Summary
הסעה משופרת (משלוח) היא שיטה המאפשרת אספקה אפקטיבית של therapeutics למוח על ידי הפרזיה ישירה של כרכים רקמות גדולות. ההליך מחייב שימוש בקטטרים ובהליך הזרקה ממוטב. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה עבור הודעת הנוגדן למוח העכבר.
Abstract
הסעה משופרת (למעלה) היא טכניקה נוירוכירורגית המאפשרת הפריה אפקטיבית של כמויות גדולות של המוח באמצעות מערכת קטטר. גישה כזו מספקת שיטת מסירה בטוחה על ידי-העברת מחסום מוח הדם (BBB), ובכך לאפשר טיפול עם therapeutics עם העניים BBB-חדירות או אלה שעבורם חשיפה מערכתית אינה רצויה, למשל, בשל רעילות. משופרת דורש אופטימיזציה של העיצוב קטטר, פרוטוקול הזרקה, ומאפיינים של האינפופוסט. עם פרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לבצע את הפתרון המכיל עד 20 μg של נוגדן לתוך putamen העכבר של עכברים. הוא מתאר את הכנת קטטרים הפסיעה, בוחן אותם בתוך מבחנה וביצוע השימוש בעכברים באמצעות תוכנית הזרקה משופרת. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות עבור אמצעי אינפוזיה אחרים וניתן להשתמש בהם להזרקת משתמשים שונים או חומרים פעילים מבחינה פרמקולוגית או לא פעילים, כולל chemotherapeutics, ציטוקינים, חלקיקים נגיפי, וליפוזומים.
Introduction
מחסום מוח הדם (BBB) יוצר גבול חדיר למחצה המפריד בין מערכת העצבים המרכזית (CN) לבין מחזור הדם. להגיע לתוך ה-CN עם therapeutics הוא הכרחי עם זאת בהקשר של מחלות שונות, כמו גידולים במוח, מחלת אלצהיימר (AD) או מחלת פרקינסון (PD) בין האחרים1. זה הופך חשוב בפיתוח של טיפולים חדשים, במיוחד אם התרופה נבדק מציג חדירות bbb המסכן או חשיפה מערכתית שלה יכול להוביל רעילות מסוכנת1,2. חלק מהנוגדנים המשמשים קלינית להציג את שתי תכונות אלה. פתרון לבעיה זו יהיה להעביר את הtherapeutics ישירות מאחורי BBB.
הסעה משופרת (משלוח) היא טכניקה נוירוכירורגית המאפשרת הפריה אפקטיבית של כמויות גדולות של מוח. זה מושגת על ידי התקנת כירורגית אחד או יותר קטטרים באזור המטרה. במהלך יישום התרופה, הדרגתי לחץ נוצר בפתיחת הצנתר, אשר הופך את הכוח המניע של הפיזור infusate ברקמה3,4. לפיכך, משך העירוי אינו מקדמי הדיפוזיה הקובעים את טווח הפרפיוז2,4,5. זה מספק משלוח אחיד של האינפופוסט מעל נפח המוח הרבה יותר גדול לעומת קונבנציונאלי, דיפוזיה מבוסס גרם הזרקת שיטות2,6. באותו זמן, מודאליות זו מסירה יש סיכון נמוך יותר של נזק לרקמות2. בהתאם לכך, מותר להפעיל מינהל בטוח ואפקטיבי של chemotherapeutics קונבנציונאלי לטיפול בגידולים של מערכת העיכול, כמו גם מסירה של מתווכים אימונומודולטוריים או אגניים ונוגדנים אנטדיוניים בהמון הפרעות אחרות בתחומי העיכול2 ,7,8,9. לח הוא נבדק כעת טיפולים של מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, כמו גם בדרגה גבוהה glioma2,7,8,10,11.
העיצוב קטטר ואת משטר ההזרקה הם בין הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על התוצאה של שלח 10,12,13,14,15,16. יתרה מזאת, היא מחייבת תכונות פיזיוכימיות מסוימות של האינפופוסט, כולל גודל מתון של החלקיקים, מטען אנייוני, ואהדה לרקמות נמוכות 10,17. כל אחד מהפרמטרים הללו צריך להיות מותאם בהתאם לתכונות היסטולוגית של אזור המוח כדי להיות ממוקד2,10,17.
כאן אנו מתארים מתודולוגיה לביצוע ביצוע של פתרון נוגדן לתוך putamen הזנב (סטריאטום) של עכברים. יתר על כן, הפרוטוקול כולל הכנת קטטרים השלב בתוך הגדרת מעבדה, בדיקות אותם בתוך מבחנה וביצוע של לח.
ישנם מספר עיצובים קטטר זמין בספרות, שונות על ידי צורת הצינורית, החומרים המשמשים ואת מספר הפתחים קטטר12,15,18,19,20 ,21,22. אנחנו משתמשים קטטר צעד עשוי סיליקה מותך בולטות 1 מ"מ ממחט מתכת בקצה קהה. זה עיצוב קטטר יכול להיות מיוצר בקלות במעבדת מחקר ומגלה מעניקה תוצאות משופרת טוב כאשר נבדק בתוך מבחנה עם בלוקים agarose עם פרמטרים פיזיים דמוי המוח בתוך כימוסמה ב vivo23.
יתר על כן, אנו ליישם משטר השיא עבור אספקת 5 μL של infusate ב vivo. בפרוטוקול כזה שיעור ההזרקה גדל מ 0.2 μL/min ל מקסימום של 0.8 μL/min, ובכך למזער את הסיכויים של ריפלוקס לאורך הקטטר, כמו גם הסיכון של נזק לרקמות16. באמצעות פרוטוקול זה, יש לנו בהצלחה מנוהל עכברים עם עד 20 μg של נוגדן ב 5 μL של PBS במהלך 11 דקות 30 s.
הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות עבור אמצעי אינפוזיה אחרים או להזרקת חומרים אחרים שונים, לדוגמה chemotherapeutics, ציטוקינים, חלקיקים נגיפי או ליפוזומים2,10,14,18 ,22 במקרה של שימוש בחוסר השימוש בתכונות פיזיקליות שונות באופן דרסטי בהשוואה לתמיסת מלח (PBS) או לתמיסה מלאכותית (aCSF) של נוגדנים, מומלץ לבצע פעולות אימות נוספות. עבור הרכבה קטטר, ואלידציה-מדיה, אנו מתארים את כל השלבים באמצעות רובוט סטריאוטקטיקה עם מקדחה ויחידת הזרקה רכוב על מסגרת סטריאוטקטיקה רגילה. ניתן לבצע הליך זה גם עם מסגרת סטריאוטקטיקה ידנית המחוברת למשאבת מיקרו-אינפוזיה ניתנת לתכנות שיכולה לנהוג במיקרו מזרקים מזכוכית שתוארו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המשרד הווטרינרי של שוויץ תחת רישיון מספר ZH246/15.
1. הכנת קטטרים הפסיעה
- הכנת צינורות סיליקה התמזגו לשלב הקטטר
- חותכים התמזגו סיליקה קפילר עם קוטר פנימי של 0.1 מ"מ ועובי הקיר של 0.0325 מ"מ אבובים לאורך של 30 מ"מ.
- בדוק את אבובים עבור סדקים וחום להבריק את הקצוות באמצעות microforge ' כדי להבטיח פתחי אבובים יש משטח חלק.
- קיבוע הצינור הפנימי במחט מתכת
- הר a 27 המחט G על 10 μL מזרק ומניחים את המזרק ברובוט סטריאוטקטיקה.
- באמצעות הרובוט, להזיז את המזרק מעל משטח קשה ולגעת בו עם קצה המחט. מיקום זה יש לציין או להישמר בתוכנה, כי זה ישמש כמשטח התייחסות לקביעת אורך של שלב הקטטר.
- העלה את המחט כדי לאפשר מיקום של סיליקה מותך בתוך המחט
- מניחים את הקפילר התמזגו במחט כגון 20 מ"מ של נימי הוא בולט מן המחט.
- שימוש בפיפטה, התפשט באופן שווה 2 μL של הדבקה מופחתת בצמיגות גבוהה לאורך הקפילר, החל ממחט המתכת וגימור 10 מ"מ מעל לקצה התחתון של הנימים, כפי שמתואר באיור 2.
- באמצעות הרובוט סטריאוטקטיקה, הנמך את המחט עד קצה המחט המתכת היא 1 מ"מ מעל פני השטח ההפניה. בדרך זו את הנימי סיליקה התמזגו יהיה קבוע במחט המתכת ויהיה צעד 1 מ"מ מקצה מחט המתכת. הסר עודף דבק בסוף המחט מתכת כדי למנוע blunting את השלב.
- לחכות 15 דקות הדבק להרדן ולהסיר את המזרק עם הקטטר מן הרובוט סטריאוטקטיקה. ודא כי בשלב כל דבק עודף הוסר על ידי בדיקת קצה הקטטר מתחת למיקרוסקופ.
- בדיקת קטטר השלב באמצעות גוש של מעלה
- הכינו 0.6% הפתרון ב-PBS במגש ג'ל קונבנציונאלי והמתן עד שהוא מקרין. חותכים את agarose בערך 20 מ"מ x 20 מ"מ בלוקים. עד השימוש, לשמור את הבלוקים שקוע ב-PBS.
- באופן ידני למלא את המחט השלב מזרק עם 10 μL של 0.4% פתרון של טרימין כחול מסוננים.
- באמצעות הרובוט סטריאוטקטיקה, לוותר על 1 μL ב 0.2 μL/min כדי להעריך את האטימות של השלב של הקטטר במהלך הליך הקיבעון. הפתרון הכחול של טרימין צריך להיות גלוי אך ורק על קצה הצנתר. . נגב את זה עם רקמת נייר
- במקום לחסום את הצמח ברובוט סטריאוטקטיקה ולכייל את הרובוט כך קצה הקטטר מופנה נגד פני השטח של בלוק agarose.
- תכנת את פרמטרי ההזרקה ל-לח.
- עבור נפח ההזרקה של 5 μL, השתמש בצעדים הבאים: 1 μL ב-0.2 μL/min, ואז 2 μL ב-0.5 μL/min ו-2 μL ב-0.8 μL/min. כוונן את עוצמת הזריקה הסופית בהתאם לתוכנית הניסיונית הספציפית על-ידי שינוי פרופורציונלי של כל אחד מהשלבים.
- כדי להזריק את הפתרון לתוך מורטין מזונבת (סטריאטום), לבצע זריקה כגון במיקום 1 מ"מ חזיתית ו 1.5 – 2 מ"מ לרוחב מ bregma בעומק של 3.5 מ"מ.
- לאחר ההזרקה, להשאיר את הקטטר במקום 2 דקות ולאחר מכן לסגת ב 1 מ"מ/min כדי להבטיח פיזור תקין של הנוזל במוח ואיטום של מערכת ההזרקה במהלך הסרת קטטר.
הערה: בהתאם לשימוש ברובוט הסטרטקטיקה הספציפי, ניתן לתכנת את כל הפרמטרים לסקריפט אחד. קובץ script לדוגמה זמין כחומר משלים.
- הפעל את ההליך מוכן והכנס 5 μL של פתרון כחול מטריא לבלוק הצמח.
- העריכו את הצורה של הענן של טריכמין כחול בתוך הצמח ודליפת הפוטנציאל לאורך מערכת הקטטר. טרילאן כחול צריך ליצור אליפסואיד או ענן עגול עם המרכז סביב קצה הקטטר וקוטר של לפחות 1 מ"מ. אין לראות גב גדול על קצה מחט המתכת צריך להיות גלוי.
- מקום לחסום agarose חדש ולהתחיל הזרקה שנייה של 1 μL ב 0.2 μL/min כדי להעריך את סתימת הקטטר עם הצמח. טרילאן כחול צריך שוב להתחיל להרכיב ענן מקצה הקטטר מיד לאחר תחילת הזריקה.
- העריכו אם אמצעי האחסון שנותר במזרק תואם ל-3 μL. כל וריאציות עשוי להצביע לכיוון דליפת נוזל דרך הרכבה קטטר או מזרק במזרק.
- אם כל זריקות הבדיקה מצליחים, הצנתר הוא אטום היטב, ישר לא טריכא פתרון כחול הוא נצפה ממקומות אחרים מאשר קצה הקטטר, לשטוף את הצנתר עם H2או (dH2o) עד אין עקבות של טריבין כחול גלויים ולאחר מכן לשטוף פי 10 כדלקמן: 70% אתנול ו 100% אתנול ואחריו שטיפה שוב עם 70% אתנול ומים נקי מיותר.
- אחסן את הקטטר. תחת תנאים יבשים
2. הסעה-משלוח משופר של פתרון נוגדן למוח מוריין
הערה: בהתאם לתקנות רווחה בעלי חיים מקומיים, סוגים שונים של הרדמה, משככי כאבים ואנטיביוטיקה ניתן ליישם עבור הליך זה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בהרדמה להזרקה. ניתן להשתמש גם בהרדמה מלאה של הרדמה כגון isofלוריאן על-ידי הרכבה של מסכת אף על מסגרת הסטריאוטקטיקה. בנוסף, אנו ממליצים להוסיף אנטיביוטיקה למים השתייה עבור מניעה זיהום.
- התקנה כירורגית
- הכינו פתרונות להרדמה ולנוגדן. עכברים יכולים להיות מורדם בבטחה באמצעות הרדמה שלושה רכיבים המכילים פנטניל (0.05 מ"ג/ק"ג), midazolam (5 מ"ג/ק"ג) ו medetomidine (0.5 מ"ג/ק"ג) מדולל ב-dH סטרילי2O. אנו מבצעים שני צעדים להתעורר הליך באמצעות שני פתרונות הנוגדן, אחד המכיל פלומאזניל (0.5 mg/ק"ג) ו בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) ב-dH סטרילי2O (פתרון הנוגדן הראשון). השני מכיל אטיפיאזול (2.5 מ"ג/ק"ג) ב-dH מעוקר2O (פתרון הנוגדן השני).
- להכין פתרון כאבים המכילים carprofen (5.667 מ"ג/ק"ג) מדולל עם dH סטרילי2O.
- נקו את מסגרת הסטריאוטקטיקה, את משטח החימום והאלמנטים של הרובוט הסטרטקטיק. זכרו כי לא כל חלקי הרובוט ניתן לנקות ללא סיכון של נזק. עיין במדריך לרובוט לקבלת פרטים על ניקוי והכנה לשימוש.
- להרכיב את המזרק עם קטטר צעד ולשטוף אותו פעמים רבות עם dH2O, 70% אתנול ו 100% אתנול ואחריו השטיפה שוב עם 70% אתנול ו-dH2O. לבסוף, לשטוף את המזרק עם PBS או מאגרים אחרים לשמש להכנת הפתרון להזרקה בתוך גולגולתי, למשל נוזל מלאכותי שדרתי. הבוכנה של המזרק צריכה לנוע בצורה חלקה וחופשית במהלך כל התהליך.
- כיול את תוכנת הרובוט הסטרטקטיקה עם מסגרת הסטריאוטקטיקה.
- בדוק את התוכנה הסטריאוטקטיקה רובוט על ידי להבטיח כי זרועות הרובוט לנוע בחופשיות, כי משאבת ההזרקה מחובר כראוי והוא יכול לבצע את ההליך מבלי לעשות הפרעות. זה כולל בדיקת תנועה רובוט, הזרקה הזריקה, בדיקת 2 דקות המתנה צעד ואת המהירות של הנסיגה קטטר. כל הפרמטרים צריכים להתאים את ההליך המותכנת מראש מראש שמתואר בנקודה 1.3.5.
- הכנס את סיבית ההסתעפות להסתעפות. מומלץ לחטא את פיסות המקדחה לפני השימוש.
- הכן פתרון נוגדן באמצעות PBS או פתרונות מאגר אחרים כגון aCSF. 1 עד 20 μg של נוגדן ב 5 μL ניתן להזריק בהליך מוברג יחיד. יש לבדוק אמצעי אחסון אחרים וכמויות חלבונים לפני ביצוע הניסוי. שים לב כי באמצעות פתרונות צמיגות גבוהה עשוי להוביל סתימת קטטר.
- לטעון ידנית את המזרק עם הנוגדן מדולל.
- הזרקת נוגדן על ידי החדרת לסטריאטום
- שוקלים את העכבר ומזריקים את פתרון ההרדמה של שלושה רכיבים לתוך הצפק בהתאם למשקל הגוף. שים לב לזמן ההזרקה. להעביר את העכבר לכלוב נפרד מחומם עם כרית חימום.
- להתבונן בעכבר כדי לקבוע מתי הרגעה מתחיל. ברגע העכבר מפסיק לנוע, להחיל משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי להגן על הקרנית מייבוש במהלך הניתוח. הרדמה מלאה מתחיל בדרך כלל 10 – 15 דקות מהזרקה של פתרון שלושה רכיבים הרדמה.
- בדוק תגובות כאב באמצעות בדיקת רפלקס לצבוט כדי להבטיח הרדמה מלאה של החיה.
- . תגלח את הראש בעזרת קוצץ שיער
- לחטא את העור עם מטליות כותנה ספוגה בתמיסת יוד. לקרצף את העור שלוש פעמים בהילוך מעגלי.
- באמצעות אזמל, לעשות חתך העור 10 מ"מ לאורך קו האמצע הגולגולת גימור על רמת העין.
- תקן את העכבר במסגרת הסטריאוטקטיקה באמצעות מהדק האף ופסי האוזן. ודא כי משטח הגולגולת הוא אופקי ומאובטח היטב. מלבד ניווט אנטומי נכון זה חיוני גם כדי למנוע הטיית הגולגולת במהלך הקידוח ואת ההליך לחות.
- הנח את המזרק ברובוט הסטרטקטיקה.
- סנכרן את סיבית ההסתעפות עם קצה הצנתר בנקודת התייחסות. חשוב שהקשר בין מיקום התרגיל למזרק נקבע בדיוק בתוכנה, כך שניתן לבצע את ההזרקה באזור האנטומי הרצוי של המוח.
- למשוך את העור באמצעות מלקחיים וברגמה לוקליזציה על פני הגולגולת.
- הפניה מרסגמה בתוכנה באמצעות קצה סיבית המקדחה.
- להעביר את התרגיל למיקום 1 מ"מ חזיתית ו 2 מ"מ לרוחב מתוך ברז ולקדוח חור בגולגולת. להיזהר לא לפגוע מאטר דורא.
- תזיז את המזרק. מעל חור הגולגולת
- מוותר 0.5 – 1 μL מן המזרק כדי להבטיח כי בועות אוויר לא נשארו בצנתר.
- הפעל את תוכנית ה-משופרת המתוארת בנקודה 1.3.5. שימו לב למשטח הגולגולת לכל עקבות של נוזל הזרמה מנקודת ההזרקה. . פקח על קצב הנשימה של החיה
- לאחר התוכנית שעברו למעלה והקטטר הוא נסוג מן המוח, להתחיל את המשאבה הזרקת ב 0.2 μL/min כדי לבדוק סתימת קטטר במהלך הבדיקה. אם לא התרחשה סתימת, אתה צריך מיד לראות droplet של ערבוב הזרקה מגיע קצה הקטטר.
- לפני שימוש חוזר או אחסון הקטטר, לבחון באופן חזותי את הצעד הקטטר עבור כל סימן של נזק או ללבוש תחת מיקרוסקופ ולנקות אותו כמו בשלב 1.3.10.
- מתעוררת הליך
- הסר בעדינות את העכבר ממסגרת הסטריאוטקטיקה.
- שטוף את אתר הניתוח. עם תמיסת מלח סטרילית
- באמצעות מלקחיים, למלא את חור הגולגולת עם שעווה העצם.
- סגור את העור עם מלקחיים דקים ולהחיל דבק כירורגי עם הצינורות 10 μL על החתך. לחכות 15-30 עבור הדבק כדי פולימלזציה.
- החלת תמיסת כאבים על ידי הזרקה תת עורית. . שים לב לזמן ההזרקה
- . החל את פתרון הנוגדן הראשון . שים לב לזמן ההזרקה
- להעביר את העכבר לכלוב נפרד עם כרית החימום ולפקח על החיה על רפלקסים מהבהיל.
- אם העכבר לא זכה בתודעה מלאה 15 דקות לאחר הממשל של פתרון הנוגדן הראשון, להחיל את פתרון הנוגדן השני על ידי הזרקה תת עורית.
- עקוב אחר בעלי חיים במהלך שלב ההחלמה.
- צ'ק 1 – 2 מאוחר יותר, כמו גם למחרת לסיבוכים שלאחר הניתוח. במקרה הצורך, החילו מחדש את השככי כאבים.
- לצורך זיהום מונע, להוסיף sulfadoxin (הריכוז הסופי 0.08% w/v) ו-ילדים (הריכוז הסופי 0.016% w/v) כדי לשתות מים שאליהם בעלי החיים יש גישה מודעה libitum למשך שבוע אחד לאחר הניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר הכנה של קטבי שלב (איור 1) לשימוש בהליך מתקדם בסביבת מעבדה. כדי לשלוט על הקטטרים עבור דליפה, ריפלוקס לאורך מערכת המחט וסתימת, אנו ממליצים ביצוע זריקות של צבע, למשל, טרימין כחול פתרון, לתוך בלוק agarose. איור 3 מתאר ענן של טרימין כחול ויוצרים לאחר ההזרקה של 1 μl ב 0.5 μl/דקה באמצעות צנתר מתקדם (איור 3a). הריפלוקס לאורך מערכת המחט היה גלוי בתחילת שלב הקטטר. יתרה מזאת, הענן המפוזר יצר צורה כדורית מבוקשת. זה לעומת זאת עם התוצאות המתקבלות באמצעות קונבנציונאלי 27 G בוטה המחט (איור 3B), שבו ריפלוקס משמעותי יכול להיות נצפתה.
כמו-כן, מחייב הליך הזרקה ממוטב. איור 4 מציג את התוצאות של הזרקת 2 μl של טריכמין כחול לתוך בלוק agarose באמצעות הליך הפסיעה המתואר בפרוטוקול (א) לעומת זריקה בקצב קבוע של 2 μl/דקה (ב). מהירות הזרקה גבוהה כפה את ריפלוקס לאורך הקטטר גם כאשר קטטר מחודש היה בשימוש.
לבסוף, כפי שמוצג באיור 5, מאפשר להציג כמויות גדולות של המוח המורין. עכברים הוזרק עם מלשן אנטי עכבר TNFα הנוגדן בשילוב עם FITC-dextran ב 5 μL של PBS ידי (הפאנל העליון) או על ידי הזרקת בולוס קונבנציונאלי (הפאנל התחתון). פרופיל זלוף של היתה אחידה יותר מאשר הזרקה קונבנציונאלי נזק פחות רקמות יכול להיות נצפתה. בשני המקרים היה פרופיל הפצה אופייני של נוגדן וחלקיקים תוספי על הקורפוס callosum. עם זאת, פרופיל הפיזור של הנוגדן המוזרקים היה מפוזר יותר מאשר dextran המולקולרי הגבוה, מדגימה הבדלים התפלגות בין infusates שונים.
איור 1: ציור סכמטי המציג את קצה הקטטר של השלב הלח. תצוגות חזיתי (A) וצד שני (B). הערכה אינה מדורגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציור סכמטי המתאר את אזור היישום של הדבק. העליון 10 מ"מ של צינורות סיליקה התמזגו מוכנסים מחט מתכת. החל את הדבק על 10 מ"מ של אבובים החל מקצה מחט המתכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואת תוצאות העירוי באמצעות קטטר או מחט בוטה-קצה. הזרקה של 1 μL של 0.4% טרילאן כחול לתוך 0.6% agarose בלוק ב 0.5 μL/דקה באמצעות קטטר (a) ו-27g בוטה-קצה המחט (ב). תמונות שצולמו מיד לאחר הקטטר או משיכת המחט. צלב מסמן את קצה הצנתר או המחט. סרגל בקנה מידה = 5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואת התוצאות של העירוי של פרוטוקול מתקדם באמצעות פרוטוקול קצב קבוע. הזרקה של 2 μL של 0.4% טריקון כחול לתוך 0.6% agarose בלוק באמצעות פרוטוקול מתקדם (0.4 μL ב-0.2 μL/min, לאחר מכן 0.8 μL בשעה 0.5 μL/min ו-0.8 μL ב-0.8 μL/min (a) או בפרוטוקולהזרקת קצב קבוע של 2 μl/min ( בשני המקרים השתמשו בצנתר מתקדם. תמונות שצולמו מיד לאחר נסיגת הקטטר. . צלב מסמן את קצה הצנתר סרגל בקנה מידה = 5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התוצאות הייצוגיות של מערכת ההזנה משופרת על ידי הזרקת-בולוס או על ידי הזרקה רגילה. עכברים הוזרק לתוך הסטריאטום (מיקום 1 מ"מ חזיתית ו 2 מ"מ לרוחב מ bregma, עומק של 3.5 מ"מ) עם 1 μg של חולדה נגד עכבר TNFα בשילוב עם 1 μg של FITC-Dextran עם משקל מולקולרי 2,000 kDa ב 5 μL של PBS. פרוטוקול משופרת (הפאנל העליון) או הזרקת בולוס קונבנציונאלי (27 גרם מחט, שיעור הזרקה 1 μL/דקה) בוצע (למטה). עכברים הוקרבו מיד לאחר ההליך המנוהל על ידי שליטה משותפת2 חנק ו 4% פורמלדהיד ב-PBS. המוח היה גזור ותוקן בנוסף עם 4% פורמלדהיד ב PBS ב 4 ° צ' עבור 24 h. לאחר מכן, המוחות נשטפו עם 15% סוכרוז במשך 60 דקות והועברו ל-30% סוכרוז ב -4 ° c. אחרי 24 שעות, המוח. קפא על קרח יבש מקטעים בחינם-צף (25 μm) היו מוכתמים באמצעות הנוגדן האנטי-שבטים (H + L) ביחד עם אלקסה Fluor 647 ומוכתם עם DAPI. תמונות עובדו באמצעות התפלגות פיג'י של ImageJ. הגדלה של 10x, סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. 4 עכברים לכל קבוצה; תמונה ייצוגית מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסעה-משלוח משופר, או הלחץ בתיווך עירוי התרופה לתוך המוח, הוצע לראשונה בתחילת 19903. גישה זו מבטיחה הפרזיה של כמויות גדולות של מוח מאחורי מחסום מוח הדם באופן מבוקר2. עם זאת, עד כה, רק כמה ניסויים קליניים בוצעו באמצעות גישה זו, חלקית בגלל שהיה מעובד קליני הראה באופן טכני תובענית24,25. ההתפתחויות האחרונות בעיצוב קטטר ותוכניות אינפוזיה נראה להתגבר על הקשיים הטכניים האלה8,19. התקדמות שנעשתה ביישום קליני של נוגדנים טיפולית, כולל הופעתו של סוכני חסימת מחסום אימונומודולטוריים, מחכה ליישום בטיפול בהפרעות ה-CN10. התפתחות זו יכולה להיות מורחבת מאוד על ידי העסקת ד ב ההתקנה ניסיוני, כגון שימוש במודלים מכרסמים קטנים.
מודלים שונים של מחלת הא זמינים בעכברים. אלה כוללים encephalomyelitis החיסון הניסיוני (ים) עבור טרשת נפוצה (MS) ו גנטית מודלים מהונדסים למחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), או לסרטן המוח. הרבה מודלים סרטניים במוח גם להסתמך על הגידול אורתוטופית של קווי התאים של מוראו glioma או השרשה של החולה הנגזר xenografts. פרוטוקול זה מאפשר אספקת פתרונות נוגדנים ישירות לתוך מיקומים אנטומיים ספציפיים, ובכך דומה להליכים טיפוליים. זה יכול להיות מיושם בפריסות ניסיוני שונים שבו מסירת נוגדנים לתוך אזור המוח מדויק ממלא תפקיד מרכזי.
הגורם הקריטי בביצוע ביצוע של העכברים הוא הזמינות של קטטרים. פרוטוקול זה מכיל תיאור מדויק איך להרכיב קטטר צעד ולבדוק את זה בסדרה של ניסויים מבחנה. יש לזכור כי סיליקה התמזגו שבהם אבובים השלב נעשה הוא חומר שביר ואיכות של משופרת עם קטטר נתון עלול לרדת לאורך זמן. מומלץ לשלוט בפרמטרים של קטטרים השלב בין הניסויים הvivo על-ידי חזרה על בדיקות החוץ בתחום שתוארו בסעיף 1.3.
ניתן לכוונן את הפרוטוקול עבור אמצעי הזרקה שונים, סוגים של אזורי חוסר החלטיות והמוח. ניתן לטפל באמצעי האחסון של ההזרקה על-ידי שינוי פרופורציונלי של משך שלבי ההזרקה. כאן אנו מתארים אינפוזיה של 5 μl, אבל עם 10 μl של פתרון נוגדנים דווחו בספרות באמצעות גישה דומה בבית מודלים לגידול במוח מורטין, השגת התפלגות רקמות מעולה וכרכים זלוף הרבה עולה על הזרקת בולוס7 . יתרה מזאת, עד 28 כרכים בלתי מוקפאים של התוכנה דווחו בשימוש לח ליישום של נוזלים לתוך המוח עכברוש22,26. חומרים שאינם פרוטטינואאוס יכולים גם להיות מוזרק על ידי לח, לזכור כי infu, לא צריך להיות של צמיגות גבוהה כדי למנוע סתימה של קצה קטטר צר. באמצעות ליפוזומים, זה הוכח כי המטען של מולקולות החדרת יכול להשפיע במידה רבה על חדירה לרקמות, עם חלקיקים נייטרלי או שלילית טעונה להיות מסוגל להיות מופץ על כרכים הגדול ביותר22. כפי שמתואר באיור 5, fitc-dextran ונוגדן להתפזר באופן שונה: למרות שניהם נוגדן ו-fitc-dextran להפיץ באופן דומה לאורך הקורפוס callosum, החדירה נוגדן של המוח בתוך מפרק מפוזר יותר מאשר fitc-dextran, שמראה רדיוס קטן יותר ותבנית הפצה מוכתם יותר. הדבר מדגיש את ההבדלים בפרופיל מבוקר בין infusates עם תכונות שונות פיסיוכימיקלים.
יתר על כן, ניסוי משופרת המתואר כאן והראו באיור 5 בוצעה הזרקת נוגדן האנטי עכבר TNFα לתוך עכברים בריאים, כך בהנחה סכום היעד המינימלי בסטריאטום. נוכחות של אנטיגן קנצוני יהיה לשנות את דפוס התפלגות רקמות. זה יכול להיות מושפע עוד יותר על ידי רקמה הומוגנית באתר אנטומי, כפי שתוארה באיור 5 על ידי הפצת האינפופוסט לאורך callosum קורפוס.
לבסוף, מושפע מזרימת נוזל ביניים, אשר במקרה של הזרקת סטריאטום, יכול לשטוף את הזרם לכיוון החדרים לרוחב27. אכן, גם כאשר הרקמה הוא קבוע מיד לאחר לסיים לחות, אנו יכולים להתבונן הדבקה מסומנת של הנוגדן המוזרק לקיר החדר (איור 5). זה יכול להיות מושפע עוד יותר על ידי תנאים פתולוגיים של ה-CN, למשל בהקשר של גידולים במוח. נמק מוקד, לעתים קרובות נצפתה ברמה גבוהה גידולים במוח28, יכול להשפיע על הזרימה של נוזל ביניים ובכך לשנות את תבנית ההפצה של ה-infusate29. מצבים פתולוגיים אחרים שיכולים להוביל לחלוקת רקמות שונה לעומת בריאה בתוך כימוסמה בריאים כוללים שבץ או פציעה טראומטית מוחית30. כדי לסכם, כל סדרה של ניסויים מוסכמים צריך להיות מאומת בקפידה כדי להבטיח הצלחה מוצלחת של אזור המוח היעד.
כיום, החוקרים משתמשים לעתים קרובות משאבות אוסמוטי שולחן כדי לספק חומרים לתוך שדרתי או המוח (הגידול) ב31,32,33. במקרים מסוימים שבהם המתואר כאן ניתן להשתמש כחלופה. ניתן לבצע מספר פעמים עם תדרים בהתאם לאזור המוח, סוג של חוסר הרדמה, נפח ופרוטוקול ההרדמה בשימוש. העברת סמים לסירוגין יכולה להיות רלוונטית במיוחד כאשר חשיפה מורחבת ל-infusate מובילה סובלנות או תופעות לוואי מערכתיות. ניתן להעלות על הדעת כי במקרים שבהם מועברים שימור גבוה ומחצית חיים, גישה זו תייצג עידון לפי העיקרון התלת-ממדי, משום שהשתלת משאבה לא תהיה נחוצה. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה של החדרת כמויות גדולות של תמיסת נוגדנים לתוך הסטריפין מוראטום וניתן להתאימו לאזורי מוח אחרים וסוגים של חוסר החלטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יוהנס הקיא Berg מוזכר בתור ממציא על יישום פטנט (PCT/EP2012/070088) של אוניברסיטת ציריך. מיכל בפפינגר, לינדה שלהמר ויוהנס ואום ברג מוזכרים כממציאים ביישום פטנטים (EP19166231) של אוניברסיטת ציריך. למחברים אין אינטרסים פיננסיים נוספים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של אוניברסיטת ציריך (FK-15-057), קרן נוברטיס למחקר רפואי-ביולוגי (16c231) ומחקר הסרטן השוויצרי (kfs-3852-02-2016, kfs-4146-02-2017) כדי יוהנס הקיא Berg ו גשר הוכחת המושג (20b1-1 _ 177300) ללינדה שאלהאמר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
References
- Scherrmann, J. M.
- Barua, N. U., Gill, S. S. Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment. CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).
- Bobo, R. H., et al.
- Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).
- Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment. Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).
- Barua, N. U., et al. Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model. Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).
- Shoji, T., et al. Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models. Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).
- Souweidane, M. M., et al. Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial. The Lancet Oncology. , (2018).
- Zhang, X., et al. Targeting immune checkpoints in malignant glioma. Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).
- Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations. Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).
- Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N.
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Nash, K. R., Gordon, M. N. Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).
- Ohlfest, J. R., et al. Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma. Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).
- Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).
- Mamot, C., et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).
- Saito, R., et al. Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).
- Oh, S., et al. Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).
- Barua, N. U., et al. A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma. Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).
- Rosenbluth, K. H., et al. Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery. Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).
- Debinski, W., Tatter, S. B. Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors. Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).
- MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating. Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Sampson, J. H., et al. Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial. Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).
- Wick, W., Weller, M., et al. Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142). Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).
- Saito, R., Tominaga, T. Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas. Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).
- Bedussi, B., et al. Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system. Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).
- Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. Hallmarks of glioblastoma: a systematic review. ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).
- Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents. British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).
- Glushakova, O. Y., et al. Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration. Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).
- Vom Berg, J., et al. Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline. Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).
- Vom Berg, J., et al. Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).
- Kurdi, A., et al. Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice. British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).
