Summary
Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) büyük doku hacimleri doğrudan perfüzyon ile beyin içine terapötik etkili teslim sağlayan bir yöntemdir. Prosedür kateterler ve optimize enjeksiyon prosedürü kullanımı gerektirir. Bu protokol, bir antikor, bir fare beyninde CED için bir metodoloji açıklanmaktadır.
Abstract
Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) bir kateter sistemi kullanarak büyük beyin hacimleri etkili perfüzyon sağlayan bir Nöroşirürji tekniktir. Böyle bir yaklaşım tarafından güvenli bir teslimat yöntemi sağlar-kan beyin bariyeri (BBB), böylece kötü BBB-geçirgenlik veya sistemik pozlama, örneğin, toksisite nedeniyle istenen değildir ile terapötik tedavi izin geçirerek. CED, kateter tasarımı, enjeksiyon Protokolü ve infusat özelliklerinin optimizasyonu gerektirir. Bu protokol ile, farelerin kaudat putamen içine bir antikor 20 μg kadar içeren bir çözüm Ced gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Bu adım kateterler hazırlanması açıklar, onları test ve bir açılı frezeleme enjeksiyon programı kullanarak farelerde Ced gerçekleştirme. Protokol, diğer infüzyon hacimleri için kolayca ayarlanabilir ve kemoterapötik, sitokinler, viral parçacıklar ve lipozomlar dahil olmak üzere çeşitli izleyiciler veya farmakolojik olarak aktif veya aktif olmayan maddeler enjekte etmek için kullanılabilir.
Introduction
Kan beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sistemini (CNS) kan dolaşımına ayıran yarı geçirgen bir kenarlık oluşturur. Tedavi ile CNS ulaşma ancak çeşitli hastalıklar bağlamında gerekli, beyin tümörleri gibi, Alzheimer hastalığı (AD) veya Parkinson hastalığı (PD) diğerleri arasında1. Bu yeni tedavilerin gelişiminde önemli olur, özellikle test edilen ilaç kötü bbb geçirgenliği sergiler veya sistemik pozlama tehlikeli toksisite yol açabilir1,2. Klinik olarak kullanılan antikorların bazıları bu özelliklerin her ikisini de görüntüler. Bu soruna bir çözüm doğrudan BBB arkasında terapi sunmak olacaktır.
Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) büyük beyin hacimleri etkili perfüzyon sağlayan bir Nöroşirürji tekniktir. Bu cerrahi olarak hedef alanda bir veya daha fazla kateter yükleyerek elde edilir. İlaç uygulaması sırasında, kateter açılışında bir basınç degradesi oluşur ve bu da doku3,4' te infusat dağılımının itici kuvveti haline gelir. Bu nedenle, perfüzyon aralığını belirleyen difüzyon katsayıları değil, infüzyon süresi2,4,5. Bu, konvansiyonel, difüzyon bazlı intraserebral enjeksiyon yöntemleri2,6ile karşılaştırıldığında çok daha büyük bir beyin hacmi üzerine infusat uniform teslim sağlar. Aynı zamanda, bu teslimat modalite doku hasarı daha düşük bir riski vardır2. Buna göre, CED, CNS tümörlerinin tedavisi için konvansiyonel kemoterapötik maddelenin güvenli ve etkili bir şekilde yönetilmesi ve diğer CNS bozukluklarının çok sayıda immünomodülatör ajanların veya agonistik ve antagonistik antikorların teslimine olanak verebilir2 ,7,8,9. Ced Şu anda Parkinson hastalığının terapilerinde, Alzheimer hastalığının yanı sıra yüksek dereceli glioma2,7,8,10,11' de test edilmiştir.
Kateter tasarımı ve enjeksiyon rejimi Ced 10,12,13,14,15,16sonucunu etkileyen en önemli faktörler arasındadır. Ayrıca, bu infusate spesifik Fizikokimyasal özellikleri gerektirir, partiküllerin orta boyutu da dahil olmak üzere, bir Anionik şarj, ve düşük doku benzeşimi 10,17. Bu parametrelerin her biri,2,10,17hedeflenecek beyin bölgesinin histolojik özelliklerine göre potansiyel olarak ayarlanmalıdır.
Burada farelerin kaudat putamen (striatum) içine bir antikor çözüm Ced gerçekleştirmek için metodoloji açıklanmaktadır. Ayrıca, protokol, bir laboratuar kurulumunda adım kateterlerinin hazırlanması, onları in vitro test ve CED gerçekleştirme içerir.
Literatürde mevcut olan birden fazla kateter tasarımı vardır, kanül şekline göre farklı, kullanılan malzemeler ve kateter açıklıkları sayısı12,15,18,19,20 ,21,22. Künt bir metal iğnesinden 1 mm çıkıntılı, erimiş silika kapiller ile yapılan bir adım kateter kullanıyoruz. Bu kateter tasarımı kolayca bir araştırma laboratuarında imal edilebilir ve tekrarlanarak, vitro23' te beyin parankiması gibi fiziksel parametrelerle agaroz blokları ile test edildiğinde iyi Ced sonuçları verir.
Dahası, 5 μL infusate in vivo sunmak için bir açılı frezeleme rejimi uygulıyoruz. Böyle bir protokolde, enjeksiyon hızı 0,2 μL/dak 'dan en fazla 0,8 μL/dak 'a yükseltilmiştir, böylece kateter boyunca infusate reflü olasılığını minimize ederek doku hasarı riski16' dır. Bu protokolü kullanarak, 11 dk 30 sn boyunca 5 μL PBS 'de 20 μg ' ye kadar antikor içeren fareler başarıyla yönetilmektedir.
Protokol, diğer infüzyon hacimleri için veya diğer çeşitli maddeleri enjekte etmek için kolayca ayarlanabilir, örneğin kemoterapötik, sitokinler, viral parçacıklar veya lipozomlar2,10,14,18 ,22. Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) veya suni beyin omurilik sıvısı (aCSF) antikorların çözeltisine kıyasla büyük ölçüde farklı Fizikokimyasal özellikleri ile infusate kullanımı durumunda, ek doğrulama adımları önerilir. Kateter montajı, doğrulama ve CED için, normal bir stereotaktik çerçeveye monte edilmiş bir matkap ve enjeksiyon ünitesi ile stereotaktik bir robot kullanarak tüm adımları tarif ediyoruz. Bu prosedür Ayrıca, açıklanan cam mikroşırıngayı kullanabilen programlanabilir mikroinfüzyon pompasına bağlı manuel stereotaktik çerçeveyle de gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler ZH246/15 lisans numarası altında Isviçre Cantonal veteriner ofisi tarafından onaylanmıştır.
1. Step kateterleri hazırlanması
- Kateter adım için erimiş silika tüpünün hazırlanması
- 0,1 mm iç çapı ve 0,0325 mm tüpün duvar kalınlığı 30 mm uzunluğuna sahip olan erimiş silika kapiller keser.
- Çatlaklar için tüp incelemek ve tüp açıklıkları pürüzsüz bir yüzeye sahip sağlamak için bir mikroforge kullanarak biter ısı cilası.
- Metal iğnesinde iç tüpün sabitlenme
- 10 μL şırınga üzerine 27 G iğne monte edin ve şırıngayı stereotaktik bir robota yerleştirin.
- Robotu kullanarak, şırıngayı sert bir yüzeye taşıyın ve iğne ucu ile dokunun. Bu pozisyon, kateter adımının uzunluğunu ayarlamak için bir referans yüzeyi olarak hizmet edecek çünkü yazılıma dikkat edilmelidir veya kaydedilmelidir.
- İğnenin içindeki erimiş silika kapiller yerleştirilmesi etkinleştirmek için iğne yükseltmek
- Erimiş silika kapiller iğnenin içinde, 20 mm kapiller iğne çıkıntılı olduğu gibi yerleştirin.
- Bir pipet kullanarak, 2 μL yüksek viskoziteye sahip siyanoakrilat yapıştırıcı kapiller üzerine, metal iğne başlayarak ve son 10 mm kapiller alt ucundaki, Şekil 2' de tasvir olarak yaymak.
- Stereotaktik robotu kullanarak, metal iğne ucu referans yüzeyi üzerinde 1 mm kadar iğne aşağı. Bu şekilde, erimiş silika kapiller metal iğnesinde düzeltilecektir ve metal iğnesi ucunu 1 mm adım oluşturur. Adım köreltme önlemek için metal iğne sonunda şekillendirme tutkal fazlalığını çıkarın.
- Yapıştırıcı için 15 dakika bekleyin ve stereaktik robottan kateter ile şırınga çıkarın. Bir mikroskop altında kateter ucunu kontrol ederek tüm aşırı tutkal kaldırıldı adımda onaylayın.
- Adım kateteri agaroz bloğunu kullanarak test etme
- Geleneksel jel tepsisinde PBS 'de% 0,6 agaroz solüsyonu hazırlayın ve polimerize olana kadar bekleyin. Yaklaşık 20 mm x 20 mm bloklar içinde agaroz kes. Kullanım kadar, PBS batırılmış blokları tutmak.
- Step kateter şırıngasını el ile 10 μL 0,4%% filtre edilen tripan mavi çözeltisi ile doldurun.
- Stereotaktik robotu kullanarak, sabitleme prosedürü sırasında kateterin adımının sızdırmazlığını değerlendirmek için 0,2 μL/dk 'da 1 μL 'i dağıtın. Tripan mavi çözeltisi sadece kateter ucunda görünür olmalıdır. Kağıt dokusuyla silin.
- Agaroz bloğunu stereotaktik robota yerleştirin ve robotu kalibre edin, böylece kateterin ucu agaroz bloğunun yüzeyine göre başvurulabilir.
- CED için enjeksiyon parametrelerini programlamak.
- 5 μL enjeksiyon hacmi için aşağıdaki adımları kullanın: 0,2 μL/dak 'da 1 μL, sonra 0,5 μL/dak 'da 2 μL ve 0,8 μL/dak 'da 2 μL. son enjeksiyon hacmini, adımların her birinin süresini orantılı olarak değiştirerek belirli deneysel plana göre ayarlayın.
- Çözüm, murin kaudat putamen (striatum) içine enjekte etmek için, 3,5 mm derinliğinde kemiğinin bir pozisyonda 1 mm frontal ve 1,5 – 2 mm lateral böyle enjeksiyon gerçekleştirin.
- Enjeksiyonu yaptıktan sonra, kateteri 2 dakika boyunca yerine bırakın ve sonra kateter çıkarılması sırasında beynin sıvısının doğru dağılımını sağlamak ve enjeksiyon sisteminin mühürlenmesi için 1 mm/dak geri çekin.
Not: Kullanılan özel stereotaktik robota bağlı olarak tüm parametreler tek bir komut dosyası halinde programlanabilir. Örnek bir komut dosyası, Tamamlayıcı malzemeolarak kullanılabilir..
- Ced prosedürünü başlatın ve agaroz bloğuna 5 μL tripan mavi çözüm enjekte etmek.
- Tripan mavi bulutun şeklini agaroz 'de ve kateter sistemi boyunca potansiyel sızıntıyı değerlendirin. Tripan mavisi, kateter ucunun çevresindeki merkezi ve en az 1 mm çapını içeren elipsoid veya yuvarlak bir bulut oluşturmalıdır. Metal iğne ucunun üzerinde büyük bir geri akış görünür olmalıdır.
- Kateterin agaroz ile tıkanmasını değerlendirmek için yeni bir agaroz bloğu yerleştirin ve 0,2 μL/dak 'da 1 μL 'ye ikinci bir enjeksiyon başlatın. Tripan mavi tekrar enjeksiyon başlamadan hemen sonra kateter ucunda bir bulut oluşturmak başlamalıdır.
- Şırıngadaki kalan hacminin 3 μL 'ye karşılık olup olmadığını değerlendirin. Herhangi bir varyasyon kateter montaj veya şırınga pistonlu bir sıvı sızıntısı doğru işaret edebilir.
- Tüm test enjeksiyonları başarılı olursa, kateter iyi mühürlü, düz ve hiçbir tripan mavi çözüm kateter ucunu daha diğer noktalardan gözlenen, deiyonize H2o (DH2o) ile kateter yıkayın tripan mavi hiçbir izleri görünür kadar ve sonra aşağıdaki gibi on kez yıkayın: 70% etanol ve 100% etanol tekrar% 70 etanol ve temiz deiyonize su ile yıkama izledi.
- Kateteri kuru koşullarda saklayın.
2. konveksiyon-antikor çözeltisi Murine beyin içine geliştirilmiş teslim
Not: Yerel hayvan refahı yönetmeliklerine bağlı olarak, bu prosedür için çeşitli anestezik, analjezikler ve antibiyotik türleri uygulanabilir. Bu protokol enjeksiyon anestezi kullanımını açıklar. Isoflurane gibi inhalasyon anestezisleri de stereotaktik çerçevede bir burun maskesi monte ederek kullanılabilir. Buna ek olarak, enfeksiyon profilaksi için içme suyuna antibiyotik eklemenizi öneririz.
- Cerrahi kurulum
- Anestezik ve panzehir çözümlerini hazırlayın. Fareler, steril DH2O 'da seyreltilmiş fentanil (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) ve Medetomidin (0,5 mg/kg) içeren üç bileşenli anestezi kullanılarak güvenle anesteziye alınabilir. İki aşamalı uyanma prosedürünü, bir tane Flumazenil (0,5 mg/kg) ve buprenorfik (0,1 mg/kg) steril dH2O (ilk panzehiri çözeltisi) içeren Iki panzehir solüsyonu kullanarak gerçekleştiriyoruz. Ikinci bir atipamezol içerir (2,5 mg/kg) steril dH2O (ikinci panzehir solüsyonu).
- Steril dH2O ile seyreltilmiş Karprofen (5,667 mg/kg) içeren analjezi çözeltisi hazırlayın.
- Stereotaktik çerçeveyi, Isıtma yastığı ve stereotaktik robotun unsurlarını temizleyin. Robotun tüm parçalarının hasar riski olmadan temizlendiğini unutmayın. Temizlik ve kullanım için hazırlık hakkında ayrıntılı bilgi için robotun kılavuzuna bakın.
- Enjektörü Step kateter ile birleştirin ve dH2o,% 70 etanol ve% 100 etanol ile birden çok kez temizleyin, ardından% 70 etanol ve DH2o ile tekrar yıkama yapın. Son olarak, intrakranial enjeksiyon için çözümün hazırlanması için kullanılacak PBS veya diğer tamponlar ile şırınga Flush, örneğin yapay beyin omurilik sıvısı. Şırınga piston tüm prosedür sırasında sorunsuz ve serbestçe hareket etmelidir.
- Stereotaktik robot yazılımını stereotaktik çerçeveyle kalibre edin.
- Robot kolların serbestçe hareket etmesini ve enjeksiyon pompasının düzgün bir şekilde bağlandığını ve CED prosedürünü herhangi bir rahatsızlıksız gerçekleştirebilmesini sağlayarak stereotaktik robot yazılımını sınayın. Bu, robot hareketini test etme, enjeksiyonu çekiş, 2 dk bekleme adımını ve kateter retraksiyon hızını kontrol etmek içerir. Tüm parametreler, 1.3.5 noktasında açıklanan önceden programlanmış CED prosedürünü sığdırmalıdır.
- Matkap üzerine matkap biti takın. Kullanmadan önce matkap bitlerini sterilize etmeniz önerilir.
- PBS veya aCSF gibi diğer tampon çözümlerini kullanarak antikor çözümünü hazırlayın. 5 μL 'de 1 ila 20 μg antikor tek bir CED prosedüre enjekte edilebilir. Deney yapmadan önce diğer birimler ve protein miktarları test edilmelidir. Yüksek viskozite çözeltileri kullanarak kateter tıkanmasını neden olabileceğini unutmayın.
- Enjektörü seyreltilmiş antikor ile manuel olarak yükleyin.
- Striatum içine CED tarafından antikor enjeksiyon
- Fareyi tartın ve üç bileşenli anestezi çözümünü vücut ağırlığına göre peritona enjekte et. Enjeksiyon süresini not edin. Fareyi bir ısıtma yastığı ile ısıtılan ayrı bir kafeye aktarın.
- Sedasyon başladığında belirlemek için fareyi gözlemlemek. En kısa sürede fare hareket durur, ameliyat sırasında kurutulması kornea korumak için gözlerde oftalmik merhem uygulayın. Tam sedasyon genellikle üç bileşenli anestezi çözeltisi enjeksiyonu 10 – 15 dakika başlar.
- Hayvan tam anestezi sağlamak için tutam-refleks testi kullanarak ağrı reaksiyonları kontrol edin.
- Bir saç düzeltici kullanarak başını tıraş.
- İyot çözeltisi içinde ıslatılmış pamuk bezlerden ile cilt dezenfekte. Dairesel harekette cildi üç kez fırçalayın.
- Bir neşter kullanarak, kafatası orta çizgi boyunca göz seviyesinde bitirme 10 mm Cilt kesi yapın.
- Burun kelepçe ve kulak çubukları kullanarak stereotaktik çerçevede fareyi düzeltin. Kafatası yüzeyinin yatay ve sıkıca sabitlendiğinden emin olun. Doğru anatomik navigasyon dışında bu da sondaj ve CED prosedürü sırasında kafatası eğme önlemek için çok önemlidir.
- Şırınga stereotaktik robota yerleştirin.
- Matkap bitini bir referans noktasında kateter ucunu ile senkronize edin. Bu matkap ve şırınga konumu arasındaki ilişki tam olarak yazılım belirlenir, bu nedenle enjeksiyonu beyin istenilen anatomik bölgede gerçekleştirilebilir önemlidir.
- Forseps kullanarak cildi geri çekin ve kafatası yüzeyinde kemiğinin yerelleştirmek.
- Matkap biti ucunu kullanarak yazılım referans kemiğinin.
- Matkap 1 mm frontal ve 2 mm lateral kemiğinin ve bir Burr delik matkap bir konuma taşıyın. Dura mater zarar değil dikkatli olun.
- Şırıngayı burr deliğinin üzerine taşıyın.
- Kateter içinde hava kabarcıkları kalmadığından emin olmak için şırıngadan 0.5 – 1 μL çıkarın.
- 1.3.5 noktasında açıklanan CED programını başlatın. Enjeksiyon noktadan sıvı geri akış izleri için kafatası yüzeyine dikkat edin. Hayvanın solunum hızını izleyin.
- CED programı sona erdiğinde ve kateter beyinden çekildikten sonra, CED sırasında kateter tıkanmasını kontrol etmek için enjeksiyon pompasını 0,2 μL/dak olarak başlatın. Hiçbir tıkanması meydana gelmemelidir, hemen kateter ucunun gelen enjeksiyon karışımı bir damlacık görmek gerekir.
- Kateteri yeniden kullanmadan veya saklamadan önce, kateter adımını mikroskop altında herhangi bir hasar belirtisi veya aşınması için görsel olarak inceleyin ve adım 1.3.10 gibi temizleyin.
- Uyanma prosedürü
- Fareyi stereotaktik çerçeveden nazikçe çıkarın.
- Cerrahi siteyi steril tuz çözeltisi ile yıkayın.
- Forseps kullanarak, Burr Deliği kemik balmumu ile doldurun.
- İnce uçlu forseps ile cildi kapatın ve kesme üzerine 10 μL pipet ile cerrahi tutkal uygulayın. Polimerize etmek için tutkal için 15 – 30 s bekleyin.
- Subkutan Enjeksiyon ile analjezi çözümü uygulayın. Enjeksiyon süresini not edin.
- İlk panzehir çözümünü uygulayın. Enjeksiyon süresini not edin.
- Bir Isıtma Pad ile ayrı bir kafes için fareyi aktarmak ve ürkütücü refleksleri için hayvan izlemek.
- Eğer fare ilk panzehir çözeltisi uygulamadan 15 dakika sonra tam bilinç kazanmadı ise, subkutan enjeksiyonu ile ikinci panzehir çözümünü uygulayın.
- Kurtarma aşamasında hayvanları izleyin.
- Kontrol 1-2 h daha sonra yanı sıra post-operatif komplikasyonlar için ertesi gün. Gerekirse, analjezi yeniden uygulayın.
- Enfeksiyon profilaksi için, sülfadoxin ekleyin (son konsantrasyon 0,08% w/v) ve trimetoprim (son konsantrasyon 0,016% w/v) hayvanların erişim reklam Isteğe bağlı için hangi içme suyu için 1 hafta ameliyattan sonra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, bir laboratuar ortamında CED prosedüründe kullanılmak üzere adım kateterleri (Şekil 1) hazırlamanıza olanak tanır. Sızıntı için kateterler kontrol etmek için, iğne yolu boyunca reflü ve tıkanması, bir agaroz blok içine, örneğin, tripan mavi çözüm, bir boya enjeksiyonları gerçekleştirme öneririz. Figure 3 , Ced kateter (Şekil 3a) kullanarak 0,5 μL/dakikada 1 μL enjekte ettikten sonra tripan mavi şekillendirme bulutunu tasvir ediyor. Kateter adımının başında iğne yolu boyunca reflü görünmez. Ayrıca, dağınık bulut istenilen bir küresel şekil oluşturdu. Bu, belirgin reflü gözlemlendiği geleneksel 27 G künt uçlu iğne (Şekil 3B) kullanılarak elde edilen sonuçların aksine.
Ayrıca CED, optimize edilmiş bir enjeksiyon prosedürü gerektirir. Şekil 4 , protokol (A) ' da açıklanan açılı frezeleme prosedürü ile 2 μL/dakika (B) sabit bir hızda enjeksiyon ile karşılaştırıldığında, bir agaroz bloğuna 2 μL tripan mavi enjekte etme sonuçlarını gösterir. Yüksek enjeksiyon hızı, CED kateter kullanıldığında bile kateter boyunca reflü zorlamıştır.
Son olarak, Şekil 5' te gösterildiği gibi Ced, murin beynin büyük hacimli perfüzyon sağlar. Fareler, CED (üst panel) veya geleneksel bir bolus enjeksiyonu (alt panel) ile 5 μL PBS 'de FITC-dextran ile birlikte bir sıçan Anti-fare TNFα antikor ile enjekte edildi. CED perfüzyon profili geleneksel enjeksiyonu daha üniforma ve daha az doku hasarı görülebilir. Her iki durumda da korpus kallosum üzerinde antikor ve dekstran partiküllerinin tipik bir dağıtım profili vardı. Ancak, enjekte antikor dispersiyon profili daha yüksek moleküler ağırlık dextran daha diffuzu, farklı infusates arasındaki dağıtım farklılıkları örneklendirme oldu.
Şekil 1: Ced Step kateter ucunu gösteren şematik bir çizim. Ön (A) ve yan (B) görünümleri. Düzeni ölçeklendirmek için değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: yapıştırıcının uygulama alanını tasvir eden bir şematik çizim. Erimiş silika tüpünün üst 10 mm metal iğne yerleştirilir. Yapıştırıcı, metal iğne ucundan başlayarak 10 mm boru üzerine uygulayın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Ced kateter veya künt uçlu iğne kullanarak infüzyon sonuçlarının karşılaştırılması. Bir Ced kateter (a) ve bir 27g künt uçlu iğne (B) kullanılarak 0,5 μL/dakikada% 0,6 agaroz bloğuna 1 μL 0,4% tripan mavi enjeksiyon. Kateter veya iğne çekilmesinden hemen sonra çekilen resimler. Çapraz kateter veya iğne ucunu işaretler. Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4: Ced protokolünün kararlı oran protokolüyle açılı frezeleme infüzyon sonuçlarının karşılaştırılması. Bir açılı frezeleme Ced Protokolü (0,2 μL/dak 'da 0,4 μL, daha sonra 0,8 μL/dak ve 0,5 μL 'de 0,6%% 0,4 tripan mavi 2 μL enjeksiyonu, (a) veya 2 μL/dak sabit oran enjeksiyon Protokolü (B). Her iki durumda da CED kateter kullanılmıştır. Kateter çekilmesinden hemen sonra çekilen resimler. Çapraz kateter ucunu işaretler. Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 5: Ced tarafından veya konvansiyonel bolus enjeksiyonu ile murine striatum perfüzyon temsili sonuçları. Fareler striatum enjekte edildi (pozisyon 1 mm frontal ve 2 mm lateral bregma, 3,5 mm derinliği) ile 1 μg sıçan Anti-fare TNFα ile kombine 1 μg FITC-dextran molekül ağırlığı ile 2.000 kDa 5 μL PBS. CED Protokolü (üst panel) veya geleneksel bir bolus enjeksiyonu (27 G iğne, enjeksiyon hızı 1 μL/dakika) yapıldı (alt). Fareler, CED işleminden hemen sonra kontrol edilen CO2 boğulma ve PBS 'de% 4 formaldehit ile perfel tarafından feda edildi. Beyin, 4 °C ' de 24 saat boyunca PBS 'de% 4 formaldehit ile çözülmiştir. Daha sonra, beyin 60 dk için% 15 sakaroz ile yıkanmış ve 4 °c ' de% 30 sakaroz transfer edildi. 24 saat sonra, beyin kuru buzda dondurulmuştu. Serbest yüzen bölümler (25 μm), Alexa Fluor 647 ile birlikte poliklonal keçi Anti-Rat IgG (H + L) antikor kullanılarak lekelenmiş ve DAPI ile karşı koyandı. Görseller, ımagej 'nin Fiji dağılımı kullanılarak işlenir. 10X büyütme, ölçek çubuğu = 5 mm. Grup başına 4 fare; temsili bir resim gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konveksiyon-gelişmiş teslimat, ya da beyin içine basınç aracılı ilaç infüzyon, ilk teklif edildi erken 19903. Bu yaklaşım kontrollü bir şekilde kan beyin bariyerinin arkasında büyük beyin hacimleri perfüzyon vaat2. Ancak, şimdiye kadar, sadece birkaç klinik denemeler bu yaklaşım kullanılarak yapılmıştır, kısmen çünkü bir klinik kurulum Ced Teknik olarak24,25talep göstermiştir. Kateter tasarımında ve infüzyon programlarında son gelişmeler bu teknik zorlukların üstesinden geliyor gibi görünüyor8,19. İmmünomodülatör kontrol noktası engelleme ajanları ortaya çıkması da dahil olmak üzere terapötik antikorların klinik uygulamasında yapılan ilerleme, CNS bozukluklarının tedavisinde uygulama bekliyor10. Bu gelişme, küçük kemirgen modelleri kullanarak gibi deneysel kurulum CED istihdam ederek büyük ölçüde artırabilir.
Çeşitli CNS hastalık modelleri fareler mevcuttur. Bunlar arasında multipl skleroz (MS) için deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ve Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD) veya beyin kanseri için genetik olarak tasarlanan modeller bulunmaktadır. Birçok beyin tümörü modeli de, murin glioma hücre hatlarının Ortez tümörü inokülasyonunu veya hasta türevi xenografların implantasyonunu kullanır. Bu protokol, antikor çözümlerinin doğrudan spesifik anatomik yerlere teslimini sağlar, böylece terapötik prosedürlere benzeyen. Antikor hassas bir beyin bölgesine tesliminin önemli bir rol oynadığı çeşitli deneysel mizanpajlarda uygulanabilir.
CED farelerde performans kritik faktör kateterler mevcudiyeti. Bu protokol, bir step kateter montajı ve bir dizi in vitro deneyde test etme konusunda kesin bir açıklama içerir. Bir göz önünde bulundurmalıdır ki hangi adım boru yapılır erimiş silika kırılgan bir malzeme ve belirli bir kateter ile CED kalitesi zaman içinde düşüş olabilir. 1,3 protokol bölümünde açıklanan in vitro testleri tekrarlayarak in vivo deneyleri arasında adım kateterlerinin parametrelerini kontrol etmek tavsiye edilir.
Protokol farklı enjeksiyon hacimleri, infusate ve beyin bölgeleri türleri için ayarlanabilir. Enjeksiyon hacmi, enjeksiyon adımlarının süresini orantılı olarak değiştirerek manipüle edilebilir. Burada 5 μL infüzyon tarif, ama CED 10 μL antikor solüsyon ile literatürde benzer bir yaklaşım murine beyin tümörü modellerinde rapor edilmiştir, mükemmel doku dağılımı ve perfüzyon hacimleri büyük ölçüde aşan bolus enjeksiyon7 elde . Ayrıca, en fazla 28 μL infusate hacimleri Rat beyin içine sıvı uygulanması için Ced kullanılarak bildirilmiştir22,26. Protein içermeyen maddeler de CED tarafından enjekte edilebilir, akılda tutulması dar kateter ucu tıkanmasını önlemek için infusate yüksek viskozite olmamalıdır. Lipozomlar kullanarak, bu infaşlı moleküllerin şarj büyük ölçüde doku penetrasyonunu etkileyebilir olduğunu göstermiştir, nötr veya negatif olarak şarj edilen parçacıklar ile en yüksek hacimler üzerinde dağıtılması mümkün22. Şekil 5' te betimlendikçe, fitc-dextran ve antikor farklı şekilde dağıtıldı: hem antikor hem de fitc-dextran korpus kallosum boyunca benzer şekilde dağıtılsa da, beyin parankiminin antikor PENETRASYONUNU fitc-dextran için daha fazla diffyor, daha küçük bir yarıçaplı ve daha fazla sivilceli dağılım deseni gösterir. Bu, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip infusates arasındaki CED profilindeki farklılıkları alt çizgiler.
Ayrıca, burada açıklanan ve Şekil 5 ' te gösterilen Ced deneyi, sağlıklı fareler içine bir anti-fare TNFα antikor enjekte yapıldı, bu yüzden striatum minimal hedef miktarı varsayarak. Bilat antijeni varlığı doku dağılımı düzenini değiştirecek. Anatomik bir sitede homojen olmayan dokudan daha da etkilenebilir, Şekil 5 ' te korpus kallosum boyunca infusat dağılımı ile tasvir edilir.
Son olarak, CED striatum enjeksiyonu durumunda, lateral ventriküller27doğru infusat floş olabilir interstisyel sıvı, akışını etkilenir. Gerçekten de, doku CED bitirdikten hemen sonra sabit olsa bile, biz ventrikül duvara enjekte antikor işaretlenmiş bir yapışma gözlemleyebilirsiniz (Şekil 5). Bu, CNS 'nin patolojik koşullarında, örneğin beyin tümörlerinin bağlamında daha da etkilenebilir. Odak nekroz, genellikle yüksek dereceli beyin tümörlerinde gözlenen28, interstisyel sıvı akışını etkileyebilir ve böylece infusate dağılım deseni değiştirmek29. Sağlıklı parankime kıyasla infusat değiştirilmiş doku dağılımına yol açabilir diğer patolojik koşullar inme veya travmatik beyin hasarı dahil30. Özetle, her bir seri CED deneyi, hedef beyin bölgesinin başarılı perfüzyon olmasını sağlamak için dikkatle doğrulanmalıdır.
Şu anda, araştırmacılar genellikle CSF veya beyin (tümör) parankimat içine maddeler teslim etmek için implantlı osrotik pompalar kullanın31,32,33. Bazı durumlarda CED burada açıklandığı gibi alternatif olarak kullanılabilir. Bu beyin bölgesine bağlı Frekanslar ile birden çok kez gerçekleştirilebilir, infusate türü, hacim ve anestezi protokolü kullanılır. Zaman zaman ilaç teslim özellikle ilgili olabilir zaman infusate genişletilmiş bir pozlama tolerans veya sistemik yan etkilere yol açar. Yüksek tutma ve yarı yaşam infusates teslim edildiği durumlarda, bu yaklaşım hiçbir pompa implantasyon gerekli olacağını beri 3R ilkesine göre bir arıtma temsil edeceğini akla geliyor. Sonuç olarak, bu protokol murine striatum içine antikor çözeltisi büyük hacimli infkullanım etkili bir şekilde açıklar ve diğer beyin bölgeleri ve infusate türleri için ayarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes vom Berg, Zürih Üniversitesi patent başvurusu (PCT/EP2012/070088) üzerinde bir mucit olarak belirtilmiştir. Michal Beffinger, Linda Schellhammer ve Johannes vom Berg bir patent başvurusu (EP19166231) Zürih Üniversitesi 'Nde mucitler olarak belirtilmiştir. Yazarların ek mali çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Zürih Üniversitesi (FK-15-057), Novartis Vakfı Tıp-biyolojik araştırma (16C231) ve Isviçre kanser Araştırması (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) Johannes vom Berg ve köprü kavramı kanıtı (20B1-1) tarafından destekleniyordu _177300) Linda Schellhammer için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
References
- Scherrmann, J. M.
- Barua, N. U., Gill, S. S. Convection-enhanced drug delivery: prospects for glioblastoma treatment. CNS Oncology. 3 (5), 313-316 (2014).
- Bobo, R. H., et al.
- Morrison, P. F., Laske, D. W., Bobo, H., Oldfield, E. H., Dedrick, R. L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. American Journal of Physiology. 266 (1 Pt 2), R292-R305 (1994).
- Zhou, Z., Singh, R., Souweidane, M. M. Convection-Enhanced Delivery for diffuse intrinsic pontine glioma treatment. Current Neuropharmacology. 15 (1), 116-128 (2017).
- Barua, N. U., et al. Intrastriatal convection-enhanced delivery results in widespread perivascular distribution in a pre-clinical model. Fluids and Barriers of the CNS. 9 (1), 2 (2012).
- Shoji, T., et al. Local convection-enhanced delivery of an anti-CD40 agonistic monoclonal antibody induces antitumor effects in mouse glioma models. Neuro-Oncology. 18 (8), 1120-1128 (2016).
- Souweidane, M. M., et al. Convection-enhanced delivery for diffuse intrinsic pontine glioma: a single-centre, dose-escalation, phase 1 trial. The Lancet Oncology. , (2018).
- Zhang, X., et al. Targeting immune checkpoints in malignant glioma. Oncotarget. 8 (4), 7157-7174 (2017).
- Barua, N. U., Gill, S. S., Love, S. Convection-enhanced drug delivery to the brain: therapeutic potential and neuropathological considerations. Brain Pathology. 24 (2), 117-127 (2014).
- Mehta, A. M., Sonabend, A. M., Bruce, J. N.
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Nash, K. R., Gordon, M. N. Convection Enhanced Delivery of Recombinant Adeno-associated Virus into the Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1382, 285-295 (2016).
- Ohlfest, J. R., et al. Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice bearing intracranial human glioblastoma. Molecular Therapy. 12 (5), 778-788 (2005).
- Yin, D., Forsayeth, J., Bankiewicz, K. S. Optimized cannula design and placement for convection-enhanced delivery in rat striatum. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 46-51 (2010).
- Mamot, C., et al. Extensive distribution of liposomes in rodent brains and brain tumors following convection-enhanced delivery. Journal of Neuro-Oncology. 68 (1), 1-9 (2004).
- Saito, R., et al. Tissue affinity of the infusate affects the distribution volume during convection-enhanced delivery into rodent brains: implications for local drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 225-232 (2006).
- Oh, S., et al. Improved distribution of small molecules and viral vectors in the murine brain using a hollow fiber catheter. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 568-577 (2007).
- Barua, N. U., et al. A novel implantable catheter system with transcutaneous port for intermittent convection-enhanced delivery of carboplatin for recurrent glioblastoma. Drug Delivery. 23 (1), 167-173 (2016).
- Rosenbluth, K. H., et al. Design of an in-dwelling cannula for convection-enhanced delivery. Journal of Neuroscience Methods. 196 (1), 118-123 (2011).
- Debinski, W., Tatter, S. B. Convection-enhanced delivery for the treatment of brain tumors. Expert Review of Neurotherapeutics. 9 (10), 1519-1527 (2009).
- MacKay, J. A., Deen, D. F., Szoka, F. C. Jr Distribution in brain of liposomes after convection enhanced delivery; modulation by particle charge, particle diameter, and presence of steric coating. Brain Research. 1035 (2), 139-153 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Sampson, J. H., et al. Poor drug distribution as a possible explanation for the results of the PRECISE trial. Journal of Neurosurgery. 113 (2), 301-309 (2010).
- Wick, W., Weller, M., et al. Trabedersen to target transforming growth factor-beta: when the journey is not the reward, in reference to Bogdahn et al. (Neuro-Oncology 2011;13:132-142). Neuro-Oncology. 13 (5), author reply 561-552 559-560 (2011).
- Saito, R., Tominaga, T. Convection-enhanced delivery of therapeutics for malignant gliomas. Neurologia Medico-Chirurgica. 57 (1), 8-16 (2017).
- Bedussi, B., et al. Clearance from the mouse brain by convection of interstitial fluid towards the ventricular system. Fluids Barriers CNS. 12, 23 (2015).
- Noroxe, D. S., Poulsen, H. S., Lassen, U. Hallmarks of glioblastoma: a systematic review. ESMO Open. 1 (6), e000144 (2016).
- Boucher, Y., Salehi, H., Witwer, B., Harsh, G. R. t, Jain, R. K. Interstitial fluid pressure in intracranial tumours in patients and in rodents. British Journal of Cancer. 75 (6), 829-836 (1997).
- Glushakova, O. Y., et al. Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries: Implications for chronic neurodegeneration. Brain Circulation. 3 (2), 87-108 (2017).
- Vom Berg, J., et al. Inhibition of IL-12/IL-23 signaling reduces Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline. Nature Medicine. 18 (12), 1812-1819 (2012).
- Vom Berg, J., et al. Intratumoral IL-12 combined with CTLA-4 blockade elicits T cell-mediated glioma rejection. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2803-2811 (2013).
- Kurdi, A., et al. Continuous administration of the mTORC1 inhibitor everolimus induces tolerance and decreases autophagy in mice. British Journal of Pharmacology. 173 (23), 3359-3371 (2016).
