik sinekler UAS/GAL4 sistemi T2A-GAL4 elektroretinogram ERG
<em>Drosophila</em> Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao,… More

Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter