Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59664
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

Summary

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Abstract

We melden dat mRNA-elektroporation fluorescerende eiwitten toelaat om cellen in levende kwartel embryo's sneller en in het algemeen te labelen dan DNA-elektroporation. De hoge transfectie-efficiëntie maakt het mogelijk om ten minste 4 verschillende Mrna's te co-transport met ~ 87% efficiëntie. De meeste van de elektroporated Mrna's worden afgebroken tijdens de eerste 2 h post-elektroporation, waardoor tijdgevoelige experimenten kunnen worden uitgevoerd in het zich ontwikkelende embryo. Ten slotte beschrijven we hoe u dynamische beelden van levende embryo's elektroporated met Mrna's die verschillende subcellulaire gerichte fluorescerende eiwitten coderen.

Introduction

Elektroporation is een fysieke transfectie methode die een elektrische puls gebruikt om voorbijgaande poriën in het plasma membraan te creëren, waardoor stoffen zoals nucleïnezuren of chemicaliën in de cytosol kunnen overgaan. Elektroporation wordt veel gebruikt om DNA te leveren in bacteriën, gist, planten en zoogdiercellen1,2,3. Het wordt routinematig gebruikt om genetische ladingen in doelcellen en weefsels in te voeren binnen het ontwikkelende aviaire embryo om de genetische controle van de ontwikkeling of de migratie populaties van cellen4,5,6te bestuderen, 7. Er bestaan echter ook verschillende experimentele beperkingen met DNA-elektroporation8. DNA-elektroporation introduceert bijvoorbeeld vaak zeer variabele aantallen expressie vectoren per cel en vervolgens de Mrna's en eiwitten die ze coderen. Deze variabiliteit kan leiden tot een aanzienlijke celcellige heterogeniteit die zowel beeldanalyse als gegevens interpretatie van9,10compliceert. Bovendien beginnen eiwitten van DNA-elektroporation slechts ~ 3 h post-elektroporation en bereiken ze niet de maximale efficiëntie in het aantal cellen en de intensiteit van de fluorescentie tot 12 uur, waarschijnlijk als gevolg van de tijd die nodig is om over te brengen in de Nucleus en volledige zowel transcriptie als vertaling in vivo11.

MRNA transfectie is daarentegen effectief gebruikt in een verscheidenheid van modelsystemen, waaronder Xenopus laevis oocyten door Microinjection12,13, herprogrammatie menselijke stamcellen door mRNA lipofectamine transfectie14 , en elektroporerende recalcitrante neurale stamcellen bij volwassen muizen15. We testten het vermogen van mRNA electroporatie om cellen efficiënt te labelen tijdens de vroege aviaire embryonale ontwikkeling met behulp van in vitro gesynthetiseerde mrna's die verschillende fluorescerende eiwitten (fps) coderen. Voor onze studies gebruikten we de pCS2 + vector, een multifunctionele expressie vector die vaak wordt gebruikt voor het uitdrukken van eiwitten in Xenopus en zebravis embryo's. De SP6 en T7-RNA-polymerase bevorderaar in de pCS2 + staan de synthese toe van mRNA en eiwitten uit elk gekloond gen bij gebruik in een in vitro transcriptie/vertaalsysteem.

Hier tonen we aan dat mRNA electroporatie een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (fps) in gastrulerende kwartel embryo's mogelijk maakt. We ontwierpen en genereerden veel van de expressie vectoren die in deze studies werden gebruikt. Zo hebben we de LifeAct-eGFP Gene16 in de pCS2 + Vector17 gesubgekloond om uit te drukken van de promotor en de SP6 Promoter van CMV. Het ingebrachte gen ligt stroomafwaarts van de SP6 promoter en stroomopwaarts van de SV40 poly (A) tail18. In embryo's co-elektroporated met mRNA en DNA, FPs gecodeerd uit in vitro getranscribeerd Mrna's werden voor het eerst gedetecteerd binnen 20 min van electroporation, terwijl FPs van DNA-expressie vectoren werden gedetecteerd pas na 3 h. meervoudige mRNAs-codering voor nucleaire, Golgi en membraan proteïnen kunnen gelijktijdig in een embryo worden geëvacueerd, wat resulteert in een snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in individuele cellen. Ten slotte, met behulp van een in vivo fluorescentie herstel na fotobleaching (FRAP) Assay, tonen we aan dat een meerderheid van de electroporated mRNAs verval binnen 2 h. Dus, snelle initiële eiwitproductie in combinatie met een beperkte nieuwe eiwit vertaling maakt mRNA elektroporation een waardevolle techniek wanneer temporele beheersing van de uitdrukking noodzakelijk is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van het Children's Hospital Los Angeles en de comités voor institutionele Dierenzorg en-gebruik van de Universiteit van Zuid-Californië.

1. generatie pCS2-gebaseerde expressie vectoren

  1. Om pCS2. Lifeact-eGFP te klonen, bereidt u de vector ruggengraat voor door 2 μg pCS2. CycB1-GFP (een constructie met een ander wisselplaat) te verteren met BamHI (10 U) en BsrGI (10 U) in een geschikte digestie buffer (zie tabel met materialen) verdund tot 1x in een totale reactie volume van 50 μL voor 1 uur bij 37 °C (Zie Figuur 1 voor de schematische weergave van de kloon procedure).
    1. Defosforylaat de vrije 3 ' OH-uiteinden van de vector ruggengraat van de restrictie-enzym reactie door toevoeging van garnalen alkalische fosfatase (1 U). Inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C.
    2. Voer het hele mengsel uit in een 1% agarose gel/1x tris acetaat EDTA (TAE) buffer bij 90 V voor ~ 50 min en beits de gel vervolgens in een 0,5 μg/mL oplossing van ethidiumbromide bromide in 1x TAE buffer voor 15 min met zachte schommeling. Zorg er ook voor dat u moleculair gewicht markeringen in een vrije rijstrook laadt om de DNA-groottes te bepalen.
    3. Gebruik een DNA veilige UV-Transilluminator om te voorkomen dat de Dna's worden geknipt, knip de vector backbone (verwachte band grootte van 4kb) snel uit de agarose-gel en Isoleer het DNA-fragment van het gelstuk met behulp van een gel-zuiverings pakket met behulp van de instructies van de fabrikant.
  2. Gelijktijdig met stap 1,1 bereidt u de wisselplaat voor door 2 μg pEGFP-N1-Lifeact te verteren met BglII (10 U) en BsrGI (10 U) in een geschikte verterings buffer, verdund tot 1x in een totaal reactievolume van 50 μL voor 1 uur bij 37 °C. Voer het hele mengsel uit in een gel van 1% agarose om de 800 BP-band te isoleren zoals eerder uitgelegd in stap 1.1.2-1.1.3.
  3. Na zowel de vector als de insert worden gezuiverd en gekwantificeerd op de spectrofotometer, combineren 50 ng van de vector en 38 ng van de insert (1:3 molaire verhouding van vector om in te voegen) in T4 DNA ligase buffer voorafgaand aan het toevoegen van T4 DNA ligase om de ligatie reactie te katalyseren. Daarnaast stelt u een besturingselement geen DNA in, alleen een vector besturingselement en een besturingselement alleen invoegen. Inincuberen alle reacties op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    1. Transformeer 1 μL van het ligatie mengsel (en) in de bevoegde E. coli DH10. Ook, transformeren water alleen negatieve controle en 20 PG van pUC19 positieve controle. Verdeel bacteriën op de Luria Bouillon (lb) agar-platen met 50 μg/ml ampicilinein en incubeer 's nachts bij 37 °c.
    2. Tel de volgende ochtend de kolonies op elke plaat.
      Opmerking: Idealiter zijn er geen kolonies op de negatieve controle platen, > 100 kolonies op de vector + insert ligatie platen, en minder kolonies op de vector plaat.
    3. Kies ten minste 8 bacterie kolonies uit de agar-plaat, getransformeerd met het ligatie mengsel vector + insert, en beënt ze met steriele tandenstokers of pipetpunten in 2 mL vloeibare LB bouillon met 50 μg/mL Ampicilineen.
    4. Extraheer DNA uit elk van de klonen met behulp van commerciële plasmide miniprep Kits.
    5. Voer een diagnostische beperkings samenvatting uit met 500 ng van het DNA van elke kloon met NotI (10 U) en BamHI (10 U) in de juiste digestie buffer, verdund tot 1x voor 1 uur bij 37 °C en voer het verteerde DNA uit op een 1% agarose-gel in 1x TAE-buffer. Verwachte band grootten voor pCS2. Lifeact-eGFP positieve klonen zijn 3,9 KB en 978 BP.
    6. Transformeer 1 pg-100 ng van het DNA van de positieve kloon in de competente E. coli DH10 en bereid 3-4 miniprep reacties voor zoals beschreven in voorgaande stappen om een voldoende hoeveelheid DNA te verkrijgen voor in vitro transcriptie reactie (minimaal 10 μg).

2. bereiding van mRNA door in vitro transcriptie

  1. Linearize 10 μg pCS2. LifeAct-eGFP op het 3 ' uiteinde van de wisselplaat met NotI (10 U) in een geschikte digestie buffer verdund tot 1x in een totaal reactievolume van 50 μL bij 37 °C 's nachts.
    Opmerking: Om RNase verontreiniging te voorkomen en mRNA afbraak te verminderen, Draag handschoenen tijdens het hanteren van mRNA monsters.
  2. Reinig het DNA met een mengsel van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, v/v).
    1. Voeg 150 μL RNase-vrij water toe om het totale volume van de digestie reactie gelijk te stellen aan 200 μL. Voeg vervolgens 200 μL fenol: chloroform: isoamyl alcohol en Vortex het mengsel voor 20 s.
    2. Centrifugeer in een microfugebuis bij maximale snelheid (18.400 x g) gedurende 2 min. Verwijder voorzichtig de bovenste waterige fase die het gelineariseerde DNA bevat. Herhaal deze stap om extra onzuiverheden te verwijderen en wees voorzichtig om het witte precipitaat dat tussen de onderste en bovenste vloeistof fasen kan vormen, niet te verstoren.
  3. Precipitaat gelineariseerd DNA door toevoeging van 1/10 volume 3M Natriumacetaat (RNase-vrij) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Laat het mengsel bij-20 °C gedurende > 30 minuten en pellet het DNA door centrifugeren bij maximale snelheid (18.400 x g).
    1. Was de DNA pellet met 70% ethanol, dan lucht-droog de pellet voor > 5 min.
    2. Los de DNA-pellet op in 5 μL RNase-vrij water. Kwantificeer het DNA door spectrofotometer.
      Opmerking: De verwachte DNA-concentratie is ~ 0,5-1 μg/μL met een A260/A280 ratio tussen 1,7-2,0.
  4. Gebruik 1 μg gelineariseerde pCS2. lifeact-EGFP DNA voor in vitro transcriptie (IVT). Volg de instructies van de fabrikant in de commerciële Kit (zie tabel van de materialen) met 10 μL van het GLB analoog (eindconcentratie 0,8 mM) en Ntp's (eindconcentratie 1 mM voor ATP, CTP en TTP; 0,2 mM voor GTP), 2 μL 10x reactiebuffer (eindconcentratie 1x), 2 μL SP6 RNA polymerase en RNase-vrij water tot 20 μL.
    1. Inbroed het IVT-mengsel gedurende ongeveer 2 uur of langer, afhankelijk van de transcriptie grootte.
      Opmerking: 2 uur incubatie werkt goed voor een transcriptie van 3 KB, maar de nachtelijke incubatie werkt beter voor transcripten die groter zijn dan 5 KB.
    2. Om vrije nucleotiden uit de transcriptie reactie te verwijderen, Voeg 30 μL LiCl RNA precipitatie oplossing (7,5 M lithiumchloride, 50 mM EDTA) toe om de mRNA te precipderen. Vortex het mengsel kort en bewaren bij-20 °C gedurende 30 min. Draai de mRNA 15 min in een microfugebuis bij maximale snelheid (18.400 x g) en spoel met 70% ethanol (RNase-vrij).
  5. Los de gesynthetiseerde mRNA op in 15 μL RNase-vrij water. Breng de gesynthetiseerde mRNA op 5 μL/buis (3 tubes in totaal) en plaats bij-80 °C voor langdurige opslag. Quantitaat de mRNA met een spectrofotometer.
    Opmerking: Verwachte opbrengst is 15-20 μg mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) is voldoende voor een experiment met ~ 10 embryo's, ervan uitgaande dat de mRNA wordt verdund van 1 μg/μL tot 500 ng/μL en dat elk embryo wordt geïnjecteerd met ~ 200 nL. Elke buis moet daarom bevatten voldoende mRNA voor ~ 5 experimenten.
  6. Voer ~ 300 ng van mRNA op een 1% agarose gel in 1x TAE buffer na het reinigen van alle gelapparatuur met de RNase decontaminatie oplossing (bijv. RNase) en zorg ervoor dat de mRNA als één band wordt weergegeven (er kunnen meerdere bands aanwezig zijn als er secundaire structuren vormen) en dat er geen uitstrijkje pperen in de gel Lane, die RNA degradatie aangeeft.

3. bereiding van mRNA Electroporation mix

  1. Het ontdooien en verdunnen van mRNA bij de gewenste concentratie (250-500 ng/μL in RNase-vrij water werkt goed voor alle Mrna's die in dit werk zijn getest). Voeg 1/10 volume gekleurde kleurstof toe (zie tabel met materialen, RNAse-vrij, 0,1% eindconcentratie) om de mRNA-injectieplaats te visualiseren en de elektroden correct te plaatsen.
    Opmerking:     als DNA en RNA worden gecombineerd om een co-elektroporation uit te voeren, zorg er dan voor dat DNA vrij is van verontreiniging van de Rnasen door gebruik te maken van fenol-chloroform extractie en ethanol precipitatie voorafgaand aan mRNA en DNA-mengsel.
    1. Zorg ervoor dat u een negatieve controle voor te bereiden met behulp van een mock (geen RNA toegevoegd) electroporatie oplossing. Indien mogelijk, bereid een positieve controle met behulp van vooraf gevalideerde mRNA (mRNA die is aangetoond dat FP met succes in eerdere experimenten te produceren).
      Opmerking: De negatieve controle is essentieel voor alle beeldvormings experimenten om achtergrond fluorescentie niveaus vast te stellen voor het normaliseren van gegevens. De positieve controle is vooral belangrijk bij het werken met nieuw getranscribeerd mRNA door te helpen bevestigen dat de elektroporation instellingen werkten.
  2. Bewaar de mRNA-elektroporation oplossing op een ijsslurry om afbraak te voorkomen tot het klaar is om door te gaan met elektroporation.

4. elektroporate Mrna's in levende kwartel embryo's

  1. Verzamel dagelijks vers gelegde, bevruchte kwarteleitjes en bewaar deze gedurende maximaal 1 week bij 13 °C in een bevoficeerde koelkast. Inbroed de kwarteleitjes op 38 °c tot de gewenste embryonale ontwikkelingsstadia19,20,21.
    Opmerking: HH3 tot HH5 werden in deze studie gebruikt voor zowel statische als dynamische beeldvorming. Voor HH3 embryo's, waardoor de eieren bij kamertemperatuur voor 2 uur voorafgaand aan de oogst het isolatie proces veel gemakkelijker maakt, omdat de embryo's in het algemeen beter bestand zijn tegen fysieke manipulaties wanneer ze worden afgekoeld.
  2. De embryo's isoleren en bereiden volgens het EG-cultuur systeem22. Verzamel ten minste 5 embryo's per aandoening, waaronder ten minste één om te dienen als een negatieve controle (niet elektroporated).
    1. Breek en giet het ei zachtjes in een 10 cm Petri schaaltje. Verwijder de meerderheid van het dikke albumine met een pipet voor overdracht en verwijder het resterende dikke albumine rond het embryo door het oppervlak van de dooier zachtjes af te vegen met een weefsel doekje om ervoor te zorgen dat het embryo strak aan de papier ring blijft kleven.
    2. Leg voorgesneden filtreerpapier (Zie tabel met materialen) op het embryo en gebruik een schaar om de omtrek van het embryo soepel te snijden.
    3. Gebruik een Pasteur-pipet om het embryo te onderdoen met PBS, met behulp van zachte stromen om elke dooier die aan het embryo vasthoudt, te verlaten.
      Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang bij het werken met jongere (< HH3) embryo's omdat deze embryo's de neiging hebben om meer aan de dooier te hechten en zullen vaak los van het vitelline membraan tijdens volgende wasstappen.
    4. Trek de embryo/papier ring langzaam omhoog en uit de dooier in een Petri schaaltje gevuld met PBS voor verdere reiniging. Nadat de meeste dooier is verwijderd, plaatst u de embryo ventrale kant op een 35 mm Petri schaaltje bedekt met een semi-massief mengsel van agar/albumen.
  3. Bereid zes tot 8 10 cm lange glazen micro capillairen (O.D. = 1,2 mm) door gebruik te maken van een glazen micropipet-trekker-instrument.
  4. Plaats de embryo ventrale zijde omhoog in de elektroporation kamer gevuld met PBS. Injecteer met behulp van een glas microcapillair een bolus van 200 nl van de mRNA-of DNA/mRNA-electroporatie mix in de holte tussen het epiblast-en vitelline-membraan dat de gewenste regio beslaat.
    Opmerking: Het hele voorste gebied voor pellucida en sommige gebied voor opaca werd elektroporated in de meeste van de experimenten die in dit manuscript worden getoond.
  5. Plaats de positieve en negatieve elektroden (platina Platte vierkante elektrode, zijlengte van 5 mm) aan de boven-en onderkant van het embryo respectievelijk en elektroporaat met behulp van de volgende pulssequentie: vijf vierkante elektrische pulsen van 5 V, 50 MS duur met 100 MS intervallen met behulp van een in vivo electroporator. Zorg ervoor dat de afstand tussen de elektroden ~ 5 mm is.
    Opmerking: Het optimaliseren van de elektroporation parameters is cruciaal om aandoeningen te vermijden die de fragiele embryonale cellen kunnen doden. Parameters van spanning, pulslengte, pulsintervallen, en het aantal pulsen voor DNA en mRNA moeten worden overwogen voor verschillende elektroporation apparaten.
  6. Incuberen de elektroporated embryo's bij 38 °C tot de gewenste ontwikkelingsfase.
    Opmerking: Een fluorescerende stereoscoop (zie tabel met materialen) helpt om getransffecteerd te worden met niet-getransfuneerde embryo's.
  7. Als de embryo's statisch worden afgebeeld, repareer deze dan in 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of gedurende een nacht bij 4 °C.
    1. Verwijder de embryo's uit de vitelline membraan door soepel te snijden rond de omtrek van het filtreerpapier met een schaar en afbladderen van het glanzende membraan op het rugoppervlak met scherpe Tang zachtjes.
    2. Was de vaste embryo's in PBS/Triton (0,1%) 2x gedurende 5 min en ga verder met in-situ hybridisatie of immunokleuring indien gewenst.
    3. Ten slotte, beits het embryo in 0,5 μg/μL DAPI in PBS/Triton (0,1%) minimaal 30 min bij kamertemperatuur. Was embryo's in PBS/Triton 2x gedurende 5 minuten en wis het embryo in SCALE-U2-oplossing23 's nachts.
  8. Om de efficiëntie van elektroporation te analyseren (Zie Figuur 2), gebruikt u de binaire en particle Analysetool en het DAPI-kanaal op imagej om nucleaire contouren van alle cellen in de afbeelding te verkrijgen.
    1. Als u het binaire hulpprogramma op ImageJ wilt gebruiken, gebruikt u één z-segment in het DAPI-kanaal met een meerderheid van de cellen en klikt u op proces ≫ binaire ≫ binair maken. Als u nabijgelegen cellen wilt scheiden, klikt u op proces ≫ binaire ≫ waterscheiding. U celconto uren verkrijgen door te klikken op analyseren ≫ deeltjes analyseren, grootte ingesteld op 100-500 (μm2).
    2. Zorg ervoor dat een meerderheid van de cellen wordt beschreven in het DAPI-kanaal en sla de celconto uren op door te klikken op meer ≫ opslaan in het pop-upvenster ROI Manager.
    3. Gebruik deze contouren voor het verkrijgen van fluorescentie intensiteitswaarden voor het mRNA en DNA-kanaal door het eerder opgeslagen bestand te openen op een enkele z-slice in het mRNA-of DNA-kanaal en klik vervolgens op meten op de ROI Manager.
    4. Filter tot slot deze intensiteitswaarden, Tel cellen met < 6000 fluorescentie intensiteit als niet-getransffecteerd en cellen met > 6000 fluorescentie intensiteit als getransffecteerd.

5. beeld FPs gecodeerd door Electroporated mRNAs

  1. Kies het gezondste en beste elektroporated embryo voor de dynamische beeldvormings experimenten na het bekijken van alle elektroporated embryo's onder de fluorescerende ontleden stereoscoop.
    1. De andere elektroporated embryo's en het niet-electroporated embryo (de negatieve controle) blijven incueren in een afzonderlijke incubator, terwijl het gekozen embryo wordt gebeeld wanneer dit embryo sterft tijdens het experiment.
  2. Voor de dynamische beeldvorming, gebruikt u de hele-Mount ex OVO aviaire embryo cultuur zoals eerder beschreven24,25,26 met een omgekeerde confocale Microscoop.
    Opmerking:     de Microscoop is uitgerust met een opstage incubator (Zie tabel met materialen) die tijdens beeldvorming de temperatuur bij 36 °c handhaaft. Tijdens de opstelling van de Microscoop werd geconstateerd dat embryo's die op 36 °C werden geïnineerd, langer overleefde dan bij hogere temperaturen, mogelijk omdat de laser lokale verwarming op het embryo kan veroorzaken. De lezers moeten de optimale incubatietemperatuur op het podium bepalen voor hun eigen Microscoop opstelling.
    1. Om de embryogenese dynamisch te kunnen afbeelten en visualiseren, reinig het elektroporated embryo kort met PBS om eventuele bubbels die zich tijdens het elektroporatie proces aan de rugzijde van het embryo kunnen vormen, te verwijderen door het embryo te verplaatsen met behulp van een tang in een PBS clean Oplossing.
    2. Plaats het schone embryo rechtstreeks op een beeldvormings schaal die een dun laagje albumen-agar (~ 150 μL) bevat, zodat er geen luchtbellen op het rugoppervlak van het embryo22ontstaan.
    3. Om de overleving voor langdurige beeldvorming te garanderen, voegt u een klein vochtig opgerold stukje tissuepapier aan de binnenranden van de beeldvormings schaal toe en verzegelen u het gerecht met behulp van paraffinefolie om de verdamping tijdens de beeldvorming en incubatie te minimaliseren.
    4. Verplaats dit gerecht snel naar de voorverwarmde fase van een confocale Microscoop en lokaliseer de gekleurde kleurstof in het embryo met behulp van het brightfield-kanaal (PMT laser 20%), dat de geïnjecteerde en elektroporated regio identificeert.
  3. Stel imaging software in op de gewenste doelstelling (10 of 20x), dichroïde spiegel (488 nm voor GFP nm, 561 voor RFP), emissiespectra (499-562 nm voor GFP, 570-695 nm voor RFP) en zet een geschikte laser aan (488 nm voor GFP, 561 nm voor RFP).
    Opmerking:     elektroporated mRNA werd vertaald in eiwitten die binnen 20 minuten werden gezien (Zie Figuur 3). De metagegevens voor Imaging die voor de meeste afbeeldingen in dit document werden gebruikt, waren: een omgekeerde confocale Microscoop met een doelstelling van 20 x (Zie tabel met materialen); pixel dwelltijd, ~ 1,5 μs; gemiddelde van 4-lijn scans.
    1. Klik op live op de beeldvormings software en stel de laser stroom in op een instelling die geschikt is voor de intensiteit van de fluorescentie, afhankelijk van de laser stroom van elke Microscoop. Begin met het beeldvorming van het embryo met 1% laser vermogen, 800 Gain, en verhoog het Laser vermogen langzaam met 1% stappen totdat verzadigde pixels worden gezien.
    2. Volg dit door het Laser vermogen iets te verlagen tot er geen verzadigde pixels meer worden gezien.
      Opmerking: De laser stroom die is gekozen voor het begin van een beeldvormings sessie van een embryo kan goed zijn voor eerdere tijdpunten, maar niet ideaal op latere tijdstippen als de fluorescentie van de cellen in de loop van de tijd veel helderder of dimmer wordt. Om dit aan te pakken, beeltenis het embryo in eerste instantie met iets lagere Vermogensinstellingen, omdat de elektroporated cellen over het algemeen helderder worden tijdens de eerste 6 uur na de elektrotechniek (Zie Figuur 3a-E voor kwantificering van signaal verhoging). Als de latere afbeeldingen verzadigd zijn, gaat u door met het beeld met de oorspronkelijke beeldvormings instellingen, maar neemt u onmiddellijk een extra afbeelding met zwakkere beeldvormings instellingen (kleiner pingat of zwakker Laser vermogen).
    3. Beeld het embryo elke 3-5 min in om individuele Celmigratie over verschillende tijdspunten te volgen. Voor dit werk waren de beelden z-Stacks (~ 50 μm dik) van het gehele elektroporated gebied, plus enkele extra ruimte naar de onderkant van de z-stack in het geval het embryo zakt in het agarose bed tijdens de Imaging sessie.
    4. Kijk hoe snel de cellen bewegen door de eerste paartijd punten van de eerste film te controleren. Als de cellen met een snel tempo bewegen (wat betekent dat ze het gebied van het afbeelding gemaakt gebied binnen een paar meer tijdpunten zullen verlaten), u overwegen de zoom van het beeldgebied uit te breiden (1x à 0.8 x) of een andere regio te maken.
      Opmerking: Embryonale gebieden in het gebied pellucida verplaatsen veel sneller dan die in het gebied opaca. Daarnaast bevatten jongere embryo's (HH3, HH5) vaak cellen die een snellere beweging ondergaan in vergelijking met oudere embryo's (> HH7).
    5. Na beeldvorming van het elektroporated gebied van het embryo, beeld een un-elektroporated gebied van hetzelfde embryo om te bepalen van de autofluorescentie niveaus (moet minimaal zijn als lage Laser vermogen < 10% wordt gebruikt voor het beeld van het embryo).

6. fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) om mRNA-integriteit te testen

Opmerking: Een in vivo fluorescentie herstel na fotobleaching (FRAP) assay kan worden gebruikt om te bepalen hoe lang getransfunteerd mRNA kan worden vertaald in FPs. Het volgende protocol schetst een FRAP-experiment voor het detecteren van de halfwaardetijd van H2B. Citrien mRNA in een elektroporated embryo.

  1. Voer FRAP-experimenten uit op de omgekeerde confocale Microscoop met behulp van een objectief van 20 x 0,8 NA en een volledig open pinhole.
    1. Na bevestiging van de elektroporation van H2B-Citrien op de stereomicroscoop en het instellen van het embryo op de voorverwarmde fase op de omgekeerde confocale Microscoop (zie stap 5.2.4), fotobleek middel het grootste deel van de cellulaire fluorescentie van H2B-Citrien in een verscheidenheid van tijd punten (45 min, 2 h, en 5 h post-Electroporation) door gebruik te maken van de 405 nm laser met 70% Laser vermogen, 100 iteraties, scansnelheid 4, die laat slechts 5% van de fluorescentie overgebleven.
      Opmerking: Dit proces moet een paar minuten duren.
    2. De embryo's op het podium blijven inbrokken bij 36 °C na fotobleaching.
  2. Zorg ervoor dat u aandacht besteedt aan het actief verdelen van cellen in het fotogebleekte gebied, wat aangeeft dat de fotogebleekte cellen na de behandeling niet volledig zijn gestorven.
  3. Verkrijg een post-Bleach-afbeelding (z-stapels van het elektroporated-gebied) tot 30 minuten met regelmatige tijdsintervallen (3 of 5 min) met behulp van de confocale Microscoop.
    Opmerking: Indien beschikbaar, gebruik een transgene H2B-XFP-lijn als een positieve controle voor het overleven van de cel in de fotogebleekte regio. De snelheid van fluorescentie herstel voor de FP gecodeerd door de electroporated mRNA moet afnemen, maar dat voor de FP gecodeerd via transgen moet consistent blijven gedurende de hele film.
  4. Om ervoor te zorgen dat de beeldvormings omstandigheden niet schadelijk zijn voor de overleving van embryo's, moeten tegelijkertijd elektroporated, die niet fotogebleekt zijn, gelijktijdig worden geïnfiltreerd, wat kan dienen als controle voorbeeld vorming.
  5. Om de fotobleaching resultaten voor mRNA Decay na elektroporation te kwantificeren, houdt u de celfluorescentie na verloop van tijd (3 of 5 min) bij door de intensiteit van de fluorescentie van het midden (een cirkel van 7,5 μm) van elke cel te meten met ImageJ. Meet dit voor alle cellen in de fotogebleekte regio die geen mitose ondergaan en volledig fotogebleekt zijn.
    Opmerking: Overweeg het weglaten van de mitotische cellen van de kwantificering omdat mitotische kernen sterker fluorescentie hebben dan interfase kernen als gevolg van chromatine condensatie.
  6. Plot de intensiteit van de fluorescentie na de tijd na het bleken op verschillende tijdspunten (45 min, 2 uur en 5 uur).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

mRNA-elektroporation is efficiënter dan DNA-elektroporation

We gebruikten pCS2 +. H2B-Citrien ter voorbereiding van de in vitro getranscribeerd mRNA. Aangezien DNA-elektroporatie gewoonlijk wordt uitgevoerd bij 1-2 μg/μL, gebruikten we een equimolaire concentratie van mRNA (berekend als ongeveer 0,25-0,5 μg/μL voor H2B-Citrien) voor mRNA-elektroporation. We testten eerst de elektroporation efficiency van pCS2 +. H2B-Citrien DNA vergeleken met H2B-Citrien mRNA (in vitro getranscribeerd uit de SP6 Promoter van pCS2 +. H2B-Citrien) door het elektroporerend DNA of mRNA afzonderlijk in HH5 kwartel embryo's te onderzoeken en vervolgens de elektro poration efficiëntie na een elektroporation van 12 uur na te gaan. Hoewel DNA-elektroporatie leidt tot helderdere fluorescentie in sommige elektroporated cellen, was de efficiëntie van DNA-elektroporation zichtbaar lager in vergelijking met de alom uitgedrukte mRNA-gecodeerde FPs (Figuur 2a en B).

Om rekening te houden met de inherente variabiliteit van embryo-tot-embryo in het elektroporation protocol, werd een equimolaire combinatie van mRNA-codering H2B-Citrien en DNA dat H2B-mKate2 uitdrukt, in de Ectoderm van HH5 embryo's geëmuleerd en 12 h waargenomen post-elektroporation. Bij het vergelijken van DNA en mRNA co-elektroporation in hetzelfde embryo was het DNA dat FP uitsprak ook significant en consequent minder efficiënt dan dat van mRNA (figuur 2c). Door alle embryo's met alleen mRNA, DNA of een combinatie van beide te kwantificeren, ontdekten we dat mRNA-transfecten ~ 75% van cellen in een bepaald gebied, terwijl DNA alleen transfects ~ 25% van cellen in een bepaalde regio (figuur 2D). De verspreiding in de expressie van fluorescerende eiwitten gecodeerd door mRNA of DNA was niet significant verschillend in alle co-elektroporated embryo's (figuur 2e).

Eiwit expressie is sneller in mRNA elektroporation dan DNA-elektroporation

De gefixeerde mRNA moet leiden tot een snellere eiwitproductie, omdat het onmiddellijk kan worden herkend door cytosolische Vertaal machines zoals te zien in Figuur 3. DNA moet worden overgebracht naar de Nucleus, getranscribeerd, en de mRNA getransporteerd naar de cytosol waar het wordt herkend door cytosolische Vertaal machines, naar verwachting meer tijd in beslag nemen. Om mRNA versus DNA-uitdrukkings percentages van de eiwitproductie direct te vergelijken, hebben we een reeks van tijdsverloop experimenten uitgevoerd waarin we een equimolaire combinatie van DNA (pCMV. H2B-mKate2) en mRNA (H2B-Citrien) in de Ectoderm van HH5 embryo's co-elektroporated. We hebben mRNA-gecodeerde FP-expressie gedetecteerd rond 22 min post-electroporation, die blijft toenemen in relatieve fluorescentie intensiteit voor ~ 6 h (Figuur 3a-E, aanvullend. Film S1b). In tegenstelling, DNA-gecodeerde FP expressie wordt voor het eerst gezien op ~ 1,5 h post-Electroporation (figuur 3A'-E ', aanvullende. Film S1c) en blijft de helderheid verhogen tot 6 uur wanneer de film is gestopt. Omdat de DNA-elektroporated cellen verzadigd waren door de 6 h-markering, hebben we deze aandoening met zwakkere beeldvormings condities (figuur 3F-F ' ') teruggezet. Over alle tijdspunten van deze timelapse (22 min tot 6 h), mRNA transfects meerdere malen meer cellen dan DNA (aanvullende. Film S1a, de totale efficiëntie van elektroporation via brightfield en DAPI worden niet getoond, omdat deze beelden worden ontleend aan een timelapse van een wild type kwartel embryo). Op basis hiervan concluderen we dat mRNA-elektroporation leidt tot eerder uitgedrukt eiwit.

Co-elektroporation van meerdere Mrna's is zeer efficiënt

Vervolgens probeerden we de efficiëntie van mRNA-elektroporation verder te testen door meerdere Mrna's naar een interessegebied te elektroporeren. Co-elektroporation van meerdere Dna's was eerder aangetoond relatief inefficiënt te zijn, met het aantal multi-gelabelde 25%, 14%, en 10% voor 2, 3 en 4 DNA constructies elektroporated, berekend als een percentage van het totale aantal cellen11 . We eerst elektroporated twee Mrna's die spectraal verschillende FPs coderen (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrien) in HH5 embryo's en verkregen hoge transfectie efficiëntie in alle elektroporated regio's. We gebruikten deze dubbel-elektroporation om films van radiale expansie tussen gebied pellucida en opaca in een HH4 gastrulerend embryo, afbeelding gemaakt 2 h post-Electroporation (aanvullende film S2a, b, en c) vast te leggen. De H2B-Citrien is gelokaliseerd binnen de celkern en laat de celproliferatie worden getraceerd27. De Turquoise2-Golgi FP lijkt te tonen subcellulaire polariteit binnen de embryonale cellen, maar lijkt niet te correleren met de snelheid of de richting van bewegende Ectoderm cellen in vivo28. Deze film (aanvullende film S2) toont aan dat cellen die met meerdere mrna's zijn geelektroporeerd, normale cellulaire activiteit kunnen voortzetten zonder zichtbare gebreken.

Bovendien co-elektroporation van 4 mRNAs-Turquoise2-Golgi (om Golgi-apparaat te visualiseren), LifeAct-eGFP (om F-actin te visualiseren), H2B-Citrien (om Nucleus te visualiseren), en membraan-Cherry FP (om membranen te visualiseren) — resulteerde in 87% trans fectie de efficiëntie van alle 4 Mrna's in alle elektroporated regio's (Figuur 4). LifeAct-EGFP en H2B-Citrien werden van elkaar gescheiden door de lineaire unmixing processing tool in de commerciële software.

FRAP assay toont de snelle afbraak van elektroporated mRNA tijdens de eerste twee uur na elektroporation.

Het is bekend dat naakte Mrna's snel worden afgebroken door cellulaire RNAases29. We postleerden dat mRNA-elektroporation nuttig zou kunnen zijn voor verlies of winst-van-functie-experimenten door snelle en efficiënte expressie van eiwitten in een zich ontwikkelende embryo toe te staan. Daarom zou het nuttig zijn om de snelheid van mRNA-verval na mRNA-elektroporation te kwantificering, omdat mRNA sneller degradeert dan DNA in cellen. In eerdere rapporten van mRNA electroporatie in de neurale stamcellen van volwassen muizen, werd ongeveer 80% mRNA geïdentificeerd 2 h post-elektroporation door QRT-PCR, maar weinig tot geen mRNA werd gedetecteerd door 24 h post-electroporatie15. We probeerden de mRNA-expressie na elektroporation verder te kwantificeren door een in vivo FRAP-assay te ontwerpen om mRNA-niveaus in elektroporated cellen te detecteren.

Photobleaching is de onomkeerbare vernietiging van de de die kan optreden wanneer de de (fluorescerende eiwitten in ons geval) in een opgewonden toestand verkeert, wat de fluorescentie elimineert tijdens observatie30,31. Elk uitgezonden licht van fluorescerende eiwitten (FPs) dat kan worden gedetecteerd in fotogebleekte cellen boven de basislijn niveaus moet daarom nieuw vertaalde FPs vertegenwoordigen die is gecodeerd door intact, getransfundeerd Mrna's. Daarom probeerden we de elektroporated cellen te fotobleken om alle bestaande door FP afgeleide fluorescentie op verschillende tijdstippen te elimineren en het daaropvolgende fluorescentie herstel te volgen.

Met behulp van geoptimaliseerde fotobleekinstellingen zoals beschreven in het protocol gedeelte, ontdekten we dat fotobleaching in eerste instantie de intensiteit van de fluorescentie in alle fotogebleekte cellen reduceert met ~ 95% wanneer deze onmiddellijk na het fotobleaching-voorval wordt aangevallen. Dit werd gedaan op 45 min, 2 h, en 5 h post-Electroporation (figuur 5a-C). Het fluorescentie herstel in elke cel binnen het fotogebleekte gebied werd bijgehouden gedurende een periode van 30 minuten na het fotobleken op elk tijdstip door de dezelfde regio op gezette tijden te Imaging (3 of 5 min). Onze gegevens suggereren dat er een significante afname van de mRNA-niveaus tussen 45 min en 5 h post-Electroporation. Dit wordt aangetoond door de grote afname van de FRAP gemeten bij 5 h in vergelijking met 45 min post-Electroporation. Om het fluorescentie herstel in de gebleekte cellen te benadrukken, met name in het tijdspunt van 5 uur, hebben we de helderheid in figuur 5a-C verbeterd met behulp van het gereedschap helderheid/contrast in imagej en deze gewijzigde afbeeldingen weergeven in afbeelding 5d-F. Interessant is dat er een grote heterogeniteit is in fluorescentie herstel van cel-naar-cel binnen het fotogebleekte gebied om 2 uur, omdat sommige cellen sneller fluorescentie herstellen dan andere cellen (figuur 5e ' ', zie pijlpunten). Alle cellen in het fotogebleekte gebied van 5 h herstellen echter de fluorescentie langzamer (figuur 5F ' ') dan de fotogebleekte cellen op 2 uur. We detecteren ook actief verdelen cellen binnen onze fotogebleekte regio, wat suggereert dat cellen niet zijn gestorven als gevolg van het fotobleekproces (figuur 5e ' ').

We kwantificeren deze resultaten in Fig. 6a door de genormaliseerde signaalintensiteit van elke cel in de fotogebleekte gebieden over een periode van 30 minuten na het photobleaching-voorval te tonen. Voor elke cel werden de fluorescentie waarden onmiddellijk na fotobleaching genormaliseerd tegen de signaalintensiteit van die cel. Deze normalisatie werd gedaan voor alle cellen in alle tijdspunten die zijn afgebeeld (45 min, 2 h, 5 h). De genormaliseerde waarden van fluorescentie herstel van de cellen binnen dezelfde foto gebleekt gebied werden vervolgens samengevoegd en gegradeerd na verloop van tijd na photobleaching gebeurtenis; Daarom vertegenwoordigt elk punt in het diagram ~ 35 cellen. De niet-genormaliseerde gegevens worden ook weergegeven in afbeelding 6B, waarin elke lijn een cel vertegenwoordigt met direct na het fotobleken de intensiteit van het fluorescentie signaal te herstellen. Deze gegevens algemene suggereert dat door 5 h, alle cellen hebben uitgeput de meeste van hun mRNA, met een groot deel van deze daling die zich voordoet tussen 45 min en 2 h post-Electroporation.

Figure 1
Figuur 1: schematische voorstelling van de kloon procedure om pCS2 + LifeAct-eGFP construct te maken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: mRNA-elektroporation is efficiënter dan DNA-elektroporation. (a-a ' ') DNA dat pCS2. H2B-Citrien uitdrukt werd in de Ectoderm van HH5 embryo's geëvacueerd. Fluorescentie werd waargenomen 12 h post-elektroporation. Schaalbalk = 50 μm. (b-b ' ') MRNA die H2B-Citrien uitdrukt werd in de Ectoderm van HH5 embryo's geëvacueerd. Fluorescentie werd 12 uur na elektroporation waargenomen. Schaalbalk = 50 μm. (c-c ' ') equimolaire combinatie van DNA (PCMV. H2B-mKate2) en MRNA (H2B-Citrien) werd geëvacueerd in HH5 embryo's en waargenomen 12 h post-elektroporation. Per aandoening werden drie embryo's getest (n = 2 experimenten). Schaalbalk = 50 μm.D) drie embryo's van A, B en C (9 totaal embryo's) werden gekwantificeerd voor de efficiëntie van de elektrotechniek met behulp van het hulpmiddel voor de analyse van de deeltjes op imagej. Een 200 μm-gebied van elk embryo werd gekwantificeerd (ten minste 150 cellen werden per regio geteld). Middelste streepje staat voor gemiddelde, terwijl boven-en onderstaven standaarddeviatie van het gemiddelde vormen. E) er worden drie co-ELEKTROPORATED (DNA en mRNA) embryo's geanalyseerd voor de verspreiding van het signaal over alle elektroporated cellen in een bepaalde 200 μm-regio. Elk embryo had ongeveer 100 cellen positief voor mRNA-elektroporatie en 30 cellen positief voor DNA-elektroporation. Middelste streepje staat voor gemiddelde, terwijl boven-en onderstaven standaarddeviatie van het gemiddelde vormen. Er is geen significant verschil tussen de verspreiding van mRNA versus DNA-elektroporation, maar mRNA-elektroporation is veel efficiënter dan die van DNA. (a-C) Afmetingen = 425,10 x 425,10 x 55 μm. pixel Dwell 2,55 μs. gemiddelde lijn 4. Bits per pixel = 16. Microscoop metagegevens = omgekeerde confocale Microscoop, 20x doelstelling (Zie tabel van de materialen) (A) Ex: 488 nm (0,05%), emissie spoor S1 = 508-579 nm; B) ex = 488 nm (5,0%), emissie spoor S1 = 508-579 nm; C) ex = 488 nm (5,0%), 561 nm (5,0%), emissie spoor S1 = 508-579 nm; S2 = 606-695 nm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: mRNA electroporatie vertoont een expressie van 22 min post-electroporatie en is veel sneller dan DNA-elektroporation. Representatieve beelden van tijdsverloop na mRNA (H2B-Citrien) en DNA (pCMV. H2B-mKate2) elektroporation met plot profile analyse op 22 min (a-a ' '), 45 min (b-b ' '), 1,5 h (c-c ' '), 3 h (d-d ' '), en 6 h (e-e ' ') op de start van Imaging (n = 1). De analyse van het plot profiel wordt opgegeven voor elk tijdpunt dat wordt weergegeven over de getekende pijl in de samengevoegde afbeelding. Elke piek in het plot profiel vertegenwoordigt de kern van een elektroporated cel. De cellen worden over het algemeen helderder over het 6 h-interval van de film, wat aangeeft dat mRNA nog steeds wordt vertaald in nieuw fluorescerende eiwitten. Voor het tijdspunt van 6 uur worden afbeeldingen van dezelfde regio die zijn vastgelegd met identieke beeldvormings condities (E-e '') en zwakkere beeldvormings condities (f-F ' ') getoond, omdat de beelden van de DNA-elektroporated cellen zeer verzadigd waren met behulp van de initiële Imaging voorwaarden. Schaalbalk = 20 μm. afmetingen: 425,10 x 425,10 x 55 μm. de afbeelding wordt weergegeven als een projectie met maximale intensiteit voor alle tijdpunten die worden afgebeeld. Pixel Dwell 2,55 μs. gemiddelde lijn 4. Bits per pixel = 16. Microscoop metadata = omgekeerde confocale Microscoop, 20x doelstelling (Zie tabel van de materialen) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%) voor initiële; Ex = 488 nm (7,5%), 594 nm (0,5%) voor het laatste tijdspunt (figuur 2F), emissie spoor S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Co-elektroporation van vier Mrna's gericht op verschillende sub-cellulaire structuren is zeer efficiënt. De Ectoderm van een HH3 embryo werd elektroporated met Mrna's die mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrien en membraan-kers coderen. Het embryo werd vast en op 4 uur na elektroporation gefotografeerd. De meeste cellen zijn elektroporated binnen de elektrode gerichte regio met alle vier Mrna's (87%). Representatieve cijfers (3 embryo's per stuk, n = 2 experimenten). Schaalbalk = 50 μm. (a) alle vier mrna's samenvoegen (MTurquoise2-Golgi, lifeact-EGFP, H2B-Citrine en membraan-kers). B) alleen H2B-Citrien-kanaal (Ex = 488 nm (0,7%), Em = 455-499 nm). C) alleen MTurquoise2-Golgi-kanaal (Ex = 458 nm (22,0%), Em = 455-499 nm). D) samenvoegen H2B-Citrien en MTurquoise2-Golgi toont aan dat Golgi een zijde van de Nucleus in de meeste cellen omhult. E) alleen lifeact-EGFP-kanaal (Ex = 488 nm (0,7%), Em: 455-499 nm). F) alleen membraan-kersen kanaal (Ex = 594 nm (37,1%), em = S2:570-695 nm). (G) samenvoegen lifeact-EGFP en membraan-Cherry shows overlappen in de meeste cellen. Afmetingen = 425,10 x 425,10. Pixel Dwell 1,58 μs. gemiddelde lijn 4. Bits per pixel = 16. Microscoop metagegevens = omgekeerde confocale Microscoop, 20x doelstelling (Zie tabel van de materialen) Ex = 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 nm (37,1%), emissie spoor S1 = 455-499 nm; S2 = 570-695 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Fotobleaching test toont een snelle afbraak van elektroporated mRNA tijdens de eerste vijf uur na elektroporation. Foto bleken van een gebied van 100 μm ² met cellen die zijn geelektroporeerd met mRNA die H2B-Citrien uitdrukken, wordt uitgevoerd bij 45 min, 2 h en 5 h post-elektroporation. Het embryo werd met regelmatige tijdsintervallen na de foto bleken (3 of 5 min) afgebeeld. Foto bleken voorwaarden zijn als volgt: 70% 405 nm laser, 100 iteraties, over 5 min duur voor hele regio. Schaalbalk 50 = μm. (a-a ' ') 45 min pre-en post-Bleach. B toont embryo onmiddellijk na foto bleken en C toont embryo 30 min post-Bleach. Schaal staaf = 50 μm. (b-b ' ') 2 h pre-en post-Bleach. De omtrek van het vierkant wordt verschoven omdat de cellen in het fotogebleekte gebied iets tijdens de bleek periode bewogen. (C-c ' ') 5 h pre-en post-Bleach. (d-d ' ') Zelfde beelden als A-A ' ' met verbeterde helderheid (maximale waarde ingesteld op 11550 ter verbetering van de helderheid na de verzameling). (e-e ' ') Zelfde beelden als B-B ' ' met verbeterde helderheid (maximale waarde ingesteld op 11550 ter verbetering van de helderheid na de verzameling). De witte pijlpunten wijzen naar cellen met een hoger fluorescentie herstel dan omringende cellen. De cyaan pijlpunt wijst naar een fotogebleekte cel die onlangs mitose heeft ondergaan. (f-f ' ') Dezelfde beelden als C-C ' ' met verbeterde helderheid (maximale waarde aangepast aan 11550 ter verbetering van de helderheid na de verzameling). Afmetingen = 425,10 x 425,10 x 42 μm. de afbeelding wordt weergegeven als een projectie met maximale intensiteit voor alle tijdpunten die worden afgebeeld. Pixel Dwell 1,58 μs. gemiddelde lijn 4. Bits per pixel = 16. Microscoop metagegevens = omgekeerde confocale Microscoop, 20x doelstelling (Zie tabel van de materialen) ex = 488nm (1,5%), emissie spoor S1 = 508-553 nm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: kwantificering van het fluorescentie herstel in fotogebleekte cellen. A) de intensiteit van de fluorescentie van alle cellen in de gebleekte gebieden (~ 35 cellen) werd gedurende elke periode na het bleken voor elke afzonderlijke cel bijgehouden. Er is een grote daling van de snelheid van de herstelde signaalintensiteit van 45 min tot 2 h, gevolgd door een kleinere daling van 2 uur tot 5 h. De bovenste foutbalk wordt weergegeven voor elk punt, dat de standaarddeviatie van het gemiddelde vertegenwoordigt. De weergegeven regel is een lineaire regressielijn. R ² voor 45 min, 2 h, en 5 h is respectievelijk 0,83, 0,58 en 0,84. De bovenste helft van de foutbalk wordt voor elk punt weergegeven. B) de intensiteit van de fluorescentie van alle cellen in de gebleekte gebieden (~ 35 cellen) werd gedurende elke periode na het bleken en grafieken zonder normalisering gevolgd voor elke afzonderlijke cel. Er is een grote daling van de snelheid van de herstelde signaalintensiteit van 45 min tot 2 h, gevolgd door een kleinere daling van 2 uur tot 5 h. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende film 1: mRNA electroporatie leidt tot een eerdere eiwit expressie dan DNA-elektroporation. H2B-Citrien mRNA en H2B-mKate2 DNA elektroporated in Ectoderm van HH5 embryo. Regio afbeelding gemaakt is aan de grens van extra-embryonale en embryonale weefsel. Schaal staaf = 50 μm. a) zowel H2B-CITRIEN als H2B-mKate2 kanaal getoond (Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 nm; S2:605-661 nm). b) alleen MRNA H2B-Citrien-kanaal getoond (Ex = 488 nm (15%), Em = 499-562 nm). (c) alleen H2B-mKate2 DNA-kanaal getoond (Ex = 594 nm (5,0%), Em = 605-661 nm). Afmetingen = 850,19 x 850,19 x 110 μm. de afbeelding wordt weergegeven als een projectie met maximale intensiteit voor alle tijdpunten die worden afgebeeld. Pixel Dwell 2,55 μs. gemiddelde lijn 4. Bits per pixel = 16. Microscoop metagegevens: omgekeerde confocale Microscoop, 20x-doelstelling (Zie tabel met materialen) Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), emissie spoor S1 = 499-562 nm; S2 = 605-661 nm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 2: Co-elektroporation van Mrna's maakt het mogelijk verschillende celgedragingen dynamisch te worden bestudeerd. Radiale expansie van cellen tussen de embryonale en extra-embryonale grens wordt geëvacueerd met mRNA (H2B-Citrien en mTurquoise2-Golgi) en gefotografeerd tijdens de passieve migratie. Deze film werd gefotografeerd door confocale microscopie van 2 tot 5 h post-elektroporation door beeldvorming elke 6 min. schaal Bar = 50 μm.  a) de getoonde H2B-Citrien en MTurquoise2-Golgi-kanalen (Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Em = 446-526 nm; S2:508-553 nm). b) alleen H2B-Citrine kanaal getoond (Ex = 488 nm (5,0%), em = S2:508-553 nm). (c) alleen MTurquoise2-Golgi-kanaal getoond (Ex = 458 nm (28%), Em = 446-526 nm). Afmetingen = 425,10 x 425,10 x 32,5 μm. de afbeelding wordt weergegeven als een projectie met maximale intensiteit voor alle tijdpunten die worden afgebeeld. Pixel Dwell 0,79 μs. gemiddelde lijn 4. Bits per pixel = 16. Microscoop metagegevens = omgekeerde confocale Microscoop, 20x doelstelling (Zie tabel van de materialen) Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), emissie spoor S1 = 446-526 nm; S2 = 508-553 nm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol hebben we stap voor stap instructies gegeven voor het nauwkeurig microinjecteren en elektroporeren van mRNA in de cellen van gastrulerende kwartel embryo's. We hebben aangetoond dat in vitro gesynthetiseerde mRNA-elektroporation een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (FPs) in gastrulerende kwartel embryo's (Figuur 2 en 3) mogelijk maakt. Fluorescentie van H2B-Citrien eiwit vertaald uit elektroporated Mrna's kan worden gedetecteerd door confocale microscopie binnen ~ 20 min en verhoogd in FP fluorescentie voor uren (Figuur 3, aanvullende film 1). Dit is verrassend snel en dicht bij de vermoedelijke rijpingstijd voor Citrien32,33. FPs uitgedrukt uit DNA vectoren werden gedetecteerd na 2-3 h (afbeelding 3, aanvullende. Film 1), vergelijkbaar met eerdere rapporten8,34,35. Verschillende FPs hebben unieke rijpingstijden, dus geavanceerde planning zal ervoor zorgen dat de ideale FP wordt gekozen in termen van de spectrale onderscheid en rijpings kinetiek gewenst voor het experiment. Bovendien, de gesynthetiseerde Mrna's efficiënter co-transfect embryonale cellen dan DNA vectoren11. De hogere transfectie-efficiëntie resulteert in meer cellen die in het gebied van belang worden getransffecteerd met single (Figuur 2) of meerdere populaties Mrna's (Figuur 4).

Stabiliteit van mRNA is sterk gereguleerd en kan worden beïnvloed door polyadenylering, splicing, vertaling, secundaire structuur, en onvertaalde gebieden te noemen een paar36,37. De halfwaardetijd van zowel endogene en gesynthetiseerde mRNA binnen cellen kan variëren van minuten tot dagen36,38. We gebruikten in vivo fluorescentie herstel na foto bleken (FRAP) aan het bleken bestaande mRNA-gecodeerd H2B-Citrien eiwitten en waargenomen de meest merkbaar H2B-Citrien fluorescentie herstel tijdens de eerste 2 uur na elektroporation (Figuur 5 en 6). verschillende mrna's zal ongetwijfeld verschillende halfwaardetijd hebben op basis van hun lengte, interne sequenties, 5 ' en 3 ' modificaties36,37, dus elk moet worden getest indien gewenst.

Vitale beeldvorming vereist doorgaans een trade-off tussen optimale omstandigheden voorbeeld vorming van hoge kwaliteit en snelle, minder toxische beeldvorming39,40. Bij beeldvorming is het raadzaam om zo weinig mogelijk Laser vermogen te gebruiken om fotobleaching en foto schade aan de embryonale cellen te minimaliseren (Zie de opmerkingen voor stap 5,3 van het Protocol)40. Het wijzigen van de Microscoop-instelling voor snelle verzamelingen (bijvoorbeeld hogere scansnelheden, minder gemiddelde) kan vaak helpen zonder verlies van de benodigde beeldresolutie41. Tot slot moet worden gezorgd voor de behandeling en manipulatie van de embryo's tijdens het oogsten, de elektroporatie en de beeldvorming (zie stap 4). De vroege-fase embryo's zijn delicaat en kunnen gemakkelijk beschadigd raken.

Over het algemeen, de precieze timing en nauwkeurige lokalisatie van mRNA electroporatie toestaan perturbatie experimenten die profiteren van de snelle expressie, co-transfection efficiëntie, en snelle verval van mRNA transcripten. Overmatige expressie of misexpressie van een gen van belang kan worden bereikt door middel van elektroporation van gesynthetiseerde mrna's. Tittering van de concentratie voor elke mRNA is van cruciaal belang, als electroporating te veel mRNA kan leiden tot niet-specifieke cellulaire toxiciteit, terwijl te weinig mRNA mag niet het etiket van de gewenste cellen of fenotypische veranderingen induceren adequaat. Een overvloed aan vectoren gegenereerd voor in vitro synthese van Mrna's die FP Fusions markers coderen voor visualisatie of veranderde genproducten voor verstoringen van diverse biologische processen bestaan al uit verschillende diermodel systemen. Veel van deze constructies ontworpen voor in vitro mRNA synthese kan snel en goedkoop worden verkregen uit non-profit plasmide repositories.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Acknowledgments

We danken David Huss voor het nuttige inzicht in dit werk. Dit werk werd deels gesteund door de Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) en de undergrad Research Fellowship van USC Provost aan M.T., het Saban Research Institute Intramural training pre-Doctoral Award aan M.D., en de Universiteit van Southern California Undergraduate Research Associates programma Award aan R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Tags

Ontwikkelingsbiologie uitgave 148 mRNA electroporation time-lapse microscopie kwartel aviaire embryo FRAP
Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tran, M., Dave, M., Lansford, R.… More

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter