Summary
ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。
Abstract
我々は、mRNAエレクトロポレーションにより、生きているウズラ胚の細胞にDNAエレクトロポレーションよりも迅速かつ広範に標識する蛍光タンパク質を可能にすることを報告する。高いトランスフェクション効率は、少なくとも4つの異なるmRNAを~87%の効率で共生することを可能にします。電化mRNAのほとんどは、最初の2時間のエレクトロポレーションの間に分解され、発達中の胚で時間に敏感な実験を行うことを可能にする。最後に、様々な細胞内標的蛍光タンパク質をコードするmRNAでエレクトロポレートされた生きた胚を動的に画像化する方法について述べた。
Introduction
エレクトロポレーションは、電気パルスを使用してプラズマ膜内に一時的な細孔を作り出し、核酸や化学物質などの物質がサイトソールに入り込むことを可能にする物理的なトランスフェクション方法です。エレクトロポレーションは、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞1、2、3にDNAを提供するために広く使用されています。これは、発達中の鳥胚内の標的細胞および組織に遺伝的ペイロードを導入するために日常的に使用され、細胞4、5、6、細胞の集団の遺伝子制御または標識移動の遺伝子制御を研究する。 7.しかし、DNAエレクトロポレーション8にはいくつかの実験的な制限も存在する。例えば、DNAエレクトロポレーションは、多くの場合、細胞あたりの発現ベクターの非常に可変数を導入し、その後、それらがコードするmRNAとタンパク質を導入します。この変動性は、画像解析とデータ解釈9、10の両方を複雑にするかなりの細胞細胞の不均一性につながる可能性があります。さらに、DNAエレクトロポレーションからのタンパク質は、エレクトロポレーション後3時間しか発現し始め、12時間まで細胞数と蛍光強度の最大効率に達せず、核への転移に要する時間が原因で完了する可能性が高い。生体内11の転写と翻訳の両方.
対照的に、mRNAトランスフェクションは、マイクロインジェクション12、13によるキセノプス・レービス卵母細胞、mRNAリポフェクタミントランスフェクション14によるヒト幹細胞の再プログラミングを含む様々なモデルシステムで効果的に使用されている。、成体マウス15における再石灰性神経幹細胞を電気的にする。我々は、異なる蛍光タンパク質(GP)をコードするインビトロ合成mRNAを用いて、初期の鳥類胚発生時に細胞を効率的に標識するmRNAエレクトロポレーションの能力を試験した。我々の研究では、キセノプスおよびゼブラフィッシュ胚のタンパク質を発現するために一般的に使用される多目的発現ベクターであるpCS2+ベクターを用いて使用した。pCS2+におけるSP6およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターは、インビトロ転写/翻訳システムで使用した場合、任意のクローン遺伝子からのmRNAおよびタンパク質の合成を可能にします。
ここでは、mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証する。我々は、これらの研究で使用される発現ベクターの多くを設計し、生成した。例えば、LifeAct-eGFP遺伝子16をpCS2+ベクター17にサブクローニングし、CMVプロモーターおよびSP6プロモーターから発現した。挿入された遺伝子は、SP6プロモーターの下流にあり、SV40ポリ(A)テール18の上流にある。mRNAとDNAと共にエレクトロポレートされた胚では、インビトロ転写されたmRNAからコードされた胎児は、最初にエレクトロポレーションの20分以内に検出されたが、DNA発現ベクターからのGPは、核、ゴルジ、および核をコードする複数のmRNAの3時間後にのみ検出された。膜タンパク質は同時に胚にエレクトロポレートされ、個々の細胞内の複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現をもたらす。最後に、光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収を用いて、電ポレートされたmRNAの大部分が2時間以内に崩壊することを示す。したがって、限られた新しいタンパク質翻訳と組み合わせた高速初期タンパク質産生は、発現の時間的制御が必要な場合にmRNAエレクトロポレーションを貴重な技術にする。
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Protocol
すべての動物の手順は、小児病院ロサンゼルスと南カリフォルニア大学機関動物ケアおよび使用委員会からの承認されたガイドラインに従って行われました。
1. 生成 pCS2 ベースの式ベクトル
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pCS2.Lifeact-eGFPをクローンするには、適切な消化バッファー(材料の表を参照)でBamHI(10U)とBsrGI(10 U)を用いてpCS2.CycB1-GFP(異なるインサートを含む構造体)の2μgを消化してベクトルバックボーンを調製します(材料の表を参照)。37 °Cで1時間50μLの体積(クローニング手順の回路図については図1を参照)。
- エビアルカリホスファターゼ(1U)を添加して制限酵素反応からベクターバックボーンの自由3'OH端部を脱リン酸化する。37°Cで30分間インキュベートします。
- 1%のアガロースゲル/1xトリスアセテートEDTA(TAE)バッファーで全体の混合物を約50分間90Vで実行し、1x TAEバッファーで1x TAEバッファーで0.5 μg/mL溶液でゲルを汚し、穏やかな揺れで15分間染色します。また、DNAサイズを決定するために、自由なレーンに分子量マーカーをロードしてください。
- DNAのニッケルを避けるためにDNA安全なUVトランスイルミネーションを使用して、アガロースゲルからベクターバックボーン(4kbの予想バンドサイズ)を素早く切り取り、メーカーの指示に従ってゲル精製キットを使用してゲル片からDNA断片を分離します。
- ステップ1.1と同時に、BglII(10U)およびBsrGI(10U)を適切な消化バッファーで2μgのpEGFP-N1-Lifeactを消化して挿入を調製し、37°Cで1時間50μLの総反応量で1倍に希釈した。ステップ1.1.2-1.1.3で前述したように、1%のアガロースゲルで混合物全体を実行し、800 bpバンドを分離します。
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ベクターとインサートの両方を分光光度計で精製および定量した後、T4 DNAリガーゼを添加する前に、T4 DNAリガーゼバッファーに50ngのベクターと38ngのインサート(1:3モル比のインサート)を組み合わせて、ライゲーション反応を触媒する。さらに、DNA コントロールなし、ベクターのみのコントロール、および挿入のみのコントロールを設定します。室温ですべての反応を30分間インキュベートします。
- ライゲーション混合物の1 μLを有能な大腸菌DH10に変換します。また、水のみ陰性対照およびpUC19陽性対照の20pgを変換する。50 μg/mLアンピシリンを含む寒天プレートに細菌を広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌朝、各プレートのコロニーを数えます。
注:理想的には、負の制御プレート上にコロニーがなく、ベクトル+インサートライゲーションプレート上にコロニーが100個あり、ベクトルのみのプレート上のコロニーが少なくなります。 - ベクター+インサートライゲーション混合物で形質転換された寒天プレートから少なくとも8つの細菌コロニーを選び、50 μg/mLアンピシリンを含む液体LBブロスの2 mLに滅菌爪楊枝またはピペチップチップを使用して接種します。
- 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、各クローンからDNAを抽出します。
- 37°Cで1時間に1xに希釈した適切な消化バッファーでNotI(10U)とBamHI(10U)を用いて各クローンから500ngのDNAを用いて診断制限ダイジェストを実行し、1x TAEバッファー内の1%アガロースゲル上で消化DNAを実行します。pCS2.Lifeact-eGFP 正のクローンの予想バンド サイズは 3.9 kb と 978 bp です。
- 陽性クローンから1pg-100 ngのDNAを有能な大腸菌DH10に変換し、前のステップで詳述したように3-4のミニプレップ反応を調製し、インビトロ転写反応(最小10μg)に十分な量のDNAを得た。
2. インビトロ転写によるmRNAの調製
- pCS2.LifeAct-eGFPの10 μgを、一晩37°Cで50μLの総反応量で1倍に希釈した適切な消化バッファーでNotI(10 U)を挿入して3'端部に直線化します。
注:RNase汚染を防止し、mRNAの分解を低減するために、mRNAサンプルを取り扱いながら手袋を着用してください。 -
フェノールの混合物を使用してDNAを精製する:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、v/v)。
- 150 μL の RNase フリーウォーターを追加し、消化反応の総体積を 200 μL にします。次に、フェノールの200μLを添加する:クロロホルム:イソアミルアルコールおよび渦混合物を20s用に加える。
- 最大速度(18,400 x g)のマイクロフュージで2分間遠心分離機は、線形化されたDNAを含む上部水相を慎重に取り除きます。追加の不純物を除去し、底と上部の液体相の間に形成される可能性のある白い沈殿物を破壊しないように注意するために、この手順を繰り返します。
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1/10体積3M酢酸ナトリウム(RNaseフリー)と100%エタノールの2.5体を添加して線形化DNAを沈殿させる。混合物を-20 °Cで>30分間放置し、その後、最大速度(18,400 x g)で遠心分離してDNAをペレットします。
- DNAペレットを70%エタノールで洗浄し、ペレットを5分間空気乾燥させます。
- DNAペレットをRNaseフリー水の5μLに溶解します。分光光度計でDNAを定量します。
注:予想DNA濃度は~0.5-1 μg/μLで、A260/A280比は1.7~2.0です。
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線形化pCS2.LifeAct-eGFP DNAの1 μgをインビトロ転写(IVT)に使用します。商用キット(材料表参照)のメーカーの指示に従って、10 μLのキャップアナログ(最終濃度0.8mM)とNTP(ATP、CTP、TTPの最終濃度1 mM、GTPの場合は0.2mM)、10倍の反応バッファーの2μL(最終濃度)を含む。1x)、SP6 RNAポリメラーゼの2μL、および20 μLまでのRNaseフリー水。
- 転写物のサイズに応じて、IVT混合物を約2時間以上インキュベートする。
注:2時間のインキュベーションは3 kbのトランスクリプトに適していますが、一晩インキュベーションは5 kbを超えるトランスクリプトの方が適しています。 - 転写反応からフリーヌクレオチドを除去するには、LiCl RNA沈殿液(塩化7.5M、50mM EDTA)を30μL添加してmRNAを沈殿させる。混合物を短時間で渦にし、-20°Cで30分間保存し、mRNAを最大速度(18,400 x g)でマイクロフュージで15分間スピンダウンし、70%エタノール(RNaseフリー)ですすいでください。
- 転写物のサイズに応じて、IVT混合物を約2時間以上インキュベートする。
- 合成したmRNAを15μLのRNaseフリー水で溶解させる。合成されたmRNAを5 μL/チューブ(3チューブ合計)で分配し、-80°Cに置いて長期保存します。分光光度計でmRNAを定量します。
注:期待降伏量はmRNAの15-20 μg(約1 μg/μL)です。1 μL(1 μg/μL)は、mRNAが1μg/μLから500ng/μLに希釈され、各胚が〜200 nLで注入されると仮定して、〜10個の胚を用いた実験に十分である。したがって、各チューブには、~5の実験に十分なmRNAが含まれている必要があります。 - RNase除去液ですべてのゲル装置を洗浄した後、1x TAEバッファーで1%のアガロースゲルでmRNAの〜300 ngを実行し、mRNAが1つのバンドとして現れることを確認します(二次構造形態の場合は複数のバンドが存在する可能性があります)。RNAの劣化を示すゲルレーンのピア。
3. mRNAエレクトロポレーションミックスの調製
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所望の濃度でmRNAを解凍および希釈します(RNaseフリー水中の250-500 ng/μLは、本研究で試験されたすべてのmRNAに適しています)。着色色素の1/10体積を追加し(材料の表、RNAseフリー、0.1%の最終濃度を参照)、mRNA注入部位を視覚化し、電極を適切に配置するのに役立ちます。
注:DNAとRNAを組み合わせて共エレクトロポレーションを行う場合は、mRNAとDNA混合物の前にフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿を使用して、DNAがRNasesを汚染していないことを確認してください。- 模擬(RNA添加なし)エレクトロポレーション溶液を使用して、必ず陰性コントロールを準備してください。可能であれば、事前に検証されたmRNA(以前の実験でFPを正常に産生することが示されているmRNA)を用いて陽性対照を準備する。
注:陰性制御は、データの正規化のための背景蛍光レベルを確立するために、すべての画像実験に不可欠です。正の制御は、エレクトロポレーション設定が働いていることを確認することにより、新しく転写されたmRNAを使用する場合に特に重要です。
- 模擬(RNA添加なし)エレクトロポレーション溶液を使用して、必ず陰性コントロールを準備してください。可能であれば、事前に検証されたmRNA(以前の実験でFPを正常に産生することが示されているmRNA)を用いて陽性対照を準備する。
- mRNAエレクトロポレーション溶液を氷スラリーに保存し、エレクトロポレーションを進める準備ができるまで劣化を防ぎます。
4. 生きたウズラ胚への電極mRNA
- 毎日作りたての受精ウズラの卵を集め、1週間以内に加湿した冷蔵庫で13°Cに保管してください。所望の胚発生段階19、20、21まで38°Cでウズラの卵をインキュベートする。
注:HH3からHH5は、静的および動的イメージングの両方に使用された。HH3胚の場合、卵を収穫前に室温で2時間放置すると、胚が冷却されたときに一般的に物理的な操作に対して耐性が高くなるため、分離プロセスがはるかに容易になります。 - EC培養システム22に従って胚を分離して調作する。条件ごとに少なくとも5個の胚を採取し、少なくとも1つを含む負の対照(電気的ではない)として機能させる。
- 卵を10cmのペトリ皿にそっと割って注ぎます。転写ピペットで厚いアルブミンの大部分を取り除き、胚が紙のリングにしっかりとくっつくようにするために、組織拭きで卵黄の表面を静かに拭くことによって、胚の周りの残りの厚いアルブミンを取り除きます。
- プリカットフィルターペーパー(材料の表を参照)を胚の上に置き、はさみを使用して胚の周囲を滑らかに切ります。
- パスツールピペットを使用して、PBSで胚の根元に、穏やかな流れを使用して胚に付着する黄身を空にします。
注:これらの胚は黄身に固執する傾向があり、その後の洗浄工程中にビテリン膜から剥離することが多いため、このステップは若い(- 胚/紙のリングを斜めの角度でゆっくりと引き上げ、さらに洗浄するためにPBSで満たされたペトリ皿に卵黄をオフにします。卵黄の大部分が取り除かれたら、寒天/アルブミンの半固体混合物で覆われた35mmペトリ皿の上に胚の腹部側を置きます。
- ガラスマイクロピペットプーラー器具を使用して、6~8個の長さ10cmのガラスマイクロキャピラリー(O.D.= 1.2 mm)を準備します。
- 胚の腹部側をPBSで満たされたエレクトロポレーション室に置きます。ガラスマイクロキャピラリーを用いて、所望の領域を覆うエピブラストとビテリン膜の間の空洞にmRNAまたはDNA/mRNAエレクトロポレーションミックスの200nLのボーラスを注入する。
注:ペルシダの前部領域全体とオパカの一部の領域は、この原稿に示す実験のほとんどで電気ポレートされた。 - 正極と負極(プラチナ平らな正方形の電極、5mmの側面長)をそれぞれ胚の上下に置き、次のパルスシーケンスを使用して電気ポレート:5Vの5つの正方形の電気パルス、100ミリ秒間隔の50ミリ秒の持続時間生体内エレクトロポレーターを使用しています。電極間の距離が~5mmであることを確認します。
注:エレクトロポレーションパラメータを最適化することは、脆弱な胚細胞を殺すことができる条件を避けるために重要です。電圧、パルス長、パルス間隔、DNAおよびmRNAのパルス数のパラメータは、様々なエレクトロポレーションデバイスで考慮する必要があります。 - 電気刺激胚を38°Cで所望の発達段階にインキュベートする。
注:蛍光解剖ステレオスコープ(材料の表を参照)は、トランスフェクトされた胚と非トランスフェクト胚をスクリーニングするのに役立ちます。 - 胚を静的に画像化する場合は、室温で1時間、または4°Cで一晩PBSで4%パラホルムアルデヒドで固定します。
- フィルターペーパーの周囲をハサミで滑らかに切り、鋭い鉗子で後面の光沢のある膜を剥離することにより、ビテリン膜から胚を取り除きます。
- 固定胚をPBS/トリトンで洗浄する (0.1%)2x 5分間、必要に応じてその中でハイブリダイゼーションまたは免疫染色を続けます。
- 最後に、PBS/トリトン(0.1%)で胚を0.5 μg/μL DAPIで染色する室温で少なくとも30分間。PBS/トリトン2xで胚を5分間洗浄し、SCALE-U2溶液23で胚を一晩クリアします。
- エレクトロポレーションの効率を分析するには(図 2を参照)、ImageJ のバイナリおよびパーティクル解析ツールと DAPI チャネルを使用して、画像内のすべてのセルから核の輪郭を取得します。
- ImageJ でバイナリ ツールを使用するには、大部分のセルを含む DAPI チャネルで単一の Z スライスを使用し、[プロセス > バイナリ > バイナリを作成]をクリックします。近くのセルを分離するには、[プロセス > バイナリ >流域] をクリックします。[パーティクルの分析]、サイズを 100~500 (μm 2) に設定した [分析] をクリックしてセルのアウトラインを取得します。
- セルの大部分が DAPI チャネルで概説されていることを確認し、[その他 ]をクリックしてセルのアウトラインを保存します。
- これらのアウトラインを使用して、mRNA または DNA チャネル内の単一の Z スライスで以前に保存したファイルを開き、ROI マネージャーの [測定] をクリックして、mRNA および DNA チャネルの蛍光強度値を取得します。
- 最後に、これらの強度値をフィルタリングし、<6,000 蛍光強度を非トランスフェクトとして細胞をカウントし、トランスフェクトとして>6,000蛍光強度を有する細胞をカウントします。
5. エレクトロポレーションmRNAによってコードされる画像FP
- 蛍光解剖ステレオスコープの下ですべての電気起電胚を見た後、動的イメージング実験のための最も健康的で最高の電気ポレート胚を選択してください。
- 実験中に他の電気起電胚と非電気起電胚(陰性対照)を別のインキュベーターでインキュベートし続け、この胚が実験中に死亡した場合に選択した胚をイメージングする。
- 動的イメージングの場合は、前述の24、25、26を反転共焦点顕微鏡で使用する。
注:顕微鏡はイメージ投射の間に36 °Cで温度を維持するステージ上のインキュベーター(材料のテーブルを参照)が装備されている。36°Cでインキュベートした胚は、レーザーが胚に局所的な加熱を引き起こす可能性があるため、より高い温度で長く生き残ることを顕微鏡セットアップ中に観察した。読者は、独自の顕微鏡セットアップのための最適なステージ上のインキュベーション温度を決定する必要があります。- 胚発生を動的に画像化して可視化するには、電解胚をPBSで簡単にきれいにし、PBSクリーンで鉗子を使用して胚を動かすことによって、エレクトロポレーションプロセス中に胚の後側に形成される可能性のある気泡を除去する。ソリューション。
- きれいな胚を、アルブデン寒天(〜150μL)の薄い層を含むイメージング皿の上に直接置き、胚22の後部表面に気泡を発生させないようにする。
- 長期的なイメージングの生存を確保するために、イメージング皿の内側の端に小さな湿った巻き上げティッシュペーパーを追加し、イメージングおよびインキュベーション中の蒸発を最小限に抑えるためにパラフィンフィルムを使用して皿を密封する。
- この皿を共焦点顕微鏡の予め温められた段階に素早く移動し、注入された領域および電気起電領域を識別する明視野チャネル(PMTレーザー20%)を使用して胚の着色された色素を見つける。
- イメージングソフトウェアを目的の目的(10または20x)、ダイクロイックミラー(GFP nmの場合は488nm、RFPの場合は561nm)、発光スペクトル(GFPの場合は499~562nm、RFPの場合は570~695nm)に設定し、適切なレーザー(GFPの場合は488nm、RFPの場合は561nm)をオンにします。
注:電気電化されたmRNAは、20分以内に見られたタンパク質に翻訳された(図3参照)。このホワイト ペーパーのほとんどの画像で使用されるイメージング メタデータは、20 倍の目的を持つ反転共焦点顕微鏡でした (材料の表を参照)。ピクセルのドウェル時間、~1.5 μs;4行スキャンの平均。- イメージングソフトウェアの[ライブ]をクリックし、各顕微鏡レーザーパワーに応じて蛍光強度に適した設定にレーザーパワーを調整します。まず、1%のレーザーパワー、800ゲインを使用して胚をイメージングし、飽和ピクセルが見られるまでレーザーパワーをゆっくりと1%増加させます。
- 飽和ピクセルが見えなくなるまで、レーザーパワーをわずかに減らして、これに従ってください。
注:胚のイメージングセッションの開始時に選択されたレーザーパワーは、以前の時点に適しているかもしれませんが、細胞の蛍光が時間の経過とともに明るくなったり暗くなったりすると、後の時点では理想的ではありません。これに対処するために、電気ポレーションされた細胞は一般的にエレクトロポレーション後6時間にわたって明るくなるので、最初はわずかに低い電力設定で胚を画像化します(信号増加の定量化については図3A-Eを参照)。後の画像が飽和状態の場合は、元のイメージング設定で画像を続行しますが、イメージ設定が弱い(ピンホールまたはレーザーパワーが小さい)直後に追加の画像を撮影します。 - 異なる時間ポイント間の個々の細胞の移動を追跡するために、3〜5分ごとに胚を画像化します。この研究では、画像は電化領域全体のZスタック(約50μmの厚さ)に加え、イメージングセッション全体を通して胚がアガロースベッドに沈んだ場合に備えて、Zスタックの底部に向かって余分な余地を与えました。
- 最初のムービーの最初の数ポイントを確認して、セルの移動速度を確認します。セルが高速で移動している場合 (つまり、イメージ領域の領域を 2 つ以上の時間ポイント内で終了する場合)、イメージ領域のズームを拡大するか(1x à 0.8x)、または別の領域をイメージングすることを検討してください。
注:地域の胚領域は、地域のオパカのそれらよりもはるかに速く移動します。さらに、若い胚(HH3、HH5)には、古い胚(>HH7)に比べてより速い運動を受けている細胞が含まれていることが多い。 - 胚の電気起電領域を画像化した後、同じ胚の非電解領域を画像化して自己蛍光レベルを決定する(低レーザーパワー<10%を使用して胚を画像化する場合は最小限にすべきである)。
6. 光漂白後の蛍光回収(FRAP)からアッセイmRNAインテグリティ
注:光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収は、トランスフェクトされたmRNAをMSPに変換できる期間を決定するために使用することができる。次のプロトコルは、H2Bの半減期を検出するFRAP実験の概要を示す。エレクトロポレート胚中のシトリンmRNA。
- 20x 0.8 NAの目的と完全に開いたピンホールを使用して、反転共焦点顕微鏡でFRAP実験を行います。
- 立体顕微鏡上のH2B-シトリンのエレクトロポレーションを確認し、反転共焦点顕微鏡上の予熱段階で胚を設定した後(ステップ5.2.4参照)、H2B-Citrineからの細胞蛍光のほとんどを様々な時間に光漂白するポイント(45分、2h、および5時間後エレクトロポレーション)は、70%のレーザーパワー、100回の反復、スキャン速度4を用いて405nmレーザーを使用することにより、蛍光の5%しか残らない。
注:このプロセスには数分かかります。 - 光漂白後36°Cでステージ上の胚をインキュベートし続ける。
- 立体顕微鏡上のH2B-シトリンのエレクトロポレーションを確認し、反転共焦点顕微鏡上の予熱段階で胚を設定した後(ステップ5.2.4参照)、H2B-Citrineからの細胞蛍光のほとんどを様々な時間に光漂白するポイント(45分、2h、および5時間後エレクトロポレーション)は、70%のレーザーパワー、100回の反復、スキャン速度4を用いて405nmレーザーを使用することにより、蛍光の5%しか残らない。
- 光漂白領域内の細胞を積極的に分割することに注意してください。
- 共焦点顕微鏡を使用して、一定の時間間隔(3または5分)で最大30分間、漂白後画像(電極領域のZスタック)を取得します。
注:可能な場合は、光漂白領域での細胞生存を確保するための正のコントロールとしてトランスジェニックH2B-XFPラインを使用してください。電光mRNAによってコードされるFPの蛍光回収率は減少するはずですが、トランスジーンを介してコードされるFPについては、ムービー全体を通して一貫性を保つべきです。 - 画像化条件が胚の生存に有害に影響を及ぼさないことを確実にするために、同時に光漂白されていない電化胚をインキュベートし、イメージングの制御として役立つ可能性がある。
- mRNA崩壊後の光漂白結果を定量化するには、ImageJを使用して各細胞の中心(7.5μm円)の蛍光強度を測定することにより、時間の経過とともに細胞蛍光を追跡します(3または5分)。これを、人芽細胞症を受けておらず、完全に光漂白されている光漂白領域内のすべての細胞に対して測定します。
注:有光核はクロマチン凝縮による相間核よりも蛍光が強いため、定量から有化細胞を省略することを検討してください。 - 様々な時間ポイント(45分、2h、5時間)で、時間の経過に渡る蛍光強度をプロットします。
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Representative Results
mRNAエレクトロポレーションはDNAエレクトロポレーションよりも効率的
私たちはpCS2+を使用しました。H2B-シトリンは、mRNAをインビトロで調製する。DNAエレクトロポレーションは通常1-2 μg/μLで行われるため、mRNAエレクトロポレーションにはmRNAの等化濃度(H2B-シトリンの場合は約0.25-0.5 μg/μL)を用いました。まず、pCS2+のエレクトロポレーション効率をテストしました。H2B-シトリンmRNAと比較したH2B-シトリンDNA(pCS2+のSP6プロモーターから転写したインビトロ。H2B-シトリン)は、DNAまたはmRNAをHH5ウズラ胚に別々に電気ポレートし、12時間後のエレクトロポレーションでエレクトロポレーション効率を調べることによって。DNAエレクトロポレーションは一部のエレクトロポレーション細胞において明るい蛍光を引き起こしますが、DNAエレクトロポレーションの効率は、広く発現したmRNAコードされたGPと比較して目に見えて低かった(図2AおよびB)。
エレクトロポレーションプロトコルに固有の胚と胚の変動性を説明するために、H2B-CkateinをコードするmRNAとH2B-mKate2を発現するDNAの等化組み合わせをHH5胚のエクトダームにエレクトロポーションし、12時間観察した。ポストエレクトロポレーション。同じ胚におけるDNAとmRNAの共エレクトロポレーションを比較した場合、FPを発現するDNAもmRNAのそれよりも有意かつ一貫して効率が低下していた(図2C)。mRNA、DNA、または2つの組み合わせのみで電化されたすべての胚を定量することにより、mRNAは所定の領域内の細胞の約75%をトランスフェクトし、DNAは所定の領域内の細胞の約25%しかトランスフェクトしないことがわかった(図2D)。mRNAまたはDNAによってコードされる蛍光タンパク質の発現における広がりは、全ての共電化胚において有意に異なっていなかった(図2E)。
タンパク質発現はDNAエレクトロポレーションよりもmRNAエレクトロポレーションの方が速い
トランスフェクトされたmRNAは、図3に見られるようにサイトソーリック翻訳機構によってすぐに認識できるため、タンパク質産生の高速化につながるはずです。DNAは核に転移し、転写し、mRNAをサイトソールに送り返し、サイトソリック翻訳機構によって認識され、より多くの時間がかかると予想される。タンパク質産生のmRNA対DNA発現速度を直接比較するために、DNA(pCMV.H2B-mKate2)とmRNA(H2B-Citrine)の等解相組合わせをHH5胚のエクトダームに共電した一連のタイムコース実験を行った。約22分間の電解後にmRNA封入FP発現を検出し、約6時間の相対蛍光強度で増加を続けている(図3A-E、補足)。ムービー S1b)。対照的に、DNAコード化FP発現は、最初に〜1.5hポストエレクトロポレーションで見られる(図3A'-E'、補足的)。ムービーS1c)と、ムービーが停止した6時間まで明るさが増加し続ける。DNA電解細胞は6時間で飽和していたため、より弱い撮像条件でこの状態を再画像化しました(図3F-F')。この時間経過のすべての時間ポイント(22分から6時間)にわたって、mRNAはDNAよりも数倍多くの細胞をトランスフェクトする(補足。ムービーS1aは、これらの画像は野生型ウズラ胚のタイムラプスから撮影されているため、ブライトフィールドおよびDAPIを介したエレクトロポレーションの総効率は示されていない。これに基づいて、mRNAエレクトロポレーションは、早期に発現したタンパク質につながると結論付ける。
複数のmRNAの共エレクトロポレーションは非常に効率的です
次に、複数のmRNAを対象地域にエレクトロポレーションすることにより、mRNAエレクトロポレーションの効率をさらにテストすることを試みた。複数のDNAの共エレクトロポレーションは、以前は比較的非効率的であることが示されており、マルチラベルの数が25%、14%、および2、3、および4DNA構築物の2、3、および4のDNA構築物の数が、細胞の総数の割合として計算された11.まず、スペクトル別のGP(Turquoise2-Golgi/H2B-Citrine)をHH5胚にコードする2つのmRNAを電気ポレートし、すべての電解領域で高いトランスフェクション効率を得た。この二重エレクトロポレーションを用いて、HH4ガストレーション胚における領域ペルシダとオパカ間の放射状膨張の動画を撮影し、2時間のポストエレクトロポレーション(補足ムービーS2a、b、およびc)を画像化した。H2B-Citrineは細胞核内に局在し、細胞増殖をトレースすることを可能にする27.Turquoise2-Golgi FPは胚細胞内の細胞細胞極性を示すように見えるが、生体内28で外胚細胞を移動する速度または方向と相関しているようには見えない。このムービー(補足ムービーS2)は、複数のmRNAで電化された細胞が明らかな欠陥なしに正常な細胞活性を継続できることを示している。
さらに、4つのmRNA-ターコイズ2-ゴルジ(ゴルジ装置を可視化する)、LifeAct-eGFP(F-アクチンを可視化する)、H2B-シトリン(核を可視化する)、膜チェリーFP(膜を可視化する)の共エレクトロポレーションは87%のトランスフェクションをもたらした。すべての電気起電領域における4つのmRNAの効率(図4)。LifeAct-EGFPおよびH2B-シトリンは、市販ソフトウェアにおけるリニアアンミキシング処理ツールによって分離された。
FRAPアッセイは、エレクトロポレーション後最初の2時間における電ポレートmRNAの急速な劣化を示す。
裸のmRNAは、細胞RNAases29によってすぐに分解されることはよく知られている。我々は、mRNAエレクトロポレーションは、現像胚におけるタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にすることによって、損失または機能性の実験に有用である可能性があると仮定した。したがって、mRNAは細胞内のDNAよりも速く分解するので、mRNAエレクトロポレーション後のmRNA減衰の速度を定量すると有用であろう。成人マウス神経幹細胞におけるmRNAエレクトロポレーションの以前の報告では、約80%mRNAがqRT-PCRによる2時間後エレクトロポレーションを同定したが、それでも24時間ポストエレクトロポレーション15によってmRNAはほとんど検出されなかった。我々は、電気起電細胞中のmRNAレベルを検出するインビボFRAPアッセイを設計することにより、電気ポレーション後のmRNA発現をさらに定量化することを目指した。
光漂白は、蛍光素(我々の場合の蛍光タンパク質)が励起状態にあるときに起こり得る蛍光素の不可逆的な破壊であり、観察30、31の間に蛍光を排除する。ベースラインレベルを超える光漂白細胞で検出できる蛍光タンパク質(GP)から放出された光は、したがって、無傷でトランスフェクトされたmRNAによってコードされる新しく翻訳されたGPを表す必要があります。そこで、電化細胞を光漂白し、様々な時点で既存のFP由来蛍光を排除し、その後の蛍光回収を追跡しました。
プロトコルセクションで説明されているように最適化された光漂白設定を使用して、光漂白イベントの直後にアッセイすると、最初にすべての光漂白細胞の蛍光強度が約95%減少することがわかりました。45分、2時間、5時間後のエレクトロポレーション(図5A-C)で行いました。光漂白領域内の各細胞における蛍光回収は、一定の時間間隔(3または5分)で同じ領域を撮像することにより、各時点での光漂白後30分の期間にわたって追跡した。我々のデータは、45分から5時間のポストエレクトロポレーションの間にトランスフェクトされたmRNAレベルの有意な減少があることを示唆している。これは、45分後のエレクトロポレーションと比較して5時間で測定されたFRAPの大きな減少によって示される。特に5時間の時点で漂白細胞の蛍光回復を強調するために、ImageJの明るさ/コントラストツールを使用して図5A-Cの明るさを強化し、これらの修正画像を図5D-Fに示しました。興味深いことに、一部の細胞は他の細胞よりも速く蛍光を回復するため、2時間で光漂白領域内の細胞から細胞間の蛍光回復に大きな不均一性がある(図5E'、矢印を参照)。しかし、5時間の光漂白領域内のすべての細胞は、2時間で光漂白細胞よりも遅い蛍光(図5F')を回復する。また、光漂白領域内で細胞を積極的に分裂させ、光漂白プロセスの結果として細胞が死んでいないことを示唆しています(図5E')。
これらの結果を図6Aで定量化し、光漂白事象後30分の間に光漂白領域内の各細胞の正規化された信号強度を示した。各細胞について、蛍光値は光漂白直後にその細胞のシグナル強度に対して正規化した。この正規化は、画像化されたすべての時間点にわたってすべての細胞に対して行われました(45分、2時間、5時間)。同じ写真漂白領域内の細胞の蛍光回収の正規化値は、その後、一緒にプールされ、光漂白イベント後に時間をかけてグラフ化された。したがって、グラフ内の各点は~35 個のセルを表します。非正規化されたデータは図6Bにも示され、各線は光漂白直後に蛍光シグナル強度を回復する細胞を表す。このデータは、全体的に、5時間までに、すべての細胞がmRNAのほとんどを枯渇させ、この滴の大部分が45分から2時間のポストエレクトロポレーションの間で起こることを示唆している。
図 1: pCS2+LifeAct-eGFP コンストラクトを作成するためのクローン作成手順の概略図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:mRNAエレクトロポレーションはDNAエレクトロポレーションよりも効率的である。(A -A')pCS2.H2B-シトリンを発現するDNAをHH5胚の外胚に電気電化した。蛍光は12時間後エレクトロポレーションを観察した。スケールバー= 50 μm.(B-B'') H2B-シトリンを発現するmRNAをHH5胚の外胚にエレクトロポレートした。蛍光は、エレクトロポレーション後12時間観察された。スケールバー= 50 μm(C-C'') DNA(pCMV.H2B-mKate2)とmRNA(H2B-シトリン)のエクイモルの組み合わせをHH5胚にエレクトロポレートし、12時間後エレクトロポレーションを観察した。条件ごとに3つの胚を試験した(n=2実験)。スケールバー= 50 μm. (D) A、B、C(全胚9個)の3つの胚を、ImageJの粒子解析ツールを用いてエレクトロポレーション効率のために定量した。各胚から200μmの領域を定量した(少なくとも150個の細胞を領域当たり数えた)。中央の破線は平均を表し、上下のバーは平均からの標準偏差を表します。(E) 3つの共エレクトロポレート(DNAおよびmRNA)胚を分析し、所定の200μm領域内のすべてのエレクトロポレート細胞間でシグナルの拡散を解析する。各胚は、mRNAエレクトロポレーションに対して陽性の約100個の細胞と、DNAエレクトロポレーションに陽性の30個の細胞を持っていた。中央の破線は平均を表し、上下のバーは平均からの標準偏差を表します。mRNAとDNAエレクトロポレーションの広がりには有意な差はありませんが、mRNAエレクトロポレーションはDNAよりもはるかに効率的です。(A-C)寸法 = 425.10 x 425.10 x 55 μm. ピクセルは 2.55 μs. 平均ライン 4.ピクセルあたりのビット数 = 16。顕微鏡メタデータ= 反転共焦点顕微鏡, 20倍の目的 (材料の表を参照) (A) 例: 488 nm (0.05%), 放出トラック S1 = 508-579 nm;(B) Ex = 488 nm (5.0%)、エミッション トラック S1 = 508-579 nm;(C) Ex = 488 nm (5.0%)、561 nm (5.0%)、エミッション トラック S1 = 508-579 nm;S2 = 606-695 nmこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:mRNAエレクトロポレーションは、22分のポストエレクトロポレーションによる発現を示し、DNAエレクトロポレーションよりもはるかに速い。mRNA(H2B-Citrine)とDNA(pCMV.H2B-mKate2)の後のタイムコースの代表的な画像は、22分(A-A')、45分(B-B')、1.5h(C-C')、3h(D-D')、および6h(E-E')でプロットプロファイル解析を行ったエレクトロポレーションを行います。イメージングの開始(n = 1)。プロット プロファイル解析は、マージされたイメージ内の描画された矢印全体に表示される各時間ポイントに対して提供されます。プロットプロファイルの各ピークは、電ポレートされた細胞の核を表す。細胞は一般的にムービーの6時間間隔で明るくなり、mRNAがまだ新しい蛍光タンパク質に翻訳されていることを示す。6時間の時点では、同一の画像条件(E-E')と弱いイメージング条件(F-F'')を用いて撮影された同じ領域の画像が、DNAエレクトロポレーション細胞の画像がイニシャルを使用して非常に飽和していたため示されている。イメージング条件。スケールバー = 20 μm. 寸法: 425.10 x 425.10 x 55 μm. 画像は、画像化されたすべての時間点にわたって最大強度投影として表示されます。ピクセルは 2.55 μs. 平均線 4.ピクセルあたりのビット数 = 16。顕微鏡メタデータ=反転共焦点顕微鏡、20倍の目的(材料の表を参照)Ex = 488 nm (15%)、594 nm (5.0%)イニシャルの場合。Ex = 488 nm (7.5%)、 594 nm (0.5%)最後の時点 (図 2F)の放出トラック S1 = 499-562 nm;S2 = 605-661 nm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:異なる細胞下構造を標的とする4つのmRNAの共エレクトロポレーションは非常に効率的である。HH3胚のエクトーダームは、mTurquoise2-ゴルジ、LifeAct-eGFP、H2B-シトリン、および膜チェリーをコードするmRNAで電気的に行われた。胚を固定し、エレクトロポレーション後4時間で画像化した。ほとんどの細胞は、4つのmRNA(87%)すべてを含む電極標的領域内で電気起電されます。代表的な数値(それぞれ3個の胚、n=2実験)を示す。スケールバー = 50 μm (A)4 つの mRNA (mTurquoise2-Golgi、LifeAct-eGFP、H2B-シトリン、および膜チェリー) をすべてマージします。(B) H2B-シトリンチャネルのみ(Ex = 488 nm (0.7%)、Em = 455-499 nm)。(C) mTurquoise2-ゴルジチャネル(Ex = 458 nm(22.0%)、Em = 455-499 nm)のみ。(D) マージH2B-シトリンとmTurquoise2-Golgiは、ゴルジがほとんどの細胞で核の片側をエンベロープすることを示しています。(E) LifeAct-eGFP チャネルのみ (Ex = 488 nm (0.7%)、 Em: 455-499 nm)(F) 膜チェリーチャネルのみ(Ex = 594 nm (37.1%)、Em = S2: 570-695 nm)(G) LifeAct-eGFPと膜チェリーを融合させると、ほとんどの細胞で重複が見られます。寸法 = 425.10 x 425.10。ピクセルは 1.58 μs. 平均線 4.ピクセルあたりのビット数 = 16。顕微鏡メタデータ= 反転共焦点顕微鏡, 20倍の目的 (材料の表を参照) Ex = 405 nm (2.4%), 458 nm (22.0%), 488 nm (0.7%), 594 nm (37.1%), 放出トラック S1 = 455-499 nm;S2 = 570-695 nm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:光漂白アッセイは、エレクトロポレーション後最初の5時間の間に電化mRNAの急速な分解を示す。H2B-シトリンを発現するmRNAで電光した細胞を含む100μm²領域の光漂白は、45分、2h、および5hポストエレクトロポレーションで行われる。胚を光漂白後の一定の時間間隔(3または5分)で画像化した。光漂白条件は以下の通りです:70%405nmレーザー、100回の反復、領域全体の約5分の持続時間。スケールバー 50 = μm.(A-A'') 45 分前および後漂白剤。Bは光漂白直後の胚を示し、Cは胚30分後の漂白後を示す。スケールバー = 50 μm (B-B''2 h プレブリーチとポスト漂白剤.光漂白領域内の細胞が漂白期間中にわずかに移動したため、正方形の周囲がシフトします。(C-C')5時間前および後漂白剤。(D-D')明るさが強化されたA-A'と同じ画像(最大値は11550に調整され、収集後の明るさを高めます)。(E-E')明るさが向上したB-B'と同じ画像(最大値は11550に調整され、収集後の明るさを高めます)。白い矢印は、周囲の細胞よりも高い蛍光回復を有する細胞を指しています。シアンの矢頭は、最近有人化した光漂白細胞を指しています。(F-F''明るさが向上したC-C'と同じ画像(最大値は11550に調整され、収集後の明るさを高めます)。寸法 = 425.10 x 425.10 x 42 μm. 画像は、画像化されたすべての時間点にわたって最大強度投影として表示されます。ピクセルは 1.58 μs. 平均線 4.ピクセルあたりのビット数 = 16。顕微鏡メタデータ=反転共焦点顕微鏡、20倍の目的(材料の表を参照)Ex = 488nm(1.5%)、放出トラックS1 = 508-553 nmこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:光漂白細胞における蛍光回収の定量化。(A) 漂白後の各期間に、漂白領域内のすべての細胞(〜35細胞)の蛍光強度を追跡した。回復した信号強度の速度は45分から2時間に大きく低下し、その後2時間から5時間に小さい低下が続きます。一番上の誤差バーは、平均からの標準偏差を表す各点に対して表示されます。表示される線は線形回帰直線です。R² は 45 分、2 時間、および 5 時間で、それぞれ 0.83、0.58、および 0.84 です。エラー バーの上半分が各ポイントに表示されます。(B) 漂白後の各期間に漂白領域内のすべての細胞(〜35細胞)の蛍光強度を追跡し、正常化せずにグラフ化した。回復した信号強度が45分から2時間に大きく低下し、その後2時間から5時間に小さく下がる。
補足ムービー1:mRNAエレクトロポレーションは、DNAエレクトロポレーションよりも早いタンパク質発現につながる。H2B-シトリンmRNAおよびH2B-mKate2 DNAをHH5胚の外胚にエレクトロポレートした。画像化された領域は、胚外組織および胚組織の境界にある。スケールバー = 50 μm (a) H2B-シトリンと H2B-mKate2 チャンネルの両方が示されています (Ex = 488 nm (15%), 594 nm (5.0%), Em: 499-562 nm;S2: 605-661 nm)。(b) 示されているmRNA H2B-シトリンチャネルのみ(Ex = 488 nm (15%)、Em = 499-562 nm)。(c) 示されている H2B-mKate2 DNA チャネルのみ (Ex = 594 nm (5.0%)、 Em = 605-661 nm)寸法 = 850.19 x 850.19 x 110 μm. 画像は、画像化されたすべての時間点にわたって最大強度投影として表示されます。ピクセルは 2.55 μs. 平均線 4.ピクセルあたりのビット数 = 16。顕微鏡メタデータ:反転共焦点顕微鏡、20倍の目的(材料の表を参照)Ex = 488 nm (15%)、594 nm (5.0%)、放出トラックS1 = 499-562 nm;S2 = 605-661 nm。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー2:mRNAの共エレクトロポレーションにより、異なる細胞挙動を動的に研究することができる。胚と胚外境界の間の細胞の放射状膨張は、mRNA(H2B-シトリンおよびmTurquoise2-Golgi)で電解され、外向きの移動中に画像化される。このムービーは、6分毎にイメージングすることにより、2~5時間のポストエレクトロポレーションの共焦点顕微鏡検査によって画像化された。 (a) H2B-シトリンとmTurquoise2-ゴルジチャンネルの両方が示されている(Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5.0%), Em = 446-526 nm;S2:508-553 nm)。(b) 表示されている H2B-シトリンチャネルのみ(Ex = 488 nm (5.0%)、Em = S2: 508-553 nm)。(c) mTurquoise2-Golgi チャネルのみが表示されます (Ex = 458 nm (28%)、 Em = 446-526 nm)寸法 = 425.10 x 425.10 x 32.5 μm. 画像は、画像化されたすべての時間点にわたって最大強度投影として表示されます。ピクセルは 0.79 μs. 平均線 4.ピクセルあたりのビット数 = 16。顕微鏡メタデータ= 反転共焦点顕微鏡, 20倍の目的 (材料の表を参照) Ex = 458 nm (28%), 488 nm (5.0%), 放出トラック S1 = 446-526 nm;S2 = 508-553 nm。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、ウズラ胚をガストレーションする細胞にmRNAを正確にマイクロインジェクトして電気ポレートする方法について段階的に説明しました。インビトロ合成mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証した(図2および3)。電気起電mRNAから翻訳されたH2B-シトリンタンパク質からの蛍光は、約20分以内に共焦点顕微鏡検査によって検出され、FP蛍光で1時間増加した(図3、補足ムービー1)。これは驚くほど速く、シトリン32、33の推定成熟時間に近い。DNAベクターから発現した胎児は、2〜3時間後に検出された(図3、補足。ムービー 1) は、以前のレポート 8、34、35に似ています。様々なFPは、ユニークな成熟時間を持っているので、高度な計画は、実験に望まれるスペクトルの区別と成熟運動学の面で理想的なFPが選択されることを保証します。さらに、合成されたmRNAは、DNAベクター11よりも効率的に胚細胞を共生させる。トランスフェクション効率が高いほど、単一(図2)またはmRNAの複数の集団(図4)を有する対象領域でより多くの細胞がトランスフェクションされる結果が生じる。
mRNAの安定性は高度に調節され、ポリアデニル化、スプライシング、翻訳、二次構造、および翻訳されていない領域の影響を受け、いくつかの36、37を挙げることができます。細胞内の内因性および合成されたmRNAの両方の半減期は、分から日36、38まで変化しうる。我々は、既存のmRNAコードH2B-シトリンタンパク質を漂白するために光漂白(FRAP)後の生体内蛍光回収に使用し、最初の2時間のエレクトロポレーション後の最も顕著なH2B-シトリン蛍光回収を観察した(図5および6)異なるmRNAは間違いなく、その長さ、内部配列、5'および3'修飾36、37に基づいて異なる半減期を持つので、それぞれが必要に応じてアッセイされなければなりません。
重要なイメージングは、通常、高品質のイメージングと高速で毒性の低いイメージング39、40の最適な条件間のトレードオフを必要とします。イメージングの場合、胚細胞への光漂白および光損傷を最小限に抑えるために、できるだけ低いレーザーパワーを使用することをお勧めします(プロトコルのステップ5.3の注記を参照)40。高速なコレクションのための顕微鏡設定を変更する(例えば、より速いスキャン速度、より少ない平均化)多くの場合、必要な画像解像度41を失うことなく助けることができる。最後に、収穫、エレクトロポレーション、イメージングの際に胚の取り扱いと操作に注意を払う必要があります(ステップ4参照)。初期段階の胚は繊細であり、容易に損傷を受ける可能性がある。
全体的に、mRNAエレクトロポレーションの正確なタイミングと正確な局在化は、mRNA転写物の迅速な発現、共トランスフェクション効率、および迅速な減衰を利用する摂動実験を可能にします。目的の遺伝子の過剰発現または誤発現は、合成されたmRNAのエレクトロポレーションを通じて達成することができる。各mRNAの濃度をちらつかせないのは、あまりにも多くのmRNAを電気ポレートすると非特異的な細胞毒性を引き起こす可能性があるが、mRNAが少なすぎると所望の細胞に標識が付着したり、表現型変化を適切に誘導したりしなくなる可能性があるためです。可視化のためのFP融合マーカーをコードするmRNAのインビトロ合成のために生成された多数のベクターは、様々な動物モデルシステムから既に存在する多様な生物学的プロセスの摂動のための遺伝子産物を変更する。インビトロmRNA合成用に設計されたこれらの構造の多くは、非営利のプラスミドリポジトリから迅速かつ安価に得ることができます。
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Disclosures
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作品に役立つ洞察をデビッド・ハスに感謝します。この研究は、ローズヒルズ財団サマーリサーチフェローシップ(2016-2018)とUSCプロボストのM.T.、サバン研究所内壁画研修前博士賞、および大学の一部で支援されました。南カリフォルニア学部研究員プログラム賞
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2 μm filter and store it at 4 ?C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
References
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