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Developmental Biology

एवियन भ्रूण में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59664
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

Summary

हम दूत आरएनए (mRNA) electroporation एक विधि है कि बटेर भ्रूण मॉडल प्रणाली में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति की अनुमति देता है के रूप में रिपोर्ट. इस विधि का उपयोग फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है और इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा विवो आंदोलनों में उनके रिकॉर्ड किया जा सकता है।

Abstract

हम रिपोर्ट करते हैं कि एमआरएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन फ्लोरोसेंट प्रोटीन को डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन की तुलना में अधिक तेजी से और मोटे तौर पर जीवित बटेर भ्रूणों में कोशिकाओं को लेबल करने की अनुमति देता है। उच्च transfection दक्षता कम से कम 4 अलग mRNAs $ 87% दक्षता के साथ सह-transfected होने के लिए अनुमति देता है। इलेक्ट्रोपोरेटेड एमआरनए के अधिकांश पहले 2 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान निम्नीकृत होते हैं, जिससे विकासशील भ्रूण में समय-संवेदी प्रयोगों को किया जा सकता है। अंत में, हम वर्णन कैसे गतिशील छवि लाइव भ्रूण mRNAs के साथ electroporated है कि विभिन्न subcellular लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेतिक संबंधों के लिए.

Introduction

इलेक्ट्रोपोरेशन एक भौतिक transfection विधि है कि एक विद्युत पल्स का उपयोग करता है प्लाज्मा झिल्ली में क्षणिक pores बनाने के लिए, न्यूक्लिक एसिड या रसायनों जैसे पदार्थों साइटोसोल में पारित करने के लिए अनुमति देता है. इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रयोग व्यापक रूप से डीएनए को बैक्टीरिया, खमीर, पौधों और स्तनधारी कोशिकाओं1,2,3में वितरित करने के लिए किया जाता है . यह नियमित रूप से विकास के आनुवंशिक नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए विकास के आनुवंशिक नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं और ऊतकों में आनुवंशिक पेलोड शुरू करने के लिए प्रयोग किया जाता है4,5,6, 7. हालांकि, कई प्रयोगात्मक सीमाओं भी डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन8के साथ मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, डीएनए इलेक्ट्रोपोरिओशन अक्सर प्रति सेल अभिव्यक्ति वैक्टर की अत्यधिक चर संख्या ओंकार और बाद में mRNAs और प्रोटीन वे सांकेतिक कोडित परिचय. यह परिवर्तनशीलता काफी सेल-सेल विषमता का कारण बन सकती है जोछवि विश्लेषण और डेटा व्याख्या 9,10दोनों को जटिल बना देती है। इसके अतिरिक्त, डीएनए इलेक्ट्रोपोरिशन से प्रोटीन केवल $ 3 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं और 12 एच तक सेल संख्या और फ्लोरोसेंट तीव्रता में अधिकतम दक्षता तक नहीं पहुंचते हैं, नाभिक में स्थानांतरित करने और पूरा करने के लिए आवश्यक समय के कारण होने की संभावना दोनों प्रतिलेखन और vivo11में अनुवाद |

इसके विपरीत, MRNA transfection प्रभावी ढंग से मॉडल प्रणालियों की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है, माइक्रोइंजेक्शन द्वारा Xenopus laevis oocytes सहित12,13,MRNA lipofectamine transfection 14 द्वारा मानव स्टेम कोशिकाओं reprogramming , और वयस्क चूहों में recalitant तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं15इलेक्ट्रोपोरेटिंग . हम mRNA electroporation की क्षमता का परीक्षण करने के लिए कुशलतापूर्वक जल्दी एवियन भ्रूण विकास के दौरान कोशिकाओं लेबल इन विट्रो संश्लेषित mRNAs कि अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेतिक संबंध में सांकेतिक संबंध रखने में उपयोग कर (FPs). हमारे अध्ययन के लिए, हम pCS2 + वेक्टर, एक बहुउद्देशीय अभिव्यक्ति वेक्टर है कि आमतौर पर Xenopus और ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है इस्तेमाल किया. चस2 में SP6 और T7 RNA पॉलिमरेज प्रवर्तक किसी भी क्लोन जीन से MRNA और प्रोटीन के संश्लेषण की अनुमति देते हैं जब इसका उपयोग इन विट्रो प्रतिलेखन/अनुवाद प्रणाली में किया जाता है।

यहाँ, हम प्रदर्शित करते हैं कि MRNA electroporation तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अनुमति देता है (FPs) गैस्ट्रेलट बटेर भ्रूण में. हमने इन अध्ययनों में प्रयुक्त कई अभिव्यक्ति सदिशों को डिजाइन और उत्पन्न किया है। उदाहरण के लिए, हमने जीवनक्रिया-इGFP जीन16 को पीसीएस2+ सदिश17 में सहयोजने से CMV प्रवर्तक तथा SP6 प्रवर्तक से अभिव्यक्त किया है। सम्मिलित जीन SP6 प्रवर्तक के नीचे और SV40 पाली (A) पूंछ18के ऊपर निहित है. एमआरएनए और डीएनए के साथ सह-इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूणों में, इन विट्रो ट्रांस्टेड एमआरएनए से एनकोड किए गए एफपी को पहले इलेक्ट्रोपोट्रेशन के 20 मिनट के भीतर पाया गया था, जबकि डीएनए अभिव्यक्ति वेक्टर से एफपी का पता केवल 3 घंटे के बाद पाया गया था, परमाणु, गोलगी, और के लिए एकाधिक MRNAs एन्कोडिंग के बाद झिल्ली प्रोटीन एक साथ एक भ्रूण में electroporated किया जा सकता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं में कई प्रोटीन की त्वरित और कुशल अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप. अंत में, photobleaching (FRAP) परख के बाद एक में विवो फ्लोरोसेंट वसूली का उपयोग कर, हम बताते हैं कि इलेक्ट्रोपोरेटेड mRNAs क्षय के बहुमत 2 ज के भीतर. इस प्रकार, तेजी से प्रारंभिक प्रोटीन उत्पादन सीमित नए प्रोटीन अनुवाद के साथ संयुक्त MRNA इलेक्ट्रोपोर्शन एक मूल्यवान तकनीक बनाता है जब अभिव्यक्ति के लौकिक नियंत्रण आवश्यक है.

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं बच्चों के अस्पताल लॉस एंजिल्स और दक्षिणी कैलिफोर्निया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के विश्वविद्यालय से अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया.

1. पीढ़ी pCS2 आधारित अभिव्यक्ति वेक्टर

  1. pCS2.Lifeact-eGFP क्लोन करने के लिए, pCS2.CycB1-GFP के 2 $g पचाने के द्वारा वेक्टर रीढ़ तैयार (एक निर्माण एक अलग डालने युक्त) BamHI के साथ (10 यू) और BsrGI (10 यू) उचित पाचन बफर में (सामग्री की तालिका देखें) एक कुल प्रतिक्रिया में 1x करने के लिए पतला 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 h के लिए 50 डिग्री सेल्सियस की मात्रा (क्लोनिंग प्रक्रिया के योजनाबद्ध के लिए चित्र 1 देखें)।
    1. श्रिम्प क्षारीय फॉस्फेट (1 उ) जोड़कर प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया से वेक्टर रीढ़ की हड्डी के मुक्त 3'OH सिरों को डिफॉस्फोरेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    2. एक 1% agarose जेल में पूरे मिश्रण चलाने के लिए /1x Tris एटेट EDTA (TAE) बफर पर 90 V के लिए $ 50 मिनट और फिर एक 0.5 g/ इसके अलावा, डीएनए आकार निर्धारित करने में मदद करने के लिए एक मुक्त लेन में आणविक वजन मार्करों लोड करने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. एक डीएनए सुरक्षित यूवी Transilluminator का उपयोग करने के लिए nicking DNAs से बचने के लिए, जल्दी से agarose जेल से वेक्टर रीढ़ की हड्डी (अपेक्षित बैंड आकार) में कटौती और एक जेल शोधन किट का उपयोग कर जेल टुकड़ा से डीएनए टुकड़ा अलग निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर.
  2. इसके साथ ही चरण 1-1 के साथ, पीईजीएफपी-एन1-लाइफैक्ट के 2 डिग्री ग्राम को, BGLII (10 उ) और BsRGI (10 उ) के साथ, उपयुक्त पाचन बफर में 1x को पतला करके सम्मिलित करें, जो कि 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए 50 डिग्री सेल्सियस की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में 1 x को पतला करता है। एक 1% agarose जेल में पूरे मिश्रण चलाने के लिए 800 बीपी बैंड को अलग के रूप में पहले चरण में समझाया 1.1.2-1.3.
  3. सदिश और सम्मिलित दोनों को प्रवर्तक प्रकाशमापी पर शुद्ध और परिमाणित करने के बाद, लिगेशन अभिक्रिया को उत्प्रेरित करने के लिए टी 4 डीएनए लिगेज बफर में ट4 डीएनए लिगेज जोड़ने से पहले वेक्टर के 50 एनजी और सम्मिलित करने का 38 एनजी (1:3 मोलर अनुपात सम्मिलित करने के लिए) को संयोजित करें। साथ ही, कोई डीएनए नियंत्रण, एक वेक्टर केवल नियंत्रण, और सम्मिलित करें केवल नियंत्रण सेट करें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सभी प्रतिक्रियाओं इनक्यूबेट।
    1. लिगेशन मिश्रण (एस) के 1 डिग्री एल को सक्षम ई. कोलाई डीएच 10 में बदलना। इसके अलावा, पानी केवल नकारात्मक नियंत्रण और pUC19 सकारात्मक नियंत्रण के 20 pg बदलना. लुरिया ब्रोथ (एलबी) आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया फैलाएं जिनमें 50 ग्राम/एमएल एम्पसिलिन और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है।
    2. अगले दिन सुबह, प्रत्येक थाली पर कालोनियों गिनती.
      नोट: आदर्श रूप में, नकारात्मक नियंत्रण प्लेटों पर कोई उपनिवेश नहीं होना चाहिए, वेक्टर पर 100 कॉलोनियां+ सम्मिलित लिगेशन प्लेट, और वेक्टर-केवल प्लेट पर कम कालोनियों।
    3. वेक्टर + इन्सर्ट लिगेशन मिश्रण के साथ परिवर्तित एगार प्लेट से कम से कम 8 जीवाणु कालोनियों को चुनें और उन्हें बाँझ टूथपिक या पाइप टिप्स का उपयोग करके 2 एमएल तरल एलबी शोरबा में टीका करें जिसमें 50 ग्राम/एमएल एम्पिसिलिन होता है।
    4. वाणिज्यिक प्लाज्मिड miniprep किट का उपयोग क्लोन में से प्रत्येक से डीएनए निकालें.
    5. एक नैदानिक प्रतिबंध डाइजेस्ट नोटI का उपयोग कर प्रत्येक क्लोन से डीएनए के 500 एनजी का उपयोग चलाने (10 यू) और BamHI (10 यू) उचित पाचन बफर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 1x करने के लिए पतला और 1x TAE बफर में एक 1% agarose जेल पर पचा डीएनए चलाते हैं। pCS2.Lifeact-eGFP सकारात्मक क्लोन के लिए अपेक्षित बैंड आकार 3.9 kb और 978 बीपी हैं.
    6. सक्षम ई. कोलाई DH10 में सकारात्मक क्लोन से डीएनए के 1 pg-100 एनजी रूपांतरण, और पिछले चरणों में विस्तृत के रूप में 3-4 miniprep प्रतिक्रियाओं तैयार करने में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए डीएनए की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए (10 g न्यूनतम).

2. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा एमआरएनए की तैयारी

  1. एक उपयुक्त पाचन बफर में 1x करने के लिए पतला के साथ सम्मिलित करने के 3' अंत पर pCS2.LifeAct-eGFP के 10 डिग्री g linearize 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर.
    नोट: RNase संदूषण को रोकने और MRNA गिरावट को कम करने के लिए, जबकि MRNA नमूने से निपटने दस्ताने पहनते हैं.
  2. फीनॉल के मिश्रण का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल (25:24:1, v/
    1. 200 र्ल के बराबर पाचन अभिक्रिया के कुल आयतन को बनाने के लिए 150 र्ल आरनेस-मुक्त जल जोड़ें। फिर, फीनॉल के 200 डिग्री सेल्सियल जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल और भंवर मिश्रण के लिए 20 s.
    2. 2 मिनट के लिए अधिकतम गति (18,400 x g) पर माइक्रोफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज, रेखीय डीएनए वाले शीर्ष जलीय चरण को सावधानीपूर्वक निकालें। अतिरिक्त अशुद्धियों को दूर करने के लिए इस चरण को दोहराएँ और नीचे और शीर्ष तरल चरणों के बीच बन ने सफेद वेग को बाधित न करने के लिए सावधान रहें।
  3. 1/10 मात्रा 3M सोडियम एसीटेट (RNase मुक्त) और 100% इथेनॉल के 2.5 संस्करणों को जोड़कर रैखिकीकृत डीएनए की तैयारी करें। मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें और 30 मिनट के लिए, फिर अधिकतम गति (18,400 x ग्राम) पर अपकेंद्रण द्वारा डीएनए को गोली दें।
    1. 70% इथेनॉल के साथ डीएनए गोली धो लें, तो हवा सूखी गोली के लिए gt;5 मिनट.
    2. डीएनए गोली को RNase-मुक्त पानी के 5 डिग्री एल में भंग करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: अपेक्षित डीएनए सांद्रता 1.7-2.0 के बीच ए260/ए280 अनुपात के साथ $0.5-1$g/
  4. इन विट्रो प्रतिलेखन (आईवीटी) के लिए रैखिकीकृत pCS2.LifeAct-eGFP डीएनए के 1 $g का उपयोग करें। वाणिज्यिक किट में निर्माता के निर्देशों का पालन करें (सामग्री की तालिका देखें) टोपी एनालॉग के 10 डिग्री एल (अंतिम एकाग्रता 0.8 एमएम) और NTPs (अंतिम एकाग्रता एटीपी, CTP, और TTP के लिए 1 एमएम; GTP के लिए 0.2 एमएम), 10x प्रतिक्रिया बफर के 2 $L (अंतिम एकाग्रता) 1x), SP6 आरएनए पॉलिमरेज के 2 डिग्री एल, और RNase मुक्त पानी अप करने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस.
    1. प्रतिलिपि आकार के आधार पर, लगभग 2 ज या उससे अधिक समय के लिए IVT मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
      नोट: 2 एच ऊष्मायन एक 3 केबी प्रतिलिपि के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन रात भर ऊष्मायन 5 kb से अधिक हैं कि प्रतिलिपि के लिए बेहतर काम करता है.
    2. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया से मुक्त न्यूक्लिओटाइड को हटाने के लिए, MRNA वेग करने के लिए लिक्ल आरएनए वर्षण समाधान (7.5 एम लिथियम क्लोराइड, 50 एमएम EDTA) के 30 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। मिश्रण को संक्षेप में घुमाएं और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अधिकतम गति (18,400 x ग्राम)पर माइक्रोफ्यूज में 15 मिनट के लिए MRNA को स्पिन करें और 70% इथेनॉल (RNase-मुक्त) के साथ कुल्ला करें।
  5. संश्लेषित MRNA में भंग 15 $L RNase मुक्त पानी की. संश्लेषित MRNA को 5 डिग्री सेल्सियस/ट्यूब (3 ट्यूब कुल) पर वितरित करें तथा दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थान दें। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ MRNA क्वांटिट करें।
    नोट: अपेक्षित उपज एम आर ए एन ए ($1 ग्राम/जेडएल) की 15-20 ग्राम है। 1 ख्0एल (1 ग्राम/जेडएल) 10 भ्रूणों के साथ प्रयोग के लिए पर्याप्त है, यह मानते हुए कि एमआरएनए 1 ग्राम/जेडएल से 500 एनजी/जेडएल तक पतला होता है और प्रत्येक भ्रूण को 200 एनएल के साथ इंजेक्ट किया जाता है। प्रत्येक ट्यूब, इसलिए, $ 5 प्रयोगों के लिए पर्याप्त MRNA होना चाहिए.
  6. RNase decontamination समाधान के साथ सभी जेल उपकरणों की सफाई के बाद 1x TAE बफर में एक 1% agarose जेल पर MRNA के $ 300 एनजी चलाने के लिए (जैसे, RNase दूर) और सुनिश्चित करें कि MRNA एक बैंड के रूप में प्रकट होता है (एकाधिक बैंड अगर माध्यमिक संरचनाओं फार्म मौजूद हो सकता है) और है कि कोई धब्बा एक जेल लेन में ppears, जो आरएनए गिरावट इंगित करता है.

3. MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन मिक्स की तैयारी

  1. इस कार्य में परीक्षण किए गए सभी एमआरएनए के लिए आरएनसे-मुक्त जल में वांछित सांद्रता (250-500 एनजी/जेडएल) पर थ्वर और पतला एमआरएनए अच्छी तरह से काम करता है। रंगीन डाई की 1/10 मात्रा जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें, RNAse मुक्त, 0.1% अंतिम एकाग्रता) MRNA इंजेक्शन साइट कल्पना में मदद करने के लिए और ठीक से इलेक्ट्रोड जगह.
    नोट:     यदि डीएनए और आरएनए को सह-इलेक्ट्रोपोकेशन करने के लिए संयोजित किया जाता है, तो यह सुनिश्चित करें कि डीएनए MRNA और डीएनए मिश्रण से पहले फीनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा का उपयोग करके RNases को दूषित करने से मुक्त है।
    1. एक नकली का उपयोग कर एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें (कोई आरएनए जोड़ा) इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान. यदि संभव हो, पूर्व मान्य MRNA (mRNA जो पिछले प्रयोगों में सफलतापूर्वक FP का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है) का उपयोग कर एक सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें.
      नोट: सभी इमेजिंग प्रयोगों के लिए डेटा के सामान्यीकरण के लिए पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट स्तर स्थापित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण आवश्यक है। सकारात्मक नियंत्रण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब नए लिखित MRNA के साथ काम करने की पुष्टि करने के लिए मदद करके कि electroporation सेटिंग्स काम किया.
  2. एक बर्फ घोल पर MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन समाधान स्टोर गिरावट को रोकने के लिए जब तक इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार है।

4. रहने वाले बटेर भ्रूण में इलेक्ट्रोपोरेट mRNAs

  1. ताजा रखी निषेचित बटेर अंडे दैनिक ले लीजिए और अब 1 सप्ताह से अधिक के लिए एक आर्द्र रेफ्रिजरेटर में 13 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। बटेर के अंडों को वांछित भ्रूणीय विकास चरणों19,20,21तक इन्क्यूबेट करें .
    नोट: HH3 करने के लिए HH5 दोनों स्थिर और गतिशील इमेजिंग के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. HH3 भ्रूण के लिए, 2 एच कटाई से पहले के लिए कमरे के तापमान पर अंडे छोड़ने अलगाव प्रक्रिया बहुत आसान बनाता है के रूप में भ्रूण आम तौर पर शारीरिक जोड़तोड़ के लिए अधिक प्रतिरोधी रहे हैं जब ठंडा.
  2. अलग करना और चुनाव आयोग संस्कृति प्रणाली के अनुसार भ्रूण तैयार22. प्रति शर्त कम से कम 5 भ्रूण ले लीजिए, कम से कम एक सहित एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए (इलेक्ट्रोपोरेटेड नहीं).
    1. धीरे से तोड़ने के लिए और एक 10 सेमी पेट्री पकवान में अंडे डालना. एक हस्तांतरण pippette के साथ मोटी एल्बुमिन के बहुमत निकालें और धीरे एक ऊतक पोंछ के साथ जर्दी की सतह पोंछते द्वारा भ्रूण के चारों ओर शेष मोटी एल्बुमिन निकालें सुनिश्चित करने के लिए कि भ्रूण कागज की अंगूठी को कसकर चिपक जाती है.
    2. भ्रूण पर प्रीकट फिल्टर पेपर (सामग्री की तालिकादेखें) रखें और भ्रूण की परिधि के चारों ओर आसानी से कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    3. पीबीएस के साथ भ्रूण को अंडरली करने के लिए एक पेस्टर पिपेट का उपयोग करें, भ्रूण से चिपके हुए किसी भी जर्दी को खाली करने के लिए कोमल धाराओं का उपयोग करें।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है जब युवा के साथ काम कर (और lt;HH3) भ्रूण क्योंकि इन भ्रूण जर्दी के लिए और अधिक छड़ी करते हैं और अक्सर बाद में धोने के चरणों के दौरान vitelline झिल्ली से अलग होगा.
    4. धीरे-धीरे भ्रूण/कागज की अंगूठी को एक तिरछी कोण पर ऊपर और जर्दी को आगे की सफाई के लिए पीबीएस से भरे एक पेट्री डिश में खींचते हैं। एक बार जर्दी के अधिकांश हटा दिया गया है, एक 35 मिमी पेट्री डिश agar/
  3. कांच के माइक्रोपिपेट पुलर उपकरण का उपयोग करके छह से आठ से आठ सेमी लंबे कांच के माइक्रोकैपिलरी (ओ.डी. $ 1.2 मिमी)।
  4. पीबीएस से भरे इलेक्ट्रोपोरेशन चैम्बर में भ्रूण अधर पक्ष रखें। एक ग्लास माइक्रोकैपिलरी का उपयोग करके, वांछित क्षेत्र को कवर करने वाले एपिब्लास्ट और विटेललाइन झिल्ली के बीच गुहा में एमआरएनए या डीएनए/एमआरएनए इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण के 200 एनएल के एक बोलस को इंजेक्ट करें।
    नोट: पेलुसिडा के लिए संपूर्ण पूर्वकाल क्षेत्र और ओपाका के लिए कुछ क्षेत्र को इस पांडुलिपि में दिखाए गए अधिकांश प्रयोगों में विद्युतीकृत किया गया था।
  5. क्रमशः भ्रूण के ऊपर और नीचे पर सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड (प्लेटिनम फ्लैट वर्ग इलेक्ट्रोड; पक्ष लंबाई 5 मिमी) रखें और निम्नलिखित पल्स अनुक्रम का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेट करें: 5 ट, 5 ट के पांच वर्ग विद्युत दालें, 100 एमएस अंतराल के साथ 5 वर्ग विद्युत दालें एक में विवो इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग कर. यह सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोडों के बीच की दूरी $5 उउ है।
    नोट: इलेक्ट्रोपोट्रेशन मापदंडों को अनुकूलित करना नाजुक भ्रूण कोशिकाओं को मारने की स्थिति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। वोल्टेज के पैरामीटर, पल्स लंबाई, पल्स अंतराल, और डीएनए और MRNA के लिए दालों की संख्या विभिन्न विद्युत उपकरणों के लिए विचार किया जाना चाहिए.
  6. इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूणों को वांछित विकास खंड में 38 डिग्री सेल्सियस पर इन्क्यूबेट करें।
    नोट: एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन स्टीरियोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें) transfected बनाम गैर transfected भ्रूण स्क्रीन करने में मदद करता है.
  7. यदि भ्रूणों को स्थिर रूप से छवि बनानी है, तो उन्हें पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में कमरे के तापमान पर 1 एच या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
    1. कैंची के साथ फिल्टर पेपर की परिधि के चारों ओर आसानी से काटने और धीरे तेज बल के साथ पृष्ठीय सतह पर चमकदार झिल्ली छीलने द्वारा vitelline झिल्ली से भ्रूण निकालें।
    2. PBS/Triton में निश्चित भ्रूण धो लें (0.1%) 5 मिनट के लिए 2x और situ संकरीकरण या इम्यूनोस्टेनिंग में अगर वांछित के साथ जारी रखें।
    3. अंत में, पीबीएस/ट्रिटन में 0.5 ग्राम/जेडएल डीएपीआई में भ्रूण को दागा जाता है (0.1%) कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए. पीबीएस/ट्रिटन 2x में भ्रूण को 5 मिनट के लिए धोएं और स्केल-यू2 समाधान23 रात में भ्रूण को साफ करें।
  8. इलेक्ट्रोपोरोनेशन की दक्षता का विश्लेषण करने के लिए (चित्र 2देखें), छवि में सभी कोशिकाओं से परमाणु रूपरेखा प्राप्त करने के लिए ImageJ पर बाइनरी और कण विश्लेषण उपकरण और DAPI चैनल का उपयोग करें।
    1. ImageJ पर बाइनरी उपकरण का उपयोग करने के लिए, DAPI चैनल में एक एकल z-slice का उपयोग करें जिसमें अधिकांश कक्ष हैं और क्लिक करें प्रक्रिया gt; बाइनरी करें बाइनरी. आस-पास के कक्षों को अलग करने के लिए, प्रक्रिया पर क्लिक करें और बाइनरी और वाटरशेडपर क्लिक करें। विश्लेषण पर क्लिक करके सेल रूपरेखा प्राप्त करें , कणों का विश्लेषण करें, आकार 100-500 पर सेट ($m2)।
    2. सुनिश्चित करें कि अधिकांश कक्ष DAPI चैनल में रेखांकित किए गए हैं और ROI प्रबंधक पॉप-अप विंडो पर अधिक और सहेजें क्लिक करके कक्ष बाह्यरेखाएँ सहेजें.
    3. MRNA या DNA चैनल में पहले से सहेजी गई फ़ाइल को किसी एकल z-स्लीप पर खोलकर MRNA और DNA चैनल के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता मान प्राप्त करने के लिए इन बाह्यरेखाओं का उपयोग करें और फिर ROI प्रबंधक पर मापें क्लिक करें.
    4. अंत में, इन तीव्रता मानों को फ़िल्टर करें, के साथ कोशिकाओं की गिनती और 6,000 फ्लोरोसेंट तीव्रता गैर-transfected के रूप में और साथ कोशिकाओं के साथ gt; 6,000 फ्लोरोसेंट तीव्रता transfected के रूप में.

5. छवि FPs Electroporated MRNAs द्वारा एनकोड

  1. फ्लोरोसेंट विच्छेदन स्टीरियोस्कोप के तहत सभी इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण को देखने के बाद गतिशील इमेजिंग प्रयोगों के लिए स्वास्थ्यप्रद और सबसे अच्छा इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण चुनें।
    1. प्रयोग के दौरान इस भ्रूण की मृत्यु होने की स्थिति में चुने गए भ्रूण को एक अलग इनक्यूबेटर में अन्य इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण और गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण (नकारात्मक नियंत्रण) को इनक्यूबेट करना जारी रखें।
  2. गतिशील इमेजिंग के लिए, पूरे-माउंट पूर्व ओवो एवियन भ्रूण संस्कृति का उपयोग करें जैसा कि पहले24,25,26 को एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप के साथ वर्णित किया गया है।
    नोट:     माइक्रोस्कोप एक मंच पर इनक्यूबेटर से सुसज्जित है (सामग्री की मेजदेखें) जो इमेजिंग के दौरान 36 डिग्री सेल्सियस तापमान बनाए रखता है। माइक्रोस्कोप सेट-अप के दौरान यह देखा गया कि 36 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए गए भ्रूण उच्च तापमान की तुलना में लंबे समय तक जीवित रहते हैं, संभवतः इसलिए कि लेजर भ्रूण पर स्थानीय हीटिंग का कारण बन सकता है। पाठकों को अपने माइक्रोस्कोप सेट-अप के लिए इष्टतम ऑन-स्टेज ऊष्मायन तापमान का निर्धारण करना चाहिए।
    1. गतिशील छवि और भ्रूणजनन कल्पना करने के लिए, PBS के साथ संक्षेप में electroporated भ्रूण को साफ करने के लिए किसी भी बुलबुले कि एक PBS साफ में संदंश का उपयोग कर के आसपास भ्रूण ले जाकर इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया के दौरान भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष पर फार्म कर सकते हैं हटाने के लिए समाधान.
    2. साफ भ्रूण को सीधे एक इमेजिंग डिश पर रखें जिसमें एल्बुरेन-आगर ($150 डिग्री सेल्सियस) की पतली परत होती है, जिससे यह सुनिश्चित हो जाता है कि भ्रूणकीपृष्ठीय सतह पर कोई बुलबुले उत्पन्न न करें।
    3. लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए, इमेजिंग डिश के अंदर किनारों पर टिशू पेपर का एक छोटा सा नम लुढ़का हुआ टुकड़ा जोड़ें और इमेजिंग और इनक्यूबेशन के दौरान वाष्पीकरण को कम करने के लिए पैराफिन फिल्म का उपयोग करके पकवान को सील करें।
    4. इस व्यंजन को एक confocal माइक्रोस्कोप के पूर्व-वार्म्ड चरण में जल्दी से ले जाएँ और ब्राइटफील्ड चैनल (पीएमटी लेजर 20%) का उपयोग करके भ्रूण में रंगीन डाई का पता लगाएं, जो इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्र की पहचान करता है।
  3. वांछित उद्देश्य के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर सेट (10 या 20x), dichroic दर्पण (488 एनएम GFP एनएम के लिए, RFP के लिए 561), उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (499-562 एनएम GFP के लिए, 570-695 एनएम आरएफपी के लिए), और एक उपयुक्त लेजर पर बारी (488 एनएम GFP के लिए, 561 एनएम आरएफपी के लिए).
    नोट:     इलेक्ट्रोपोरेटेड एमआरएनए का प्रोटीन में अनुवाद किया गया जो 20 मिनट के भीतर देखा गया था (चित्र 3देखें)। इस कागज में अधिकांश छवियों के लिए उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग मेटाडेटा थे: 20x उद्देश्य के साथ एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें); पिक्सेल रहने का समय, $1.5$s; 4-लाइन स्कैन का मतलब है।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर लाइव क्लिक करें और प्रत्येक माइक्रोस्कोप लेजर शक्ति के आधार पर फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए उपयुक्त है कि एक सेटिंग के लिए लेजर शक्ति को समायोजित. 1% लेजर शक्ति, 800 लाभ का उपयोग कर भ्रूण इमेजिंग द्वारा शुरू, और संतृप्त पिक्सल देखा जाता है जब तक 1% वेतन वृद्धि से लेजर शक्ति धीरे धीरे वृद्धि.
    2. लेजर शक्ति थोड़ा कम जब तक कोई संतृप्त पिक्सल अब और देखा जाता है द्वारा इस का पालन करें.
      नोट: एक भ्रूण के एक इमेजिंग सत्र की शुरुआत के लिए चुना लेजर शक्ति पहले समय अंक के लिए अच्छा हो सकता है, लेकिन बाद में समय अंक पर आदर्श नहीं अगर कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट समय के साथ बहुत उज्जवल या dimmer हो जाता है. इसपर भ्रूण को थोड़ा कम विद्युत सेटिंग्स पर छवि करें क्योंकि इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाएं आम तौर पर इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद पहले 6 घंटों में उज्जवल हो जाती हैं (संकेत वृद्धि के परिमाणीकरण के लिए चित्र 3A-E देखें)। यदि बाद में छवियों संतृप्त कर रहे हैं, मूल इमेजिंग सेटिंग्स के साथ छवि के लिए जारी है, लेकिन एक अतिरिक्त छवि के तुरंत बाद कमजोर इमेजिंग सेटिंग्स (छोटे pinhole या कमजोर लेजर शक्ति) के साथ ले.
    3. विभिन्न समय बिंदुओं पर अलग-अलग सेल प्रवास को ट्रैक करने के लिए भ्रूण को हर 3-5 मिनट में छवि करें। इस काम के लिए, छवियों थे z-स्टैक ($50 $m मोटी) पूरे electroporated क्षेत्र के, प्लस z-स्टैक के नीचे की ओर कुछ अतिरिक्त कमरे के मामले में भ्रूण इमेजिंग सत्र भर में agarose बिस्तर में डूब.
    4. निरीक्षण कितनी तेजी से कोशिकाओं पहली फिल्म के पहले कुछ समय अंक की जाँच करके आगे बढ़ रहे हैं. यदि कोशिकाओं को एक तेज दर से आगे बढ़ रहे हैं (मतलब है कि वे एक दो और समय अंक के भीतर छवि क्षेत्र के क्षेत्र से बाहर निकल जाएगा), छवि क्षेत्र के ज़ूम विस्तार पर विचार (1x $ 0.8x) या एक अलग क्षेत्र इमेजिंग.
      नोट: क्षेत्र में भ्रूण क्षेत्र pellucida क्षेत्र opaca में उन लोगों की तुलना में अधिक तेजी से चलते हैं. इसके अतिरिक्त, युवा भ्रूण (HH3, HH5) अक्सर कोशिकाओं है कि पुराने भ्रूण की तुलना में अधिक तेजी से आंदोलन के दौर से गुजर रहे हैं होते हैं (gt; HH7).
    5. भ्रूण के इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्र को इमेजिंग करने के बाद, ऑटोफ्लोरेसींस के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक ही भ्रूण के एक गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्र की छवि (कम लेजर पावर और lt;10% भ्रूण की छवि के लिए उपयोग किया जाता है, तो कम से कम होना चाहिए)।

6. Fluorscence वसूली के बाद Photobleaching (FRAP) परख MRNA अखंडता के लिए

नोट: photobleaching के बाद एक विवो फ्लोरोसेंट वसूली में (FRAP) परख निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कितनी देर तक transfected MRNA FPs में अनुवाद किया जा सकता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल H2B के आधे जीवन का पता लगाने के लिए एक FRAP प्रयोग रूपरेखा. एक इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण में सिट्रीन एम.आर.एन.ए.

  1. एक 20x 0.8 एनए उद्देश्य और एक पूरी तरह से खुला pinhole का उपयोग कर उल्टे confocal माइक्रोस्कोप पर FRAP प्रयोगों प्रदर्शन.
    1. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर H2B-Citrine के इलेक्ट्रोपोट्रन की पुष्टि करने और उल्टे confocal माइक्रोस्कोप पर पूर्व गर्म मंच पर भ्रूण की स्थापना के बाद (चरण 5.2.4 देखें), समय की एक किस्म में H2B-Citrine से सेलुलर फ्लोरोसेंट के सबसे photobleach अंक (45 मिनट, 2 एच, और 5 एच के बाद electroporation) 70% लेजर शक्ति के साथ 405 एनएम लेजर का उपयोग करके, 100 पुनरावृत्तियां, स्कैन गति 4, जो फ्लोरोसेंट के केवल 5% शेष छोड़ देता है.
      नोट: इस प्रक्रिया में कुछ मिनट लग जाने चाहिए.
    2. फोटोब्लीकिंग के बाद 36 डिग्री सेल्सियस पर मंच पर भ्रूण ों को इनक्यूबेट करना जारी रखें।
  2. फोटोब्लीच्ड क्षेत्र के भीतर सक्रिय रूप से कोशिकाओं को विभाजित करने पर ध्यान देना सुनिश्चित करें, जो संकेत मिलता है कि photobleached कोशिकाओं को पूरी तरह से उपचार के बाद नहीं मर गया है।
  3. पोस्ट-ब्लीच छवियों (z-स्टैक्स इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्र के) को प्राप्त करने के लिए अप करने के लिए 30 मिनट नियमित समय अंतराल पर (3 या 5 मिनट) confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर.
    नोट: यदि उपलब्ध हो, photobleached क्षेत्र में सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ट्रांसजेनिक H2B-XFP लाइन का उपयोग करें. विद्युत porated MRNA द्वारा इनकोडिंग FP के लिए फ्लोरोसेंट वसूली की दर में कमी करनी चाहिए, लेकिन है कि transgene के माध्यम से इनकोडिंग FP के लिए पूरी फिल्म भर में संगत रहना चाहिए.
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि इमेजिंग स्थितियां भ्रूण के जीवित रहने को हानिकारक रूप से प्रभावित न करें, समवर्ती इनक्यूबेट इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण जो फोटोब्लीच्ड नहीं हैं, जो इमेजिंग के लिए एक नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं।
  5. MRNA क्षय के बाद electroporation के लिए photobleaching परिणाम ों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, समय के साथ सेल फ्लोरोसेंट ट्रैक (3 या 5 मिनट) केंद्र के फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के द्वारा (एक 7.5 डिग्री चक्र) ImageJ का उपयोग कर प्रत्येक सेल. photobleached क्षेत्र है कि mitosis के दौर से गुजर नहीं रहे हैं और पूरी तरह से photobleached किया गया है के भीतर सभी कोशिकाओं के लिए इस उपाय.
    नोट: परिमाणीकरण से माइटोटिक कोशिकाओं को हटाने पर विचार करें क्योंकि माइटोटिक नाभिक में क्रोमैटिन संघनन के कारण अंतरकला नाभिक की तुलना में अधिक श्वसन होता है।
  6. समय अंक (45 मिनट, 2 ज, और 5 ज) की एक किस्म पर समय के बाद ब्लीच पर फ्लोरोसेंट तीव्रता प्लॉट।

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Representative Results

MRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन डीएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन की तुलना में अधिक कुशल है

हम pCS2 + इस्तेमाल किया. एच 2 बी-सिट्रीन इन विट्रो लिखित एम.आर.ए.एन.ए. चूंकि डीएनए इलेक्ट्रोपोरिओशन आमतौर पर 1-2 g/$L पर किया जाता है, हमने mrna इलेक्ट्रोपोर्नेशन के लिए MRNA के लिए 0.25-0.5 g/$L के आस-पास की गणना की है। हमने सबसे पहले pCS2+ की इलेक्ट्रोपोट्रेशन दक्षता का परीक्षण किया। H2B-Citrine डीएनए H2B-Citrine MRNA की तुलना में (पीसीएस 2 + के SP6 प्रमोटर से लिखित इन विट्रो में)। H2B-Citrine) द्वारा विद्युत ीकरण डीएनए या MRNA अलग से HH5 बटेर भ्रूण में तो 12 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन पर विद्युत अपघटन दक्षता की जांच. यद्यपि डीएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन कुछ इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं में उज्जवल फ्लोरोसेंट की ओर जाता है, डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन की दक्षता व्यापक रूप से व्यक्त एमआरएनए एनकोडेड एफपीएस की तुलना में कम थी (चित्र 2ए औरबी)।

इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल में अंतर्निहित भ्रूण-से-भ्रूण परिवर्तनशीलता के लिए खाते में, MRNA एन्कोडिंग H2B-Citrine और डीएनए व्यक्त H2B-mKate2 के एक समसूत्री संयोजन HH5 भ्रूण के बहिर्चर्म में विद्युतीकृत किया गया था और मनाया 12 ज पश् च-विद्युतीकरण। एक ही भ्रूण में डीएनए और एमआरएनए सह-इलेक्ट्रोपोकेशन की तुलना करते समय, एफपी व्यक्त करने वाला डीएनए भी एमआरएनए की तुलना में काफी और लगातार कम कुशल था (चित्र 2च)। केवल एम आर एन ए, डीएनए, या दो के संयोजन के साथ विद्युतीकृत सभी भ्रूणों की मात्रा निर्धारित करके, हमने पाया कि किसी दिए गए क्षेत्र में एमआरएनए ट्रांसफेक्ट्स $75% कोशिकाओं का ट्रांसफेक्ट्स, जबकि डीएनए किसी दिए गए क्षेत्र में कोशिकाओं का केवल ट्रांसफेेक्ट्स $25% है (चित्र 2D)। MRNA या डीएनए द्वारा इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति में प्रसार सभी सह विद्युतीकृत भ्रूणों में काफी अलग नहीं था (चित्र 2E)।

प्रोटीन अभिव्यक्ति डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन की तुलना में MRNA इलेक्ट्रोपोर्नेशन में तेज है

ट्राफ्रैक्ड एमआरएनए को प्रोटीन का उत्पादन तेजी से करना चाहिए क्योंकि इसे साइटोसोलिक अनुवाद मशीनरी द्वारा तुरंत पहचाना जा सकता है जैसा कि चित्र 3में देखा गया है . डीएनए नाभिक के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए, प्रतिलेखन, और MRNA cytosol जहां यह cytosolic अनुवाद मशीनरी द्वारा मान्यता प्राप्त है, और अधिक समय लेने की उम्मीद करने के लिए वापस ले जाया. सीधे प्रोटीन उत्पादन के डीएनए अभिव्यक्ति दरों की तुलना करने के लिए, हम समय पाठ्यक्रम प्रयोगों की एक श्रृंखला है जिसमें हम सह-इलेक्ट्रोपोरेटेड डीएनए के एक सममोलर संयोजन (pCMV.H2B-mKate2) और MRNA (H2B-Citrine) HH5 भ्रूण के बहिर्चर्म में किया. हमने 22 मिनट के बाद के आस-पास MRNA-एनकोडेड FP व्यंजक का पता लगाया, जो $6 h के लिए सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता में बढ़ता जा रहा है (चित्र 3A-E, पूरक. मूवी S1b). इसके विपरीत, डीएनए-एनकोडेड एफपी अभिव्यक्ति को सबसे पहले $1.5 h पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्र 3A'-E', पूरक पर देखा जाता है। मूवी S1c) और 6 एच जब तक फिल्म बंद कर दिया गया था चमक में बढ़ती जारी है. क्योंकि डीएनए इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को 6 एच मार्क से संतृप्त किया गया था, इसलिए हमने इस स्थिति को कमजोर इमेजिंग स्थितियों के साथ पुनः निर्धारित किया था (चित्र 3 एफ-एफ')। इस समय चूक के सभी समय बिंदुओं के पार (22 मिनट से 6 एच), MRNA डीएनए से कई गुना अधिक कोशिकाओं transfects(पूरक. मूवी S1a, ब्राइटफील्ड और DAPI के माध्यम से विद्युत पोर्शन की कुल दक्षता नहीं दिखाया जाता है क्योंकि इन छवियों को एक जंगली प्रकार बटेर भ्रूण के एक समय चूक से लिया जाता है). इस आधार पर, हम निष्कर्ष है कि MRNA विद्युत पोट्रेशन पहले व्यक्त प्रोटीन की ओर जाता है.

एकाधिक mRNAs के सह-विद्युतीकरण अत्यधिक कुशल है

इसके बाद, हमने कई एमआरएनए को ब्याज के क्षेत्र में विद्युतीकरण करके एमआरएनए इलेक्ट्रोपोरेटिंग की दक्षता का परीक्षण करने की मांग की। एकाधिक DNAs के सह-इलेक्ट्रोपोट्रेशन पहले अपेक्षाकृत अक्षम होने के लिए दिखाया गया था, बहु लेबल की संख्या के साथ दिखा रहा है 25%, 14%, और 10% के लिए 2, 3, और 4 डीएनए निर्मित electroporated, कोशिकाओं की कुल संख्या के अनुपात के रूप में गणना11 . हम पहले विद्युतीकृत दो mRNAs कि वर्णक्रमीय विशिष्ट FPs सांकेतिक शब्दों में बदलना (Turcoise2-Golgi/H2B-Citrine) HH5 भ्रूण में और सभी विद्युतीकृत क्षेत्रों में उच्च transfection दक्षता प्राप्त की. हम इस डबल electroporation का इस्तेमाल किया क्षेत्र pellucida और एक HH4 gastrulating भ्रूण में opaca के बीच रेडियल विस्तार की फिल्मों पर कब्जा करने के लिए, छवि 2 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन (पूरकमूवी S2a, बी, और ग)। एच 2 बी-सिट्रीन कोशिका नाभिक के भीतर स्थानीयकृत है और कोशिका प्रसार को27का पता लगाने की अनुमति देता है। फ़िरोज़ी2-गोलगी एफपी भ्रूण कोशिकाओं के भीतर उपकोशिकीय ध्रुवता को प्रकट करता है लेकिन विवो28में बहिर्चर्म कोशिकाओं को गति या गति के साथ सहसंबंधित प्रतीत नहीं करता है। इस फिल्म (पूरक मूवी S2) से पता चलता है कि कोशिकाओं को कई mRNAs के साथ विद्युतीकृत किसी भी स्पष्ट दोष के बिना सामान्य सेलुलर गतिविधि जारी रख सकते हैं.

इसके अलावा, 4 mRNAs के सह-इलेक्ट्रोपोशन - फ़िरोज़ी2-गोलगी (गोलगी उपकरण की कल्पना करने के लिए), लाइफ एक्ट-ईजीएफपी (एफ-एक्टिन की कल्पना करने के लिए), एच 2 बी-सिट्रीन (नाभिक की कल्पना करने के लिए), और झिल्ली-चेरी एफपी (विजुअल झिल्ली के परिणामस्वरूप) - 87% ट्रांसफेक्शन के परिणामस्वरूप सभी विद्युतीकृत क्षेत्रों में सभी 4 mRNAs की दक्षता (चित्र 4)। LifeAct-EGFP और H2B-Citrine वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर में रैखिक unmixing प्रसंस्करण उपकरण द्वारा अलग किया गया.

FRAP परख पहले दो घंटे के बाद विद्युत अपघटन के दौरान इलेक्ट्रोपोरेटेड MRNA के तेजी से गिरावट से पता चलता है.

यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि नग्न mRNAs जल्दी सेलुलर RNAases29द्वारा अपमानित कर रहे हैं. हम माना कि MRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन हानि या एक विकासशील भ्रूण में प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति की अनुमति देकर लाभ के समारोह प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है. इसलिए, यह MRNA इलेक्ट्रोपोरेटेशन के बाद MRNA क्षय की दर की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी होगा, के बाद से MRNA कोशिकाओं में डीएनए की तुलना में तेजी से degrades. वयस्क माउस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में MRNA इलेक्ट्रोपोरिकेशन की पिछली रिपोर्टमें, लगभग 80% MRNA की पहचान की गई थी 2 h पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा QRT-PCR, अभी तक कोई MRNA करने के लिए थोड़ा 24 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोट्रेशन15द्वारा पता लगाया गया था। हमने इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं में एमआरएनए स्तरों का पता लगाने के लिए एक इन विवो एफआरओपी परख को डिजाइन करके एमआरएनए अभिव्यक्ति पोस्ट-इलेक्ट्रोपोट्रेशन को और अधिक परिमाणित करने की मांग की।

Photobleaching फ्लोरोफोर का अपरिवर्तनीय विनाश है कि हो सकता है जब फ्लोरोफोर (हमारे मामले में फ्लोरोसेंट प्रोटीन) एक उत्साहित राज्य में है, जो अवलोकन के दौरान फ्लोरोसेंट समाप्त30,31. फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FPs) है कि आधार भूतल के स्तर से ऊपर photobleached कोशिकाओं में पता लगाया जा सकता है से किसी भी उत्सर्जित प्रकाश, इसलिए, बरकरार, transfected MRNAs द्वारा इनकोडिंग नव अनुवादित FPs का प्रतिनिधित्व करना चाहिए. इसलिए, हम समय अंक की एक किस्म पर सभी मौजूदा FP व्युत्पन्न फ्लोरोसेंट को खत्म करने और बाद में फ्लोरोसेंट वसूली ट्रैक करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं photobleach करने की मांग की।

प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में अनुकूलित photobleaching सेटिंग्स का उपयोग करना, हमने पाया कि photobleaching शुरू में सभी photobleached कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट तीव्रता कम कर देता है $95% जब photobleaching घटना के तुरंत बाद परख. यह 45 मिनट, 2 ज, और 5 ज पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन में किया गया था (चित्र 5ए-सी)। photobleached क्षेत्र के भीतर प्रत्येक सेल में फ्लोरोसेंट वसूली नियमित रूप से समय अंतराल (3 या 5 मिनट) पर एक ही क्षेत्र इमेजिंग द्वारा प्रत्येक समय बिंदु पर photobleaching के बाद एक 30 मिनट समय अवधि में ट्रैक किया गया था. हमारे डेटा से पता चलता है कि 45 मिनट और 5 एच के बीच transfected MRNA स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी है electroporation. यह FRAP में बड़ी कमी द्वारा दिखाया गया है 5 ज पर मापा 45 मिनट के बाद electroporation. विशेष रूप से 5 एच समय बिंदु में विरंजन कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट वसूली को उजागर करने के लिए, हम ImageJ में चमक / दिलचस्प बात यह है कि 2 एच पर फोटोब्लेश्ड क्षेत्र के भीतर सेल से सेल से सेल तक फ्लोरोसेंट वसूली में एक बड़ी विषमता है क्योंकि कुछ कोशिकाएं अन्य कोशिकाओं की तुलना में तेजी से फ्लोरोसेंट ठीक हो जाती हैं (चित्र 5E', arrowheads देखें)। हालांकि, 5 एच फोटोब्लीच्ड क्षेत्र के भीतर सभी कोशिकाएं 2 एच पर फोटोब्लेप्ड कोशिकाओं की तुलना में फ्लोरोसेंट धीमी (चित्र5F')ठीक हो जाती हैं। हम भी सक्रिय रूप से हमारे photobleached क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं को विभाजित करने का पता लगाने, सुझाव है कि कोशिकाओं photobleaching प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में नहीं मर गया है (चित्र 5E')।

हम Photobleaching घटना के बाद एक 30 मिनट की अवधि में photobleached क्षेत्रों के भीतर प्रत्येक सेल के सामान्यीकृत संकेत तीव्रता दिखा कर चित्र 6A में इन परिणामों की मात्रा निर्धारित. प्रत्येक सेल के लिए, फ्लोरोसेंट मूल्यों photobleaching के तुरंत बाद उस सेल के संकेत तीव्रता के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया. यह सामान्यीकरण सभी समय अंक छवि भर में सभी कोशिकाओं के लिए किया गया था (45 मिनट, 2 ज, 5 ज). एक ही फोटो विरंजन क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट वसूली के सामान्यीकृत मूल्यों तो एक साथ जमा किया गया और photobleaching घटना के बाद समय के साथ रेखांकन; इसलिए, ग्राफ़ का प्रत्येक बिंदु $35 कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है. असामान्यीकृत डेटा चित्र 6ख में भी दिखाया गया है, जिसमें प्रत्येक पंक्ति फोटोब्लीचिंग के तुरंत बाद फ्लोरोसेंट सिग्नल तीव्रता को ठीक करने के साथ एक सेल का प्रतिनिधित्व करती है। इस डेटा समग्र पता चलता है कि द्वारा 5 ज, सभी कोशिकाओं को उनके MRNA के सबसे समाप्त हो गया है, इस ड्रॉप के एक बड़े हिस्से के साथ 45 मिनट और 2 एच के बीच होने वाली बिजली के बाद electroporation.

Figure 1
चित्र 1: clcs2 + LifeAct-eGFP निर्माण करने के लिए क्लोनिंग प्रक्रिया के Schematic. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: MRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन डीएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन की तुलना में अधिक कुशल है। (ए-ए') डीएनए व्यक्त pCS2.H2B-Citrine HH5 भ्रूण के बहिर्चर्म में विद्युतीकृत किया गया था. फ्लुओरेसेंस 12 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन देखा गया। स्केल बार - 50 डिग्री मी.(बी-बी') एमआरनएएच 2 बी-सिट्रीन को एच एच 5 भ्रूण के बहिर्चर्म में विद्युतीकृत किया गया था। फ्लुओरेसेंट 12 घंटे बाद देखा गया। स्केल बार - 50 डिग्री मी. (सी-सी') डीएनए के समान संयोजन (pCMV.H2B-mKate2) और MRNA (H2B-Citrine) HH5 भ्रूण में विद्युतीकृत किया गया था और मनाया 12 एच पोस्ट विद्युत- विद्युतकरण. तीन भ्रूणों का प्रति शर्त परीक्षण किया गया (द र् 2 प्रयोग)। स्केल बार - 50 डिग्री मी. (छ) ImageJ पर कण विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता के लिए ए, बी, और सी (9 कुल भ्रूण) से तीन भ्रूणों की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रत्येक भ्रूण से एक 200 डिग्री क्षेत्र मात्रा निर्धारित किया गया था (कम से कम 150 कोशिकाओं प्रति क्षेत्र गिना गया). मध्य डैश माध्य का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ऊपर और नीचे की पट्टियाँ माध्य से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. (म)दिए गए 200 डिग्री क्षेत्र में सभी इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं में संकेत के प्रसार के लिए तीन सह-इलेक्ट्रोपोरेटेड (डीएनए और एमआरएनए) भ्रूणों का विश्लेषण किया जाता है। प्रत्येक भ्रूण के बारे में 100 कोशिकाओं MRNA विद्युत पोर्शन के लिए सकारात्मक और डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए सकारात्मक 30 कोशिकाओं था. मध्य डैश माध्य का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ऊपर और नीचे की पट्टियाँ माध्य से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. वहाँ MRNA बनाम डीएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन के प्रसार के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, लेकिन MRNA विद्युत पोर्शन डीएनए की तुलना में अधिक कुशल है. (ए-सी) आयाम - 425.10 x 425.10 x 55 m. पिक्सेल निवास 2.55 डिग्री. औसत रेखा 4. बिट्स प्रति पिक्सेल $ 16. माइक्रोस्कोप मेटाडेटा - उल्टे confocal माइक्रोस्कोप, 20x उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें) (ए) पूर्व: 488 एनएम (0.05%), उत्सर्जन ट्रैक S1 - 508-579 एनएम; (बी) पूर्व $ 488 एनएम (5.0%), उत्सर्जन ट्रैक S1 - 508-579 एनएम; (सी) पूर्व $ 488 एनएम (5.0%), 561 एनएम (5.0%), उत्सर्जन ट्रैक S1 - 508-579 एनएम; S2 - 606-695 एनएम कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 3
चित्रा 3: MRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन 22 मिनट के बाद विद्युत-संघटन द्वारा अभिव्यक्ति से पता चलता है और डीएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन की तुलना में बहुत जल्दी है। MRNA (H2B-Citrine) और डीएनए (pCMV.H2B-mKate2) के बाद समय पाठ्यक्रम के प्रतिनिधि छवियों 22 मिनट(ए',45 मिनट(बी-बी'),1.5 एच(सी-सी'),3 एच(डी-डी'),और 6 एच (ई-ई') पर साजिश प्रोफ़ाइल विश्लेषण के साथ इलेक्ट्रोपोट्रेशन इमेजिंग की शुरुआत (एन $ 1)। प्लॉट प्रोफ़ाइल विश्लेषण मर्ज किए गए तीर में सभी बार दिखाए गए प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रदान किया गया है। प्लॉट प्रोफाइल में प्रत्येक शिखर विद्युतीकृत सेल के नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है। कोशिकाओं को आम तौर पर फिल्म के 6 एच अंतराल पर उज्जवल हो, यह दर्शाता है कि MRNA अभी भी नए फ्लोरोसेंट प्रोटीन में अनुवाद किया जा रहा है. 6 घंटे के समय बिंदु के लिए, समान इमेजिंग स्थितियों का उपयोग कर कब्जा कर लिया एक ही क्षेत्र की छवियों (ई'ई') और कमजोर इमेजिंग शर्तों (एफ -एफ') दिखाया जाता है क्योंकि डीएनए electroporated कोशिकाओं की छवियों को अत्यधिक प्रारंभिक का उपयोग कर संतृप्त थे इमेजिंग की स्थिति. स्केल बार $ 20 डिग्री उ. आयाम: 425.10 x 425.10 x 55 डिग्री मी. छवि को सभी समय बिंदुओं पर अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में दिखाया गया है। पिक्सेल 2.55 डिग्री रहते हैं। औसत रेखा 4. बिट्स प्रति पिक्सेल $ 16. माइक्रोस्कोप मेटाडेटा - उल्टे confocal माइक्रोस्कोप, 20x उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें ) पूर्व $ 488 एनएम (15%), 594 एनएम (5.0%) प्रारंभिक के लिए; पूर्व $ 488 एनएम (7.5%), 594 एनएम (0.5%) अंतिम समय बिंदु के लिए (चित्र 2F), उत्सर्जन ट्रैक S1 ] 499-562 एनएम; S2 - 605-661 एनएम. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: विभिन्न उप-कोशिकीय संरचनाओं को लक्षित करने वाले चार एमआरनए का सह-इलेक्ट्रोपोएशन अत्यधिक कुशल है। एक HH3 भ्रूण के बहिर्चर्म mRNAs कि सांकेतिक धर्मकेष2-गोलगी, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine, और झिल्ली-चेरी के साथ electroporated किया गया था. भ्रूण को ठीक किया गया था और 4 घंटे के बाद विद्युत-संघटित किया गया था। अधिकांश कोशिकाओं सभी चार mRNAs (87%) के साथ इलेक्ट्रोड लक्षित क्षेत्र के भीतर electroporated हैं. प्रतिनिधि आंकड़े दिखाए गए (3 भ्रूण प्रत्येक, n ] 2 प्रयोगों). स्केल बार ] 50 डिग्री मी. (ए) सभी चार mRNAs मर्ज (mTurcouise2-Golgi, LifeAct-eGFP, H2B-Citrine, और झिल्ली-चेरी). (ख) केवल H2B-Citrine चैनल (एक्स $ 488 एनएम (0.7%), एम $ 455-499 एनएम) . (ग) केवल mTurcuise2-Golgi चैनल (पूर्व $ 458 एनएम (22.0%), एम $ 455-499 एनएम). (घ) एच2बी-सिट्रीन को मर्ज करें तथा मतुर्व2-गोलगी दर्शाता है कि गोल्गी अधिकांश कोशिकाओं में नाभिक के एक तरफ लिफाफे हैं। (ई) केवल LifeAct-eGFP चैनल (पूर्व $ 488 एनएम (0.7%), एम: 455-499 एनएम) . (च) केवल झिल्ली-चेरी चैनल (पूर्व $ 594 एनएम (37.1%), एम जेड एस2: 570-695 द.उ.)। (छ) मर्ज LifeAct-eGFP और झिल्ली चेरी से पता चलता है ज्यादातर कोशिकाओं में ओवरलैप. आयाम $ 425.10 x 425.10. पिक्सेल 1.58 डिग्री रहते हैं। औसत रेखा 4. बिट्स प्रति पिक्सेल $ 16. माइक्रोस्कोप मेटाडेटा - उल्टे confocal माइक्रोस्कोप, 20x उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें ) पूर्व $ 405 एनएम (2.4%), 458 एनएम (22.0%), 488 एनएम (0.7%), 594 एनएम (37.1%), उत्सर्जन ट्रैक S1 ] 455-499 एनएम; S2 $ 570-695 एनएम. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: फोटोब्लीकिंग परख पहले पांच घंटों के बाद के विद्युत अपघटन के दौरान इलेक्ट्रोपोरेटेड एमआरएनए की तेजी से गिरावट दर्शाती है। एक 100 m2 क्षेत्र की photobleaching कोशिकाओं MRNA के साथ विद्युतीकृत H2B-Citrine व्यक्त 45 मिनट, 2 ज, और 5 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोट्रेशन पर किया जाता है. फोटोब्लीचिंग (3 या 5 मिनट) के बाद भ्रूण को नियमित समय अंतराल पर छवि बनाया गया था। Photobleaching शर्तों के रूप में इस प्रकार हैं: 70% 405 एनएम लेजर, 100 पुनरावृत्तियां, पूरे क्षेत्र के लिए लगभग 5 मिनट की अवधि. स्केल बार 50 [ ]m. (A-A'') 45 मिनट पूर्व और बाद ब्लीच. बी photobleaching के तुरंत बाद भ्रूण से पता चलता है और सी भ्रूण 30 मिनट के बाद ब्लीच से पता चलता है. स्केल बार ] 50 डिग्री मी.(B-B'') 2 h पूर्व और बाद ब्लीच. वर्ग की परिधि स्थानांतरित कर दिया है क्योंकि photobleached क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं ब्लीच अवधि के दौरान थोड़ा ले जाया गया. (सी-सी') 5 ज पूर्व और बाद ब्लीच. (डी-डी') बढ़ाया चमक के साथ एक'A' के रूप में एक ही छवियों (अधिकतम मूल्य 11550 करने के लिए समायोजित चमक के बाद संग्रह बढ़ाने के लिए). (ई-ई') बढ़ाया चमक के साथ बी-बी' के रूप में एक ही छवियों (अधिकतम मूल्य 11550 करने के लिए समायोजित चमक के बाद संग्रह बढ़ाने के लिए)। सफेद arrowheads कोशिकाओं है कि आसपास की कोशिकाओं की तुलना में उच्च फ्लोरोसेंट वसूली है करने के लिए इंगित करते हैं। सियान ऐरोहेड एक फोटोब्लेप्ड सेल की ओर इशारा करता है जो हाल ही में मिटोसिस से गुजरा है। (एफ-एफ') बढ़ाया चमक के साथ सी-सी' के रूप में एक ही छवियों (अधिकतम मूल्य 11550 करने के लिए समायोजित चमक के बाद संग्रह को बढ़ाने के लिए)। आयाम - 425.10 x 425.10 x 42 डिग्री उ. छवि को सभी समय बिंदुओं पर अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में दिखाया गया है। पिक्सेल 1.58 डिग्री रहते हैं। औसत रेखा 4. बिट्स प्रति पिक्सेल $ 16. माइक्रोस्कोप मेटाडेटा - उल्टे confocal माइक्रोस्कोप, 20x उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें ) पूर्व $ 488nm (1.5%), उत्सर्जन ट्रैक S1 ] 508-553 एनएम कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र ााालों में फ्लोरोसेंट वसूली का परिमाणीकरण। (क) विरंजन क्षेत्रों के भीतर सभी कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट तीव्रता ($35 कोशिकाओं) प्रत्येक समय अवधि के बाद ब्लीच के दौरान प्रत्येक एकल कोशिका के लिए ट्रैक किया गया. वहाँ बरामद संकेत तीव्रता की दर में एक बड़ी गिरावट 45 मिनट से 2 एच करने के लिए है, 2 एच से 5 एच के लिए एक छोटी बूंद के बाद. शीर्ष त्रुटि पट्टी प्रत्येक बिंदु के लिए दिखाया गया है, जो माध्य से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है. दिखाया गया रेखा एक रेखीय प्रतिगमन रेखा है. 45 मिनट, 2 एच के लिए R2, और 5 एच क्रमशः 0.83, 0.58, और 0.84 है। त्रुटि पट्टी के शीर्ष आधे प्रत्येक बिंदु के लिए दिखाया गया है। (ख) विरंजन क्षेत्रों के भीतर सभी कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट तीव्रता ($35 कोशिकाओं) प्रत्येक एकल कोशिका के लिए प्रत्येक समय अवधि के बाद ब्लीच के दौरान ट्रैक किया गया और सामान्यीकरण के बिना ग्राफ किया गया. 45 मिनट से 2 एच तक बरामद सिग्नल तीव्रता की दर में एक बड़ी गिरावट है, जिसके बाद 2 ज से 5 ज तक एक छोटी बूंद के बाद कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फिल्म 1: MRNA इलेक्ट्रोपोरिओशन डीएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन की तुलना में पहले प्रोटीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है। H2B-Citrine MRNA और H2B-mKate2 डीएनए HH5 भ्रूण के बहिर्चर्म में विद्युतीकृत. क्षेत्र छवि अतिरिक्त भ्रूणीय और भ्रूण ऊतक की सीमा पर है. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. (एक) दोनों H2B-Citrine और H2B-mKate2 चैनल दिखाया गया (पूर्व $ 488 एनएम (15%), 594 एनएम (5.0%), एम: 499-562 एनएम; S2: 605-661 एनएम). (ख) केवल MRNA H2B-Citrine चैनल दिखाया (पूर्व $ 488 एनएम (15%), एम $ 499-562 एनएम). (ग) केवल H2B-mKate2 डीएनए चैनल दिखाया गया (एक्स ] 594 एनएम (5.0%), एम $ 605-661 एनएम)। आयाम - 850.19 x 850.19 x 110 $m. छवि सभी समय अंक छवि भर में एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में दिखाया गया है. पिक्सेल 2.55 डिग्री रहते हैं। औसत रेखा 4. बिट्स प्रति पिक्सेल $ 16. माइक्रोस्कोप मेटाडेटा: उल्टे confocal माइक्रोस्कोप, 20x उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें ) पूर्व $ 488 एनएम (15%), 594 एनएम (5.0%), उत्सर्जन ट्रैक S1 - 499-562 एनएम; S2 - 605-661 एनएम. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फिल्म 2: mRNAs के सह-विद्युतीकरण गतिशील अध्ययन किया जा करने के लिए अलग सेल व्यवहार की अनुमति देता है। भ्रूणीय और अतिरिक्त भ्रूणीय सीमा के बीच कोशिकाओं के रेडियल विस्तार MRNA (H2B-Citrine और mTurcoise2-Golgi) के साथ विद्युतीकृत कर रहे हैं और जावक प्रवास के दौरान छवि. इस फिल्म को कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा 2 से 5 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा हर 6 मिनट में इमेजिंग द्वारा छवि बनाई गई थी। स्केल बार ] 50 $m.  (क) दोनों H2B-Citrine और mTurcuise2-Golgi चैनल दिखाए गए (पूर्व $ 458 एनएम (28%), 488 एनएम (5.0%), एम $ 446-526 एनएम; S2: 508-553 एनएम). (ख) केवल H2B-Citrine चैनल दिखाया (एक्स $ 488 एनएम (5.0%), एम ] S2: 508-553 एनएम). (ग) केवल m Turcuoise2-Golgi चैनल दिखाया (पूर्व $ 458 एनएम (28%), एम $ 446-526 एनएम). आयाम - 425.10 x 425.10 x 32.5 डिग्री मी. छवि को सभी समय बिंदुओं पर अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में दिखाया गया है। पिक्सेल 0.79 डिग्री रहते हैं. औसत रेखा 4. बिट्स प्रति पिक्सेल $ 16. माइक्रोस्कोप मेटाडेटा - उल्टे confocal माइक्रोस्कोप, 20x उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें ) पूर्व $ 458 एनएम (28%), 488 एनएम (5.0%), उत्सर्जन ट्रैक S1 - 446-526 एनएम; S2 ] 508-553 एनएम. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे ठीक microinect और विद्युत mRNA करने के लिए पर कदम से कदम निर्देश प्रदान की gastrulating बटेर भ्रूण की कोशिकाओं में. हमने यह प्रदर्शित किया कि इन विट्रो संश्लेषित एमआरएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन में बटेर कुटिल भ्रूणों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) की तीव्र और कुशल अभिव्यक्ति की अनुमति देता है (चित्र 2 और 3)। एच 2 बी-सिट्रीन प्रोटीन से फ्लोरोसेंट इलेक्ट्रोपोरेटेड एमआरनए से अनुवादित $ 20 मिनट के भीतर confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है और घंटे के लिए एफपी फ्लोरोसेंट में वृद्धि हुई (चित्र 3, पूरकमूवी 1)। यह आश्चर्यजनक रूप से तेजी से और सिट्रीन32,33के लिए अनुमानित परिपक्वता समय के करीब है . डीएनए सदिशों से व्यक्त किए गए एफ पी का पता 2-3 ज के बाद लगाया गया (चित्र 3, पूरक। मूवी 1), जो पिछले रिपोर्ट8,34,35 केसमान है . विभिन्न FPs अद्वितीय परिपक्वता बार है, तो उन्नत योजना आश्वस्त करेगा कि आदर्श FP वर्णक्रमीय भेद और परिपक्वता गतिकी प्रयोग के लिए वांछित के मामले में चुना जाता है. इसके अतिरिक्त, संश्लेषित mRNAs अधिक कुशलता से सह-ट्रांसफेक्ट भ्रूण कोशिकाओं डीएनए वैक्टर11की तुलना में. उच्च संक्रमण दक्षता के परिणामस्वरूप अधिक कोशिकाओं को एकल के साथ ब्याज के क्षेत्र में स्थानांतरित किया जा रहा है (चित्र 2) या mRNAs की बहु आबादी (चित्र 4) .

एमआरएनए की स्थिरता अत्यधिक विनियमित है और पॉलीडेनिलेशन, जोड़, अनुवाद, द्वितीयक संरचना, और अअनुवादित क्षेत्रों द्वारा कुछ36,37के नाम पर प्रभावित किया जा सकता है। कोशिकाओं के भीतर अंतर्जात और संश्लेषित एमआरएनए दोनों के आधे जीवन मिनट से दिन36,38तक भिन्न हो सकते हैं। हम photobleaching के बाद vivo फ्लोरोसेंट वसूली में इस्तेमाल किया (FRAP) मौजूदा MRNA-एनकोडेड H2B-citrine प्रोटीन ब्लीच करने के लिए और पहले 2 घंटे के दौरान सबसे प्रशंसनीय H2B-citrine फ्लोरोसेंट वसूली मनाया ( चित्र 5 औरचित्र 5 और 6) विभिन्न mRNAs निस्संदेह उनकी लंबाई, आंतरिक दृश्यों, 5' और3' संशोधन36,37के आधार पर अलग आधा रहता है, तो प्रत्येक अगर वांछित परख किया जाना चाहिए.

महत्वपूर्ण इमेजिंग आम तौर पर उच्च गुणवत्ता इमेजिंग और तेजी से, कम विषैले इमेजिंग39,40के लिए इष्टतम स्थितियों के बीच एक व्यापार बंद की आवश्यकता है. जब इमेजिंग, यह संभव के रूप में कम लेजर शक्ति के रूप में उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है photobleaching और भ्रूण कोशिकाओं के लिए photodamage को कम करने के लिए (प्रोटोकॉल के कदम 5.3 के लिए नोट्स देखें)40. तेजी से संग्रह के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग बदलने (उदाहरण के लिए, तेजी से स्कैन गति, कम औसत) अक्सर आवश्यक छवि संकल्प41खोने के बिना मदद कर सकते हैं. अंत में, कटाई, इलेक्ट्रोपोरेशन, और इमेजिंग के दौरान भ्रूण को संभालने और हेरफेर करने में सावधानी बरती जानी चाहिए (चरण 4 देखें)। प्रारंभिक चरण भ्रूण नाजुक होते हैं और आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं।

कुल मिलाकर, सटीक समय और MRNA electroporation की सटीक स्थानीयकरण की अनुमति क्षोभ प्रयोगों कि तेजी से अभिव्यक्ति पर कैपिटल, सह संक्रमण दक्षता, और MRNA प्रतिलिपि के त्वरित क्षय. अधिक अभिव्यक्ति या ब्याज की एक जीन की misexpression संश्लेषित MRNAs के विद्युत ीकरण के माध्यम से पूरा किया जा सकता है. प्रत्येक MRNA के लिए एकाग्रता tittering महत्वपूर्ण है, के रूप में electroporating बहुत अधिक MRNA गैर विशिष्ट सेलुलर विषाक्तता का कारण हो सकता है, जबकि बहुत कम MRNA वांछित कोशिकाओं लेबल या पर्याप्त रूप से phenotypic परिवर्तन प्रेरित नहीं हो सकता है. mRNAs के इन विट्रो संश्लेषण के लिए उत्पन्न सदिशों की एक बहुतायत है कि दृश्य या विविध जैविक प्रक्रियाओं के क्षोभ के लिए बदल जीन उत्पादों के लिए एफपी संलयन मार्करों सांकेतिक संबंधों के लिए पहले से ही विभिन्न पशु मॉडल प्रणालियों से मौजूद हैं. इन इन विट्रो MRNA संश्लेषण के लिए डिजाइन इन निर्माणों में से कई जल्दी और सस्ते में गैर लाभ प्लाज्मिड खजाने से प्राप्त किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध नहीं है की घोषणा की.

Acknowledgments

हम इस काम में उपयोगी अंतर्दृष्टि के लिए दाऊद Huss धन्यवाद. यह काम भाग में गुलाब हिल्स फाउंडेशन ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप (2016-2018) और यूएससी प्रोवोस्ट के अंडरग्रेड रिसर्च फैलोशिप द्वारा एम.टी., Saban अनुसंधान संस्थान Intramural प्रशिक्षण पूर्व डॉक्टरेट पुरस्कार एमडी के लिए समर्थित किया गया था, और विश्वविद्यालय के दक्षिणी कैलिफोर्निया अंडरग्रेजुएट रिसर्च एसोसिएट्स कार्यक्रम आर.एल.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 148 MRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन समय चूक माइक्रोस्कोपी बटेर एवियन भ्रूण FRAP
एवियन भ्रूण में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग
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Tran, M., Dave, M., Lansford, R.… More

Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).

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