Summary
Здесь мы представляем интегрированный рабочий процесс для идентификации фенотипических и молекулярных особенностей, характеризующих циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). Мы объединяем живые иммуноокрашивания и роботизированные микроманипуляции одиночных и кластерных КЦС с помощью единой ячейки на основе методов для анализа и оценки метастазирования способность посева.
Abstract
Кровь метастазов приходится большинство смертей, связанных с раком и включает в себя циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), которые успешно в создании новых опухолей в отдаленных местах. ЦОК находятся в крови пациентов как одиночные клетки (одиночные ЦОК) или как многоклеточные агрегаты (СТС кластеров и СТС-белые группы кровяных телец), с последним отображая выше метастатической способности. Помимо перечисления, фенотипический и молекулярный анализ чрезвычайно важен, чтобы вскрыть биологию КТК и выявить действенные уязвимости. Здесь, мы предоставляем подробное описание рабочего процесса, который включает в себя СТС иммуноокрашивания и микроманипуляции, ex естественных условиях культуры для оценки пролиферативного и выживания возможности отдельных клеток, и в естественных условиях метастазов образования анализов. Кроме того, мы предоставляем протокол для достижения диссоциации кластеров КТК в отдельные ячейки и исследование внутрикластерной неоднородности. С помощью этих подходов, например, мы точно количественно выживания и пролиферативного потенциала одного ЦОК и отдельных клеток в рамках КТК кластеров, что привело нас к наблюдению, что клетки в кластеры дисплей лучше выживания и распространения в ex естественных культурах по сравнению с одной ЦОК. в целом, наш рабочий процесс предлагает платформу для рассечения характеристик ЦОК на уровне одного ячейки, стремясь к идентификации метастазов соответствующих путей и лучшего понимания СТС биологии.
Introduction
Клиническое проявление метастазов в отдаленных органах представляет собой завершающую стадию прогрессирования рака и составляет более 90% смертей, связанных с раком1. Переход от локализованного к метастатическим заболеванием является многоступенчатый процесс, часто опосредованный циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК)2,3,4. Эти клетки сбрасывают из первичной опухоли в кровообращение и транспортируются в отдаленные органы, где они могут экстратравате и установить метастатические поражения5,6. Хотя твердые опухоли могут выпустить относительно большое количество ЦОК, большинство ЦОК суждено умереть, из-за высокой силы сдвига в обращении, аноки-опосредованной клеточной смерти, иммунного нападения или ограниченные возможности, чтобы адаптироваться к иностранной микросреде7. Таким образом, это имеет решающее значение для создания инструментов, которые позволяют рассечение молекулярных особенностей тех, ЦОК, которые наделены с метастазами-посевной способности. Недавние доклинические и клинические исследования показывают, что наличие и количество единичных ЦОК и КТК кластеров связано с худшим результатом у пациентов с различными типами твердых опухолей8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 -ое . КТК кластеры группы из двух или более ЦВК, прилагаемый друг к другу во время циркуляции и более эффективны в формировании метастазов по сравнению с одной ЦОК3,15,16. Ячейки внутри кластера поддерживают сильную адгезианию клеток через десмоссомы и адхеренс соединения, которые могут помочь преодолеть анаикис17,18. В последнее время мы наблюдали, что кластеризация ЦОК связано с гипомеэтилляции сайтов связывания для штемфее и связанных с распространением транскрипционных факторов, что приводит к увеличению способности успешно инициировать метастазирование19. СТС кластерной диссоциации приводит к реконструкции ключевых сайтов связывания, и, следовательно, подавление их метастатического потенциала19. Дополнительно к кластерам раковых клеток, ЦОК также может ассоциировать с лейкоцитов (чаще всего нейтрофилов) для поддержания высокого уровня распространения в обращении и увеличить их метастатическим потенциалом20. Тем не менее, биология ЦОК понимается только в части и несколько вопросов остаются открытыми, в том числе основные молекулярные особенности и уязвимости отдельных и кластерных клеток.
В последние годы было создано несколько стратегий, которые используют шаблоны выражения клеточной поверхности, а также физические свойства ЦВК для их изоляции21,22,23,24, 25. антиген-зависимые методы изоляции опираются в основном на экспрессию клеточной поверхности клеток эпителиальной адгезии (EpCam)26. Наиболее часто используемой и (в настоящее время) единственной одобренной FDA платформой для перечисления КТК является система CellSearch, которая основывается на двухэтапной процедуре для изолирования ЦОК21. На первом этапе плазменные компоненты удаляются с помощью центрифугирования, в то время как ЦОК улавливания с магнитной фермофлюидов в сочетании с анти-EpCAM антител. На втором шаге раствор, обогащенный КТК, окрашивается для нуклеажных (DAPI-положительных) клеток, выражающих цитокератин (CK)8,18,19, в то время как белые кровяные тельца (лейкоциты) идентифицируются с использованием Пан-лейкоцитарный маркер CD45. Наконец, захваченные клетки помещаются на интегрированной платформе скрининга и ЦОК идентифицируются через выражение EpCAM, Рикс, и DAPI, будучи отрицательным для CD45. Несмотря на то, что это считается золотым стандартом для перечисления КТК, молекулярный анализ ниже по течению является сложной задачей с помощью этой технологии из-за присущих им ограничений поиска КТК. Кроме того, с учетом его процедуры изоляции, CellSearch может способствовать обогащению ЦОК с более высокими уровнями EpCAM по сравнению с ЦОК с более низким EpCAM выражение, из-за, например, гетерогенность рака27 или Даунрегуляция эпителиальных маркеров 28,29. Для преодоления этих ограничений появились антиген-независимые технологии обогащения ЦОК. Например, "СТС-чип" интегрирует гидродинамическая разделение нуклеированных ячеек, включая ЦВК и лейкоциты из оставшихся компонентов крови, а затем иммуномагнетик истощение антител, отмеченных лейкоцитов, что позволяет очистить немаркированные и жизнеспособные ЦОК в решение25. Кроме того, тот факт, что большинство ЦОК немного больше, чем красных кровяных телец (эритроцитов) или лейкоцитов привело к развитию на основе размера КТК технологий обогащения23,30 (например, система парсоркс (угол)), которая делает использование микрофлюидическая технология, включающая сужение канала через разделение кассеты, ведущие ячейки к терминальным пробелом 10, 8, 6,5 или 4,5 мкм (различные размеры доступны в зависимости от ожидаемого диаметра целевых раковых клеток). Большая часть клеток крови проходит через узкий зазор, в то время как ЦОК попадают в ловушку из-за их размера (но также из-за их нижней деформируемого) и, следовательно, сохраняются в кассете. Возврат направления потока позволяет выпустить захваченные ЦОК, которые находятся в жизнеспособное состояние и подходит для нисходящего анализа. Независимо от выбранного протокола для изоляции КТК, однако, типичные после обогащения процедуры по-прежнему дают ЦВК, которые смешиваются с относительно небольшим числом эритроцитов и кровяных телец, что делает анализ чистой одной или объемных ЦОК сложным. Для решения этой проблемы, мы создали рабочий процесс, который позволяет КТК манипуляции без потенциальной предвзятости, введенных загрязняющих клеток крови. Добавление иммуноокрашивания заранее, с переменными антителами-комбинациями, отличает ЦОК от клеток крови и даже позволяет идентифицировать КТК подгрупп с отдельными поверхностными маркером выражения профилей. Эта высоко настраиваемая процедура может быть затем дополнительно объединено с конкретными нижестоящих приложениями.
Здесь мы описываем рабочий процесс, который начинается с продуктов, обогащенных КТК (полученных с помощью любой технологии по обогащению КТК), и сочетает в себе несколько подходов для получения понимания СТС биологии при разрешении одной ячейки. В двух словах, наш рабочий процесс позволяет идентификации одного ЦОК, СТС кластеров и КТК-WBC кластеров в прямом эфире иммуноокрашивания, а затем одноклеточных микроманипуляции и нисходящего анализа с использованием ex естественных условиях культивирования протоколов, одной ячейки последовательности, и в естественных условиях метастазов анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с образцами крови пациентов, проводились при подписанном информированное согласие участников. Процедуры проводились в соответствии с протоколами EKNZ BASEC 2016-00067 и EK 321/10, утвержденными этическим и институциональным Советом по обзору (Комитет по этике северо-запад/Центральная Швейцария [EKNZ]), и в соответствии с Хельсинкской декларацией.
Все процедуры, касающиеся животных были выполнены в соответствии с институциональными и кантональные руководящие принципы (утвержденный протокол мышь #2781, кантональное ветеринарного управления Базеля-Сити).
1. Подготовка образца пациента
- Перед началом, обеспечить работу с асекотических решений и материалов для поддержания бесплодия в течение всей процедуры.
- Вывести 7,5 мл периферической крови из больного раком молочной железы в 10 мл трубки ЭДТА крови.
- Инкубировать кровь содержащие трубы в течение короткого периода времени (до 1 ч) при комнатной температуре (RT) на качающемся шейкере на 40 колебаний в минуту (ОСК/мин).
- Обогащают одиночные ЦБК и КТК кластеры с использованием КТК методом выбора21,22,23,25. Выпуск ЦВК в 1x DPBS решение.
Примечание: в зависимости от выбранной технологии по обогащению, оставшиеся белые кровяные тельца и эритроциты могут присутствовать. Отрегулируйте высвобождающие давления, чтобы сохранить кластерные структуры КТК. - Немедленно переходите к следующему шагу в разделе 3.
2. Подготовка образца мыши
- Перед началом, подготовить 1 мл инсулина шприц с 25 г иглы, 5 мм ЭДТА фильтруют раствор, и 2 мл крови ЭДТА коллекционные трубы.
- Обеспечить работу с асекотических решений и материалов для поддержания бесплодия в течение всей процедуры.
- Предварительно промойте шприц с 5 мм раствором ЭДТА.
- Загрузите шприц с 100 мкл 5 мм ЭДТА и удалить пузыри.
- Усыпить мышь с помощью 80% CO2 /20% O2 вдыхания газа и немедленно перейти к следующему шагу.
Примечание: альтернативой CO2 ингаляционного метода является изофлуран анестезии (3 т% изофлуран и кислород (перевозчик газа) при скорости потока 600 мл/мин), а затем вывих шейки матки или передозировки инъекции кетамина/ксилазин раствора. Конкретный метод эвтаназии может варьироваться в зависимости от утвержденного протокола мыши. - Подтвердите смерть животного отсутствием дыхательной активности, отсутствующий рефлекторный рефлекс, и мочеиспускание без внешних раздражителей.
- Выполните прокол сердца, тщательно введя иглу предварительно загруженного шприца ЭДТА с углом 30 ° в грудную клетку от грудины к сердцу.
Примечание: для неопытных экспериментаторов рекомендуется сначала открыть грудную полость перед выполнением сердечного пункции, чтобы лучше визуализировать сердце. - Извлекаем до 1 мл крови. Не выпуская поршень, вытащить шприц из груди животного, безопасно удалить иглу, откройте крышку 2 мл трубки ЭДТА крови и распределять кровь непосредственно внутри. Закройте крышку и инвертировать трубку 10x.
- Инкубировать кровь содержащие трубы в течение короткого периода времени (до 1 ч) на RT на качалки шейкер на 40, в/мин.
Осторожно: игла должна быть утилизироваться при резком безопасном удалении биологической опасности.
Примечание: множественные проколы возможны для того чтобы увеличить общий объем крови. Используйте отдельные шприцы предварительно загружены с ЭДТА для различных отзывает, чтобы избежать АСС запекшейся крови присутствует в предыдущей иглы. - Обогащать для одиночных ЦОК и КТК кластеров с использованием ЦВК метод изоляции выбора21,22,23,25. Выпуск ЦВК в 1x DPBS решение.
Примечание: в зависимости от выбранной технологии по обогащению, оставшиеся белые кровяные тельца и эритроциты могут присутствовать. Отрегулируйте высвобождающие давления, чтобы сохранить кластерные структуры КТК. - Немедленно переходите к следующему шагу в разделе 3.
Примечание: для всех следующих процедур, убедитесь, что нефиксированные и свежезаваренным изолированной крови используется.
3. ЦОК жить иммуноокрашивания
- Центрифуга КТК обогатила клеточную подвеску на 72 x g за 4 мин.
Примечание: 72 x g соответствует 800 оборотов в минуту, если ротор имеет диаметр 100 мм. Преобразуйте число g-Force в соответствии с ротором. - Осторожно ресуспензируем гранулы в 1% растворе БСА в 1x DPBS и добавьте 2 мкг/мл анти-человеческого антитела EpCAM-AF488 и 1 мкг/мл анти-человеческого антитела CD45-BV605 или 2 мкг/мл анти-мыши CD45-BV605 антитела в общем объеме 500 мкл.
Примечание: для рака молочной железы пациента, полученных ЦОК, анти-человека EGFR-FITC, и анти-человека HER2-AF488 могут быть добавлены дополнительно к анти-EpCAM и анти-CD45. Это позволяет лучше идентифицировать ЦВК, которые выражают более низкие уровни EpCAM. - Инкубировать в течение 30 минут на RT и защиты от света.
- Мытье ЦБК подвеска с использованием 1 мл 1% БСА в 1x DPBS решение и центрифугирования на 72 x g в течение 4 мин. Повторите эту стирку дважды.
- Ресуспензируем окрашенных клеток в 2 мл 1% БСА в 1x DPBS решение и передавать общий объем в 1 скважинах ультра-низкая крепления пластины 6-скважин.
- Инкубировать пластины для 10-15 мин при температуре 4 ° c защищен от света, чтобы позволить осаждения ЦОК и остаточных клеток крови.
4. микроманипуляции ЦВК и одноклеточный сбор
Примечание: перед началом, имейте в виду, что микроманипулятор требует до 45 мин для полного набора. После настройки процедура идентификации и микроманипуляции КТК требует до 2 минут на ячейку (или кластер).
- Убедитесь в том, чтобы прекратить процедуру выбора КТК в течение 2 ч от конца окрашивания.
- Запустите программное обеспечение микроманипулятора и включите микроманипулятор. Подключите микроманипулятор к компьютеру и инициализировать роботизированную руку, а также Микроскоп этап, нажав кнопку Connect следуют int устройства.
- Закройте шкаф защиты после каждой манипуляции машины, чтобы иметь возможность маневрировать его через компьютер.
- Чистота поверхностей от пыли и разливов путем распыления этанола и очистки внутренних поверхностей кабинета. Чистая окружающая среда обеспечит стерильность процесса.
- Установите новый стеклянный капилляра на роботизированную руку. Для сбора одноклеточных, используйте 20-30 мкм капилляров, а 30-50 мкм предпочтительнее для подбора кластера КТК.
- Удалите все пузырьки, присутствующие в трубке, путем дозирования или ассоряции системного масла.
Осторожно: стекло капилляра является резким и хрупким. Ручка с осторожностью. - Заполните стерилизацию бак 1 с 70% этанола, стерилизация бак 2 стерильной нуклеазы H2O и буферный бак с стерильным 1x dpbs.
Осторожно: не закрыв крышки резервуаров, так как во время следующих шагов капилляры должны будут свободно получать доступ к танкам. - Стерилизовать капилляры дважды с 70% этанола.
- Замените стерилизацию бак 1 с цистерна 2 и мыть капилляры в H2O по крайней мере три раза, используя функцию стерилизации.
- С помощью микроманипулятора программного обеспечения, начать новый эксперимент и выбрать тип выбора эксперимента между автоматическим и ручной выбор режимов.
Примечание: выберите тип эксперимента, основанный на конечной точке манипуляции. Ручной режим позволяет маневрировать роботизированной рукой после того, как капилляры попадают в клеточную суспензию. Этот шаг необходим для диссоциации кластеров КТК в отдельные ячейки. В ходе эксперимента можно изменить тип подбора. - Настройте лоток для палубы с указанием положения бака стерилизации (жидкость 1), буферного бака (жидкость 2) и депонирования лотка (цель 1 или 2). Цель 1 позволяет депозит в пластины, Цель 2 позволяет депозит в трубки или ЦР-ЦР пластин.
- Установите температуру жидких резервуаров и откладывая на хранение лоток, выбранный до 4 °C.
Примечание: процесс выбора может занять много времени. Охлаждение жидких резервуаров и депонирования лотка, поэтому рекомендуется - Позиция ультра-низкая привязанность пластины, содержащие выпустила решение ЦОК под микроскопом внутри микронипулятора кабинета. Снимите крышку с плиты и закройте шкаф. Держите тарелку в RT для остальной части настройки и во время процедуры выбора.
- Вручную выберите цель микроскопа для подбора (10-20x) и время экспозиции всех необходимых каналов (каналы Брайтфилд, FITC и TRITC).
- Выберите хорошо показать навигатор из панели инструментов для визуализации и выберите тип пикап пластины (6-хорошо пластины).
Примечание: любой пластины или хорошо формат может быть установлен только производителем. - Калибровка пикап положение в середине скважины, содержащие раствор ЦОК, но без клеток в центре поля зрения. Калибровка, выполняравная по краям скважин, может привести к неправильной калибровке из-за неровной поверхности скважины.
- Используйте датчик, чтобы мягко коснуться нижней части пластины с капиллярами (скорость 0,01 мм/шаг и 1% скорость).
- Установите позицию пикапа 0,05 мм над нижней частью пластины.
Примечание: Убедитесь в том, чтобы открыть и удалить крышки пластин и танков, прежде чем продолжить. Капилляры могут сломаться на закрытой или незаизвлекатой крышке.
Предостережение: Если капилляры перерывы при контакте с крышками, разбитое стекло может быть найден в окрестностях или в растворах. - Выберите тип ячейки и параметры комплектации. Параметр параметра может быть настроен и загружен при каждом запуске. Для подбора одной ячейки выберите ручной режим.
- В настройках подготовки подбора :
- Установите объем зазор между системным маслом и образцом до 1 мкл
- Установите объем буфера жидкости, чтобы занять до каждого подбора до 0,5 мкл.
Примечание: буфер жидкого объема корректируется на общий максимальный объем пикапа. Небольшие объемы не влияют на сбор или внесение эффективности. - Установите скорость устремленности буферной жидкости между 1-6%.
- Установите время ожидания после стремления буфера к 1 с.
Примечание: при необходимости можно использовать опцию взятия буфера из скважины вместо буферного жидкого бака - Установите для повторного использования стеклянных капилляров и не стерилизации между кирками.
Примечание: стерилизация между выборами может быть выполнена вручную, если требуется. Выполните несколько моет в H2O между кирками или две стерилизации в этанол следуют несколько моет в H2O.
- В настройках выбора :
- Измените настройки камеры во время сбора и время экспозиции под микроскопом до 7 500 МКС.
- Выберите фиксированную высоту комплектации.
Примечание: вместо этого можно выбрать датчик инструмента или автофокус. Тем не менее, небольшие несовершенства пластины может нарушить чувствительность датчика или автофокусировки, которые могут вызвать воздействие капилляров в тарелку. - Установите аспирационной скорости капилляров ввода исходной пластины до 7-15%.
- Включите интерактивный сбор.
- Установите объем аспирации в мкл до 0-0,5.
- Установите скорость устремленности до 5%.
- Установите время ожидания после аспирации в s к 0-1.
- Установите Количество подобранных частиц на капилляры до 1.
- Установить не множественный сбор в той же позиции и не выскабливание функций. Свойства аспирации должны быть установлены в соответствии с типом эксперимента (например, автоматический режим подбора может требовать больших объемов аспирации).
- В настройках депозита :
Примечание: внесение настроек строго зависит от сдачи пластины/трубки.- Для сбора одной ячейки, определить скорость капилляров ввода целевой пластины до 25%.
- Установите скорость дозирования до 6%.
- Установите время ожидания после дозирования в s к 0.
- Установите количество зазор , распределяемой в цель хорошо к 100%.
- Установить не промыть после сдачи на хранение.
Примечание: стерилизация может быть выполнена после сдачи на хранение, чтобы очистить капилляры. - Установите Максимальное количество частиц депозита в хорошо и количество целевых показателей для распределения частиц 1.
- Калибровка высоты депозита на позиции a1 целевой 1 для пластин или на позиции a1 целевого 2 для труб. Поместите открытую трубку или пластину без крышки для калибровки и используйте датчик, чтобы аккуратно коснуться сдачи скважины (скорость 0,01 мм/шаг и 1% скорость). Установите высоту депозита 1 мм над нижней частью пластины.
- В настройках:
- Установите скорость сцены во время подбора до 5-10%.
Примечание: быстрые движения пластины могут привести к перемещению клеток в подвеске и затруднениям при подборе нескольких клеток в связи с миоспоциционирование. - Установите Свойства стерилизации , используя объем промывки до 1 мкл, 3 полоскание петли и 2 s времени ожидания на стерилизацию круглый.
- Примените изменения перед закрытием.
- Установите скорость сцены во время подбора до 5-10%.
- Перейдите стекла капилляров с помощью джойстика в колодец и поместите его на вершине одной ячейки интерес. Выбирайте позиции на безопасном расстоянии от границы скважины (1 мм), так как капилляры могут сломаться на краю колодца.
- Вручную добавляйте частицы с помощью кнопки джойстика или вручную выбрав из меню.
- Для начала подбора выберите активированные частицы .
- Капилляры остановится 0,05 мм над нижней части пластины и на верхней части выбранного пикап позиции из-за интерактивного сбора (ручной режим). Осторожно поверните ручку джойстика по часовой стрелке, чтобы вручную аспоте частицы и окружающие решения DPBS. Максимальный объем не фиксируется при режиме ручного режима. Однако максимальный объем, разрешный в шприце, будет 25 мкл.
- Отказаться от избыточного DPBS решение или нежелательных частиц, осторожно поворачивая ручку джойстика против часовой стрелки. Слишком много дозирования выпустит зазор из шприца формирования пузырьков в вашем решении и компрометирующей видимости.
- Нажмите Далее , чтобы продолжить депозит.
- Наблюдайте за тем, как капилляры входят в депонирование трубки или пластины ЦР, выпуская громкость и возвращаясь в исходное положение с пустым капилляра.
Примечание: если есть объем остается в капилляров, приступить к стерилизации. Затем перепроверьте настройки, уровень масла и высоту масла перед выполнением нового подбора. - Переходите из пункта 26 раздела 4, чтобы начать новый сбор одной ячейки. Во время подбора может понадобиться замена капилляра. После установки необходимо выполнить новую калибровку позиции пикапа. В конце калибровки, выберите функцию откалиброванные изменения в Z-высота , чтобы депозит высота для того, чтобы исправить высоту депозита к новой калибровке капилляров и пропустить калибровки высота депозита (раздел 4,16).
Примечание: описанные в разделе 1-4 шаги применимы к большинству методов обогащения и изоляции ЦОК. Здесь мы сообщаем о необязательных шагах для конкретного анализа ЦБК.
5. сбор и посев одиночных ячеек для анализа выживаемости и распространения
- Обеспечить работу с асекотических растворов и материалов для поддержания бесплодия в течение всей процедуры.
- Подготовка 384 хорошо пластины содержат взял один Кцвк для культивирования с 20 мкл СТС культивирования СМИ31. Убедитесь, что ЦОК посеяны в небольших объемах среды после манипуляции (например, 10-20 мкл для 384 хорошо пластины).
- Спин вниз решение в нижней части пластины. Поместите 384 хорошо пластины в цель 1 и держать на 4 ° c.
- Выполните все шаги с микроманипулятором описано в разделе 4 создать микроманипулятор и начать новый сбор.
Примечание: несколько выбранных одиночных ячеек вызовут формирование списка выбора. Частицы будут собраны и депонированы один за другим в последовательных скважинах (см. раздел 4.22.6). Тем не менее, интерактивный режим (ручной режим) остановит капилляры прямо перед устремлением, таким образом позволяя экспериментатору контролировать этот критический шаг и обеспечить успешное собирание. Быстрые движения пластины может привести к движению клеток в подвеске и трудности в нескольких выбора ячейки. - После внесения депозита повторите шаг 4, чтобы начать новый сбор.
- В конце комплектации, центрифуга пластины на 72 x g за 4 мин для обеспечения того, чтобы выбрали клетки помещаются в нижней части скважины.
6. КТК разбивая и одноклеточный сбор для секвенирования
- Обеспечить работу с асекотических растворов и материалов для поддержания стерильности в течение всей процедуры.
- Приготовьте одиночные трубки для ПОЦР или пластинку ЦР, которая будет содержать одиночные ячейки разбитого кластера с суммарным разрешением ячейки 2,5 мкл, включающим 1 U/мкл ингибитора РНК.
- Быстро закрутить вниз раствор к дну пробки. Поместите контейнеры в цель 2 и держите при температуре 4 °C.
- Выполните все шаги, описанные в разделе 4 с микроманипулятором, чтобы настроить микроманипулятор.
- Начните новый сбор. Капилляры остановят 0,05 мм над нижней частью пластины и поверх выбранного блока КТК из-за интерактивного подбора (ручной режим).
- Осторожно поверните ручку джойстика по часовой стрелке, чтобы вручную аспоте кластера и окружающих решение DPBS. Обойтись с придыханием объем в том числе КТК кластера, осторожно поворачивая ручку джойстика против часовой стрелки.
- Повторите аспирация/Удаление кластера КТК, описанный в шаге 6, пока одиночные ячейки, образующие кластер, не будут распаваться.
Примечание: слишком много дозирования выпустит зазор из шприца формирования пузырьков в вашем решении и компрометирующей видимости. - Следуйте в глаза положение одиночных ячеек. Вручную добавьте частицы с помощью кнопки джойстика или вручную выбрав из меню.
Примечание: несколько выбранных одиночных ячеек вызовут формирование списка выбора. Частицы будут собраны и сданы на хранение один за другим в последовательных труб ЦР/скважин (см. раздел 4.22.6). Тем не менее, интерактивный режим (ручной режим) остановит капилляры прямо перед устремлением, таким образом, позволяя экспериментатору контролировать этот критический шаг и обеспечить успешное собирание. - Для начала подбора выберите активированные частицы .
Примечание: количество ячейки lysing решение позволит одной ячейки, чтобы полностью lysing. Однако длительное воздействие лизированных содержимого на лисинг агента может ухудшить ДНК или мРНК. Поэтому немедленно переходите к следующему шагу. - Немедленно закройте трубку, содержащую подобранную одну клетку и переведите на сухой лед для замораживания.
- Быстро закрутить трубку и проверить отсутствие капель по бокам трубки, чтобы обеспечить надлежащий Lyse на хранение ячейки.
- Повторите с шага 5, чтобы начать новый сбор.
Примечание: Этап микроскопа будет переходить от одной добавленной частицы к другой на скорости, описанной в разделе 4.23.1. Подвеска ЦОК в ультра-низкой пластине вложения может двигаться, вызывая неисправный выбор из-за неправильного.
7. изоляция ЦБК для инъекций мыши
- Обеспечить работу с асекотических растворов и материалов для поддержания бесплодия в течение всей процедуры.
- Подготовьте пробирку с 5 мкл стерильных 1x DPBS.
- Быстро закрутить вниз раствор к дну пробки. Поместите контейнеры в цель 2 и держите при температуре 4 °C.
- В настройках депозита применяются изменения на шаге 4.22.6: установите Максимальное количество частиц депозита в хорошо к 1 000 и количество целевых показателей для распределения частиц 1. Этот шаг гарантирует, что подобранных ячеек будет храниться в одной трубе в течение 1 000 раз.
- Используйте только интерактивный режим (ручной режим), чтобы точно контролировать шаг сбора и держать выбранный раствор свободным от загрязняющих клеток.
Примечание: Если требуется более 1 000 ячеек, увеличьте количество мишеней для распределения частиц , чтобы избежать потери образца после 1 000 клеток. - Продолжайте шаги раздела 4,26, чтобы начать новый сбор. Повторите шаг 6, чтобы выполнить несколько поживу. Аннотировать количество ячеек, собранных на каждом сборе, чтобы отслеживать количество ячеек, доступных для инъекций мыши.
- В конце сбора, центрифуга трубки на 72 x g для 4 мин (см. раздел 3,1.) и аспирин supernatant.
- Ресуспензируем собранные ЦВК в буфер выбора, подходящий для инъекции мыши. Для молочных жира площадку инъекции, ресуспензируем собранные ЦОК в 1 к 1 соотношение 1x DPBS и восстановленный подвал мембраны извлечены, и держать на 4 ° c до инъекции. Для внутривенного впрыска, ресуспензируем собранные ЦОК в DPBS только.
Примечание: объем решения строго зависит от количества СЦВК, которые будут введены. Рекомендуется вводить в молочную жирную площадку или внутривенно максимум 100 мкл на мышь. При расчете объема всегда учитывайте мертвый объем для манипуляции и загрузки шприца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный рабочий процесс позволяет подготовку отдельных ЦВК, либо из однокц, либо отделяются от кластеров КТК. ЦОК от пациентов или опухолевые мышей обогащаются из цельной крови с помощью методов обогащения КТК, а затем окрашивается с антителами против рака-ассоциированные маркеры (например, EpCAM, зеленый) и WBC конкретных маркеров (например, CD45, красный) (рис. 1A ). Окрашенных продукт КТК затем передается микроманипуляции станции были отдельные ячейки собраны, депонированные в трубки или многоплодной пластины и подготовлены для нисходящего анализа, в том числе одноклеточных секвенирования, в пробирке культуры или в естественных условиях анализов (рис. 1b).
Надежность этого метода основывается на надлежащей цели ячейки различие во время ручного подбора клеток. Live иммуноокрашивания с анти-EpCAM антител визуализирует раковые клетки в суспензии и позволяет точное различие от CD45-положительных событий (скорее всего, лейкоциты) (рис.2A). При правильном калибровке и поддерживается, Cellcвыборщик обеспечивает хорошо контролируемой клеточной манипуляции. Точная изоляция КТК характеризуется стремлением только к желаемой цели без окружающих загрязняющих клеток (эритроцитов или лейкоцитов), как показано на снимках до и после кластерного аспирации КТК (Рисунок 2B, C).
Как описано ранее, СТС кластеров дисплей более метастатическим фенотипа по сравнению с соответствием одной ЦОК19. Тем не менее, является ли наличие соседних клеток достаточно, чтобы увеличить скорость распространения клеток в кластеры неизвестно. Для того, чтобы решить этот вопрос, 1009 одного СТС и 1008 кластеров КТК, начиная между 2-17 клетки (с 89,5% из них являются 2-5 клеточных кластеров), полученных от КТК-производные BR16 ячейки линии20 были микроанипуты в отдельных скважин 384-хорошо ультра-низкие пластины крепления. Количество живых клеток в каждом хорошо подсчитывали вручную под микроскопом и записанные еженедельно. Все анализы проводились после нормализации клеточного номера (то есть, кластер из трех ячеек анализировали как три отдельные ячейки). Неудачными колониями характеризовались отсутствие живых клеток в колодец в конце эксперимента. Как подозревается, кластеры КТК показали повышенную выживаемость по сравнению с одной ЦОК и породили ячейки колонии в течение 56 дней в пробирке культивирования (Рисунок 3a, 3a). Примечательно, что группы КТК также продемонстрировали более высокий уровень распространения и, таким образом, достигли более высоких окончательных ячеек (Диаграмма 3C), указывая, что непосредственный контакт с другими опухолевыми клетками влияет как на их жизнеспособность, так и на скорость распространения.
Наконец, мы предоставляем одноклеточные РНК секвенирования данных ЦОК непосредственно изолированы от рака молочной железы пациентов. В частности, мы показываем т-распределенные стохастические сосед вложения (tSNE) одиночных клеток, полученных от одного ЦОК, КТК кластеров или КТК-WBC кластеров (рис. 4). Такой подход позволяет идентифицировать клетки с аналогичным профилем экспрессии генов, а также различать популяции клеток, которые различаются на основе экспрессии определенных генов.
Рисунок 1 . Схематическое представление экспериментального рабочего процесса. (А) ЦВК получаются из крови онкологических больных или мышей рака модели, обогащенный использованием имеющихся методов и помечены с антителами различать опухолевые клетки (зеленый) из белых кровяных клеток (красный). (B) точный микроманипуляции ЦОК облегчает несколько процедур и приложений, например, одноклеточных СЕКВЕНИРОВАНИЯ, КТК культуры или в естественных условиях трансплантации экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 . Представительные фотографии ЦОК до и после микроманипуляции. (A) репрезентативные образы ЦОК, полученных из КПК-производного ксенотрансплантата (ГНГ-CDX-BR16) и окрашенных антител анти-EpCam (зеленый) и анти-CD45 (красный), чтобы включить визуализации ЦОК и белых кровяных клеток, соответственно. Показано увеличение 40x. (B, C) Микроманипуляции позволяет точное разделение ЦОК от нежелательных клеток, как показано на изображениях до (слева) и после (справа) CELL-аспирационной процедуры. Увеличение 10x. Показано более крупное поле зрения (B) и более узкое поле зрения (C) , соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 . Анализ на выживание и распространение единично-ЦВК и КТК кластеров. Индивидуальные ячейки от одиночных ЦОК или СТС кластеров из культивируемых КТК-производные BR16 клетки были микроанипуты в 384-хорошо пластин. (A) Каплан-Мейер сюжет показаны вероятность выживания посеяны одиночные клетки против клеточных кластеров. P< 0.0001 by pairwise тест log-ранга. (B) барный график, представляющий долю колоний, которые состояли из живых клеток в конце эксперимента (день 56). P< 0.0001 тестом Chi-Square. (C) тепловые карты визуализации нормированного распределения количества клеток в ходе эксперимента (день 0, 8, 32, 56). Каждый блок представляет собой одну стартовую ячейку, и теплкарта показывает количество ячеек на колодец в данном часовом пункте. d = день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4 . Одноклеточная секвенирование РНК. Визуализация данных СТС РНК экспрессии с использованием т-распределенного стохастического соседа вложения (tSNE). Каждая точка представляет собой единую ячейку, полученную из одного КТК, кластера КТК или кластера КТК-WBC. Цвета точек соответствуют ИДЕНТИФИКАТОРУ донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Молекулярная характеристика ЦОК имеет обещание улучшить наше понимание метастатического процесса и направлять развитие новых анти-метастазов терапии. Здесь мы предоставляем подробное описание тех протоколов, которые позволяют анализ микроманипуляции и нисходящего анализа, включая как единичные функциональные анализы на основе клеток, анализ экспрессии генов и трансплантацию в естественных условиях для метастатического потенциала Оценка20.
Среди наиболее важных этапов нашего протокола, микроманипуляции продуктов, обогащенных КТК, направлены на получение одноклеточных решений от относительно неоднородных суспензий клеток, т.е. позволяющих достигать высочайших уровней чистоты и улучшать качество последующего функционального или молекулярного анализа. Например, сбор одной ячейки ЦОК позволил нам и другим лицам исследовать гетерогенность КТК (например, различия между однокц, скоплениями КТК и скоплениями «КТК-WBC»), как с молекулярной точки зрения, так и с точки зрения возможности оценить способность к метастазированию. В то время как мы, как правило, выступаем за протоколы подбора клеток, позволяющие экспериментатору вручную изолировать ЦОК (т.е. позволяя более высокую степень гибкости в зависимости от характеристик индивидуальных целей), автоматизированные решения теперь доступны для облегчения сбор клеток и ускорение процесса изоляции КТК в хорошо контролируемых экспериментах.
При рассмотрении микроманипуляции одиночных ячеек в контексте анализа КТК время является очень важным ограничивающим фактором. Так как наш протокол предназначен для быть проведены на живые клетки, необходимо действовать как можно быстрее, чтобы минимизировать изменения из-за среды ex естественных условиях, таких как upregulation или Даунрегуляция генов, которые в зависимости от контекста. По сравнению с существующими методами анализа СТС, одноклеточные микроманипуляции живых ЦОК предлагают более высокую гибкость для анализа выбора в нисходящем диапазоне, начиная от последовательности одиночных клеток и заканчивая прямым функциональным анализом.
В этой рукописи, мы также предоставляем новые данные, которые выделяют важные различия между одной и кластерных ЦОК по micromanipulating и посев более тысячи одиночных ЦОК или КТК кластеров (с четко определенным размером) от КТК-производные ячейки линии в отдельные скважины пластины микротитрования. Во-первых, мы отмечаем, что КТК кластеров (например, наличие соседних клеток) являются достаточными для достижения более выживаемость семенами клеток, поддерживая наши в естественных условиях данные предлагая более низкие Апоптотические ставки скос кластеров при посеве в отдаленном месте 19. Далее, даже при нормализации для количества посеянных клеток, раковые клетки, выращенные как кластеры, демонстрируют гораздо более высокие показатели распространения, что еще больше укрепляет концепцию, что кластерных ЦОК являются высокоэффективными авторами метастазов.
Вместе мы представляем конкретные протоколы для анализа КТК с целью содействия проведению исследований, связанных с проведением одиночных ячеек в области КТК. В будущем мы предполагаем, что эти протоколы могут быть полезны для исследований, связанных с КТК, с целью лучшего понимания биологии, которая характеризует метастазирование крови в различных типах рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Н.А. и Б.М.С. перечислены в качестве изобретателей в патентных заявок, которые касаются циркулирующих опухолевых клеток и лечения рака. Н.А. является платной консультантом для фармацевтических и страховых компаний, заинтересованных в жидкостной биопсии.
Acknowledgments
Мы благодарим всех пациентов, которые пожертвовали кровью для нашего исследования, а также всех участвующих клиницистов и обучение медсестер. Мы благодарим Дженса Эберхардта, Уве бирке и д-ра Катарины Ухыг из решений ALS автоматизированная лаборатория GmbH для непрерывной поддержки. Мы благодарим всех членов лаборатории ацето за обратную связь и обсуждения. Исследования в лаборатории ацето поддерживаются Европейским исследовательским советом, Европейским союзом, Швейцарским национальным научным фондом, швейцарской онкологической Лигой, Базельской онкологической Лигой, двумя кантонами Базеля через Цюрих, и Базельским университетом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
References
- Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
- Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
- Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
- Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
- Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
- Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
- Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
- Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
- Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
- Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
- Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment? Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).
- Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
- Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
- Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
- Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
- Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
