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Developmental Biology

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59664
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

Summary

Reportamos la electroporación del ARN mensajero (ARNm) como un método que permite la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en el sistema modelo de embriones de codorniz. Este método se puede utilizar para etiquetar fluorescentes las células y registrar sus movimientos in vivo mediante microscopía de lapso de tiempo poco después de la electroporación.

Abstract

Informamos que la electroporación de ARNm permite que las proteínas fluorescentes etiqueten las células en embriones de codorniz vivos de forma más rápida y amplia que la electroporación del ADN. La alta eficiencia de la transfección permite que al menos 4 ARNm distintos sean co-transfigurados con una eficiencia del 87 %. La mayoría de los ARNm electroportados se degradan durante las primeras 2 h después de la electroporación, lo que permite realizar experimentos sensibles al tiempo en el embrión en desarrollo. Por último, describimos cómo crear imágenes dinámicas de embriones vivos electroporados con ARNm que codifican varias proteínas fluorescentes subcelulares dirigidas.

Introduction

La electroporación es un método de transfección física que utiliza un pulso eléctrico para crear poros transitorios en la membrana plasmática, permitiendo que sustancias como ácidos nucleicos o productos químicos pasen al citosol. La electroporación se utiliza ampliamente para suministrar ADN en bacterias, levaduras, plantas y células de mamíferos1,2,3. Se utiliza rutinariamente para introducir cargas útiles genéticas en las células y tejidos diana dentro del embrión aviar en desarrollo para estudiar el control genético del desarrollo o etiquetar las poblaciones migratorias de células4,5,6, 7. Sin embargo, también existen varias limitaciones experimentales con la electroporación de ADN8. Por ejemplo, la electroporación de ADN a menudo introduce números muy variables de vectores de expresión por célula y posteriormente los ARNm y proteínas que codifican. Esta variabilidad puede dar lugar a una considerable heterogeneidad celular quecomplica tanto el análisis de imágenes como la interpretación de datos 9,10. Además, las proteínas de la electroporación del ADN sólo comienzan a expresar 3 h después de la electroporación y no alcanzan la máxima eficiencia en el número de células y la intensidad de la fluorescencia hasta las 12 h, probablemente debido al tiempo necesario para transferirse al núcleo y completar transcripción y traducción in vivo11.

Por el contrario, la transfección de ARNm se ha utilizado eficazmente en una variedad de sistemas de modelos, incluyendo ovocitos De Xenopus laevis por microinyección12,13, reprogramación de células madre humanas por transfección de lipofectamina mRNA14 , y electroporating de células madre neurales recalcitrantes en ratones adultos15. Probamos la capacidad de la electroporación de ARNm para etiquetar eficientemente las células durante el desarrollo embrionario aviar temprano utilizando ARNm sintetizados in vitro que codifican proteínas fluorescentes distintas (FPs). Para nuestros estudios, utilizamos el vector pCS2+, un vector de expresión multipropósito que se utiliza comúnmente para expresar proteínas en embriones de Xenopus y pez cebra. Los promotores de la polimerasa de ARN SP6 y T7 en el pCS2+ permiten la síntesis de ARNm y proteína de cualquier gen clonado cuando se utiliza en un sistema de transcripción/traducción in vitro.

Aquí, demostramos que la electroporación de ARNm permite la expresión rápida y eficiente de proteínas fluorescentes (FP) en embriones de codorniz gastrulantes. Diseñamos y generamos muchos de los vectores de expresión utilizados en estos estudios. Por ejemplo, subclonamos el gen LifeAct-eGFP16 en el vector pCS2+17 para expresarlo desde el promotor cmV y el promotor SP6. El gen insertado se encuentra aguas abajo del promotor SP6 y aguas arriba de la cola SV40 poli(A)18. En embriones coelectroportados con ARNm y ADN, los FP codificados a partir de ARNm transcritos in vitro se detectaron por primera vez en un plazo de 20 minutos de electroporación, mientras que los FP de vectores de expresión de ADN se detectaron sólo después de 3 h. Múltiples ARNm codificados para nuclear, Golgi y proteínas de membrana pueden electroporarse en un embrión simultáneamente, lo que resulta en la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en células individuales. Finalmente, utilizando una recuperación de fluorescencia in vivo después del ensayo de fotoblanqueo (FRAP), mostramos que la mayoría de los ARNm electroportados se descomponen dentro de 2 h. Por lo tanto, la rápida producción inicial de proteínas combinada con una nueva traslación de proteínas limitada hace que la electroporación de ARNm sea una técnica valiosa cuando es necesario un control temporal de la expresión.

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Protocol

Todos los procedimientos de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas del Children's Hospital Los Angeles y los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de California.

1. Generación de vectores de expresión basados en pCS2

  1. Para clonar pCS2.Lifeact-eGFP, prepare la columna vertebral vectorial digiriendo 2 g de pCS2.CycB1-GFP (una construcción que contenga un inserto diferente) con BamHI (10 U) y BsrGI (10 U) en el búfer de digestión adecuado (ver Tabla de Materiales) diluido a 1o en una reacción total volumen de 50 oL durante 1 h a 37 oC (véase la figura 1 para el esquema del procedimiento de clonación).
    1. Defosforilalos los extremos libres 3'OH de la columna vertebral vectorial de la reacción enzimática de restricción mediante la adición de fosfatasa alcalina de camarón (1 U). Incubar durante 30 min a 37oC.
    2. Ejecuta toda la mezcla en un tampón EDTA (TAE) de gel de agarosa al 1%/1x Tris Acetate edTA a 90 V durante 50 min y luego mancha el gel en una solución de 0,5 g/ml de bromuro de etidio en 1x tampón TAE durante 15 minutos con balanceo suave. Además, asegúrese de cargar marcadores de peso molecular en un carril libre para ayudar a determinar los tamaños de ADN.
    3. Usando un Transiluminador UV seguro para el ADN para evitar el abusar de los ADN, corte rápidamente la columna vertebral vectorial (tamaño de banda esperado de 4 kb) del gel de agarosa y aísle el fragmento de ADN de la pieza de gel utilizando las instrucciones del fabricante.
  2. Simultáneamente con el paso 1.1, prepare el inserto digiriendo 2 g de pEGFP-N1-Lifeact con BglII (10 U) y BsrGI (10 U) en el tampón de digestión adecuado diluido a 1x en un volumen de reacción total de 50 oL durante 1 h a 37 oC. Ejecuta toda la mezcla en un gel de agarosa del 1% para aislar la banda de 800 bp como se explicó anteriormente en el paso 1.1.2-1.1.3.
  3. Después de que tanto el vector como el inserto se purifiquen y cuantifiquen en el espectrofotómetro, combine 50 ng del vector y 38 ng del inserto (1:3 proporción molar de vector a insertar) en el tampón de ligasa de ADN T4 antes de añadir la ligasa de ADN T4 para catalizar la reacción de ligación. Además, configure un control sin ADN, un control de solo vector y un control de solo inserción. Incubar todas las reacciones a temperatura ambiente durante 30 min.
    1. Transformar 1 l de la(s) mezcla(s) de ligadura(s) en E. coli DH10 competente. Además, transforme el control negativo del agua y 20 pg de control positivo pUC19. Esparza las bacterias en las placas de agar de Luria (LB) que contienen ampicilina de 50 g/ml e incubadurante durante la noche a 37oC.
    2. A la mañana siguiente, cuenta las colonias en cada plato.
      NOTA: Idealmente, no debe haber colonias en las placas de control negativas, >100 colonias en las placas de ligadura vector+insert, y menos colonias en la placa de solo vectores.
    3. Escoge al menos 8 colonias bacterianas de la placa de agar transformadas con la mezcla de ligadura vector+insert e inocularlas usando palillos de dientes estériles o puntas de pipeta en 2 ml de caldo líquido LB que contenga 50 g/ml de ampicilina.
    4. Extrae ADN de cada uno de los clones utilizando kits de miniprep de plásmido comercial.
    5. Ejecuta un resumen de restricción diagnóstica usando 500 ng de ADN de cada clon usando NotI (10 U) y BamHI (10 U) en el tampón de digestión adecuado diluido a 1x durante 1 h a 37oC y ejecuta el ADN digerido en un gel de agarosa del 1% en 1 tampón TAE. Los tamaños de banda esperados para clones positivos pCS2.Lifeact-eGFP son de 3,9 kb y 978 bp.
    6. Transforma 1 pg-100 ng de ADN del clon positivo en E. coli DH10 competente, y prepara 3-4 reacciones miniprep como se detalla en pasos anteriores para obtener una cantidad suficiente de ADN para la reacción de transcripción in vitro (10 g como mínimo).

2. Preparación de ARNm mediante transcripción in vitro

  1. Linealizar 10 g de pCS2.LifeAct-eGFP en el extremo de 3' de la plaquita con NotI (10 U) en un tampón de digestión adecuado diluido a 1x en un volumen de reacción total de 50 oC a 37 oC durante la noche.
    NOTA: Para evitar la contaminación por RNase y reducir la degradación del ARNm, use guantes mientras manipula muestras de ARNm.
  2. Purificar el ADN utilizando una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo (25:24:1, v/v).
    1. Añadir 150 l de agua libre de RNase para que el volumen total de la reacción de digestión sea igual a 200 l. A continuación, añadir 200 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo y vórtice la mezcla durante 20 s.
    2. Centrífuga en un microfúcteo a velocidad máxima (18.400 x g) durante 2 min. Retire cuidadosamente la fase acuosa superior que contiene el ADN linealizado. Repita este paso para eliminar impurezas adicionales y tenga cuidado de no interrumpir el precipitado blanco que se puede formar entre las fases líquidas inferior y superior.
  3. Precipita el ADN linealizado añadiendo 1/10 volumen de acetato de sodio 3M (sin RNase) y 2,5 volúmenes de etanol 100%. Dejar la mezcla a -20 oC durante >30 min, luego peletizar el ADN centrifugando a velocidad máxima (18.400 x g).
    1. Lavar el pellet de ADN con 70% de etanol, luego secar al aire el pellet durante >5 min.
    2. Disolver el pellet de ADN en 5 l de agua libre de RNase. Cuantificar el ADN por espectrofotómetro.
      NOTA: La concentración de ADN esperada es de 0,5-1 g/L con una relación A260/A280 entre 1,7 y 2,0.
  4. Utilice 1 g del ADN linealizado pCS2.LifeAct-eGFP para la transcripción in vitro (IVT). Siga las instrucciones del fabricante en el kit comercial (ver Tabla de Materiales) para incluir 10 l de tapa analógica (concentración final 0,8 mM) y NTP (concentración final 1 mM para ATP, CTP y TTP; 0,2 mM para GTP), 2 l de reacción de 10x (concentración final 1x), 2 l de ARN polimerasa SP6 y agua libre de RNase de hasta 20 l.
    1. Incubar la mezcla de IVT durante aproximadamente 2 h o más, dependiendo del tamaño de la transcripción.
      NOTA: La incubación de 2 h funciona bien para una transcripción de 3 kb, pero la incubación durante la noche funciona mejor para transcripciones que son mayores de 5 kb.
    2. Para eliminar los nucleótidos libres de la reacción de transcripción, agregue 30 ml de solución de precipitación de ARN LiCl (cloruro de litio de 7,5 M, EDTA de 50 mM) para precipitar el ARNm. Vortex la mezcla brevemente y almacenar a -20 oC durante 30 min. Gire el ARNm hacia abajo durante 15 minutos en un microfuo a velocidad máxima (18.400 x g)y enjuague con 70% de etanol (sin RNase).
  5. Disolver el ARNm sintetizado en 15 ml de agua libre de RNase. Dispensar el ARNm sintetizado a 5 l/tubo (3 tubos en total) y colocar a -80 oC para el almacenamiento a largo plazo. Cuantitativa el ARNm con un espectrofotómetro.
    NOTA: El rendimiento previsto es de 15-20 g de arnm (1 g/L). 1 l (1 g/l) es suficiente para un experimento con 10 embriones, suponiendo que el ARNm se diluya de 1 g/l a 500 ng/L y que cada embrión se inyecta con 200 nL. Por lo tanto, cada tubo debe contener suficiente ARNm para los experimentos de 5.
  6. Ejecutar 300 ng de ARNm en un gel de agarosa del 1% en 1 tampón TAE después de limpiar todos los equipos de gel con la solución de descontaminación RNase (por ejemplo, RNase Away) y asegurarse de que el ARNm aparece como una banda (pueden estar presentes varias bandas si se forman estructuras secundarias) y que no se mancha un frotis un frotis ppears en el carril de gel, que indica la degradación del ARN.

3. Preparación de la mezcla de electroporación de ARNm

  1. Descongelar y diluir el ARNm a la concentración deseada (250-500 ng/L en agua libre de RNase funciona bien para todos los ARNm probados en este trabajo). Añadir 1/10 volumen de tinte coloreado (ver Tabla de Materiales, Libre de ARNI, 0.1% concentración final) para ayudar a visualizar el sitio de inyección de ARNm y colocar correctamente los electrodos.
    NOTA:     Si el ADN y el ARN se combinan para realizar una coelectroporación, asegúrese de que el ADN esté libre de Arqueos contaminantes mediante la extracción de fenol-cloroformo y la precipitación de etanol antes de la mezcla de ARNm y ADN.
    1. Asegúrese de preparar un control negativo utilizando una solución de electroporación simulada (sin ARN añadido). Si es posible, prepare un control positivo utilizando mRNA prevalidado (arNM que se ha demostrado que produce FP con éxito en experimentos anteriores).
      NOTA: El control negativo es esencial para que todos los experimentos de imágenes establezcan niveles de fluorescencia en segundo plano para la normalización de los datos. El control positivo es especialmente importante cuando se trabaja con mRNA recién transcrita al ayudar a confirmar que los ajustes de electroporación funcionaron.
  2. Almacene la solución de electroporación de ARNm en una suspensión de hielo para evitar la degradación hasta que esté lista para proceder con la electroporación.

4. Electroporate arNM en embriones de codorniz viviente

  1. Recoger los huevos de codorniz fertilizados recién puestos todos los días y almacenar a 13 oC en un refrigerador humidificado durante no más de 1 semana. Incubar los huevos de codorniz a 38oC hasta las etapas de desarrollo embrionario deseadas19,20,21.
    NOTA: HH3 a HH5 se utilizaron en este estudio para imágenes estáticas y dinámicas. Para los embriones HH3, dejar los óvulos a temperatura ambiente durante 2 h antes de la cosecha hace que el proceso de aislamiento sea mucho más fácil, ya que los embriones son generalmente más resistentes a las manipulaciones físicas cuando se enfrían.
  2. Aislar y preparar embriones según el sistema de cultivo de la CE22. Recoger al menos 5 embriones por condición, incluyendo al menos uno para servir como un control negativo (no electroporado).
    1. Rompe suavemente y vierte el huevo en un plato Petri de 10 cm. Retire la mayor parte de la albúmina gruesa con una pipeta de transferencia y retire la albúmina gruesa restante alrededor del embrión limpiando suavemente la superficie de la yema con una toallita de tejido para asegurarse de que el embrión se pegue firmemente al anillo de papel.
    2. Poner papel de filtro precortado (ver Tabla de Materiales)sobre el embrión y utilizar tijeras para cortar suavemente alrededor del perímetro del embrión.
    3. Utilice una pipeta Pasteur para subyficar el embrión con PBS, utilizando corrientes suaves para desalojar cualquier yema que se pegue al embrión.
      NOTA: Este paso es fundamental cuando se trabaja con embriones más jóvenes (
    4. Tire lentamente del anillo de embrión/papel en un ángulo oblicuo hacia arriba y hacia fuera de la yema en una placa Petri llena de PBS para su posterior limpieza. Una vez que se haya eliminado la mayor parte de la yema, coloque el lado ventral embrionario hacia arriba en una placa Petri de 35 mm cubierta con una mezcla semisólida de agar/albúmina.
  3. Preparar microcapilares de vidrio de seis a ocho de 10 cm de largo (D.O. a 1,2 mm) utilizando un instrumento de tirador de micropipeta de vidrio.
  4. Coloque el lado ventral embrionario hacia arriba en la cámara de electroporación llena de PBS. Usando un microcapilar de vidrio, inyectar un bolo de 200 nL de la mezcla de ARNm o electroporación de ADN/mRNA en la cavidad entre la membrana epiblasto y vitelina que cubre la región deseada.
    NOTA: Toda el área anterior para pellucida y alguna zona para opaca fue electroporada en la mayoría de los experimentos mostrados en este manuscrito.
  5. Coloque los electrodos positivos y negativos (electrodo cuadrado plano platino; longitud lateral de 5 mm) en la parte superior e inferior del embrión respectivamente y el electroporato utilizando la siguiente secuencia de pulsos: cinco pulsos eléctricos cuadrados de 5 V, 50 ms de duración con intervalos de 100 ms usando un electroporator in vivo. Asegúrese de que la distancia entre los electrodos es de 5 mm.
    NOTA: Optimizar los parámetros de electroporación es crucial para evitar condiciones que puedan matar las células embrionarias frágiles. Se deben considerar los parámetros de voltaje, longitud de pulso, intervalos de pulso según el número de pulsos para el ADN y el ARNm para varios dispositivos de electroporación.
  6. Incubar los embriones electroportados a 38oC a la etapa de desarrollo deseada.
    NOTA: Un estereoscopio de disección fluorescente (ver Tabla de Materiales)ayuda a examinar embriones transinfectados frente a embriones no transinfectados.
  7. Si los embriones deben ser investigados estáticamente, fijarlos en 4% paraformaldehído en PBS durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 oC.
    1. Retire los embriones de la membrana vitelina cortando suavemente alrededor del perímetro del papel filtrante con tijeras y despegando la membrana brillante en la superficie dorsal con fórceps afilados suavemente.
    2. Lavar los embriones fijos en PBS/Triton (0,1%) 2x durante 5 min y continuar con hibridación in situ o inmunomanchasi si se desea.
    3. Por último, manchar el embrión en 0,5 g/L de DAPI en PBS/Triton (0,1%) durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Lavar los embriones en PBS/Triton 2x durante 5 min y limpiar el embrión en la solución SCALE-U223 durante la noche.
  8. Para analizar la eficiencia de la electroporación (véase la figura2), utilice la herramienta de análisis binario y de partículas y el canal DAPI en ImageJ para obtener contornos nucleares de todas las celdas de la imagen.
    1. Para utilizar la herramienta binaria en ImageJ, utilice un único sector z en el canal DAPI que contenga la mayoría de las celdas y haga clic en Proceso > Binario > Crear binario. Para separar celdas cercanas, haga clic en Proceso > Binario > Cuenca hidrográfica. Para obtener contornos de celda, haga clic en Analizar > Analizar partículas, tamaño establecido en 100-500 (m2).
    2. Asegúrese de que la mayoría de las celdas se describen en el canal DAPI y guarde los contornos de celda haciendo clic más > Guardar en la ventana emergente Administrador de ROI.
    3. Utilice estos contornos para obtener valores de intensidad de fluorescencia para el ARNm y el canal de ADN abriendo el archivo guardado previamente en un solo corte z en el ARNm o canal de ADN y, a continuación, haga clic en Medir en el gestor de ROI.
    4. Por último, filtre estos valores de intensidad, contando las células con <6.000 de intensidad de fluorescencia como no transtrampetes y las células con >6.000 de intensidad de fluorescencia transinfectadas.

5. FPs de imagen codificados por ARNm electroportados

  1. Elija el embrión electroporado más saludable y mejor para los experimentos de imágenes dinámicas después de examinar todos los embriones electroporados bajo el estereoscopio de disuadeción fluorescente.
    1. Continúe incubando los otros embriones electroporados y el embrión no electroporado (el control negativo) en una incubadora separada mientras toma imágenes del embrión elegido en caso de que este embrión muera durante el experimento.
  2. Para la toma de imágenes dinámicas, utilice el cultivo de embriones ex ovo aviar de montaje completo como se describió anteriormente24,25,26 con un microscopio confocal invertido.
    NOTA:     El microscopio está equipado con una incubadora en el escenario (ver Tabla de Materiales)que mantiene la temperatura a 36oC durante la toma de imágenes. Durante la configuración del microscopio se observó que los embriones incubados a 36 oC sobreviven más tiempo que a temperaturas más altas, posiblemente porque el láser puede causar calentamiento local en el embrión. Los lectores deben determinar la temperatura óptima de incubación en el escenario para su propia configuración del microscopio.
    1. Para visualizar dinámicamente la embriogénesis, limpie brevemente el embrión electroporado con PBS para eliminar cualquier burbuja que pueda formarse en el lado dorsal del embrión durante el proceso de electroporación moviendo el embrión usando fórceps en una limpieza de PBS Solución.
    2. Coloque el embrión limpio directamente sobre una placa de imágenes que contenga una fina capa de albúto-agar (150 l) asegurándose de no generar ninguna burbuja en la superficie dorsal del embrión22.
    3. Para garantizar la supervivencia de las imágenes a largo plazo, agregue un pequeño trozo de papel tisú humeante en los bordes interiores de la placa de imágenes y selle el plato con película de parafina para minimizar la evaporación durante la toma de imágenes y la incubación.
    4. Mueva este plato rápidamente a la etapa precalentada de un microscopio confocal y localice el tinte de color en el embrión utilizando el canal de campo brillante (láser PMT 20%), que identifica la región inyectada y electroporada.
  3. Ajuste el software de imagen al objetivo deseado (10 o 20x), espejo dicroro (488 nm para GFP nm, 561 para RFP), espectros de emisión (499-562 nm para GFP, 570-695 nm para RFP) y encienda un láser adecuado (488 nm para GFP, 561 nm para RFP).
    NOTA:     El ARNm electroportado se tradujo en proteínas que se observaron en 20 min (ver Figura 3). Los metadatos de imagen utilizados para la mayoría de las imágenes de este documento fueron: un microscopio confocal invertido con un objetivo de 20x (ver Tabla de Materiales); tiempo de permanencia de píxeles, 1,5 euros; media de escaneos de 4 líneas.
    1. Haga clic en Live en el software de imágenes y ajuste la potencia del láser a un ajuste que sea adecuado para la intensidad de la fluorescencia dependiendo de cada potencia láser del microscopio. Comience por tomar imágenes del embrión usando 1% de potencia láser, 800 ganancias, y aumente la potencia del láser lentamente en un 1% de incrementos hasta que se ven píxeles saturados.
    2. Siga esto disminuyendo ligeramente la potencia del láser hasta que ya no se ven píxeles saturados.
      NOTA: La potencia láser elegida para el comienzo de una sesión de imágenes de un embrión puede ser buena para puntos de tiempo más tempranos, pero no es ideal en momentos posteriores si la fluorescencia de las células se vuelve mucho más brillante o más tenue con el tiempo. Para abordar esto, idee el embrión con ajustes de potencia ligeramente más bajos inicialmente, ya que las células electroporadas generalmente se vuelven más brillantes durante las primeras 6 horas después de la electroporación (ver Figura 3A-E para la cuantificación del aumento de la señal). Si las imágenes posteriores están saturadas, continúe con la imagen con la configuración de imágenes original, pero tome una imagen adicional inmediatamente después con ajustes de imagen más débiles (agujero más pequeño o potencia láser más débil).
    3. Imagen del embrión cada 3-5 minutos con el fin de realizar un seguimiento de la migración celular individual a través de diferentes puntos de tiempo. Para este trabajo, las imágenes eran pilas z (50 m de espesor) de toda el área electroporada, además de un poco de espacio adicional hacia la parte inferior de la pila z en caso de que el embrión se hunde en el lecho de agarosa durante toda la sesión de imágenes.
    4. Observe la velocidad con la que se mueven las celdas comprobando los primeros puntos de tiempo de la primera película. Si las celdas se mueven a una velocidad rápida (lo que significa que saldrán del área de la región de la imagen dentro de un par de puntos de tiempo más), considere la posibilidad de expandir el zoom del área de la imagen (1x a 0,8x) o crear imágenes de una región diferente.
      NOTA: Las regiones embrionarias de la zona pellucida se mueven mucho más rápidamente que las de la zona, opacas. Además, los embriones más jóvenes (HH3, HH5) a menudo contienen células que están experimentando un movimiento más rápido en comparación con los embriones más viejos (>HH7).
    5. Después de tomar imágenes de la región electroporada del embrión, haga una imagen de una región no electroporada del mismo embrión para determinar los niveles de autofluorescencia (debe ser mínimo si se utiliza una baja potencia láser <10% para tomar imágenes del embrión).

6. Recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) para analizar la integridad del ARNm

NOTA: Se puede utilizar una recuperación de fluorescencia in vivo después del ensayo de fotoblanqueo (FRAP) para determinar cuánto tiempo se podría traducir el ARNm transinfectado al APF. El siguiente protocolo describe un experimento FRAP para detectar la vida media de H2B. ARNm de citrino en un embrión electroporado.

  1. Realice experimentos FRAP en el microscopio confocal invertido utilizando un objetivo de 20x 0.8 NA y un agujero completamente abierto.
    1. Después de confirmar la electroporación de H2B-Citrine en el estereomicroscopio y poner el embrión en la etapa precalentada en el microscopio confocal invertido (ver paso 5.2.4), fotoblanquear la mayor parte de la fluorescencia celular de H2B-Citrine en una variedad de tiempo puntos (45 min, 2 h y 5 h post-electroporación) mediante el uso del láser de 405 nm con 70% de potencia láser, 100 iteraciones, velocidad de escaneo 4, que deja sólo el 5% de la fluorescencia restante.
      NOTA: Este proceso debe tardar un par de minutos.
    2. Continúe incubando los embriones en el escenario a 36 oC después del fotoblanqueo.
  2. Asegúrese de prestar atención a las células que se dividen activamente dentro de la región fotoblanqueada, lo que indica que las células fotoblanqueadas no han muerto completamente después del tratamiento.
  3. Adquirir imágenes posteriores a la lejía (pilas z de la región electroporada) durante un máximo de 30 minutos a intervalos de tiempo regulares (3 o 5 min) utilizando el microscopio confocal.
    NOTA: Si está disponible, utilice una línea transgénica H2B-XFP como un control positivo para garantizar la supervivencia celular en la región fotoblanqueada. La tasa de recuperación de fluorescencia para el FP codificado por el ARNm electroportado debe disminuir, pero que para el FP codificado a través del transgén debe permanecer constante a lo largo de toda la película.
  4. Para garantizar que las condiciones de diagnóstico por imágenes no afecten el uso nocivo de la supervivencia de los embriones, incubar simultáneamente embriones electroporados que no estén fotoblanqueados, lo que puede servir como control para la toma de imágenes.
  5. Para cuantificar los resultados del fotoblanqueo para la descomposición del ARNm después de la electroporación, realice un seguimiento de la fluorescencia celular a lo largo del tiempo (3 o 5 min) midiendo la intensidad de fluorescencia del centro (un círculo de 7,5 m) de cada célula utilizando ImageJ. Mida esto para todas las células dentro de la región fotoblanqueada que no están sufran mitosis y han sido completamente fotoblanqueadas.
    NOTA: Considere la posibilidad de omitir las células mitóticas de la cuantificación, ya que los núcleos mitóticos tienen fluorescencia más fuerte que los núcleos interfases debido a la condensación de cromatina.
  6. Trazar la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo después de la lejía en una variedad de puntos de tiempo (45 min, 2 h, y 5 h).

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Representative Results

La electroporación de ARNm es más eficiente que la electroporación de ADN

Usamos pCS2+. H2B-Citrine para preparar mRNA transcrito in vitro. Dado que la electroporación de ADN se realiza generalmente a 1-2 g/L, utilizamos una concentración equimolar de ARNm (calculada en torno a 0,25-0,5 g/L para H2B-Citrine) para la electroporación de ARNm. Primero probamos la eficiencia de electroporación de pCS2+. ADN H2B-Citrine en comparación con el ARNm H2B-Citrine (transcrito in vitro del promotor SP6 de pCS2+. H2B-Citrine) electroportando EL ADN o el ARNm por separado en embriones de codorniz HH5 y luego examinando la eficiencia de la electroporación a 12 h después de la electroporación. Aunque la electroporación del ADN conduce a una fluorescencia más brillante en algunas células electroporadas, la eficiencia de la electroporación de ADN fue visiblemente menor en comparación con los FP codificados por ARNm ampliamente expresados (Figura2A yB).

Para tener en cuenta la variabilidad inherente de embrión a embrión en el protocolo de electroporación, una combinación equimolar de codificación mRNA H2B-Citrine y ADN que expresa H2B-mKate2 se electroporató en el ectodermo de los embriones HH5 y observó 12 h post-electroporación. Al comparar la coelectroporación de ADN y ARNm en el mismo embrión, el ADN que expresaBA FP también era significativa y consistentemente menos eficiente que el de ARNm (Figura2C). Al cuantificar todos los embriones electroporados sólo con ARNm, ADN o una combinación de los dos, encontramos que el ARNm transfecta el 75% de las células en una región determinada, mientras que el ADN sólo trantrula el 25% de las células en una región determinada (Figura2D). La propagación en la expresión de proteínas fluorescentes codificadas por ARNm o ADN no fue significativamente diferente en todos los embriones coelectroportados (Figura2E).

La expresión de proteínas es más rápida en la electroporación de ARNm que la electroporación de ADN

El ARNm transinfectado debe conducir a una producción de proteínas más rápida, ya que puede ser inmediatamente reconocido por la maquinaria de traducción citosólica como se ve en la Figura3. El ADN debe ser translocado al núcleo, transcrito, y el ARNm transportado de vuelta al citosol donde es reconocido por la maquinaria de traducción citosólica, se espera que tome más tiempo. Para comparar directamente las tasas de expresión de ARNm frente a LAS de la producción de proteínas, llevamos a cabo una serie de experimentos de curso de tiempo en los que coelectroportamos una combinación equimolar de ADN (pCMV.H2B-mKate2) y mRNA (H2B-Citrine) en el ectodermo de los embriones HH5. Detectamos la expresión FP codificada en ARNm alrededor de 22 min después de la electroporación, que continúa aumentando en intensidad de fluorescencia relativa durante 6 h (Figura3A-E, Suplementario. Película S1b). Por el contrario, la expresión FP codificada en ADN se ve por primera vez en la postelectroporación de 1,5 h (Figura3A'-E', Suplementaria. Película S1c) y continúa aumentando en brillo hasta las 6 h cuando la película se detuvo. Debido a que las células electroporadas de ADN estaban saturadas por la marca de 6 h, reimaged esta condición con condiciones de imagen más débiles (Figura3F-F''). A lo largo de todos los puntos de tiempo de este lapso de tiempo (22 min a 6 h), mRNA trantrula varias veces más células que el ADN(Suplementario. Película S1a, la eficiencia total de la electroporación a través de campo brillante y DAPI no se muestran porque estas imágenes se toman de un lapso de tiempo de un embrión de codorniz de tipo salvaje). Basándonos en esto, llegamos a la conclusión de que la electroporación de ARNm conduce a proteínas expresadas anteriormente.

La coelectroporación de múltiples ARNm es altamente eficiente

A continuación, buscamos probar aún más la eficiencia de la electroporación de ARNm electroporando múltiples ARNm en una región de interés. Anteriormente se había demostrado que la coelectroporación de múltiples ADN era relativamente ineficiente, mostrando que el número de multietiquetados era del 25%, 14% y 10% para 2, 3 y 4 construcciones de ADN electroporadas, calculadas como una proporción del número total de células11 . Primero electroporatamos dos ARNm que codifican FP espectralmente distintos (Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine) en embriones HH5 y obtuvimos una alta eficiencia de transfección en todas las regiones electroporadas. Usamos esta doble electroporación para capturar películas de expansión radial entre la pellucida de área y la opaca en un embrión gastrulante HH4, imagen de 2 h post-electroporación (Película Suplementaria S2a, b, y c). El H2B-Citrine se localiza dentro del núcleo celular y permite rastrear la proliferación celular27. El FP Turquoise2-Golgi parece mostrar polaridad subcelular dentro de las células embrionarias, pero no parece correlacionarse con la velocidad o dirección de las células de ectodermo en movimiento in vivo28. Esta película (Supplemental Movie S2) muestra que las células electroporadas con múltiples ARNm pueden continuar la actividad celular normal sin defectos aparentes.

Además, la coelectroporación de 4 ARNm - Turquesa2-Golgi (para visualizar el aparato Golgi), LifeAct-eGFP (para visualizar F-actin), H2B-Citrine (para visualizar el núcleo) y membrana-Cherry FP (para visualizar membranas) - resultó en 87% de transfección eficiencia de los 4 ARNm en todas las regiones electroporadas (Figura4). LifeAct-EGFP y H2B-Citrine fueron separados por la herramienta de procesamiento de desmezcla lineal en el software comercial.

El ensayo FRAP muestra la rápida degradación del ARNm electroporado durante las primeras dos horas posteriores a la electroporación.

Es bien sabido que los ARNm desnudos se degradan rápidamente por arniases celulares29. Postulamos que la electroporación de ARNm podría ser útil para experimentos de pérdida o ganancia de función al permitir una expresión rápida y eficiente de proteínas en un embrión en desarrollo. Por lo tanto, sería útil cuantificar la tasa de descomposición del ARNm después de la electroporación del ARNm, ya que el ARNm se degrada más rápido que el ADN en las células. En informes anteriores de electroporación de ARNm en células madre neurales de ratón adultos, alrededor del 80% de ARNm se identificó 2 h después de la electroporación por qRT-PCR, pero poco o ningún ARNm fue detectado por 24 h post-electroporación15. Buscamos cuantificar aún más la expresión de ARNm después de la electroporación mediante el diseño de un ensayo FRAP in vivo para detectar los niveles de ARNm en células electroporadas.

El fotoblanqueo es la destrucción irreversible del fluoróforo que puede ocurrir cuando el fluoróforo (proteínas fluorescentes en nuestro caso) está en un estado excitado, lo que elimina la fluorescencia durante la observación30,31. Por lo tanto, cualquier luz emitida de proteínas fluorescentes (FP) que pueda detectarse en células fotoblanqueadas por encima de los niveles basales debe representar los FP recién traducidos codificados por ARNm intactos y transinfectados. Por lo tanto, buscamos fotoblanquear las células electroporadas para eliminar toda la fluorescencia derivada de FP existente en una variedad de puntos de tiempo y realizar un seguimiento de la posterior recuperación de fluorescencia.

Usando ajustes optimizados de fotoblanqueo como se describe en la sección de protocolo, encontramos que el fotoblanqueo reduce inicialmente la intensidad de la fluorescencia en todas las células fotoblanqueadas en un 95 % cuando se muestra inmediatamente después del evento de fotoblanqueo. Esto se hizo a 45 min, 2 h, y 5 h post-electroporación (Figura5A-C). La recuperación de fluorescencia en cada célula dentro de la región fotoblanqueada se rastreó durante un período de tiempo de 30 minutos después del fotoblanqueo en cada punto de tiempo mediante imágenes de la misma región en intervalos de tiempo regulares (3 o 5 min). Nuestros datos sugieren que hay una disminución significativa en los niveles de ARNm transfectó entre 45 min y 5 h después de la electroporación. Esto se demuestra por la gran disminución de FRAP medida a 5 h en comparación con 45 min postelectroporación. Para resaltar la recuperación de fluorescencia en las células blanqueadas especialmente en el punto de tiempo de 5 h, hemos mejorado el brillo en la Figura 5A-C utilizando la herramienta de brillo/contraste en ImageJ y mostramos estas imágenes modificadas en la Figura 5D-F. Curiosamente, hay una gran heterogeneidad en la recuperación de fluorescencia de célula a célula dentro del área fotoblanqueada a 2 h porque algunas células recuperan la fluorescencia más rápido que otras células (Figura5E'', ver puntasde flecha). Sin embargo, todas las células dentro del área fotoblanqueada de 5 h recuperan la fluorescencia más lenta (Figura5F'') que las células fotoblanqueadas a 2 h. También detectamos células que se dividen activamente dentro de nuestra región fotoblanqueada, lo que sugiere que las células no han muerto como resultado del proceso de fotoblanqueo (Figura5E').

Cuantificamos estos resultados en la Figura 6A mostrando la intensidad de la señal normalizada de cada célula dentro de las áreas fotoblanqueadas durante un período de 30 minutos después del evento de fotoblanqueo. Para cada célula, los valores de fluorescencia se normalizaron contra la intensidad de la señal de esa célula inmediatamente después del fotoblanqueo. Esta normalización se realizó para todas las celdas en todos los puntos de tiempo de la imagen (45 min, 2 h, 5 h). Los valores normalizados de la recuperación de fluorescencia de las células dentro de la misma región fotoblanqueada se agruparon y graficaron a lo largo del tiempo después del evento de fotoblanqueo; por lo tanto, cada punto del gráfico representa 35 celdas. Los datos no normalizados también se muestran en la Figura 6B, en la que cada línea representa una célula con intensidad de señal de fluorescencia recuperada inmediatamente después del fotoblanqueo. Estos datos en general sugieren que en 5 h, todas las células han agotado la mayor parte de su ARNm, con una gran porción de esta caída que ocurre entre 45 min y 2 h después de la electroporación.

Figure 1
Figura 1: Esquema del procedimiento de clonación para hacer que pCS2+LifeAct-eGFP se construya. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: la electroporación de ARNm es más eficiente que la electroporación de ADN. (A-A'') El ADN que expresa pCS2.H2B-Citrine se electroporó en el ectodermo de los embriones HH5. Se observó fluorescencia 12 h después de la electroporación. La barra de escala de 50 m. (B-B'') mRNA que expresa H2B-Citrine se electroporó en el ectodermo de los embriones HH5. Se observó fluorescencia 12 horas después de la electroporación. La barra de escala de 50 m.(C-C'') La combinación equimolar de ADN (pCMV.H2B-mKate2) y mRNA (H2B-Citrine) se electroporó en embriones HH5 y se observó 12 h después de la electroporación. Se probaron tres embriones por condición (experimentos n.o 2). Barra de escala a 50 m. (D) Se cuantificaron tres embriones de A, B y C (9 embriones en total) para una eficiencia de electroporación utilizando la herramienta de análisis de partículas en ImageJ. Se cuantificó una región de 200 m de cada embrión (se contaron al menos 150 células por región). El guión medio representa la media, mientras que las barras superior e inferior representan la desviación estándar de la media. (E) Se analizan tres embriones coelectroporados (ADN y ARNm) para la propagación de la señal en todas las células electroporadas en una región determinada de 200 m. Cada embrión tenía alrededor de 100 células positivas para la electroporación de ARNm y 30 células positivas para la electroporación de ADN. El guión medio representa la media, mientras que las barras superior e inferior representan la desviación estándar de la media. No hay diferencia significativa entre la propagación del ARNm frente a la electroporación de ADN, pero la electroporación de ARNm es mucho más eficiente que la del ADN. (A-C) Dimensiones: 425,10 x 425,10 x 55 m. Dorada de píxeles 2,55 s. Línea media 4. Bits por píxel 16. Metadatos del microscopio: microscopio confocal invertido, objetivo 20x (ver Tabla de Materiales)(A) Ex: 488 nm (0,05%), Pista de Emisión S1 a 508-579 nm; (B) Ex a 488 nm (5,0%), Pista de Emisión S1 a 508-579 nm; (C) Ex a 488 nm (5,0%), 561 nm (5,0%), Pista de Emisión S1 a 508-579 nm; S2 á 606-695 nm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: la electroporación del ARNm muestra la expresión por 22 min después de la electroporación y es mucho más rápida que la electroporación del ADN. Imágenes representativas de curso de tiempo después de ARNm (H2B-Citrine) y ADN (pCMV.H2B-mKate2) electroporación con análisis de perfil de parcela a 22 min (A-A''), 45 min (B-B''), 1,5 h (C-C''), 3 h (D-D''), y 6 h (E-E'') el inicio de la toma de imágenes (n.o 1). Se proporciona un análisis de perfil de trazado para cada punto de tiempo que se muestra a través de la flecha dibujada en la imagen combinada. Cada pico en el perfil de trazado representa el núcleo de una célula electroporada. Las células generalmente se vuelven más brillantes en el intervalo de 6 h de la película, lo que indica que el ARNm todavía se está traduciendo en nueva proteína fluorescente. Para el punto de tiempo de 6 horas, se muestran imágenes de la misma región capturadas utilizando condiciones de imagen idénticas(E-E'') y condiciones de imagen más débiles (F-F'') porque las imágenes de las células electroporadas de ADN estaban muy saturadas utilizando la inicial condiciones de imagen. Barra de escala a 20 m. Dimensiones: 425,10 x 425,10 x 55 m. La imagen se muestra como una proyección de intensidad máxima en todos los puntos de tiempo indicados. Color de píxeles 2,55 s. Línea media 4. Bits por píxel 16. Metadatos del microscopio: microscopio confocal invertido, objetivo 20x (ver Tabla de Materiales) Ex a 488 nm (15%), 594 nm (5,0%) para la inicial; Ex 488 nm (7,5%), 594 nm (0,5%) para el último punto de tiempo (Figura2F), Pista de Emisión S1 a 499-562 nm; S2 a 605-661 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La coelectroporación de cuatro ARNm dirigidas a diferentes estructuras subcelulares es altamente eficiente. El ectodermo de un embrión HH3 fue electroporado con ARNm que codifican mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine y membrana-Cherry. El embrión fue fijado e imagendo a las 4 horas después de la electroporación. La mayoría de las células se electroporatan dentro de la región dirigida al electrodo con los cuatro ARNm (87%). Cifras representativas mostradas (3 embriones cada uno, n 2 experimentos). Barra de escala a 50 m. (A) Combinar los cuatro ARNm (mTurquoise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine y membrana-Cherry). (B) Sólo canal H2B-Citrine (Ex a 488 nm (0,7%), Em a 455-499 nm). (C) Sólo canal mTurquoise2-Golgi (Ex 458 nm (22,0%), Em a 455-499 nm). (D) Combinar H2B-Citrine y mTurquoise2-Golgi muestra que Golgi envuelve un lado del núcleo en la mayoría de las células. (E) Sólo canal LifeAct-eGFP (Ex a 488 nm (0,7%), Em: 455-499 nm). (F) Sólo canal de membrana-cereza (Ex a 594 nm (37,1%), Em a S2: 570-695 nm). (G) Combinar LifeAct-eGFP y membrana-Cherry muestra superposición en la mayoría de las células. Dimensiones: 425,10 x 425,10. Color de píxeles 1,58 s. Línea media 4. Bits por píxel 16. Metadatos del microscopio- microscopio confocal invertido, 20x objetivo (ver Tabla de Materiales) Ex a 405 nm (2,4%), 458 nm (22,0%), 488 nm (0,7%), 594 nm (37,1%), Pista de Emisión S1 a 455-499 nm; S2 a 570-695 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: El ensayo de fotoblanqueo muestra una rápida degradación del ARNm electroportado durante las primeras cinco horas posteriores a la electroporación. El fotoblanqueo de una región de 100 m2 que contiene células electroporadas con ARNm que expresa H2B-Citrine se realiza a 45 min, 2 h y 5 h después de la electroporación. El embrión fue fotografiado a intervalos regulares después del fotoblanqueo (3 o 5 min). Las condiciones de fotoblanqueo son las siguientes: 70% 405 nm láser, 100 iteraciones, aproximadamente 5 min de duración para toda la región. Barra de escala de 50 a m. (A-A'') 45 min pre- y post-bleach. B muestra el embrión inmediatamente después del fotoblanqueo y C muestra el embrión 30 min después de la lejía. Barra de escala a 50 m. (B-B'') 2 h pre y post-blanqueador. El perímetro del cuadrado se desplaza porque las células dentro de la región fotoblanqueada se movieron ligeramente durante el período de lejía. (C-C'') 5 h pre y post-blanqueador. (D-D'') Mismas imágenes que A-A'' con brillo mejorado (valor máximo ajustado a 11550 para mejorar el brillo después de la recolección). (E-E'') Mismas imágenes que B-B'' con brillo mejorado (valor máximo ajustado a 11550 para mejorar el brillo después de la recolección). Las puntas de flecha blancas apuntan a las células que tienen una mayor recuperación de fluorescencia que las células circundantes. La punta de flecha cian apunta a una célula fotoblanqueada que ha sufrido recientemente mitosis. (F-F'') Mismas imágenes que C-C'' con brillo mejorado (valor máximo ajustado a 11550 para mejorar el brillo después de la recolección). Dimensiones: 425,10 x 425,10 x 42 m. La imagen se muestra como una proyección de intensidad máxima en todos los puntos de tiempo de la imagen. Color de píxeles 1,58 s. Línea media 4. Bits por píxel 16. Metadatos del microscopio: microscopio confocal invertido, objetivo 20x (ver Tabla de Materiales) Ex a 488 nm (1,5%), Pista de emisión S1 a 508-553 nm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figure 6
Figura 6: Cuantificación de la recuperación de fluorescencia en células fotoblanqueadas. (A) Se rastreó la intensidad de la fluorescencia de todas las células dentro de las regiones blanqueadas (35 células) para cada célula individual durante cada período de tiempo posterior a la lejía. Hay una gran caída en la velocidad de intensidad de la señal recuperada de 45 min a 2 h, seguido de una caída más pequeña de 2 h a 5 h. La barra de error superior se muestra para cada punto, que representa la desviación estándar de la media. La línea mostrada es una línea de regresión lineal. R2 para 45 min, 2 h y 5 h es 0,83, 0,58 y 0,84 respectivamente. La mitad superior de la barra de error se muestra para cada punto. (B) Se rastreó la intensidad de la fluorescencia de todas las células dentro de las regiones blanqueadas (35 células) para cada célula durante cada período de tiempo posterior a la lejía y se graficaron sin normalización. Hay una gran caída en la tasa de intensidad de la señal recuperada de 45 min a 2 h, seguido de una caída más pequeña de 2 h a 5 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película suplementaria 1: la electroporación de ARNm conduce a una expresión proteica más temprana que la electroporación del ADN. El ARNm H2B-Citrine y el ADN H2B-mKate2 electroporados en ectodermo del embrión HH5. La región que se muestra en el borde del tejido extraembrionario y embrionario. Barra de escala a 50 m. ( a ) Se muestran tanto el canal H2B-Citrine como el canal H2B-mKate2 (Ex a 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Em: 499-562 nm; S2: 605-661 nm). (b) Sólo se ha mostrado el canal mRNA H2B-Citrine (Ex a 488 nm (15%), Em a 499-562nm). (c) Sólo se muestra el canal de ADN H2B-mKate2 (Ex a 594 nm (5,0%), Em a 605-661 nm). Dimensiones: 850,19 x 850,19 x 110 m. La imagen se muestra como una proyección de intensidad máxima en todos los puntos de tiempo de la imagen. Color de píxeles 2,55 s. Línea media 4. Bits por píxel 16. Metadatos del microscopio: microscopio confocal invertido, objetivo 20x (ver Tabla de Materiales) Ex a 488 nm (15%), 594 nm (5,0%), Pista de Emisión S1 a 499-562 nm; S2 a 605-661 nm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 2: La coelectroporación de ARNm permite estudiar dinámicamente comportamientos celulares distintos. La expansión radial de las células entre el borde embrionario y extraembrionario se electropora con ARNm (H2B-Citrine y mTurquoise2-Golgi) y se imágen durante la migración hacia el exterior. Esta película fue imagendeada por microscopía confocal de 2 a 5 h después de la electroporación por imágenes cada 6 min. Barra de escala de 50 m.  (a ) Se muestran los canales H2B-Citrine y mTurquoise2-Golgi (Ex 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Em a 446-526 nm; S2: 508-553 nm). (b) Sólo se muestra el canal H2B-Citrine (Ex a 488 nm (5,0%), Em a S2: 508-553 nm). (c) Sólo se muestra el canal mTurquoise2-Golgi (Ex 458 nm (28%), Em a 446-526 nm). Dimensiones: 425,10 x 425,10 x 32,5 m. La imagen se muestra como una proyección de intensidad máxima en todos los puntos de tiempo de la imagen. Distura de píxeles 0,79 s. Línea media 4. Bits por píxel 16. Metadatos del microscopio- microscopio confocal invertido, objetivo 20x (ver Tabla de Materiales) Ex a 458 nm (28%), 488 nm (5,0%), Pista de Emisión S1 a 446-526 nm; S2 a 508-553 nm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

En este protocolo, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo microinyectar y electroporar con precisión el ARNm en las células de los embriones de codorniz gastrulantes. Demostramos que la electroporación de ARNm sintetizada in vitro permite la expresión rápida y eficiente de proteínas fluorescentes (FP) en embriones de codorniz gastrulantes (Figura2 y 3). La fluorescencia de la proteína H2B-citrine traducida a partir de ARNm electroportados podría detectarse mediante microscopía confocal en un plazo de 20 minutos y aumentaren en fluorescencia FP durante horas (Figura3, Película suplementaria 1). Esto es sorprendentemente rápido y cercano al supuesto tiempo de maduración para el citrino32,33. Los FP expresados a partir de vectoresde ADN se detectaron después de 2-3 h (Figura 3,Suplementario. Película 1), que es similar a los informes anteriores8,34,35. Varios FP tienen tiempos de maduración únicos, por lo que la planificación avanzada asegurará que el FP ideal se elija en términos de la distinción espectral y la cinética de maduración deseada para el experimento. Además, los ARNM sintetizados co-transfectan más eficientemente las células embrionarias co-transfectadas que los vectores de ADN11. La mayor eficiencia de transfección da como resultado más célulasque se transtornutran en la región de interés con poblaciones individuales (Figura 2) o múltiples de ARNm (Figura4).

La estabilidad del ARNm está altamente regulada y puede verse afectada por la poliadenilación, empalme, traducción, estructura secundaria y regiones no traducidas, por nombrar unas36,37. La vida media de arNM endógeno y sintetizado dentro de las células puede variar de minutos a días36,38. Utilizamos la recuperación de fluorescencia in vivo después del fotoblanqueo (FRAP) para blanquear las proteínas H2B-citrine codificadas con ARNm existentes y observamos la recuperación de fluorescencia H2B-citrine más apreciable durante las primeras 2 horas después de la electroporación (Figura5 y 6). Diferentes ARNM sin duda tendrán diferentes vidas medias basadas en su longitud, secuencias internas, 5' y 3' modificaciones36,37, por lo que cada uno debe ser saysayed si se desea.

Las imágenes vitales normalmente requieren un equilibrio entre las condiciones óptimas para la imagen de alta calidad y las imágenes rápidas y menos tóxicas39,40. En la toma de imágenes, es aconsejable utilizar la menor potencia láser posible para minimizar el fotoblanqueo y el fotodaño a las células embrionarias (ver notas para el paso 5.3 del protocolo)40. Alterar la configuración del microscopio para colecciones rápidas (por ejemplo, velocidades de escaneo más rápidas, menos promedio) a menudo puede ayudar sin perder la resolución de imagen necesaria41. Por último, se debe tener cuidado al manipular y manipular los embriones durante la cosecha, la electroporación y la toma de imágenes (ver paso 4). Los embriones en etapa temprana son delicados y pueden dañarse fácilmente.

En general, el tiempo preciso y la localización precisa de los experimentos de perturbación de electroporación de ARNm permiten perturbar que capitalizan la expresión rápida, la eficiencia de co-transfección y la rápida decadencia de las transcripciones de ARNm. La sobreexpresión o la expresión errónea de un gen de interés se puede lograr mediante la electroporación de ARNm sintetizados. La medición de la concentración para cada ARNm es crucial, ya que electroportar demasiado el ARNm puede causar toxicidad celular no específica, mientras que muy poco ARNm puede no etiquetar las células deseadas o inducir cambios fenotípicos adecuadamente. Una plétora de vectores generados para la síntesis in vitro de ARNm que codifican marcadores de fusión FP para visualización o productos genéticos alterados para perturbaciones de diversos procesos biológicos ya existen a partir de diversos sistemas de modelos animales. Muchas de estas construcciones diseñadas para la síntesis de ARNm in vitro se pueden obtener rápida y económicamente de repositorios de plásmido sin fines de lucro.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Agradecemos a David Huss por sus útiles ideas sobre este trabajo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Beca de Investigación de Verano de la Fundación Rose Hills (2016-2018) y la Beca de Investigación de Grado de USC Provost a M.T., el Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award to M.D., y la University of M.D., y la University of M.D., y la University of M.D., Premio al Programa de Asociados de Investigación de Grado del Sur de California a R.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

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References

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Biología del desarrollo número 148 electroporación de ARNm microscopía de lapso de tiempo codornices aviar embriones FRAP
Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm
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Tran, M., Dave, M., Lansford, R.… More

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

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