Summary
Konvektion-forbedret levering (CED) er en metode, der muliggør effektiv levering af terapeutisk i hjernen ved direkte perfusion af store vævs volumener. Proceduren kræver brug af katetre og en optimeret injektion procedure. Denne protokol beskriver en metode til CED af et antistof i en musehjerne.
Abstract
COnvection-forbedret levering (CED) er en Neurokirurgisk teknik, der muliggør effektiv perfusion af store hjerne volumener ved hjælp af et katetersystem. En sådan tilgang giver en sikker leveringsmetode ved at passere blod-hjerne barrieren (BBB), således at behandling med terapeutisk virkning med dårlig BBB-permeabilitet eller dem, for hvilke systemisk eksponering ikke ønskes, fx på grund af toksicitet. CED kræver optimering af kateter design, injektion protokol, og egenskaber af infusate. Med denne protokol beskriver vi, hvordan man udfører CED af en opløsning, der indeholder op til 20 μg antistof i den hale putamen af mus. Det beskriver forberedelsen af trin katetre, teste dem in vitro og udføre CED i mus ved hjælp af en ramping injektion program. Protokollen kan let justeres for andre infusions volumener og kan anvendes til injektion af forskellige røbestoffer eller farmakologisk virksomme eller inaktive substanser, herunder kemoterapeutika, cytokiner, virale partikler og Liposomer.
Introduction
Blod-hjerne barrieren (BBB) danner en halv gennemtrængelig grænse, der adskiller centralnervesystemet (CNS) fra blodcirkulationen. At nå CNS med Therapeutics er dog nødvendigt i forbindelse med forskellige sygdomme, ligesom hjernetumorer, Alzheimers sygdom (AD) eller Parkinsons sygdom (PD) blandt andre1. Dette bliver vigtigt i udviklingen af nye terapier, især hvis det testede lægemiddel udviser dårlig BBB permeabilitet eller dets systemiske eksponering kan føre til farlig toksicitet1,2. Nogle af de klinisk anvendte antistoffer viser begge disse funktioner. En løsning på dette problem ville være at levere de Therapeutics direkte bag BBB.
COnvection-forbedret levering (CED) er en Neurokirurgisk teknik, der muliggør effektiv perfusion af store hjerne volumener. Dette opnås ved kirurgisk installation af et eller flere katetre i målområdet. Under lægemidlet ansøgning, en trykgradient dannes ved åbningen af kateteret, som bliver drivkraften i vase dispersion i vævet3,4. Det er således varigheden af infusionen og ikke de diffusions koefficienter, der bestemmer perfusionens rækkevidde2,4,5. Dette giver ensartet levering af infusatet over en meget større hjernevolumen sammenlignet med konventionelle, Diffusion baseret intracerebral injektion metoder2,6. På samme tid, denne levering modalitet har en lavere risiko for vævsskade2. Derfor kan CED muliggøre sikker og effektiv administration af konventionelle kemoterapeutika til behandling af CNS tumorer, samt levering af immunmodulerende midler eller agonistiske og antagonistiske antistoffer i en lang række andre CNS lidelser2 ,7,8,9. CED er i øjeblikket testet i behandlinger af Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, samt høj kvalitet gliom2,7,8,10,11.
Kateter design og injektion regime er blandt de vigtigste faktorer, der påvirker resultatet af CED 10,12,13,14,15,16. Desuden kræver det specifikke fysisk-kemiske egenskaber af infusatet, herunder moderat størrelse af partiklerne, en anionisk ladning, og lav væv affinitet 10,17. Hver af disse parametre skal være potentielt justeret i henhold til de histologiske træk i hjernen region at være målrettet2,10,17.
Her beskriver vi metoder til at udføre CED af en antistof opløsning i musene hale putamen (striatum). Desuden omfatter protokollen forberedelse af trin katetre i et laboratorie opsætning, afprøvning af dem in vitro og udførelse af CED.
Der er flere kateter design til rådighed i litteraturen, som afviger ved formen af kanyle, de anvendte materialer og antallet af kateter åbninger12,15,18,19,20 ,21,22. Vi bruger et trin kateter lavet af en smeltet silica kapillar fremspringende 1 mm fra en stump metal nål. Dette kateter design kan let fremstilles i et forskningslaboratorium og reproducerbart giver gode resultater, når de testes in vitro med agopstået blokke med fysiske parametre, der ligner hjernens parenkym in vivo23.
Desuden implementerer vi et ramping-regime til levering af 5 μL infusat in vivo. I en sådan protokol øges injektionshastigheden fra 0,2 μl/min til maksimalt 0,8 μl/min, hvilket minimerer chancerne for infusat refluks langs kateteret samt risiko for vævsskader16. Ved hjælp af denne protokol har vi med succes administreret mus med op til 20 μg antistof i 5 μL PBS i løbet af 11 min 30 s.
Protokollen kan let justeres for andre infusions volumener eller for injektion af forskellige andre stoffer, fx kemoterapeutika, cytokiner, virale partikler eller Liposomer2,10,14,18 ,22. I tilfælde af at bruge infusat med drastisk forskellige fysisk-kemiske egenskaber sammenlignet med en fosfat Buffered saltvand (PBS) eller kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) opløsning af antistoffer, anbefales yderligere valideringstrin. For kateter samling, validering og CED beskriver vi alle trin ved hjælp af en Stereotaktisk robot med en bore-og Indsprøjtnings enhed monteret på en almindelig Stereotaktisk ramme. Denne procedure kan også udføres med en manuel Stereotaktisk ramme forbundet til programmerbar mikroinfusions pumpe, der kan køre de beskrevne glas mikrosprøjter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af det schweiziske kantonale Veterinærkontor under licensnummer ZH246/15.
1. klargøring af trin katetre
- Klargøring af en smeltet silica slange til trin af kateteret
- Skær den smeltet silica kapillær med indvendig diameter på 0,1 mm og vægtykkelse på 0,0325 mm slange til en længde på 30 mm.
- Undersøg slangen for revner og varme polere enderne ved hjælp af en mikroforge for at sikre slange åbninger har en glat overflade.
- Fiksering af det indvendige rør i en metal nål
- Monter en 27 G nål på en 10 μL sprøjte og Anbring sprøjten i en Stereotaktisk robot.
- Brug robotten til at flytte sprøjten over en hård overflade og røre den med nålens spids. Denne position skal noteres eller gemmes i softwaren, fordi den vil fungere som en referenceflade til indstilling af længden af kateter trinnet.
- Løft nålen for at muliggøre anbringelse af smeltet silica kapillær inde i nålen
- Placer den smeltet silica kapillær i nålen sådan, at 20 mm af kapillar er fremspringende fra nålen.
- Ved hjælp af en pipette fordeles 2 μL højviskositets cyanoacrylat-klæbemiddel jævnt over kapillær, begyndende fra metal nålen og efter behandling 10 mm over den nedre ende af kapillar, som vist i figur 2.
- Brug den stereotaktiske robot til at sænke nålen, indtil spidsen af metal nålen er 1 mm over reference overfladen. Denne måde smeltet silica kapillær vil blive fastgjort i metal nålen og vil danne et 1 mm skridt fra spidsen af metal nålen. Fjern ethvert overskud af lim formning i enden af metal nålen for at undgå at sløvhed trinnet.
- Vent 15 min for lim til at hærde og fjerne sprøjten med kateteret fra den stereotaktiske robot. Bekræft, at på trinnet er al overskydende lim blevet fjernet ved at kontrollere spidsen af kateteret under et mikroskop.
- Afprøvning af trin kateteret ved hjælp af en blok af agopstået
- Forbered 0,6% agopstået opløsning i PBS i en konventionel gel bakke og vent, indtil den polymeriserer. Skær agopstod i ca. 20 mm x 20 mm blokke. Indtil brug, holde blokkene nedsænket i PBS.
- Fyld trin kateter sprøjten manuelt med 10 μL 0,4% opløsning af filtreret trypan og et blå.
- Ved hjælp af den stereotaktiske robot dispenserer 1 μL ved 0,2 μL/min for at vurdere forseglingen af katetrets trin under fikserings proceduren. Trypan blå opløsning skal være synlig udelukkende på spidsen af kateteret. Tør det af med et papirvæv.
- Placer den aganerede blok i den stereotaktiske robot og Kalibrer robotten, så spidsen af kateteret refereres til overfladen af aganerede blokken.
- Program mere injektions parametrene for CED.
- For Injektionsvolumen på 5 μL skal du bruge følgende trin: 1 μL ved 0,2 μL/min, derefter 2 μL ved 0,5 μL/min og 2 μL ved 0,8 μL/min. Juster den endelige Injektionsvolumen i henhold til den specifikke forsøgsplan ved forholdsmæssigt at ændre varigheden af hver af trinene.
- For at injicere opløsningen i murine caudatus putamen (striatum), skal du udføre en sådan injektion i en position 1 mm frontal og 1,5 – 2 mm lateral fra bregma i dybden på 3,5 mm.
- Efter injektionen skal kateteret være på plads i 2 min og derefter trække sig tilbage ved 1 mm/min for at sikre korrekt dispersion af væsken i hjernen og forsegling af injektions kanalen under kateter fjernelse.
Bemærk: Afhængigt af den specifikke sterilitotaktiske robot, der anvendes, kan alle parametre programmeres ind i et enkelt script. Et eksempelscript er tilgængeligt som supplerende materiale..
- Start CED-proceduren, og Injicer 5 μL trypan og et Blue-opløsning i aghas-blokken.
- Vurder formen af Cloud of trypan og et Blue i aghas og potentiel lækage langs kateter kanalen. Trypan Blue skal danne en ellipsoide eller en rund Sky med centrum omkring kateterspidsen og en diameter på mindst 1 mm. Ingen større tilbagestrømning over spidsen af metal nålen skal være synlig.
- Placer en ny agantet blok og start en anden injektion på 1 μL ved 0,2 μL/min for at vurdere tilstopning af kateteret med agantet. Trypan Blue bør igen begynde at danne en sky fra spidsen af kateteret umiddelbart efter starten af injektionen.
- Vurder, om den resterende volumen i sprøjten svarer til 3 μL. Eventuelle variationer kan pege i retning af en lækage af væske gennem kateter monterings-eller sprøjtestemplet.
- Hvis alle test indsprøjtninger er vellykkede, er kateteret godt forseglet, lige og ingen trypan og et blå opløsning observeres fra andre pletter end kateterspidsen, vask kateteret med deioniseret H2o (DH2o), indtil der ikke er synlige spor af trypan og et blå og derefter vaskes ti gange som følger: 70% ethanol og 100% ethanol efterfulgt af rødmen igen med 70% ethanol og rent deioniseret vand.
- Opbevar kateteret under tørre forhold.
2. konvektion-forbedret levering af antistof opløsning i murine hjernen
Bemærk: Afhængigt af lokale dyrevelfærd forordninger, forskellige typer af anæstetika, analgetika og antibiotika kan implementeres for denne procedure. Denne protokol beskriver brugen af injektion anæstesi. Inhalations anæstetika såsom isofluran kan også anvendes ved at montere en næse maske på den stereotaktiske ramme. Derudover anbefaler vi at tilføje antibiotika til drikkevandet for infektion profylakse.
- Kirurgisk opsætning
- Forbered anæstetika og antidot løsninger. Mus kan være sikkert bedøvet ved hjælp af en tre-komponent anæstesi indeholdende fentanyl (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) og medetomidin (0,5 mg/kg) fortyndet i steril dH2O. Vi udfører en to-trins Wake up procedure ved hjælp af to antidot løsninger, en indeholdende Flumazenil (0,5 mg/kg) og buprenorphin (0,1 mg/kg) i steril dH2O (første antidot opløsning). Den anden indeholder Atipamezol (2,5 mg/kg) i steril DH2O (anden antidot opløsning).
- Forbered analgesi opløsning indeholdende carprofen (5,667 mg/kg) fortyndet med steril DH2O.
- Rengør den stereotaktiske ramme, varmepuden og elementerne i den stereotaktiske robot. Husk, at ikke alle dele af robotten kan rengøres uden risiko for beskadigelse. Se i manualen til robotten for detaljer om rengøring og klargøring til brug.
- Saml sprøjten med trin kateteret og skyl den flere gange med dH2o, 70% ethanol og 100% ethanol efterfulgt af rødmen igen med 70% ethanol og DH2o. Endelig skylles sprøjten med PBS eller andre buffere, der skal anvendes til fremstilling af opløsningen til intrakraniel injektion, fx kunstig cerebrospinalvæske. Sprøjtens stempel skal bevæge sig jævnt og frit under hele proceduren.
- Kalibrer den stereotaktiske robot software med den stereotaktiske ramme.
- Test den stereotaktiske robot software ved at sikre, at robotarmene bevæger sig frit, og at indsprøjtningspumpen er korrekt tilsluttet og kan udføre CED-proceduren uden forstyrrelser. Dette omfatter afprøvning af robot bevægelse, ramping injektion, kontrol af 2 min vente trin og hastigheden af kateter retraktion. Alle parametre skal passe til den forudprogrammerede CED-procedure, der er beskrevet i punkt 1.3.5.
- Indsæt bore bitten i boret. Det anbefales at sterilisere bore bits før brug.
- Forbered antistof opløsning ved hjælp af PBS eller andre bufferopløsninger såsom aCSF. 1 til 20 μg antistof i 5 μL kan injiceres i en enkelt CED-procedure. Andre mængder og protein mængder bør testes, før forsøget udføres. Vær opmærksom på, at brug af højviskositets opløsninger kan føre til tilstopning af kateter.
- Læg sprøjten med det fortyndede antistof manuelt.
- Antistof injektion ved CED i striatum
- Veje musen og injicere tre-komponent anæstesi opløsning i bughinden i henhold til kropsvægten. Bemærk injektionstiden. Overfør musen til et separat bur opvarmet med en varmepude.
- Overhold musen for at bestemme, hvornår sedationen starter. Så snart musen holder op med at bevæge sig, anvende oftalmologiske salve på øjnene for at beskytte hornhinden fra udtørring under operationen. Fuld sedation starter normalt 10 – 15 min fra injektion af den tre-komponent anæstesi opløsning.
- Kontroller smerter reaktioner ved hjælp af pinch-refleks test for at sikre fuld anæstesi af dyret.
- Barberer hovedet ved hjælp af en hårtrimmer.
- Desinficer huden med vatpinde gennemblødt i jod opløsning. Skrub huden tre gange i cirkulær bevægelse.
- Ved hjælp af en skalpel, lav en 10 mm hud indsnit langs kranie midterlinjen efter behandling på øjenhøjde.
- Fastgør musen i den stereotaktiske ramme ved hjælp af næseklemmen og ørekopperne. Sørg for, at kraniets overflade er vandret og tæt sikret. Bortset fra korrekt anatomisk navigation er dette også afgørende for at undgå at vippe kraniet under boring og CED-proceduren.
- Anbring sprøjten i den stereotaktiske robot.
- Synkroniser bore bitten med spidsen af kateteret på et referencepunkt. Det er afgørende, at forholdet mellem bore Rens position og sprøjten bestemmes præcist i softwaren, så injektionen kan udføres i den ønskede anatomiske region af hjernen.
- Træk huden tilbage ved hjælp af pincet og lokalisere bregma på kraniets overflade.
- Reference bregma i softwaren ved hjælp af spidsen af bore bitten.
- Flyt boret til en position 1 mm frontal og 2 mm lateral fra bregma og bore et Burr hul. Pas på ikke at beskadige dura mater.
- Bevæg sprøjten over Burr hullet.
- 0,5 – 1 μL dispenserer fra sprøjten for at sikre, at der ikke er luftbobler tilbage i kateteret.
- Start det CED-program, der er beskrevet i punkt 1.3.5. Observere kraniets overflade for eventuelle spor af væske tilbagestrømning fra injektionsstedet. Overvåge dyrets åndedræts hastighed.
- Når CED-programmet er overstået, og kateteret trækkes ud af hjernen, skal du starte indsprøjtningspumpen med 0,2 μL/min for at kontrollere, om kateter tilstopning under CED. Hvis ingen tilstopning indtraf, bør du straks se en dråbe af injektion mix kommer fra kateterspidsen.
- Før du genbruger eller opbevarer kateteret, skal du visuelt undersøge kateter trinnet for eventuelle tegn på beskadigelse eller slid under et mikroskop og rengøre det som i trin 1.3.10.
- Opvågning af proceduren
- Fjern forsigtigt musen fra den stereotaktiske ramme.
- Vask operationsstedet med steril saltvandsopløsning.
- Ved hjælp af pincet fyldes Burr hullet med knogle voks.
- Luk huden med tynde spidser, og Påfør kirurgisk lim med en pipette på 10 μL over snittet. Vent 15 – 30 s for limen til polymeriserer.
- Anvend analgesi opløsning ved subkutan injektion. Bemærk tidspunktet for injektionen.
- Anvend den første antidot-opløsning. Bemærk tidspunktet for injektionen.
- Overfør musen til et separat bur med en varmepude og overvåge dyret for chok reflekser.
- Hvis musen ikke har opnået fuld bevidsthed 15 min efter administration af den første antidot opløsning, skal du anvende den anden antidot opløsning ved subkutan injektion.
- Overvåge dyrene i genvindings fasen.
- Check 1 – 2 h senere samt den næste dag for postoperative komplikationer. Om nødvendigt anvendes analgesi igen.
- For infektions profylakse tilsættes sulfadoksin (endelig koncentration 0,08% w/v) og trimethoprim (slutkoncentration 0,016% w/v) til drikkevand, som dyrene har adgang til ad libitum i 1 uge efter operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol muliggør fremstilling af trin katetre (figur 1) til brug i CED-proceduren i et laboratoriemiljø. For at kontrollere katetre for lækage, refluks langs nåle kanalen og tilstopning, anbefaler vi at udføre injektioner af et farvestof, f. eks, trypan og et blå opløsning, i en agopstået blok. Figur 3 skildrer en sky af trypan og et Blue, der danner efter injektion af 1 μl ved 0,5 μl/minut ved hjælp af et CED-kateter (figur 3a). Ingen refluks langs nåle kanalen var synlig i begyndelsen af kateter trinnet. Desuden dannede den spredte Sky en ønsket sfærisk form. Dette er i kontrast til resultaterne opnået ved hjælp af en konventionel 27 G stump ende nål (figur 3b), hvor signifikant refluks kunne observeres.
Desuden kræver CED en optimeret injektionsprocedure. Figur 4 viser resultaterne af injektion af 2 μl trypan og et Blue i en agopstået blok ved hjælp af ramping-proceduren beskrevet i protokollen (A) sammenlignet med en injektion med en konstant hastighed på 2 μl/minut (B). Høj injektionshastighed tvang refluks langs kateteret, selv når et CED kateter blev brugt.
Endelig muliggør CED, som vist i figur 5, perfusion af store mængder af murine hjernen. Mus blev injiceret med en rotte anti-mus TNFα antistof kombineret med FITC-dextran i 5 μL PBS af CED (øvre panel) eller ved en konventionel bolt injektion (bundpanel). Perfusions profilen for CED var mere ensartet end ved konventionel injektion, og mindre vævsskade kunne observeres. I begge tilfælde var der en typisk fordelingsprofil for antistof-og dextran-partikler over Corpus callosum. Dispersions profilen for det injicerede antistof var imidlertid mere diffus end for dextran med høj molekylvægt, hvilket eksemplificerer forskelle i fordelingen mellem forskellige infusater.
Figur 1: en skematisk tegning, der viser CED Step kateterspidsen. Frontal (A) og side (B) synspunkter. Ordning er ikke op til skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: en skematisk tegning, der skildrer klæbe stoffets applikationsområde. De øverste 10 mm af smeltet silica slange er indsat i metal nålen. Påfør klæbemidlet på 10 mm slange startende fra spidsen af metal nålen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af infusions resultater ved brug af CED-kateter eller en stump-ende nål. Injektion af 1 μL 0,4% trypan og et blå i en 0,6% agopstået blok ved 0,5 μL/minut ved brug af et CED-kateter (a) og en 27g stump-ende nål (B). Billeder taget umiddelbart efter kateteret eller nål tilbagetrækning. Kryds markerer spidsen af kateteret eller nål. Skala bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: sammenligning af infusions resultater af ramping CED-protokollen med steady rate-protokol. Injektion af 2 μL 0,4% trypan og et blå i 0,6% agopstået blok ved hjælp af en ramping CED-protokol (0,4 μL ved 0,2 μL/min, derefter 0,8 μL ved 0,5 μL/min og 0,8 μL ved 0,8 μL/min (a) eller en 2 μl/min steady rate Injection Protocol (B). I begge tilfælde blev der anvendt et CED-kateter. Billeder taget umiddelbart efter kateteret tilbagetrækning. Kryds markerer spidsen af kateteret. Skala bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater af murine striatum perfusion ved CED eller ved konventionel Mus blev injiceret i striatum (position 1 mm frontal og 2 mm lateral fra bregma, dybde på 3,5 mm) med 1 μg rotte anti-mus TNFα kombineret med 1 μg FITC-dextran med molekylvægten 2.000 kDa i 5 μL PBS. CED-protokol (øvre panel) eller en konventionel bolt indsprøjtning (27 G nål, injektion rate 1 μL/minut) blev udført (nederst). Mus blev ofret umiddelbart efter CED-proceduren ved kontrolleret CO2 -kvælning og perfeksieret med 4% formaldehyd i PBS. Hjerner blev dissekeret og derudover fikseret med 4% formaldehyd i PBS ved 4 °C i 24 timer. Efterfølgende blev hjerner vasket med 15% saccharose i 60 min og overført til 30% saccharose ved 4 °C. Efter 24 timer blev hjerner frosset på tøris. Fritflydende sektioner (25 μm) blev plettet ved hjælp af polyklonal ged anti-rotte IgG (H + L) antistof kombineret med Alexa fluor 647 og modfarvet med DAPI. Billeder blev behandlet ved hjælp af Fiji distribution af ImageJ. 10x forstørrelse, Scale bar = 5 mm. 4 mus pr. gruppe; der vises et repræsentativt billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konvektion-forbedret levering, eller tryk-medieret Drug infusion i hjernen, blev først foreslået i begyndelsen af 19903. Denne tilgang lover perfusion af store hjerne mængder bag blod-hjerne barrieren på en kontrolleret måde2. Men indtil videre er der kun blevet udført nogle få kliniske forsøg ved hjælp af denne fremgangsmåde, delvist fordi CED i en klinisk opsætning har vist sig at være teknisk krævende24,25. Den seneste udvikling i kateter design og infusions programmer synes at have overvundet disse tekniske vanskeligheder8,19. Fremskridt i klinisk gennemførelse af terapeutiske antistoffer, herunder fremkomsten af immunmodulerende check point blokerende agenter, afventer anvendelse i behandlingen af CNS lidelser10. Denne udvikling kan i høj grad forstærkes ved at anvende CED i den eksperimentelle opsætning, såsom brug af små gnaver modeller.
Forskellige CNS-sygdomsmodeller er tilgængelige i mus. Disse omfatter eksperimentel autoimmun hesteencephalitis (EAE) for multipel sklerose (MS) og genmanipulerede modeller for Alzheimers sygdom (ad), Parkinsons sygdom (PD), eller for hjernen kræft. Mange hjernetumor modeller også stole på ortotopisk tumor inokulering af murine gliom cellelinjer eller implantation af patient-afledte xenografts. Denne protokol muliggør levering af antistof opløsninger direkte til specifikke anatomiske steder, hvilket ligner terapeutiske procedurer. Det kan implementeres i forskellige eksperimentelle layouts, hvor levering af antistof i en præcis hjerneregion spiller en afgørende rolle.
Den kritiske faktor i udførelsen af CED i mus er tilgængeligheden af katetre. Denne protokol indeholder en præcis beskrivelse af, hvordan man samler et trin kateter og tester det i en række in vitro eksperimenter. Man skal huske på, at smeltet silica, som trin slangen er lavet er et skørt materiale og kvaliteten af CED med et givet kateter kan falde over tid. Det anbefales at kontrollere parametrene for trin katetre mellem in vivo-forsøgene ved at gentage de in vitro-test, der er beskrevet i protokollens afsnit 1,3.
Protokollen kan justeres for forskellige injektionsvolumener, typer af infusat og hjerneregioner. Injektionsvolumenet kan manipuleres ved proportionalt at ændre varigheden af Indsprøjtnings trinnene. Her beskriver vi infusion af 5 μL, men CED med 10 μL antistof opløsning er blevet rapporteret i litteraturen ved hjælp af en lignende tilgang i murine hjernen tumormodeller, opnåelse af fremragende vævsfordeling og perfusion mængder langt overstiger bolte injektion7 . Desuden er op til 28 μl infusat volumener blevet rapporteret ved anvendelse af CED til påføring af væsker i rotte hjernen22,26. Ikke-proteinholdige stoffer kan også injiceres af CED, idet der tages hensyn til, at infusatet ikke bør være af høj viskositet for at undgå tilstopning af det smalle kateterspids. Ved hjælp af Liposomer er det blevet påvist, at angrebet af de inanvendte molekyler i høj grad kan påvirke vævs penetrationen, med neutrale eller negativt ladede partikler, der er i stand til at blive distribueret over de største volumener22. Som afbildet i figur 5spredes FITC-dextran og antistof forskelligt: selv om både antistof og FITC-dextran fordeler på samme måde langs Corpus callosum, er antistof penetrationen af hjerneparenkyma mere diffus end for FITC-dextran, som viser en mindre radius og en mere plettet fordeling mønster. Dette understreger forskellene i CED-profilen mellem infusater med varierende fysisk-kemiske egenskaber.
Desuden blev CED-eksperimentet, der er beskrevet her og vist i figur 5 , udført med indsprøjtning af et anti-muse-TNFα-antistoffer i raske mus, så det var minimalt målbeløb i striatum. Tilstedeværelsen af cognate antigen vil ændre vævs fordelings mønsteret. Det kan påvirkes yderligere af inhomogent væv på et anatomisk sted, som afbildet i figur 5 ved fordeling af infusatet langs Corpus callosum.
Endelig påvirkes CED af strømmen af interstitiel væske, som i tilfælde af striatum injektion kan skylle infusatet mod de laterale ventrikler27. Faktisk, selv når vævet er fast umiddelbart efter endt CED, vi kan observere en markant vedhæftning af det injicerede antistof til ventrikel væggen (figur 5). Dette kan yderligere påvirkes af patologiske tilstande af CNS, fx i forbindelse med hjernetumorer. Fokal nekrose, ofte observeret i høj kvalitet hjernetumorer28, kan påvirke strømmen af interstitiel væske og dermed ændre fordelingen mønster af vase29. Andre patologiske tilstande, der kan føre til ændret vævsfordeling af infusat sammenlignet med sund parenkym omfatter slagtilfælde eller traumatisk hjerneskade30. Sammenfattende skal hver serie af CED-eksperimenter valideres omhyggeligt for at sikre en vellykket perfusion af målhjerne regionen.
I øjeblikket, forskere bruger ofte implantabelt udstyr osmotiske pumper til at levere stoffer i CSF eller hjernen (tumor) parenkym31,32,33. I visse tilfælde kan CED som beskrevet her bruges som et alternativ. Det kan udføres flere gange med frekvenser afhængigt af hjernen region, type infusate, volumen og anæstesi protokol anvendes. Intermitterende Drug levering kan være særligt relevant, når en udvidet eksponering for infusat fører til tolerance eller systemiske bivirkninger. Det er tænkeligt, at i tilfælde, hvor der leveres høj retention og Half-Life infusater, ville denne fremgangsmåde være en forbedring i henhold til 3R-princippet, da ingen pumpe implantation ville være nødvendig. Afslutningsvis, denne protokol beskriver en effektiv måde at inficere store mængder af antistof opløsning i murine striatum og kan justeres for andre hjerneområder og typer af infusate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes vom Berg er nævnt som en opfinder på patentansøgning (PCT/EP2012/070088) af universitetet i Zürich. Michal Beffinger, Linda Schellhammer og Johannes vom Berg er nævnt som opfindere på en patentansøgning (EP19166231) af universitetet i Zürich. Forfatterne har ingen yderligere finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra universitetet i Zürich (FK-15-057), Novartis Foundation for medicinsk-biologisk forskning (16C231) og Swiss Cancer Research (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) til Johannes vom Berg og BRIDGE proof of concept (20B1-1 _177300) til Linda Schellhammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
References
- Scherrmann, J. M.
- Barua, N. U., Gill, S. S. Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment. CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).
- Bobo, R. H., et al.
- Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).
- Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment. Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).
- Barua, N. U., et al. Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model. Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).
- Shoji, T., et al. Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models. Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).
- Souweidane, M. M., et al. Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial. The Lancet Oncology. , (2018).
- Zhang, X., et al. Targeting immune checkpoints in malignant glioma. Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).
- Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations. Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).
- Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N.
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Nash, K. R., Gordon, M. N. Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).
- Ohlfest, J. R., et al. Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma. Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).
- Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).
- Mamot, C., et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).
- Saito, R., et al. Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).
- Oh, S., et al. Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).
- Barua, N. U., et al. A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma. Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).
- Rosenbluth, K. H., et al. Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery. Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).
- Debinski, W., Tatter, S. B. Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors. Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).
- MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating. Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Sampson, J. H., et al. Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial. Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).
- Wick, W., Weller, M., et al. Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142). Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).
- Saito, R., Tominaga, T. Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas. Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).
- Bedussi, B., et al. Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system. Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).
- Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. Hallmarks of glioblastoma: a systematic review. ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).
- Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents. British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).
- Glushakova, O. Y., et al. Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration. Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).
- Vom Berg, J., et al. Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline. Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).
- Vom Berg, J., et al. Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).
- Kurdi, A., et al. Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice. British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).
