Summary
L'accouchement par convection (CED) est une méthode permettant une livraison efficace des produits thérapeutiques dans le cerveau par perfusion directe de grands volumes de tissus. La procédure nécessite l'utilisation de cathéters et une procédure d'injection optimisée. Ce protocole décrit une méthodologie pour LED d'un anticorps dans un cerveau de souris.
Abstract
L'accouchement enrichi par convection (DEC) est une technique neurochirurgicale permettant une perfusion efficace de gros volumes cérébraux à l'aide d'un système de cathéter. Une telle approche fournit une méthode d'accouchement sûre en contournant la barrière hémato-encéphalique (BBB), permettant ainsi un traitement à l'aide d'une thérapie à faible perméabilité à la BBB ou pour laquelle l'exposition systémique n'est pas souhaitée, par exemple, en raison de la toxicité. Le CED nécessite l'optimisation de la conception du cathéter, du protocole d'injection et des propriétés de l'infusate. Avec ce protocole, nous décrivons comment effectuer LECE d'une solution contenant jusqu'à 20 g d'un anticorps dans le putamen caudate de souris. Il décrit la préparation des cathéters d'étape, les testant in vitro et exécutant le CED chez les souris utilisant un programme d'injection rampant. Le protocole peut être facilement ajusté pour d'autres volumes de perfusion et peut être utilisé pour injecter divers traceurs ou substances pharmacologiquement actives ou inactives, y compris les chimiothérapies, cytokines, particules virales et liposomes.
Introduction
La barrière hémato-encéphalique (BBB) forme une frontière semi-perméable séparant le système nerveux central (SNC) de la circulation sanguine. Atteindre le SNC avec des traitements est cependant nécessaire dans le contexte de diverses maladies, comme les tumeurs cérébrales, la maladie d'Alzheimer (MA) ou la maladie de Parkinson (PD) entre autres1. Cela devient important dans le développement de nouvelles thérapies, surtout si le médicament testé présente une faible perméabilité BBB ou son exposition systémique peut conduire à une toxicité dangereuse1,2. Certains des anticorps cliniquement utilisés affichent ces deux caractéristiques. Une solution à ce problème serait de livrer la thérapeutique directement derrière le BBB.
L'accouchement enrichi par convection (DEC) est une technique neurochirurgicale permettant une perfusion efficace de grands volumes cérébraux. Ceci est réalisé en installant chirurgicalement un ou plusieurs cathéters dans la zone cible. Pendant l'application de drogue, un gradient de pression est formé à l'ouverture du cathéter, qui devient la force motrice de la dispersion d'infusate dans le tissu3,4. C'est donc la durée de l'infusion et non les coefficients de diffusion qui déterminent la plage de perfusion2,4,5. Ceci fournit la livraison uniforme de l'infusate au-dessus d'un volume de cerveau beaucoup plus grand comparé aux méthodes conventionnelles, de diffusion basée d'injection intracérébrale2,6. Dans le même temps, cette modalité d'administration a un risque plus faible de lésions tissulaires2. En conséquence, LE DEC peut permettre l'administration sûre et efficace des chimiothérapeutiques conventionnels pour le traitement des tumeurs de CNS, aussi bien que la livraison des agents immunomodulateurs ou des anticorps agonistiques et antagonistes dans une multitude d'autres désordres de CNS2 ,7,8,9. CED est actuellement testé dans les thérapies de la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, ainsi que le gliome de haute qualité2,7,8,10,11.
La conception du cathéter et le régime d'injection sont parmi les facteurs les plus importants influençant le résultat de CED 10,12,13,14,15,16. En outre, il nécessite des propriétés physicochimiques spécifiques de l'infusate, y compris la taille modérée des particules, une charge anionique, et une faible affinité tissulaire 10,17. Chacun de ces paramètres doit être potentiellement ajusté en fonction des caractéristiques histologiques de la région du cerveau pour être ciblé2,10,17.
Ici nous décrivons la méthodologie pour exécuter CED d'une solution d'anticorps dans le putamen caudate (striatum) des souris. En outre, le protocole comprend la préparation de cathéters d'étape dans une configuration de laboratoire, les tester in vitro et effectuer le CED.
Il existe plusieurs conceptions de cathéter disponibles dans la littérature, différant par la forme de la canule, les matériaux utilisés et le nombre d'ouvertures de cathéter12,15,18,19,20 ,21,22. Nous utilisons un cathéter d'étape fait d'un capillaire de silice fusionné dépassant 1 mm d'une aiguille en métal d'extrémité émoussée. Cette conception de cathéter peut être facilement fabriquée dans un laboratoire de recherche et donne de façon reproductible de bons résultats DEC une fois examiné in vitro avec des blocs d'agarose avec des paramètres physiques ressemblant au parenchyme cérébral in vivo23.
De plus, nous mettons en œuvre un régime de rampe ment pour la livraison de 5 L d'infusate in vivo. Dans un tel protocole, le taux d'injection est augmenté de 0,2 L/min à un maximum de 0,8 L/min, minimisant ainsi les chances d'infuser le reflux le long du cathéter ainsi que le risque de lésions tissulaires16. En utilisant ce protocole, nous avons administré avec succès des souris avec jusqu'à 20 g d'anticorps dans 5 L de PBS au cours de 11 min 30 s.
Le protocole peut être facilement ajusté pour d'autres volumes de perfusion ou pour l'injection de diverses autres substances, par exemple chimiothérapeutiques, cytokines, particules virales ou liposomes2,10,14,18 ,22. En cas d'utilisation d'infusate avec des propriétés physicochimiques radicalement différentes par rapport à une solution de saline tamponnée de phosphate (PBS) ou de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) d'anticorps, des étapes de validation supplémentaires sont recommandées. Pour l'assemblage, la validation et le CED du cathéter, nous décrivons toutes les étapes à l'aide d'un robot stéréotaxique avec une unité de forage et d'injection montée sur un cadre stéréotaxique régulier. Cette procédure peut également être effectuée avec un cadre stéréotaxique manuel relié à la pompe programmable de microinfusion qui peut conduire les microseringues en verre décrites.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l'Office vétérinaire cantonal suisse sous le numéro de licence ZH246/15.
1. Préparation des cathéters d'étape
- Préparation d'un tube de silice fusionné pour l'étape du cathéter
- Couper le capillaire de silice fusionné avec un diamètre intérieur de 0,1 mm et une épaisseur de mur de 0,0325 mm à une longueur de 30 mm.
- Examinez le tube pour les fissures et polir la chaleur les extrémités à l'aide d'une microforge pour s'assurer que les ouvertures de tuyauterie ont une surface lisse.
- Fixation du tube intérieur dans une aiguille métallique
- Montez une aiguille de 27 G sur une seringue de 10 l et placez la seringue dans un robot stéréotaxique.
- À l'aide du robot, déplacez la seringue sur une surface dure et touchez-la avec la pointe de l'aiguille. Cette position doit être notée ou enregistrée dans le logiciel car elle servira de surface de référence pour définir la longueur de l'étape cathéter.
- Élever l'aiguille pour permettre le placement du capillaire de silice fusionné à l'intérieur de l'aiguille
- Placez le capillaire de silice fusionné dans l'aiguille de telle sorte que 20 mm du capillaire dépassent de l'aiguille.
- À l'aide d'une pipette, répartir uniformément 2 l d'adhésif cyanoacrylate à haute viscosité sur le capillaire, à partir de l'aiguille métallique et en finissant 10 mm au-dessus de l'extrémité inférieure du capillaire, comme le montre la figure 2.
- À l'aide du robot stéréotaxique, abaisser l'aiguille jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille métallique soit de 1 mm au-dessus de la surface de référence. De cette façon, le capillaire de silice fusionné sera fixé dans l'aiguille métallique et formera un pas de 1 mm de la pointe de l'aiguille métallique. Enlever tout excès de colle qui se forme à l'extrémité de l'aiguille métallique pour éviter d'émousser l'étape.
- Attendez 15 min pour que la colle durcisse et retirez la seringue avec le cathéter du robot stéréotaxique. Confirmez qu'à l'étape toute la colle excédentaire a été enlevée en vérifiant la pointe du cathéter sous un microscope.
- Test du cathéter d'étape à l'aide d'un bloc d'agarose
- Préparer la solution d'agarose de 0,6 % dans LE PBS dans un bac à gel conventionnel et attendre qu'elle polymérise. Couper l'agarose en blocs d'environ 20 mm x 20 mm. Jusqu'à utilisation, gardez les blocs immergés dans PBS.
- Remplissez manuellement la seringue de cathéter d'étape avec 10 l de la solution de 0,4% de bleu trypan filtré.
- À l'aide du robot stéréotaxique, distribuez 1 l à 0,2 l/min afin d'évaluer l'étanchéité de l'étape du cathéter pendant la procédure de fixation. La solution bleu Trypan doit être visible uniquement sur la pointe du cathéter. Essuyez-le avec un papier mouchoir.
- Placez le bloc d'agarose dans le robot stéréotaxique et calibrez le robot de sorte que la pointe du cathéter soit référencée contre la surface du bloc d'agarose.
- Programmez les paramètres d'injection pour LE DEC.
- Pour le volume d'injection de 5 L, utilisez les étapes suivantes : 1 L à 0,2 l/min, puis 2 l à 0,5 l/min et 2 l à 0,8 L/min. Ajuster le volume d'injection final selon le plan expérimental spécifique en modifiant proportionnellement la durée de chacune des étapes.
- Afin d'injecter la solution dans le putamen caudé murine (striatum), effectuer une telle injection dans une position de 1 mm frontale et 1,5 -2 mm latérale de bregma à la profondeur de 3,5 mm.
- Après l'injection, laisser le cathéter en place pendant 2 min, puis se rétracter à 1 mm/min pour assurer une dispersion adéquate du liquide dans le cerveau et l'étanchéité du tractus d'injection pendant l'ablation du cathéter.
REMARQUE: Selon le robot stéréotaxique spécifique utilisé, tous les paramètres peuvent être programmés en un seul script. Un script d'exemple est disponible sous forme de matériel supplémentaire..
- Démarrer la procédure CED et injecter 5 l l de solution trypan bleu dans le bloc d'agarose.
- Évaluer la forme du nuage de bleu trypan dans l'agarose et les fuites potentielles le long du cathéter. Trypan bleu devrait former un ellipsoïde ou un nuage rond avec le centre autour de l'extrémité du cathéter et un diamètre d'au moins 1 mm. Aucun reflux important sur la pointe de l'aiguille métallique ne doit être visible.
- Placez un nouveau bloc d'agarose et commencez une deuxième injection de 1 l à 0,2 L/min afin d'évaluer le colmatage du cathéter avec l'agarose. Trypan bleu devrait à nouveau commencer à former un nuage à partir de la pointe du cathéter immédiatement après le début de l'injection.
- Évaluer si le volume restant de la seringue correspond à 3 L. Toute variation peut pointer vers une fuite de liquide à travers le montage du cathéter ou le piston de seringue.
- Si toutes les injections d'essai sont réussies, le cathéter est bien scellé, droit et aucune solution bleu trypan n'est observée à partir d'autres endroits que la pointe du cathéter, laver le cathéter avec déionisé H2O (dH2O) jusqu'à ce qu'aucune trace de bleu trypan ne soit visible et laver dix fois comme suit : 70 % d'éthanol et 100 % d'éthanol, suivi s'il est de nouveau rincé avec 70 % d'éthanol et de l'eau déionisée propre.
- Conserver le cathéter dans des conditions sèches.
2. Convection-amélioré livraison de la solution d'anticorps dans le cerveau de Murine
REMARQUE: Selon les règlements locaux sur le bien-être animal, divers types d'anesthésiques, d'analgésiques et d'antibiotiques peuvent être mis en œuvre pour cette procédure. Ce protocole décrit l'utilisation de l'anesthésie par injection. Les anesthésiques par inhalation tels que l'isoflurane peuvent également être utilisés en montant un masque nasal sur le cadre stéréotaxique. En outre, nous recommandons d'ajouter des antibiotiques à l'eau potable pour la prophylaxie infectieuse.
- Configuration chirurgicale
- Préparer des solutions d'anesthésie et d'antidote. Les souris peuvent être anesthésiées en toute sécurité à l'aide d'une anesthésie à trois composants contenant du fentanyl (0,05 mg/kg), du midazolam (5 mg/kg) et de la médetomidine (0,5 mg/kg) diluée en dH 2 O stérile. Nous effectuons une procédure de réveil en deux étapes à l'aide de deux solutions antidote, l'une contenant du flumazenil (0,5 mg/kg) et la buprénorphine (0,1 mg/kg) en dH2O stérile (première solution antidote). Le second contient de l'atipamézole (2,5 mg/kg) en dH2O stérile (deuxième solution antidote).
- Préparer une solution d'analgésie contenant du carprofène (5,667 mg/kg) dilué avec dH2O stérile.
- Nettoyez le cadre stéréotaxique, le coussin chauffant et les éléments du robot stéréotaxique. Gardez à l'esprit que toutes les parties du robot ne peuvent pas être nettoyées sans risque de dommages. Consultez le manuel du robot pour plus de détails sur le nettoyage et la préparation à l'utilisation.
- Assembler la seringue avec le cathéter d'étape et la rincer plusieurs fois avec dH2O, 70% d'éthanol et 100% d'éthanol suivi de rinçage à nouveau avec 70% d'éthanol et dH2O. Enfin, rincer la seringue avec du PBS ou d'autres tampons à utiliser pour la préparation de la solution pour l'injection intracrânienne, par exemple le liquide céphalo-rachidien artificiel. Le piston de la seringue doit se déplacer en douceur et librement pendant toute la procédure.
- Calibrer le logiciel robot stéréotaxique avec le cadre stéréotaxique.
- Testez le logiciel robot stéréotaxique en veillant à ce que les bras du robot se déplacent librement et que la pompe d'injection est correctement connectée et peut effectuer la procédure CED sans aucune perturbation. Cela comprend l'essai du mouvement du robot, l'injection rampante, la vérification de l'étape d'attente de 2 min et la vitesse de rétraction du cathéter. Tous les paramètres doivent s'adapter à la procédure DEC préprogrammée décrite au point 1.3.5.
- Insérez le morceau de perceuse dans la perceuse. Il est recommandé de stériliser les morceaux de forage avant utilisation.
- Préparer la solution d'anticorps à l'aide de PBS ou d'autres solutions tampons telles que l'aCSF. 1 à 20 g d'anticorps sur 5 L peuvent être injectés en une seule procédure DEC. D'autres volumes et quantités de protéines doivent être testés avant d'effectuer l'expérience. Soyez conscient que l'utilisation de solutions à haute viscosité pourrait conduire à l'engorgement du cathéter.
- Chargez manuellement la seringue avec l'anticorps dilué.
- Injection d'anticorps par CED en striatum
- Pesez la souris et injectez la solution d'anesthésie à trois composants dans le péritoine en fonction du poids corporel. Notez l'heure d'injection. Transférer la souris dans une cage séparée chauffée à l'' entrée d'un coussin chauffant.
- Observez la souris pour déterminer quand la sédation commence. Dès que la souris cesse de bouger, appliquez un onduleur ophtalmique sur les yeux pour protéger la cornée contre le dessèchement pendant la chirurgie. La sédation complète commence habituellement 10 à 15 min à partir de l'injection de la solution d'anesthésie à trois composants.
- Vérifiez les réactions de douleur à l'aide du test de pincement-réflexe pour assurer une anesthésie complète de l'animal.
- Raser la tête à l'aide d'un coupe-cheveux.
- Désinfecter la peau avec des cotons-tiges imbibés de solution d'iode. Frotter la peau trois fois en mouvement circulaire.
- À l'aide d'un scalpel, faire une incision cutanée de 10 mm le long de la ligne médiane crânienne en finissant au niveau des yeux.
- Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique à l'aide de la pince nasale et des barres d'oreilles. Assurez-vous que la surface du crâne est horizontale et bien fixée. Outre la navigation anatomique correcte, cela est également crucial pour éviter l'inclinaison du crâne pendant le forage et la procédure CED.
- Placez la seringue dans le robot stéréotaxique.
- Synchroniser le morceau de forage avec la pointe du cathéter sur un point de référence. Il est crucial que la relation entre la position de la perceuse et la seringue soit déterminée avec précision dans le logiciel, de sorte que l'injection peut être effectuée dans la région anatomique désirée du cerveau.
- Retirez la peau à l'aide de forceps et localisez le bregma sur la surface du crâne.
- Bregma de référence dans le logiciel en utilisant la pointe de la partie de forage.
- Déplacez la perceuse vers une position frontale de 1 mm et latérale de 2 mm à partir du brégma et percez un trou de bavure. Veillez à ne pas endommager le dura mater.
- Déplacez la seringue sur le trou de bavure.
- Distribuez 0,5 à 1 L de la seringue pour s'assurer qu'il ne reste plus de bulles d'air dans le cathéter.
- Démarrer le programme CED décrit au point 1.3.5. Observez la surface du crâne pour détecter toute trace de reflux liquide provenant du point d'injection. Surveillez le rythme respiratoire de l'animal.
- Une fois le programme DEC terminé et le cathéter retiré du cerveau, démarrez la pompe d'injection à 0,2 L/min afin de vérifier si le cathéter obstrue le cathéter pendant le DEC. Si aucun colmatage ne s'est produit, vous devriez immédiatement voir une gouttelette de mélange d'injection provenant de la pointe du cathéter.
- Avant de réutiliser ou de stocker le cathéter, examinez visuellement l'étape du cathéter pour déceler tout signe de dommage ou d'usure au microscope et nettoyez-le comme à l'étape 1.3.10.
- Procédure de réveil
- Retirez doucement la souris du cadre stéréotaxique.
- Laver le site de la chirurgie avec une solution saline stérile.
- À l'aide de forceps, remplissez le trou de la bavure avec de la cire osseuse.
- Fermez la peau avec des forceps à bout mince et appliquez de la colle chirurgicale avec une pipette de 10 l sur la coupe. Attendez 15 à 30 s pour que la colle polymérise.
- Appliquer la solution d'analgésie par injection sous-cutanée. Notez l'heure de l'injection.
- Appliquer la première solution antidote. Notez l'heure de l'injection.
- Transférer la souris dans une cage séparée avec un coussin chauffant et surveiller l'animal pour les réflexes de sursaut.
- Si la souris n'a pas pris conscience 15 min après l'administration de la première solution antidote, appliquez la deuxième solution antidote par injection sous-cutanée.
- Surveiller les animaux pendant la phase de récupération.
- Vérifiez 1/2 h plus tard ainsi que le lendemain pour les complications post-opératoires. Si nécessaire, réappliquer l'analgésie.
- Pour la prophylaxie de l'infection, ajouter la sulfadoxine (concentration finale de 0,08 % w/v) et le trimethoprim (concentration finale de 0,016 % w/v) à l'eau potable à laquelle les animaux ont accès au libitum ad pendant 1 semaine après la chirurgie.
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Representative Results
Ce protocole permet la préparation de cathéters d'étape (figure 1) pour une utilisation dans la procédure CED dans un environnement de laboratoire. Afin de contrôler les cathéters pour les fuites, le reflux le long de la région de l'aiguille et le colmatage, nous recommandons d'effectuer des injections d'un colorant, par exemple, solution bleu trypan, dans un bloc d'agarose. La figure 3 représente un nuage de formation bleue trypan après injection de 1 l à 0,5 l/minute à l'aide d'un cathéter CED (figure 3A). Aucun reflux le long du secteur d'aiguille n'était visible au cours du début de l'étape de cathéter. En outre, le nuage dispersé a formé une forme sphérique désirée. Ceci est en contraste avec les résultats obtenus à l'aide d'une aiguille d'extrémité émoussée conventionnelle de 27 G (figure 3B), où un reflux important pourrait être observé.
En outre, LE DEC nécessite une procédure d'injection optimisée. La figure 4 montre les résultats de l'injection de 2 'L de bleu trypan dans un bloc d'agarose en utilisant la procédure de rampe décrite dans le protocole (A) par rapport à une injection à un taux régulier de 2 l/minute (B). La vitesse d'injection élevée a forcé le reflux le long du cathéter même quand un cathéter de CED a été employé.
Enfin, comme le montre la figure 5, le DEC permet la perfusion de grands volumes du cerveau murine. Des souris ont été injectées avec un anticorps anti-souris de rat TNFMD combiné avec LE FITC-dextran dans 5 'L de PBS par CED (panneau supérieur) ou par une injection conventionnelle de bolus (panneau inférieur). Le profil de perfusion de CED était plus uniforme que de l'injection conventionnelle et moins de dommages de tissu pourraient être observés. Dans les deux cas, il y avait un profil de distribution typique des particules d'anticorps et de dextrans sur le corpus callosum. Cependant, le profil de dispersion de l'anticorps injecté était plus diffus que du dextran de poids moléculaire élevé, illustrant des différences dans la distribution entre les différents infusates.
Figure 1 : Dessin schématique montrant la pointe du cathéter d'étape CED. Vues frontales (A) et côté (B). Le système n'est pas à la hauteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Dessin schématique représentant la zone d'application de l'adhésif. Les 10 mm supérieurs du tube de silice fusionné sont insérés dans l'aiguille métallique. Appliquer l'adhésif sur les 10 mm de tuyauterie à partir de la pointe de l'aiguille métallique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Comparaison des résultats de perfusion à l'aide d'un cathéter CED ou d'une aiguille émoussée. Injection de 1 'L de 0,4% trypan bleu dans un bloc d'agarose de 0,6% à 0,5 l/minute à l'aide d'un cathéter CED (A) et une aiguille émoussée 27G (B). Photos prises immédiatement après le retrait du cathéter ou de l'aiguille. La croix marque la pointe du cathéter ou de l'aiguille. Barre d'échelle de 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Comparaison des résultats de perfusion du protocole DEC rampant avec le protocole de taux régulier. Injection de 2 l de 0,4 % de bleu trypan dans un bloc d'agarose de 0,6 % à l'aide d'un protocole DEC rampant (0,4 l à 0,2 L/min, puis de 0,8 l à 0,5 l/min et de 0,8 l à 0,8 l/min (A) ou d'un protocole d'injection à taux régulier de 2 l/min (B). Dans les deux cas, un cathéter CED a été utilisé. Photos prises immédiatement après le retrait du cathéter. La croix marque la pointe du cathéter. Barre d'échelle de 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Résultats représentatifs de perfusion de striatum murine par CED ou par injection conventionnelle de bolus. Des souris ont été injectées dans le striatum (position 1 mm frontale et 2 mm latérale du bregma, profondeur de 3,5 mm) avec 1 g de rat anti-souris TNFMD combiné à 1 g de FITC-Dextran avec un poids moléculaire de 2 000 kDa dans 5 'L de PBS. Le protocole CED (panneau supérieur) ou une injection conventionnelle de bolus (27 G d'aiguille, taux d'injection 1 l/minute) a été exécuté (en bas). Les souris ont été sacrifiées immédiatement après la procédure DEC par asphyxie contrôlée de CO2 et perfused avec le formaldéhyde de 4% dans PBS. Les cerveaux ont été disséqués et en outre fixés avec 4% de formaldéhyde dans le PBS à 4 oC pendant 24 h. Par la suite, les cerveaux ont été lavés avec 15% de saccharose pendant 60 min et transférés à 30% de saccharose à 4 oC. Après 24 h, les cerveaux étaient gelés sur de la glace sèche. Des sections flottantes (25 m) ont été tachées à l'aide d'anticorps anti-rat polyclonal igG (H-L) couplés à Alexa Fluor 647 et contrecarrés avec DAPI. Les images ont été traitées à l'aide de la distribution Fidji d'ImageJ. 10x grossissement, barre d'échelle de 5 mm. 4 souris par groupe; une image représentative est affichée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'accouchement par convection, ou perfusion médicamenteuse sous pression dans le cerveau, a été proposé pour la première fois au début des années 19903. Cette approche promet la perfusion de gros volumes de cerveau derrière la barrière hémato-encéphalique d'une manière contrôlée2. Cependant, jusqu'à présent, seuls quelques essais cliniques ont été réalisés en utilisant cette approche, en partie parce que LE CED dans une configuration clinique s'est avéré techniquement exigeant24,25. Les développements récents dans la conception de cathéter et les programmes de perfusion semblent avoir surmonté ces difficultés techniques8,19. Les progrès réalisés dans la mise en œuvre clinique d'anticorps thérapeutiques, y compris l'avènement d'agents de blocage de points de contrôle immunomodulatoires, attendent l'application dans le traitement des troubles du SNC10. Ce développement peut être considérablement augmenté par l'utilisation de CED dans la configuration expérimentale, comme l'utilisation de petits modèles de rongeurs.
Divers modèles de maladie scnS sont disponibles chez la souris. Il s'agit notamment de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) pour la sclérose en plaques (SEP) et des modèles génétiquement modifiés pour la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (DP), ou pour le cancer du cerveau. Beaucoup de modèles de tumeur de cerveau comptent également sur l'inoculation orthotopic de tumeur des lignes de cellules de gliome murine ou de l'implantation des xénogreffes patient-dérivées. Ce protocole permet la livraison de solutions d'anticorps directement dans des endroits anatomiques spécifiques, ressemblant ainsi à des procédures thérapeutiques. Il peut être mis en œuvre dans diverses mises en page expérimentales où la livraison d'anticorps dans une région cérébrale précise joue un rôle central.
Le facteur critique dans l'exécution de CED chez les souris est la disponibilité des cathéters. Ce protocole contient une description précise de la façon d'assembler un cathéter d'étape et de le tester dans une série d'expériences in vitro. Il faut garder à l'esprit que la silice fusionnée dont le tube d'étape est fait est un matériau cassant et la qualité du CED avec un cathéter donné pourrait diminuer au fil du temps. Il est recommandé de contrôler les paramètres des cathéters d'étape entre les expériences in vivo en répétant les tests in vitro décrits dans la section 1.3 du protocole.
Le protocole peut être ajusté pour différents volumes d'injection, types d'infusate et de régions du cerveau. Le volume d'injection peut être manipulé en modifiant proportionnellement la durée des étapes d'injection. Ici nous décrivons l'infusion de 5 l, mais CED avec 10 l de solution d'anticorps a été rapportée dans la littérature utilisant une approche semblable dans les modèles de tumeur de cerveau murine, réalisant la distribution excellente de tissu et volumes de perfusion dépassant largement l'injection de bolus7 . De plus, jusqu'à 28 volumes d'infusate de L ont été signalés à l'aide du DEC pour l'application de liquides dans le cerveau du rat22,26. Les substances non protéiniques peuvent également être injectées par LE DEC, en gardant à l'esprit que l'infusate ne doit pas être d'une viscosité élevée pour éviter le colmatage de la pointe étroite du cathéter. À l'aide de liposomes, il a été démontré que la charge des molécules infusées peut grandement influencer la pénétration des tissus, avec des particules neutres ou chargées négativement pouvant être distribuées sur les plus grands volumes22. Comme le montre la figure 5, FITC-dextran et anticorps se dispersent différemment : bien que les anticorps et le FITC-dextran distribuent de la même façon le long du corpus callosum, la pénétration des anticorps du parenchyme cérébral est plus diffuse que pour fitC-dextran, qui montre un rayon plus petit et un modèle de distribution plus inégal. Cela souligne les différences dans le profil CED entre les infusates avec des propriétés physicochimiques variables.
En outre, l'expérience CED décrite ici et montrée dans la figure 5 a été réalisée en injectant un anticorps anti-souris TNMD chez des souris en bonne santé, en supposant ainsi une quantité minimale de cible dans le striatum. La présence d'antigène cognate changera le modèle de distribution des tissus. Il peut être affecté par des tissus inhomogènes à un site anatomique, tel que représenté à la figure 5 par la distribution de l'infusate le long du corpus callosum.
Enfin, le DEC est affecté par le flux de liquide interstitiel, qui, dans le cas de l'injection de striatum, peut rincer l'infusate vers les ventricules latéraux27. En effet, même lorsque le tissu est fixé immédiatement après la fin du DEC, on peut observer une adhérence marquée de l'anticorps injecté à la paroi ventriculaire (Figure 5). Ceci peut être davantage affecté par des conditions pathologiques du CNS, par exemple dans le contexte des tumeurs cérébrales. La nécrose focale, souvent observée dans les tumeurs cérébrales de haut grade28,peut affecter le flux de fluide interstitiel et ainsi modifier le modèle de distribution de l'infusate29. D'autres conditions pathologiques qui peuvent mener à la distribution modifiée de tissu de l'infusate par rapport au parenchyme sain incluent la course ou le lésion cérébrale traumatique30. En résumé, chaque série d'expériences CED doit être soigneusement validée pour assurer la perfusion réussie de la région cérébrale cible.
Actuellement, les chercheurs utilisent fréquemment des pompes osmotiques implantables pour fournir des substances dans le CSF ou le parenchyme cérébral (tumeur)31,32,33. Dans certains cas, le DEC tel qu'il est décrit ici peut être utilisé comme solution de rechange. Il peut être effectué plusieurs fois avec des fréquences en fonction de la région du cerveau, le type d'infusate, le volume et le protocole d'anesthésie utilisé. L'administration intermittente de médicaments peut être particulièrement pertinente lorsqu'une exposition prolongée à l'infusate entraîne une tolérance ou des effets secondaires systémiques. Il est concevable que dans les cas où une rétention élevée et des infusates de demi-vie sont livrées, cette approche représenterait un raffinement selon le principe 3R puisqu'aucune implantation de pompe ne serait nécessaire. En conclusion, ce protocole décrit un moyen efficace d'infuser de grands volumes de solution d'anticorps dans le striatum murine et peut être ajusté pour d'autres régions du cerveau et les types d'infusate.
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Disclosures
Johannes vom Berg est mentionné comme inventeur sur demande de brevet (PCT/EP2012/070088) de l'Université de Zurich. Michal Beffinger, Linda Schellhammer et Johannes vom Berg sont cités comme inventeurs sur une demande de brevet (EP19166231) de l'Université de Zurich. Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers supplémentaires.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de l'Université de Zurich (FK-15-057), de la Novartis Foundation for medical-biological Research (16C231) et de Swiss Cancer Research (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) à Johannes vom Berg et BRIDGE Proof of Concept (20B1-1 177300) à Linda Schellhammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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