Summary
对流增强输送(CED)是一种通过直接灌注大量组织,使治疗药物有效输送到大脑的方法。该过程需要使用导管和优化的注射程序。该协议描述了一种将抗体送入小鼠大脑的CED方法。
Abstract
对流增强输送 (CED) 是一种神经外科技术,利用导管系统能够有效灌注大脑容量。这种方法提供了一种安全分娩方法,通过血脑屏障(BBB),从而允许治疗与不良BBB渗透性或那些不需要全身接触,例如,由于毒性的治疗。CED 要求优化导管设计、注射协议和内福的特性。通过该协议,我们描述了如何执行含有高达20μg的抗体的溶液的CED到小鼠的牛精。它描述了步进导管的制备,在体外测试,并使用斜坡注射程序在小鼠中执行CED。该协议可以很容易地调整其他输注量,并可用于注射各种示踪剂或药理活性或非活性物质,包括化疗剂、细胞因子、病毒颗粒和脂质体。
Introduction
血脑屏障 (BBB) 形成一个半渗透边界,将中枢神经系统 (CNS) 与血液循环分离。然而,在各种疾病的背景下,如脑肿瘤、阿尔茨海默氏病(AD)或帕金森病(PD)等疾病,达到CNS是必要的。这成为新疗法开发的重要,特别是如果被测试的药物表现出较差的BBB渗透性或其全身暴露可能导致危险的毒性1,2。一些临床使用的抗体显示这两个功能。解决这个问题的方法是直接在BBB后面提供治疗药物。
对流增强输送(CED)是一种神经外科技术,能够有效灌注大脑容量。这是通过在目标区域通过手术安装一个或多个导管来实现的。在药物应用过程中,导管开口处形成压力梯度,成为组织3、4中迷剂的驱动力。因此,决定灌注范围2、4、5的不是输液的持续时间,而不是扩散系数。与传统的基于扩散的脑内注射方法2、6相比,这提供了在更大的脑体积上均匀地输送的内福剂。同时,这种分娩方式具有较低的组织损伤风险2。因此,CED 可以安全有效地给常规化疗药物用于治疗中枢神经系统肿瘤,以及提供免疫调节剂或许多其他中枢神经系统疾病中的抗性和对抗性抗体2 ,7,8,9.CED目前正在测试帕金森病,阿尔茨海默氏病,以及高档胶质瘤2,7,8,10,11的疗法。
导管设计和注射方案是影响CED 10、12、13、14、15、16结果的最重要因素之一。此外,它要求特定的物理化学性质,包括中等大小的颗粒,一个电子电荷,和低组织亲和力10,17。 这些参数中的每一个都必须根据大脑区域的组织特征进行潜在的调整,以瞄准2,10,17。
在这里,我们描述了将抗体溶液的CED执行到小鼠的牛锥(纹状体)的方法。此外,该协议包括在实验室设置中制备阶梯导管,在体外测试和执行CED。
文献中有多种导管设计,不同形状的导管、所用材料和导管开口数 12、15、18、19、20 ,21,22.我们使用的阶梯导管由熔融的二氧化硅毛细管制成,从钝端金属针伸出1毫米。这种导管设计可以很容易地在研究实验室制造,并可重复提供良好的CED结果,当在体外测试与基因胶块与物理参数类似于脑气囊在体内23。
此外,我们实施斜坡方案,在体内提供5μL的芬福。在这样的协议中,注射率从0.2μL/min提高到最大0.8μL/min,从而最大限度地减少了导管内液倒流的机会以及组织损伤的风险16。使用该协议,我们在11分钟30秒内成功地在5μL的PBS中用高达20μg的抗体给小鼠。
该协议可以很容易地调整其他输注量或注射各种其他物质,如化疗,细胞因子,病毒颗粒或脂质体2,10,14,18 ,22.如果使用与磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或人工脑脊液 (aCSF) 抗体溶液相比具有巨大物理化学特性的富化液,建议采取额外的验证步骤。对于导管组件、验证和 CED,我们使用一个立体定向机器人描述所有步骤,该机器人的钻头和喷射单元安装在常规立体定向框架上。此过程也可以通过连接到可编程微输液泵的手动立体定向框架执行,该泵可驱动所述玻璃微注射器。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得瑞士州兽医局批准,许可证号为 ZH246/15。
1. 步进导管的准备
- 为导管步骤制备熔融石英管
- 将内径为 0.1 mm、壁厚为 0.0325 mm 的熔融硅毛细管切割至 30 mm 的长度。
- 使用微锻件检查管道有无裂纹和热抛光,以确保管开口表面光滑。
- 内管固定在金属针中
- 将 27 G 针头安装在 10 μL 注射器上,并将注射器放入立体定向机器人中。
- 使用机器人,将注射器移到坚硬表面上,并用针尖触摸。应在软件中记下或保存此位置,因为它将用作设置导管步长的参考表面。
- 提升针头,使熔融的硅毛细管位于针头内
- 将熔融的硅毛细管放入针头中,使 20 mm 的毛细管从针头伸出。
- 使用移液器,均匀地将 2 μL 的高粘度氰丙烯酸酯粘合剂涂在毛细管上,从金属针开始,在毛细管下端上方完成 10 mm,如图2所示。
- 使用立体定向机器人,将针头放下,直到金属针尖在参考表面上方 1 mm。这样,熔融的二氧化硅毛细管将固定在金属针中,并形成从金属针尖1毫米的步长。清除金属针末端形成的任何多余的胶水,以避免钝化台阶。
- 等待 15 分钟,使胶水硬化,用导管从立体定向机器人中取出注射器。通过在显微镜下检查导管尖端,确认在步骤中已去除所有多余的胶水。
- 使用一块甘蔗测试步进导管
- 在传统的凝胶托盘中制备PBS中的0.6%甘蔗溶液,等待其聚合。将角胶切成约 20 mm x 20 mm 块。在使用之前,请将方块浸入 PBS 中。
- 手动将阶梯导管注射器填充过滤锥蓝的 10 μL 0.4% 溶液。
- 使用立体定向机器人,以 0.2 μL/min 点发 1 μL,以评估固定过程中导管步骤的密封性。胰盘蓝色溶液应仅在导管尖端可见。用纸巾擦去。
- 将角性障碍放入立体定向机器人中并校准机器人,以便导管尖端与角玫瑰块表面参照。
- 对 CED 的喷射参数进行编程。
- 对于 5 μL 的注射体积,使用以下步骤:0.2 μL/min 时为 1 μL,在 0.5 μL/min 时为 2 μL,在 0.8 μL/min 时使用 2 μL。根据特定实验计划按比例更改每个步骤的持续时间,调整最终注射体积。
- 为了将溶液注射到鼠尾石(纹状体),在深度为 3.5 mm 的 1 mm 正面和 1.5–2 mm 的横向位置进行此类注射。
- 注射后,将导管留在原位2分钟,然后以1毫米/分钟缩回,以确保液体在大脑中适当分散,并在导管去除过程中密封注射道。
注:根据所使用的特定立体定向机器人,所有参数都可以编程为单个脚本。示例脚本可作为补充材料提供。.
- 启动 CED 程序,将 5 μL 的锥体蓝色溶液注射到腺苷组。
- 评估锥形玫瑰中锥形蓝色云的形状和导管管道上的潜在泄漏。锥形蓝色应形成一个椭圆形或圆形云与中心周围的导管尖端和直径至少1毫米。金属针尖上不应出现大的回流。
- 放置新的蔗甘原块,并在 0.2 μL/min 下开始 1 μL 的第二次注射,以评估导管与甘蔗的堵塞情况。注射开始后,试管蓝应再次开始从导管尖端形成云。
- 评估注射器中的剩余体积是否对应于 3 μL。任何变化都可能指向通过导管安装或注射器柱塞的液体泄漏。
- 如果所有测试注射都成功,导管密封良好,笔直,从导管尖端以外的其他部位未观察到锥体蓝色溶液,用去离子H2O (dH2O)清洗导管,直到看不到锥体蓝色的痕迹然后按以下方式清洗十次:70%乙醇和100%乙醇,然后用70%乙醇和清洁去离子水再次冲洗。
- 在干燥条件下存放导管。
2. 对流增强的抗体溶液输送到毛里脑
注:根据当地的动物福利条例,可以实施各种类型的麻醉剂、镇痛药和抗生素。该协议描述了注射麻醉的使用。吸入麻醉剂,如异构体,也可以通过在立体定向框架上安装鼻罩使用。此外,我们建议在饮用水中添加抗生素以预防感染。
- 手术设置
- 准备麻醉剂和解毒剂溶液。小鼠可以使用含有芬太尼(0.05毫克/千克)、中子兰(5毫克/千克)和模子胺(0.5毫克/千克)的三组分麻醉,在无菌dH2O中稀释。我们使用两种解毒剂溶液执行两步唤醒程序,一种在无菌 dH2O(第一种解毒剂溶液)中含有氟马泽尼 (0.5 mg/kg) 和丁丙诺啡 (0.1 mg/kg)。第二种在无菌 dH2O(第二种解毒剂溶液)中含有阿提帕美酮(2.5毫克/千克)。
- 准备含有卡洛芬(5.667毫克/千克)的麻醉液,用无菌dH2O稀释。
- 清洁立体定向框架、加热垫和立体定向机器人的元素。请记住,并非所有机器人部件都可以清洁,而不会有损坏的风险。有关清洁和准备使用的详细信息,请参阅机器人手册。
- 用阶梯导管组装注射器,用dH2O、70%乙醇和100%乙醇多次冲洗,然后用70%乙醇和dH2O再次冲洗。最后,用PBS或其他缓冲液冲洗注射器,用于制备颅内注射溶液,例如人工脑脊液。在整个过程中,注射器的柱塞应平稳、自由移动。
- 使用立体定向框架校准立体定向机器人软件。
- 通过确保机器人手臂自由移动以及喷射泵连接正确,并可以在没有任何干扰的情况下执行 CED 程序,测试立体定向机器人软件。这包括测试机器人运动、斜坡喷射、检查 2 分钟等待步数和导管回缩速度。所有参数都应符合第 1.3.5 点中描述的预编程 CED 程序。
- 将钻头插入钻头。建议在使用前对钻头进行消毒。
- 使用PBS或其他缓冲液(如ACSF)制备抗体溶液。在5μL中注射1至20μg的抗体,可在单个CED程序中注射。在进行实验之前,应测试其他体积和蛋白质量。请注意,使用高粘度溶液可能会导致导管堵塞。
- 使用稀释的抗体手动加载注射器。
- CED 将抗体注射到纹状体中
- 称量小鼠,并根据体重将三组分麻醉溶液注射到围肠中。注意注射时间。将鼠标转移到用加热垫加热的独立保持架上。
- 观察鼠标以确定镇定何时开始。一旦小鼠停止移动,在眼睛上涂上眼膏,保护角膜在手术过程中不会干涸。完全镇解通常从注射三组分麻醉溶液开始10-15分钟。
- 使用捏反射测试检查疼痛反应,以确保动物完全麻醉。
- 使用修剪头发器修剪头部。
- 用浸泡在碘溶液中的棉签对皮肤进行消毒。以圆周运动擦洗皮肤三次。
- 使用手术刀,沿着颅中线在眼睛水平上做一个10毫米的皮肤切口。
- 使用鼻夹和耳杆将鼠标固定在立体定向框架中。确保头骨表面是水平和紧密固定的。除了正确的解剖导航,这也是避免在钻孔和CED程序期间头骨倾斜的关键。
- 将注射器放入立体定向机器人中。
- 将钻头与参考点上导管的尖端同步。在软件中精确确定钻头和注射器的位置之间的关系至关重要,因此注射可以在大脑的所需解剖区域进行。
- 使用钳子缩回皮肤,并在头骨表面本地化布雷格玛。
- 使用钻头尖端在软件中引用布雷格马。
- 将钻头移到 1 mm 正面和 2 mm 横向位置,然后钻一个毛刺孔。小心不要损坏杜拉母体。
- 将注射器移到毛刺孔上。
- 从注射器中分配 0.5±1 μL,以确保导管中没有气泡。
- 启动第 1.3.5 点中描述的 CED 程序。观察颅骨表面是否有液体回流从注射点的痕迹。监测动物的呼吸速率。
- 一旦 CED 程序结束,导管从大脑中取出,以 0.2 μL/min 启动喷射泵,以检查 CED 期间导管堵塞。如果未发生堵塞,应立即看到来自导管尖端的喷射混合物滴。
- 在重复使用或存放导管之前,目视检查导管步骤在显微镜下是否有损坏或磨损的迹象,并如步骤 1.3.10 中一样清洁。
- 唤醒过程
- 轻轻地将鼠标从立体定向帧中取出。
- 用无菌盐水溶液清洗手术部位。
- 使用钳子,用骨蜡填充毛刺孔。
- 用薄尖钳合皮肤,在切口上涂上10μL移液器的手术胶水。等待 15-30 s 的胶水聚合。
- 通过皮下注射应用麻醉液。注意注射时间。
- 应用第一个解毒剂溶液。注意注射时间。
- 将鼠标转移到带有加热垫的单独笼子,并监控动物的启动反射。
- 如果小鼠在施用第一个解毒剂溶液15分钟后未获得全意识,则通过皮下注射应用第二种解毒剂溶液。
- 在恢复阶段监测动物。
- 检查1~2小时后以及第二天术后并发症。如有必要,重新涂抹痛感。
- 对于感染预防,在手术后1周内将磺胺毒素(最终浓度0.08%w/v)和三聚氰胺(最终浓度0.016%w/v)添加到动物可进入的饮用水中。
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Representative Results
该协议允许制备步进导管 (图 1),用于实验室环境中的 CED 程序。为了控制导管的泄漏、沿着针道回流和堵塞,我们建议将染料(例如锥形蓝色溶液)注射到腺苷酸块中。图 3描述了使用 CED 导管在 0.5 μL/分钟下注入 1 μL 后形成锥形蓝色云(图 3A)。在导管步骤的开头,看不到沿着针道的回流。此外,分散的云形成了一个所需的球形。这与使用常规的27 G钝端针(图3B)获得的结果形成鲜明对比,在这种方法中可以观察到显著的反流。
此外,CED 需要优化的注射程序。图 4显示了使用协议 (A) 中描述的斜坡过程将 2 μL 的锥形蓝色注射到甘蔗块中的结果,而注射的速率稳定为 2 μL/分钟 (B)。即使使用 CED 导管,高喷射速度也迫使导管回流。
最后,如图5所示,CED能够灌注大量的鼠脑。通过CED(上面板)或传统的bolus注射(底板),在5μL的PBS中与FITC-dextran结合的小鼠抗小鼠TNF®抗体注射。CED的灌注轮廓比传统注射更均匀,可观察到较少的组织损伤。在这两种情况下,在体素的基盒上都有抗体和dextran粒子的典型分布曲线。然而,注射抗体的分散分布图谱比高分子量dextran的扩散性更分散,说明了不同体间分布的差异。
图 1:显示 CED 阶梯导管尖端的示意图。正面 (A) 和侧 (B) 视图.计划规模不大。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:描述胶粘剂应用区域的示意图。熔融石英管的上部 10 mm 插入金属针中。从金属针尖开始,将胶粘剂涂抹在 10 mm 的管上。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:使用CED导管或钝端针进行输注结果的比较。使用 CED 导管 (A ) 和 27G 钝端针 (B) 在 0.5 μL/分钟时将 1 μL 的 0.4% 锥形蓝色注射到 0.6% 的甘蔗块中。在导管或针头取出后立即拍摄的照片。交叉标记导管或针尖。比例尺 = 5 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:斜率CED协议输注结果与稳定速率协议的输注结果比较。使用斜坡CED协议将2 μL的0.4%锥蓝色色注入0.6%的甘蔗组(0.2 μL/min时为0.4 μL,0.8 μL在0.5μL/min时为0.8μL/min(A)或2μL/min稳定速率注射协议(B )。在这两种情况下都使用了CED导管。导管取出后立即拍摄的照片。十字标记导管的尖端。比例尺 = 5 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:通过CED或常规博鲁斯注射的鼠纹灌注的代表性结果。小鼠被注射到纹状体(位置1毫米正面和2毫米横向从胸膜,深度3.5毫米),与1μg的灭鼠TNF®结合1μg的FITC-Dextran与分子量2,000 kDa在5μL的PBS。执行CED协议(上面板)或传统的博鲁斯注射(27 G针,注射速率1μL/分钟)(底部)。在CED程序后,通过受控的CO2窒息和在PBS中注入4%甲醛立即牺牲小鼠。对大脑进行解剖,并在4°C的PBS中用4%的甲醛进行24小时。随后,用15%蔗糖洗涤60分钟,在4°C下转移到30%蔗糖。24小时后,大脑被冻结在干燥的冰上。自由浮动部分(25 μm)使用多克隆山羊抗鼠IgG(H+L)抗体与Alexa Fluor 647结合,与DAPI反染色。使用斐济分发的 ImageJ 处理图像。10倍放大倍率,比例尺 = 5 mm. 每组 4 只小鼠;显示了具有代表性的图片。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
对流增强的输送,或压力介导的药物输注到大脑,首次提出在1990年初3。这种方法有望以可控的方式灌注血脑屏障后面的大脑容量2。然而,到目前为止,只有少数临床试验已经使用这种方法,部分是因为CED在临床设置已被证明是技术要求24,25。导管设计和输液方案的最新发展似乎已经克服了这些技术困难8,19。治疗抗体的临床实施取得进展,包括免疫调节检查点阻断剂的出现,等待在中枢神经系统疾病10的治疗中的应用。通过在实验设置中使用CED,例如使用小型啮齿动物模型,可以大大促进这一发展。
各种中枢神经系统疾病模型可用于小鼠。其中包括用于多发性硬化症 (MS) 的实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 和用于阿尔茨海默氏病 (AD)、帕金森病 (PD) 或脑癌的转基因模型。许多脑肿瘤模型还依赖于正交肿瘤接种的鼠胶质瘤细胞系或植入患者衍生的异种移植物。该协议允许将抗体溶液直接输送到特定的解剖位置,从而类似于治疗程序。它可以在各种实验布局中实现,其中抗体输送到精确的大脑区域中起着关键作用。
在小鼠中执行CED的关键因素是导管的可用性。该协议包含如何组装步进导管并在一系列体外实验中对其进行测试的精确描述。应该记住,步进管的熔融二氧化硅是脆性材料,与给定导管的CED质量可能会随着时间的推移而下降。建议通过重复协议第 1.3 节中所述的体外测试来控制体内实验之间的步进导管的参数。
该协议可以针对不同的注射量、内液和大脑区域进行调整。喷射体积可以通过按比例改变注射步骤的持续时间来操纵。在这里,我们描述了5μL的输注,但CED与10μL的抗体溶液已经报告在文献中使用类似的方法在鼠脑肿瘤模型中,实现良好的组织分布和灌注量大大超过博鲁斯注射7.此外,据报告,使用CED将液体应用于大鼠大脑22、26的液体,其体积高达28μL。非蛋白质物质也可以由CED注射,请记住,内富物不应具有高粘度,以避免狭窄的导管尖端堵塞。使用脂体,已经证明,注入分子的电荷可以极大地影响组织的渗透,中性或负电荷粒子能够分布在最大的体积22。如图5所示,FITC-dextran和抗体的分散方式不同:虽然抗体和FITC-dextran在体素中分布相似,但脑气囊瘤的抗体渗透比FITC-dextran更分散,显示较小的半径和更零散的分布模式。这突显了具有不同物理化学特性的化合物在CED轮廓上的差异。
此外,此处描述如图5所示的CED实验是将抗小鼠TNF®抗体注射到健康小鼠体内,因此假设纹状体中的目标量最小。共生抗原的存在将改变组织分布模式。它可以进一步受到解剖位点不均匀组织的影响,如图5所示,通过沿体形的软体分布。
最后,CED受间质流体流动的影响,在纹状体注射的情况下,可以将内液冲向侧心室27。事实上,即使组织在完成CED后立即固定,我们也可以观察到注射的抗体对心室壁的明显附着力(图5)。这可能进一步受中枢神经系统的病理条件的影响,例如在脑肿瘤的情况下。焦点坏死,常在高档脑肿瘤28中观察到,可影响间质流体的流动,从而改变infusate29的分布模式。其他病理条件,可能导致改变组织分布的麻胶相比,健康的帕伦奇马包括中风或创伤性脑损伤30。总之,每个系列的CED实验都必须经过仔细验证,以确保目标脑区域的灌注成功。
目前,研究人员经常使用植入式渗透泵将物质输送到CSF或脑(肿瘤)脑瘤31,32,33。在某些情况下,此处描述的 CED 可用作替代方案。它可以执行多次与频率取决于大脑区域,苯化类型,体积和麻醉协议使用。当长时间接触迷口导致耐受性或系统性副作用时,间歇性药物输送可能特别相关。可以想象,在高保留率和半寿命的 Fusates 交付的情况下,这种方法将代表根据 3R 原则的改进,因为无需植入泵。总之,该协议描述了一种将大量抗体溶液注入鼠纹状体的有效方法,并可针对其他大脑区域和体液类型进行调整。
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Disclosures
约翰内斯·沃姆·伯格是苏黎世大学专利申请(PCT/EP2012/070088)的发明人。米哈尔·贝芬格、琳达·舍尔哈默和约翰内斯·沃姆·伯格被提为苏黎世大学专利申请(EP19166231)的发明人。提交人没有额外的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了苏黎世大学(FK-15-057)、诺华医学生物学研究基金会(16C231)和瑞士癌症研究(KFS-3852-02-2016,KFS-4146-02-2017)对约翰内斯·沃姆·伯格和BRIDGE概念证明(20B1-1)的资助。#177300) 给琳达·舍尔哈默。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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