Summary
我们报告信使RNA(mRNA)电穿孔作为一种方法,允许快速有效地表达多个蛋白质在龟胚胎模型系统。该方法可用于荧光标记细胞,并在电穿孔后不久通过延时显微镜记录细胞体内运动。
Abstract
我们报告说,mRNA电穿孔允许荧光蛋白比DNA电穿孔更快地和广泛地标记活的鹅胚胎中的细胞。高转染效率允许至少4个不同的mRNA以±87%的效率进行共转染。大多数电穿孔的mRNA在电穿孔后的前2小时降解,允许在发育中的胚胎中进行时间敏感的实验。最后,我们描述了如何动态成像活胚胎电镀与mRNA编码各种亚细胞靶向荧光蛋白。
Introduction
电穿孔是一种物理转染方法,它使用电脉冲在等离子膜中产生瞬态孔隙,使核酸或化学物质等物质进入细胞醇。电穿孔被广泛用于将DNA输送到细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞1、2、3。它通常用于将遗传有效载荷引入发育中的鸟类胚胎中的目标细胞和组织,以研究发育的遗传控制或标记细胞迁移种群4、5、6 7.然而,DNA电穿孔8也存在一些实验限制。例如,DNA电穿孔通常引入每个细胞表达载体数量高度可变,随后引入其编码的 mRNA 和蛋白质。这种变异性会导致相当大的细胞异质性,使图像分析和数据解释复杂化9,10。此外,来自DNA电穿孔的蛋白质在电穿孔后才开始表达±3小时,直到12小时才达到细胞数量和荧光强度的最高效率,这可能是因为需要时间转移到细胞核并完成转录和翻译在体内11。
相比之下,mRNA转染已有效地用于各种模型系统,包括通过微注射12、13、通过mRNA脂肪可敏转染14重新编程人类干细胞,在成年小鼠中电化顽固神经干细胞15。我们利用编码不同荧光蛋白(FPs)的体外合成mRNA,测试了mRNA电穿孔在早期鸟类胚胎发育过程中有效标记细胞的能力。在我们的研究中,我们使用pCS2+载体,一种多用途表达载体,通常用于在异种动物和斑马鱼胚胎中表达蛋白质。pCS2+ 中的 SP6 和 T7 RNA 聚合酶启动子允许在体外转录/翻译系统中使用时从任何克隆基因中合成 mRNA 和蛋白质。
在这里,我们证明了mRNA电穿孔允许快速有效地表达荧光蛋白(FPs)在胃化鹅胚胎。我们设计并生成了许多在这些研究中使用的表达式向量。例如,我们将 LifeAct-eGFP 基因16分克隆到 pCS2+ 载体17中,以从 CMV 启动子和 SP6 启动子表达。插入的基因位于SP6启动子的下游和SV40聚(A)尾18的上游。在与mRNA和DNA共电的胚胎中,从体外转录的mRNA编码的FPs在电穿孔后20分钟内首次被检测到,而DNA表达载体中的FPs仅在3小时后被检测到。膜蛋白可以同时电化到胚胎中,从而在单个细胞中快速有效地表达多种蛋白质。最后,使用光漂白(FRAP)测定后的体内荧光恢复,我们发现大多数电化mRNA在2小时内衰变。因此,快速的初始蛋白质生产与有限的新蛋白质转化相结合,使mRNA电穿孔成为一种有价值的技术,当需要时间控制表达时。
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Protocol
所有动物程序均按照洛杉矶儿童医院和南加州大学机构动物护理和使用委员会批准的准则进行。
1. 生成基于 pCS2 的表达式矢量
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要克隆 pCS2.Lifeact-eGFP,请通过消化 2 μg 的 pCS2.CycB1-GFP(包含不同插入的构造)在适当的消化缓冲液中(参见材料表)在适当的消化缓冲液中(参见材料表)稀释到总反应中的 1 倍来制备载体主干在37°C下体积为50μL1小时(参见图1,了解克隆过程原理图)。
- 通过加入虾碱性磷酸酶(1 U),从限制性酶反应中脱光载体骨干质的游离3'OH端。在37°C下孵育30分钟。
- 在 1% 甘蔗凝胶/1x Tris 醋酸 EDTA (TAE) 缓冲液中运行整个混合物,在 90 V 下进行 ±50 分钟,然后在 1x TAE 缓冲液中将凝胶染色至 0.5 μg/mL 溶液中,在 1x TAE 缓冲液中轻轻摇动 15 分钟。此外,请确保在自由通道中加载分子量标记,以帮助确定 DNA 大小。
- 使用 DNA 安全紫外线转导剂避免刻痕 DNA,快速从腺胶凝胶中切出载体主干(预期带大小为 4kb),并使用制造商的说明使用凝胶纯化试剂盒从凝胶片中分离 DNA 片段。
- 与步骤1.1同时,在适当的消化缓冲液中,在总反应体积为50μL的50μL中,在37°C下,在适当的消化缓冲液中消化2μg的pEGFP-N1-Lifeact,将2μg的pEGFP-N1-Lifeact与BglII(10 U)一起制备。运行整个混合物在1%的甘蔗凝胶中,以分离800 bp带,如步骤1.1.2-1.1.3所述。
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在分光光度计上纯化和定量载体后,在T4DNA冠带缓冲液中结合50纳克的载体和38纳克的插入物(1:3载体与插入的摩尔比),然后加入T4DNA联结酶,催化结扎反应。此外,设置无 DNA 控制、仅矢量控制以及仅插入控件。在室温下孵育所有反应30分钟。
- 将结扎混合物的1μL转化为合格的大肠杆菌DH10。 此外,仅转换水负控制和 20 pUC19 正控制。将细菌传播到含有50微克/mL阿霉素的Luria Broth(LB)琼脂板,并在37°C下孵育过夜。
- 第二天早上,计算每个盘子上的菌落。
注:理想情况下,负控制板上不应有菌落,矢量插入连接板上不应有>100个菌落,并且仅向量板上的菌落较少。 - 从用载体+插入结扎混合物转化的琼脂板上挑选至少8个细菌菌落,并使用无菌牙签或移液头将其接种到含有50μg/mL阿霉素的2 mL液体LB汤中。
- 使用商业质粒小试剂盒从每个克隆中提取DNA。
- 使用每个克隆的500 ng DNA在适当的消化缓冲液中使用NotI(10 U)和BamHI(10 U)运行诊断限制消化,在37°C下稀释至1x1小时1小时,并在1x TAE缓冲液中运行1%的角糖凝胶上消化的DNA。pCS2.Lifeact-eGFP 阳性克隆的预期波段大小为 3.9 kb 和 978 bp。
- 将1 pg-100 ng的DNA从阳性克隆转化为合格的大肠杆菌DH10,并准备3-4个微预备反应,如前一步所述,以获得足够量的DNA进行体外转录反应(最小10微克)。
2. 通过体外转录制备mRNA
- 在适当的消化缓冲液中,用 NotI (10 U) 在 37°C 过夜时,在总反应量为 50 μL 的 50 μL 中,用 NotI (10 U) 在刀片的 3' 端线性化 10 μg 的 PCS2.LifeAct-eGFP。
注:为了防止RNase污染,减少mRNA降解,在处理mRNA样品时戴手套。 -
使用苯酚混合物净化DNA:氯仿:等亚醇(25:24:1,v/v)。
- 加入150 μL无RNase水,使消化反应的总体积等于200μL。然后,加入200μL的苯酚:氯仿:等醇和涡旋混合物20s。
- 以最大速度(18,400 x g)在微熔中离心2分钟。小心地去除含有线性DNA的顶部水相。重复此步骤以去除其他杂质,并小心不要破坏底部和顶部液相之间可能形成的白色沉淀物。
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通过加入1/10体积3M醋酸钠(无RN酶)和2.5卷100%乙醇沉淀线性DNA。将混合物留在-20°C处,超过30分钟,然后以最大速度(18,400 x g)离心,颗粒DNA。
- 用70%乙醇清洗DNA颗粒,然后风干颗粒,超过5分钟。
- 将DNA颗粒溶解在5μL的无RNase水中。通过分光光度计量化DNA。
注:预期DNA浓度为±0.5-1 μg/μL,A260/A280比率介于1.7-2.0之间。
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使用1 μg的线性化pCS2.LifeAct-eGFPDNA进行体外转录(IVT)。按照制造商在商业套件中的说明(参见材料表)包括 10 μL 的盖模拟(最终浓度 0.8 mM)和 NTP(ATP、CTP 和 TTP 的最终浓度为 1 mM;GTP 为 0.2 mM),2 μL 的 10 倍反应缓冲液(最终浓度)SP6 RNA聚合酶的2μL和高达20μL的无RN酶水。
- 根据转录笔大小,孵育 IVT 混合物约 2 小时或更长时间。
注:2 h 孵育对3 kb成绩单有效,但隔夜孵育对大于5 kb的转录本效果更好。 - 要从转录反应中去除游离核苷酸,加入30μL的LiCl RNA沉淀溶液(7.5M氯化锂,50mM EDTA)以沉淀mRNA。将混合物短暂涡流,在-20°C下储存30分钟,以最大速度(18,400 x g)在微熔中将mRNA旋转15分钟,然后用70%乙醇(无RNase)冲洗。
- 根据转录笔大小,孵育 IVT 混合物约 2 小时或更长时间。
- 将合成的mRNA溶解在15μL的无RN酶水中。在5μL/管(共3管)下分配合成的mRNA,并置于-80°C进行长期储存。用分光光度计定量mRNA。
注:预期收率为15-20 μg mRNA(±1 μg/μL)。1 μL (1 μg/μL) 足以进行 10 个胚胎的实验,假设 mRNA 从 1 μg/μL 稀释到 500 纳克/μL,并且每个胚胎被注射 ±200 nL。因此,每个管子应包含足够的mRNA进行+5实验。 - 使用 RNase 去污溶液(例如,RNase Away)清洁所有凝胶设备后,在 1x TAE 缓冲液中的 1% agarose 凝胶上运行 ±300 ng mRNA,并确保 mRNA 显示为一个波段(如果形成二级结构,则可能存在多个带),并且不会涂抹凝胶通道中的ppears,表明RNA降解。
3. mRNA电穿孔混合物的制备
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以所需浓度解冻和稀释 mRNA(无RNase水中的250-500纳克/μL适用于本工作测试的所有 mRNA)。添加 1/10 体积的彩色染料(参见材料表,无RNAe,0.1%最终浓度),以帮助可视化 mRNA 注射部位并正确放置电极。
注:如果DNA和RNA结合进行共电穿孔,则使用苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀在mRNA和DNA混合物之前,确保DNA不会污染RNases。- 请务必使用模拟(无添加RNA)电穿孔溶液准备负控制。如果可能,使用预先验证的 mRNA(在以前的实验中证明能成功产生 FP 的 mRNA)制备阳性对照。
注:负控制对于所有成像实验建立背景荧光水平以实现数据规范化至关重要。当使用新转录的mRNA时,正控制尤其重要,因为帮助确认电穿孔设置是否有效。
- 请务必使用模拟(无添加RNA)电穿孔溶液准备负控制。如果可能,使用预先验证的 mRNA(在以前的实验中证明能成功产生 FP 的 mRNA)制备阳性对照。
- 将 mRNA 电穿孔溶液储存在冰浆上,以防止降解,直到准备好进行电穿孔。
4. 电波mRNA进入活的奎尔胚胎
- 每天收集新鲜产的受精卵,在13°C的加湿冰箱中储存不超过1周。在38°C下孵育卵,直到所需的胚胎发育阶段19,20,21。
注:HH3至HH5用于静态和动态成像。对于HH3胚胎,在收获前将卵子留在室温下2小时,使得分离过程更容易,因为当冷却时,胚胎通常更耐物理操作。 - 根据EC培养系统22分离和制备胚胎。每个条件至少收集5个胚胎,包括至少一个作为阴性对照(不电镀)。
- 轻轻打破,将鸡蛋倒入10厘米的培养皿中。用转移移液器去除大部分厚白蛋白,并用纸巾轻轻擦拭蛋黄表面,取出胚胎周围剩余的厚白蛋白,以确保胚胎紧紧地粘在纸环上。
- 将预切滤纸(见材料表)放在胚胎上,用剪刀在胚胎周围平滑切割。
- 使用巴斯德移液器用PBS为胚胎提供底,使用柔和的溪流来腾空任何粘在胚胎上的蛋黄。
注:在使用更年轻 (- 缓慢地将胚胎/纸环以倾斜的角度向上拉,然后从蛋黄上拉出,放入装满 PBS 的培养皿中,以便进一步清洁。一旦大部分蛋黄被移除,将胚胎腹腔侧向上放在一个35毫米的培养皿上,上面覆盖着半固体混合物的琼脂/白蛋白。
- 使用玻璃微移液拉器仪器制备 6 至 8 个 10 厘米长的玻璃微毛细血管(O.D. = 1.2 mm)。
- 将胚胎腹腔侧向上放在充满PBS的电穿孔室中。使用玻璃微毛细管,将200 nL的mRNA或DNA/mRNA电穿孔混合物注射到覆盖所需区域的表膜和维他林膜之间的腔中。
注:在本手稿中显示的大多数实验中,整个前部区域和一些用于 opaca 的区域被电化。 - 将正极和负极(铂平方形电极;侧长5mm)分别放置在胚胎顶部和底部,并使用以下脉冲序列电波:5个5V的方形电脉冲,50ms持续时间,间隔为100 ms使用体内电孔。确保电极之间的距离为 ±5 mm。
注:优化电穿孔参数对于避免可能杀死脆弱的胚胎细胞的条件至关重要。电压、脉冲长度、脉冲间隔以及DNA和mRNA脉冲数的参数应考虑用于各种电穿孔装置。 - 在38°C下孵育电镀胚胎到所需的发育阶段。
注:荧光解剖立体镜(见材料表)有助于筛选转染的胚胎与非转染胚胎。 - 如果胚胎要静态成像,在PBS中将其固定在4%的甲醛中,在室温下固定1小时,或在4°C下过夜。
- 用剪刀平滑地在滤纸周围切开,用锋利的钳子轻轻剥去背表面的闪亮膜,从而从膜膜中取出胚胎。
- 在 PBS/Triton 中清洗固定胚胎 (0.1%)2x 5 分钟,如果需要,继续原位杂交或免疫染色。
- 最后,在PBS/Triton(0.1%)中将胚胎染色在0.5μg/μL DAPI中在室温下至少30分钟。在PBS/Triton 2中清洗胚胎5分钟,在SCALE-U2溶液23中清除胚胎过夜。
- 要分析电穿孔的效率(见图2),使用ImageJ上的二进制和粒子分析工具和DAPI通道从图像中的所有细胞获取核轮廓。
- 要在 ImageJ 上使用二进制工具,请在包含大多数单元格的 DAPI 通道中使用单个 z 切片,然后单击"处理 > 二进制 > 使二进制"。要分离附近的单元格,请单击"处理 > 二进制 > 分水岭"。通过单击"分析>分析粒子",大小设置为 100-500 (μm2) 获取细胞轮廓。
- 确保大多数单元格在 DAPI 通道中勾勒,并通过单击"更多>在ROI 管理器弹出窗口上保存"来保存单元格轮廓。
- 通过打开 mRNA 或 DNA 通道中的单个 z 切片上以前保存的文件,然后单击 ROI 管理器上的"测量",使用这些轮廓获得 mRNA 和 DNA 通道的荧光强度值。
- 最后,过滤这些强度值,将具有<6,000荧光强度的细胞计数为非转染细胞,将>6,000荧光强度的细胞作为转染。
5. 由电镀 mRNA 编码的图像 FP
- 在荧光解剖立体镜下观察所有电镀胚胎后,选择最健康、最好的电镀胚胎进行动态成像实验。
- 继续孵育其他电镀胚胎和非电化胚胎(负控制)在单独的培养箱中,同时成像选定的胚胎,以防该胚胎在实验期间死亡。
- 对于动态成像,使用前24、25、26所述的全山前ovo鸟类胚胎培养,使用倒置共聚焦显微镜。
注:显微镜配有一个台面培养箱(见材料表),在成像过程中将温度保持在36°C。在显微镜设置期间观察到,在36°C下孵育的胚胎比在较高温度下存活的时间更长,可能是因为激光可能导致胚胎局部加热。读者应确定适合自己显微镜设置的最佳舞台孵化温度。- 要动态成像和可视化胚胎生成,请用 PBS 短暂清洁电穿孔胚胎,通过在 PBS 清洁中使用钳子移动胚胎,去除在电穿孔过程中胚胎背侧可能形成的任何气泡解决 方案。
- 将干净的胚胎直接放在含有一层薄白蛋白-agar(±150 μL)的成像皿上,确保胚胎22的背表面不会产生任何气泡。
- 为确保长期成像的生存,在成像盘的内边缘添加一张湿润的纸片,并使用石蜡薄膜密封培养皿,以尽量减少成像和孵育过程中的蒸发。
- 将此培养皿快速移动到共聚焦显微镜的预加热阶段,并使用明场通道(PMT 激光 20%)定位胚胎中的彩色染料,该通道可识别注射和电镀区域。
- 将成像软件设置为所需目标(10 或 20x)、二色镜(GFP nm 为 488 nm,RFP 为 561),发射光谱(GFP 为 499-562 nm,RFP 为 570-695 nm),并打开适当的激光(GFP 为 488 nm,RFP 为 561 nm)。
注:电镀mRNA被转化为在20分钟内看到的蛋白质(见图3)。 本文中大多数图像使用的成像元数据是:具有20倍目标的倒置共聚焦显微镜(见材料表);像素停机时间,±1.5 μs;4 行扫描的平均值。- 单击成像软件上的 Live,根据每个显微镜激光功率将激光功率调整到适合荧光强度的设置。首先使用1%的激光功率、800增益对胚胎进行成像,并将激光功率缓慢地增加1%,直到看到饱和像素。
- 遵循此操作,稍微降低激光功率,直到不再看到饱和像素。
注:为胚胎成像过程的开始而选择的激光功率可能适合早期时间点,但如果细胞的荧光随着时间的推移变得明亮或变暗,则在以后的时间点并不理想。为了解决这个问题,最初在稍低的功率设置下对胚胎进行成像,因为电穿孔电池通常在电穿孔后的前 6 小时内变亮(参见图 3A-E,用于量化信号增加)。如果后面的图像已饱和,则继续使用原始成像设置进行成像,但在使用较弱的成像设置(较小的针孔或较弱的激光功率)后立即拍摄其他图像。 - 每3-5分钟对胚胎进行图像,以跟踪不同时间点的单个细胞迁移。对于这项工作,图像是Z堆栈(约50μm厚)的整个电镀区域,再加上一些额外的空间朝z堆栈的底部,以防胚胎沉入角玫瑰床在整个成像会话。
- 通过检查第一部电影的前几个时间点,观察单元格的移动速度。如果像元以快速的速度移动(意味着它们将在几个时间点内退出图像区域的区域),请考虑扩大图像区域的缩放(1 倍 = 0.8 倍)或对不同区域进行成像。
注:该地区的胚胎区移动速度比该地区地区快得多。此外,较年轻的胚胎(HH3,HH5)通常含有与较老的胚胎相比,经历更快速运动的细胞(>HH7)。 - 对胚胎的电镀区域进行成像后,对同一胚胎的未电镀区域进行成像,以确定自荧光水平(如果使用低激光功率 <10% 来成像胚胎,则应为最小)。
6. 光漂白 (FRAP) 到测定 mRNA 完整性后的荧光恢复
注:光漂白 (FRAP) 测定后体内荧光恢复可用于确定转染的 mRNA 可转换为 FP 的时间。以下协议概述了用于检测 H2B 半寿命的 FRAP 实验。黄水晶mRNA在电镀胚胎中。
- 使用 20x 0.8 NA 物镜和完全打开的针孔在倒置共焦显微镜上执行 FRAP 实验。
- 在立体显微镜上确认H2B-黄水晶的电穿孔,并在倒式共焦显微镜的预热台上设置胚胎(参见步骤5.2.4)后,不同时间从H2B-Citrine中光漂白大部分细胞荧光点(45分钟,2小时,5小时电穿孔后)使用405nm激光70%激光功率,100次迭代,扫描速度4,仅剩5%的荧光。
注:此过程需要几分钟时间。 - 光漂白后,继续在36°C的舞台上孵育胚胎。
- 在立体显微镜上确认H2B-黄水晶的电穿孔,并在倒式共焦显微镜的预热台上设置胚胎(参见步骤5.2.4)后,不同时间从H2B-Citrine中光漂白大部分细胞荧光点(45分钟,2小时,5小时电穿孔后)使用405nm激光70%激光功率,100次迭代,扫描速度4,仅剩5%的荧光。
- 注意在光漂白区域内积极分割细胞,这表明光漂白细胞在治疗后尚未完全死亡。
- 使用共聚焦显微镜,定期(3 或 5 分钟)获取漂白后图像(电镀区域的 z 堆栈),时间间隔长达 30 分钟。
注:如果可用,使用转基因 H2B-XFP 线作为正对照,以确保光漂白区域的细胞存活。电镀mRNA编码的FP的荧光回收率应降低,但在整个电影中,通过转基因编码的FP应保持一致。 - 确保成像条件不会有害地影响胚胎存活,同时孵育未光漂白的电化胚胎,可作为成像的控制。
- 要量化 mRNA 衰变后电穿孔的光漂白结果,请使用 ImageJ 测量每个细胞的中心荧光强度(7.5 μm 圆),从而跟踪细胞荧光随时间推后(3 或 5 分钟)。测量光漂白区域内所有未进行线粒体,且已完全光漂白的细胞。
注:考虑从定量中省略线粒细胞,因为由于染色质凝结,线粒核的荧光比相间核更强。 - 在各种时间点(45 分钟、2 小时和 5 小时)绘制漂白后随时间的荧光强度。
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Representative Results
mRNA 电穿孔比 DNA 电穿孔更有效
我们使用 pCS2+。H2B-黄体素制备体外转录mRNA。由于DNA电穿孔通常在1-2μg/μL下进行,我们使用mRNA的等位浓度(计算为H2B-Citrine的约0.25-0.5微克/μL)进行mRNA电穿孔。我们首先测试了pCS2+的电穿孔效率。H2B-黄水晶DNA与H2B-黄水晶mRNA(从pCS2+的SP6启动子体转录的体外转录)。H2B-黄酸酯)通过将DNA或mRNA分别电穿孔到HH5青鱼胚胎中,然后在电穿孔后12小时检查电穿孔效率。虽然DNA电穿孔导致一些电穿孔细胞的荧光更亮,但与广泛表达的mRNA编码FPs相比,DNA电穿孔的效率明显较低(图2A和B)。
考虑到电穿孔协议中固有的胚胎到胚胎变异性,将编码H2B-黄水晶的mRNA和表达H2B-mKate2的DNA的模棱两格组合电化到HH5胚胎的外孔中,并观察到12小时电穿孔后。当比较同一胚胎的DNA和mRNA共电,DNA表达FP也明显和持续低于mRNA的效率(图2C)。通过量化所有仅用mRNA、DNA或两者组合电化的胚胎,我们发现mRNA转染了给定区域中75%的细胞,而DNA仅转染给定区域中25%的细胞(图2D)。在所有共电化胚胎中,由mRNA或DNA编码的荧光蛋白表达中的扩散没有显著差异(图2E)。
在mRNA电穿孔中,蛋白质表达比DNA电穿孔更快
转染的mRNA应导致更快的蛋白质生产,因为它可以立即被细胞翻译机制识别如图3所示。DNA必须转移到细胞核,转录,mRNA被运回细胞醇,在那里它被细胞翻译机械识别,预计需要更多的时间。为了直接比较mRNA与蛋白质生产DNA表达率,我们进行了一系列时间过程实验,将DNA(pCMV.H2B-mKate2)和mRNA(H2B-Citrine)的模位组合共同电化到HH5胚胎的子宫内。我们检测到mRNA编码的FP表达大约22分钟电穿孔后,这继续增加在相对荧光强度+6小时(图3A-E,补充。电影 S1b.相比之下,DNA编码的FP表达在电穿孔后±1.5小时处首次出现(图3A'-E',补充)。电影 S1c),亮度继续增加,直到 6 小时停止影片。由于DNA电孔细胞被6小时标记饱和,我们用较弱的成像条件重新成像这一状况(图3F-F')。在这个时间推移的所有时间点(22分钟到6小时),mRNA转染细胞比DNA多好几倍(补充)。电影S1a,通过亮场和DAPI电穿孔的总效率不显示,因为这些图像是从野生类型的鹅胚胎的延时。基于此,我们得出结论,mRNA电穿孔导致早期表达的蛋白质。
多mRNA的共电穿孔是高效率的
接下来,我们试图通过将多个 mRNA 电化到感兴趣的区域来进一步测试 mRNA 电穿孔的效率。多个DNA的共电穿孔先前已被证明是相对低效的,显示多标记的数量为25%,14%,和10%的2,3和4DNA结构电穿孔,计算在细胞总数11的比例.我们首先将两个mRNA电镀,将光谱上截然不同的FPs(Turquoise2-Golgi/H2B-黄水晶)编码到HH5胚胎中,并在所有电镀区域获得高转染效率。我们使用这种双电穿孔来捕捉HH4胃化胚胎中区域排卵和欧帕卡之间的径向扩张电影,在电穿孔后2小时成像(补充电影S2a,b和c)。H2B-黄水晶在细胞核内局部化,允许细胞增殖被追踪到27。Turquoise2-Golgi FP似乎显示胚胎细胞内的亚细胞极性,但似乎与体内转移细胞的速度或方向无关。这部电影 (补充电影 S2) 显示,与多个 mRNA 电镀的细胞可以继续正常细胞活动,没有任何明显的缺陷.
此外,4 mRNA 的共电穿孔 - Turquoise2-Golgi(可视化 Golgi 仪器)、LifeAct-eGFP(可视化 F-actin)、H2B-Citrine(可视化核)和膜-樱桃 FP(可视化膜) - 导致 87% 转染所有电镀区域所有4mRNA的效率(图4)。LifeAct-EGFP和H2B-黄水晶由商业软件中的线性解混处理工具分离。
FRAP测定显示电穿孔mRNA在电穿孔后的头两个小时中迅速降解。
众所周知,裸的mRNA被细胞RNAases29迅速降解。我们假设mRNA电穿孔可能有助于在发育中的胚胎中快速有效地表达蛋白质,从而对丧失或获得功能的实验有用。因此,在mRNA电穿孔后定量mRNA衰变率会很有帮助,因为mRNA在细胞中的降解速度比DNA快。在以往关于成年小鼠神经干细胞中mRNA电穿孔的报告中,qRT-PCR在电穿孔后2小时中发现了约80%mRNA,但电穿孔后24小时未检测到mRNA。我们试图通过设计体内FRAP测定来检测电穿孔细胞中的mRNA水平,从而进一步量化电穿孔后的mRNA表达。
光漂白是当荧光团(我们的例子中的荧光蛋白)处于兴奋状态时可能发生的对荧光的不可逆的破坏,在观察30,31期间消除荧光。因此,在光漂白细胞中检测到荧光蛋白(FPs)发出的任何光光,在基线水平以上,应代表由完整、转染的mRNA编码的新翻译的FP。因此,我们寻求对电镀电池进行光漂白,以消除各种时间点的所有现有的FP衍生荧光,并跟踪随后的荧光回收。
使用协议部分中描述的优化光漂白设置,我们发现光漂白最初在光漂白事件后立即测定后,所有光漂白细胞的荧光强度降低±95%。这在45分钟、2小时和5小时电穿孔后完成(图5A-C)。光漂白区域内每个细胞的荧光回收在每个时间点光漂白后的30分钟内被跟踪,通过定期时间间隔(3或5分钟)对同一区域进行成像。我们的数据表明,在电穿孔后45分钟至5小时之间转染的mRNA水平显著下降。这表现在5小时测量的FRAP与电穿孔后45分钟的较大下降。为了突出漂白细胞的荧光恢复,特别是在5小时时间点,我们使用ImageJ中的亮度/对比度工具增强了图5A-C的亮度,并在图5D-F中显示这些经过修改的图像。有趣的是,在光漂白区域内2小时内,光漂白区域内细胞对细胞的荧光恢复存在很大的异质性,因为有些细胞的荧光恢复速度比其他细胞快(图5E',见箭头)。然而,5小时光漂白区域内的所有细胞在2小时时恢复荧光的速度比光漂白细胞慢(图5F')。我们还检测出光漂白区域内的细胞被积极分裂,这表明细胞没有因光漂白过程而死亡(图5E')。
在图 6A中,我们通过显示光漂白事件后 30 分钟内光漂白区域内每个细胞的标准化信号强度来量化这些结果。对于每个细胞,荧光值在光漂白后立即根据该细胞的信号强度进行归化。此规范化针对所有图像化时间点(45 分钟、2 小时、5 小时)的所有单元格执行。光漂白事件后,将同一光漂白区域内细胞荧光回收的标准化值汇集在一起,并随时间绘制;因此,图形中的每个点表示 +35 个单元格。非规范化数据也如图6B所示,其中每条线表示光漂白后立即恢复荧光信号强度的细胞。这些数据总体表明,到5小时,所有细胞都耗尽了大部分mRNA,其中很大一部分发生在电穿孔后45分钟至2小时之间。
图1:克隆过程的原理图,使pCS2_LifeAct-eGFP构造。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:mRNA电穿孔比DNA电穿孔更有效。(A-A')表达pCS2.H2B-黄水晶的脱氧核糖核酸被电化到HH5胚胎的外孔。电穿孔后12小时观察到荧光。比例棒 = 50 μm . (B-B'') mRNA 表达 H2B-黄水晶被电镀到 HH5 胚胎的外孔中。电穿孔后12小时观察到荧光。刻度棒 = 50 μm. (C-C')) DNA (pCMV.H2B-mKate2) 和 mRNA (H2B-黄水晶) 的等价组合被电镀到 HH5 胚胎中,并观察到电穿孔后 12 小时。每个条件测试三个胚胎(n = 2实验)。在ImageJ上使用粒子分析工具对A、B和C(9个胚胎)的三个胚胎(共9个胚胎)的缩放条 = 50 μm (D) 进行量化,以达到电穿孔效率。每个胚胎的200μm区域被量化(每个区域至少计算150个细胞)。中间破折号表示平均值,而顶部和底部条表示与平均值的标准偏差。(E) 分析三个共电(DNA和mRNA)胚胎,在给定的200μm区域内在所有电镀细胞中传播信号。每个胚胎有大约100个细胞对mRNA电穿孔呈阳性反应,30个细胞对DNA电穿孔呈阳性。中间破折号表示平均值,而顶部和底部条表示与平均值的标准偏差。mRNA与DNA电穿孔的传播没有显著差异,但mRNA电穿孔比DNA电穿孔效率高得多。(A-C)尺寸 = 425.10 x 425.10 x 55 μm. 像素位 2.55 μs. 平均线 4.每像素位 = 16。显微镜元数据 = 倒置共聚焦显微镜,20x 物镜(参见材料表) (A) Ex: 488 nm (0.05%),排放轨道 S1 = 508-579 nm;(B) Ex = 488 nm (5.0%),排放轨道 S1 = 508-579 nm;(C) Ex = 488 nm (5.0%),561 nm (5.0%),排放轨道 S1 = 508-579 nm;S2 = 606-695 nm请点击这里查看此图的较大版本。
图3:mRNA电穿孔显示电穿孔后22分钟的表达,比DNA电穿孔快得多。mRNA (H2B-Citrine) 和 DNA (pCMV.H2B-mKate2) 电穿孔后的时间过程的代表性图像,在 22 分钟 (A-A')、 45 分钟(B-B'')、1.5 小时(C-C')和 6 h(E-E''时进行图谱分析)成像的开始(n = 1)。为合并图像中绘制的箭头上显示的每个时间点提供图剖面分析。图谱中的每个峰值表示电镀电池的细胞核。细胞通常在电影的6小时间隔内变亮,这表明mRNA仍在转化为新的荧光蛋白。在 6 小时时间点,使用相同的成像条件(E-E'') 和较弱的成像条件(F-F')捕获的相同区域的图像显示,因为 DNA 电化细胞的图像使用初始成像条件。比例尺 = 20 μm. 尺寸:425.10 x 425.10 x 55 μm.图像显示为所有图像中所有时间点的最大强度投影。像素位 2.55 μs. 平均线 4.每像素位 = 16。显微镜元数据 = 倒置共聚焦显微镜,20x 物镜(参见材料表) Ex = 488 nm (15%),594 nm (5.0%)初始;Ex = 488 纳米 (7.5%), 594 纳米 (0.5%)最后一个时间点(图2F),排放轨道S1 = 499-562 nm;S2 = 605-661 nm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:针对不同亚细胞结构的4个mRNA共电孔效率高。HH3胚胎的外孔用mRNA电镀,mRNA编码mTurquoise2-Golgi、LifeAct-eGFP、H2B-黄水晶和膜-樱桃。胚胎在电穿孔后4小时被固定并成像。大多数电池在电极靶区内电镀,所有四个mRNA(87%)。显示的代表性数字(每个3个胚胎,n = 2个实验)。刻度条 = 50 μm. (A) 合并所有四个 mRNA(mTurquoise2-Golgi、LifeAct-eGFP、H2B-黄水晶和膜-樱桃)。(B) 仅 H2B-黄水晶通道(Ex = 488 nm (0.7%),Em = 455-499 nm)。(C) 只有 mTurquoise2-Golgi 通道 (Ex = 458 nm (22.0%),Em = 455-499 nm)。(D) 合并 H2B-黄水晶和 mTurquoise2-Golgi 表明 Golgi 在大多数细胞中包络了细胞核的一侧。(E) 仅 LifeAct-eGFP 通道(Ex = 488 nm (0.7%),Em: 455-499 nm)。(F) 仅膜-樱桃通道(Ex = 594 nm (37.1%),Em = S2:570-695 nm)。(G) 合并生命Act-eGFP和膜-樱桃显示大多数细胞重叠。尺寸 = 425.10 x 425.10。像素位 1.58 μs. 平均线 4.每像素位 = 16。显微镜元数据 = 倒置共聚焦显微镜,20x 物镜(参见材料表) Ex = 405 nm (2.4%),458 nm (22.0%),488 nm (0.7%),594 nm (37.1%),排放轨道 S1 = 455-499 nm;S2 = 570-695 nm。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:光漂白测定显示电镀mRNA在电穿孔后前五小时内迅速降解。电穿孔后45分钟、2小时和5小时进行含有电镀细胞的100μm2区域的光漂白,其中含有mRNA表达H2B-黄素。在光漂白(3或5分钟)后,胚胎以固定的时间间隔成像。光漂白条件如下:70% 405 nm 激光,100 次迭代,整个区域约 5 分钟持续时间。刻度条 50 = μm. (A-A'') 45 分钟漂白前和漂白后。B 显示光漂白后立即胚胎,C 显示胚胎漂白后 30 分钟。刻度条 = 50 μm. (B-B'') 2 h 预漂白和后漂白。由于光漂白区域内的细胞在漂白期间略有移动,因此正方形的周长会移动。(C-C'') 5 小时漂白前和漂白后。(D-D'')与 A-A'' 相同的图像具有增强的亮度(最大值调整为 11550 以增强收集后的亮度)。(E-E'')与 B-B'' 相同的图像具有增强的亮度(最大值调整为 11550 以增强收集后的亮度)。白色箭头指向荧光恢复率高于周围细胞的细胞。青色箭头指向最近经历的线粒体化的光漂白细胞。(F-F'')与 C-C'' 相同的图像具有增强的亮度(最大值调整为 11550 以增强收集后的亮度)。尺寸 = 425.10 x 425.10 x 42 μm.图像显示为所有图像中所有时间点的最大强度投影。像素位 1.58 μs. 平均线 4.每像素位 = 16。显微镜元数据 = 倒置共聚焦显微镜,20x 物镜(参见材料表) Ex = 488nm (1.5%),排放轨道 S1 = 508-553 nm请点击此处查看此图的较大版本。
图6:光漂白细胞荧光回收的定量。(A) 在漂白后的每个时段,对漂白区内所有细胞(+35个细胞)的荧光强度进行跟踪。恢复信号强度从 45 分钟到 2 小时,随后从 2 小时到 5 小时下降。显示每个点的顶部误差条,表示与平均值的标准偏差。显示的线是线性回归线。45 分钟、2 小时和 5 小时的 R2 分别为 0.83、0.58 和 0.84。显示每个点的误差栏的上半部分。(B) 漂白后每个时段对每个单个细胞(+35个细胞)内所有细胞的荧光强度进行跟踪,并在未正常化的情况下绘制图形。恢复信号强度的速率从45分钟下降到2小时,随后从2小时到5小时下降,请点击这里查看这个数字的较大版本。
补充电影1:mRNA电穿孔导致比DNA电穿孔更早的蛋白质表达。H2B-黄水晶mRNA和H2B-mKate2DNA电镀到HH5胚胎的外孔。区域图像位于胚胎外和胚胎组织的边界处。比例尺 = 50 μm. (a) 同时显示 H2B-黄水晶和 H2B-mKate2 通道(Ex = 488 nm (15%),594 nm (5.0%),Em: 499-562 nm;S2: 605-661 nm)。(b) 仅显示 mRNA H2B-黄水晶通道 (Ex = 488 nm (15%),Em = 499-562 nm。(c) 仅显示 H2B-mKate2 DNA 通道(Ex = 594 nm (5.0%),Em = 605-661 nm)。尺寸 = 850.19 x 850.19 x 110 μm.图像显示为所有图像中所有时间点的最大强度投影。像素位 2.55 μs. 平均线 4.每像素位 = 16。显微镜元数据:倒置共聚焦显微镜,20x物镜(见材料表)Ex = 488 nm (15%),594 nm (5.0%),排放轨道 S1 = 499-562 nm;S2 = 605-661 nm。请点击此处下载此文件。
补充电影2:mRNA的共电穿孔允许动态研究不同的细胞行为。胚胎边界和胚胎外边界之间的细胞径向扩张用mRNA(H2B-黄水晶和mTurquoise2-Golgi)电镀,并在向外迁移期间成像。这部影片通过电传后2至5小时共聚焦显微镜成像,每6分钟成像一次。 (a) 显示的 H2B-黄水晶和 mTurquoise2-Golgi 通道(Ex = 458 nm (28%)、488 nm(5.0%),Em = 446-526 nm;S2: 508-553 nm)。(b) 仅显示 H2B-黄水晶通道(Ex = 488 nm (5.0%),Em = S2:508-553 nm)。(c) 仅显示 mTurquoise2-Golgi 通道(Ex = 458 nm (28%),Em = 446-526 nm)。尺寸 = 425.10 x 425.10 x 32.5 μm.图像显示为所有图像中所有时间点的最大强度投影。像素位 0.79 μs. 平均线 4.每像素位 = 16。显微镜元数据 = 倒置共聚焦显微镜,20x 物镜(参见材料表) Ex = 458 nm (28%),488 nm (5.0%),排放轨道 S1 = 446-526 nm;S2 = 508-553 nm。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在此协议中,我们提供了关于如何精确微注射和电镀mRNA到胃化鹅胚胎细胞的逐步说明。我们证明,体外合成的mRNA电穿孔允许快速有效地表达荧光蛋白(FPs)在胃化鹅胚胎(图2和3)。 从电镀mRNA翻译的H2B-黄水晶蛋白的荧光可以在+20分钟内通过共聚焦显微镜检测,并在FP荧光中增加数小时(图3,补充电影1)。这是令人惊讶的快速和接近假定的黄水晶成熟时间32,33。从DNA载体表达的FPs在2-3小时后被检测到(图3,补充。电影1),这是类似于以前的报告8,34,35。各种FP具有独特的成熟时间,因此先进的规划将确保根据实验所需的光谱区分和成熟动力学选择理想的FP。此外,合成的mRNA比DNA载体11更有效地共同转染胚胎细胞。转染效率越高,在感兴趣的区域转染的细胞越多(图2)或多群mRNA(图4)。
mRNA的稳定性受到高度调节,可以受多面化、拼接、翻译、二级结构和未翻译区域的影响,仅举几例36,37。细胞内源性和合成的mRNA的半寿命从分钟到第36天、38天不等。我们在光漂白 (FRAP) 后的体内荧光恢复中用于漂白现有的 mRNA 编码的 H2B-黄水晶蛋白,并在电穿孔后的前 2 小时内观察到最可观察到的 H2B-黄水晶荧光回收(图 5和6).不同的mRNA无疑会根据其长度、内部序列、5'和3'的修改36,37有不同的半寿命,因此,如果需要,每个都必须被测定。
生命成像通常需要在高质量成像的最佳条件和快速、毒性较低的成像39、40之间进行权衡。成像时,建议使用尽可能低的激光功率,以尽量减少对胚胎细胞的光漂白和光损伤(参见协议第5.3步的注释)40。改变快速集合的显微镜设置(例如,更快的扫描速度,更少的平均)通常可以帮助而不会丢失必要的图像分辨率41。最后,在收获、电穿孔和成像过程中,应小心处理和操纵胚胎(参见步骤 4)。早期胚胎是脆弱的,很容易损坏。
总体而言,mRNA电穿孔的精确定时和精确定位允许利用mRNA转录的快速表达、共转染效率和快速衰变的扰动实验。通过合成mRNA的电穿孔,可以实现对感兴趣的基因的过度表达或错误表达。 滴射每个mRNA的浓度至关重要,因为电渗透过多的mRNA可能导致非特异性细胞毒性,而太少的mRNA可能无法标记所需的细胞或诱导人位变化充分。从各种动物模型系统中,已经存在大量用于体外合成的载体,这些载体编码FP融合标记物,用于可视化或改变基因产物,以干扰各种生物过程。许多专为体外mRNA合成设计的结构可以从非营利质粒储存库快速、廉价地获得。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可申报。
Acknowledgments
我们感谢大卫·胡斯对这项工作的有益见解。这项工作部分得到了玫瑰山基金会暑期研究奖学金(2016-2018年)和南加州大学教务长研究生研究奖学金、萨班研究所校内培养博士前博士奖和大学南加州本科生研究伙伴计划奖授予R.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
References
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