Summary
우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 번역형 면역 종양학 연구를 위한 기지를 둔 인간화한 이종이식 마우스 모형. 이 프로토콜은 I-O 치료 평가를 위한 유사한 모형을 설치하고 특성화하기 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었습니다.
Abstract
최근 몇 년 동안 면역 종양학 (I-O) 치료의 발견과 개발은 암 치료의 이정표를 나타냅니다. 그러나, 치료 도전은 지속. 강력하고 질병과 관련된 동물 모델은 다양한 추가 적인 면역 체크포인트를 해결하기 위해 지속적인 전임상 연구 및 개발을 위한 중요한 자원입니다. 여기에서, 우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 기지를 둔 인간화한 이종이식 모형. BGB-A317(Tislelizumab)은 후기 임상 개발에서 인간화된 항PD-1 항체로 플랫폼 설정, 모델 특성화 및 약물 효능 평가를 논의하는 예로 사용됩니다. 이 인간화한 마우스는 시험된 대부분의 인간적인 종양의 성장을 지원합니다, 따라서 인간적인 면제 및 인간적인 암 둘 다의 맥락에서 I-O 치료의 평가를 허용하. 일단 확립되면, 우리의 모델은 비교적 시간과 비용 효율적이며, 일반적으로 매우 재현 가능한 결과를 산출한다. 우리는 이 문서에 설명된 프로토콜이 I-O 연구를 위한 인간 PBMC 및 종양으로 재구성된 마우스 모형을 설치를 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었다는 것을 건의합니다.
Introduction
면역 종양학 (I-O)는 암 치료의 급속하게 확장하는 분야입니다. 연구원은 최근에 종양을 공격하는 면역 계통의 변조 기능의 치료 잠재력을 평가하기 시작했습니다. 면역체크포인트 봉쇄는 흑색종, 신장세포암, 두경부암, 폐암, 방광및 전립선암1,2를포함한 다양한 암 유형에서 고무적인 활동을 입증했다. 암세포를 직접 죽이는 표적 치료와는 달리, I-O 요법은 종양을 공격하기 위해신체의 면역 체계를 강력하게 합니다 3.
현재까지 수많은 관련 I-O 동물 모델이 설립되었습니다. 이들은: 1) 마우스 종양 세포주 또는 합성 마우스에서의 종양 동종 이식; 2) 유전자 조작 마우스 (GEM) 또는 발암 물질 유도로부터 유래 된 자발적 종양; 3) 기능성 뮤린 면역계에서 인간 약물 표적(들)의 노크인을 가진 키메라 GEM; 및 4) 인간 암세포 또는 환자 유래 이종이식(PDX)으로 이식된 재구성된 인간 면역을 가진 마우스. 이러한 각 모델은 명백한 장점뿐만 아니라 제한 사항이 있으며, 다른 곳에서 광범위하게 설명하고 검토한4.
면역결핍 마우스에서 인간 면역의 재구성은 번역I-O 연구를 위한 임상적으로 관련있는 접근법으로서 점점 더 평가되고 있다. 이것은 일반적으로 성인 면역 세포의 1) 생착 (예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)) 5,6,또는 2) 조혈 줄기 세포 (HSC)의 생착, 예를 들어, 탯줄 혈액 또는 태아를 통해 달성됩니다. 간7,8. 이 인간화한 마우스는 인간적인 종양의 성장을 지원할 수 있었습니다, 따라서 인간적인 면제 및 인간적인 암 둘 다의 맥락에서 I-O 치료의 평가를 허용하. 장점에도 불구하고, I-O 연구에서 인간화 마우스의 응용은 일반적으로 긴 모델 개발 시간과 상당히 높은 비용과 같은 몇 가지 우려에 의해 방해되었다.
여기서, 우리는 번역 I-O 연구에 널리 적용될 수 있는 인간 PBMC 기반 모델을 설명합니다. 이 모델은 효능 연구에서 높은 재현성을 가진 비교적 시간 및 비용 효율적입니다. 그것은 현재 전임상 및 임상 개발 하에 여러 I-O 치료제의 평가를 위해 사내에서 사용되어 왔다. BGB-A317 (Tislelizumab), 조사 인간화 된 항 PD-1 항체9는 항 종양 효능 분석을위한 모델 개발, 특성 화 및 가능한 응용 프로그램을 논의하는 예로 사용됩니다.
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Protocol
인간 참가자와 관련된 연구에서 수행된 모든 절차는 BeiGene 및/또는 국가 연구 위원회의 윤리 기준과 1964년 헬싱키 선언 및 그 이후의 개정 또는 비교 가능한 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 고지된 동의는 연구에 포함된 모든 개별 참가자로부터 얻어졌다. 동물과 관련된 연구에서 수행 된 모든 절차는 BeiGene의 내부 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 인간화된 NOD/SCID 마우스에서 BGB-A317(Tislelizumab)의 평가를 위해 특별히 조정되었습니다.
1. 인간 PBMC 기반 모델 구축
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사이클로포스파미드를 사용한 NOD/SCID 마우스의 골수성 절제술: 최적의 용량 결정
- 구매 여성 NOD/SCID 마우스 (6-8 주).
참고: 이 연구에 참여한 모든 마우스는 여성이었다. - 식염수에 다른 용량 (50, 100 및 150 mg/kg)에서 사이클로 포스파미드 (CP)를 준비하십시오. 125 mg/kg에서 식염수로 0.8% 트웬-80에 디설피람(DS)을 준비합니다.
참고: CP의 상이한 농도는 CP의 상이한 복용량을 얻는 마우스에 동등한 양의 약물 용액의 투여를 가능하게 하기 위해 제조되었다. - 동물을 CP(i.p.) 및 DS(p.o.)로 하루에 한 번 2일 동안 치료하십시오. CP의 각 투여 후 DS (p.o.) 2 h를 준다.
참고: DS는 마우스에서 CP의 비뇨독성을 감소시키고, DS와 결합된 CP는 CP 단독으로 치료한 동물보다 더 오래 지속되는 호중구 감소증을 가지는 것으로 제안되었다10 CP의 투여량 요법은 실제 연구 이전에 미리 결정되어야 할 수도 있고 변화하는 것으로 나타났다. 약간 다른 면역 결핍 마우스 긴장 사이. - 궤도 정맥 부비동에서 혈액 샘플을 수집하고 0일째(1st 투여 전 1시간), 2일째(2nd 투여 후 24시간) 및 4일째(2nd 투여 후 72시간)에 얼음위에 EDTA-K 코팅 튜브로 옮김을 전달한다.
- FACS에 의한 CP 및 DS 치료 후 골수제 효과를 검사한다. 쥐 안티 마우스 CD11b (M1/70), 쥐 반대로 마우스 Ly6C (HK1.4, ) 및 쥐 반대로 마우스 Ly6G (1A8) 게이팅 CD11b+ Ly6G높은 호중구로 높은, CD11b+Ly6C높은 단핵구11,12.
- 1 주일 동안 매일 쥐의 체중과 건강 상태를 기록하십시오. CP와 DS의 최적 용량은 마우스에 심각한 독성을 유발하지 않고 호중구 및 단핵구의 최대 고갈을 초래하는 처방으로 결정된다.
- 구매 여성 NOD/SCID 마우스 (6-8 주).
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인간 PBMC 이식 및 종양 생착: 모델 설정
- 제조업체의 지침에 따라 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 건강한 기증자로부터 인간 PBMC를 분리합니다.
- 이식 효율을 높이기 위해 1.1.2 단계 및 1.1.3단계로 표시된 바와 같이 마우스를 CP 및 DS로 미리 치료하였다.
- CP와 DS의 두 번째 투여 후 20~24시간, A431 세포(ATCC, 2.5x 10 6) 및 5 x 106 단종 PBMC(50% 마트리겔을 함유하는 총 200μL 인산완충식염수(PBS)에 혼합)과 같은 인간 종양 세포주 주입 , 또는 종양 단편(3 x3 x 3 mm 3, 총 부피 200 μL PBS에서 50% 마트리겔을 함유하고) 및 200 μL의 5 x 106 PBMC (생착종양 단편의 좌우측에 각각 100 μL) (s.c.) 동물의 우측 측면에 피하로.
- 원발성 종양 량을 측정하고 4-6 주 동안 일주일에 두 번 기록하십시오.
참고: 마우스는 그들의 바디 무게가 20% 이상 분실하거나 그들의 종양 양이 2,000 mm3에 도달하거나 종양이 궤양성되면 안락사될 것입니다. - 이산화탄소와 가스 실에서 마우스를 안락사. 안과 가위로 희생 된 마우스에서 전체 종양 조직을 수집하고 조직학 및 면역 조직 화학 (IHC) 분석을 위해 처리하십시오. 이들 조직에서 인간 CD8, PD-1 및 PD-L1 발현을 조사한다. 프로토콜 단계 4를 참조하십시오.
2. PBMC 기증자 화면
- 개인으로부터 수집된 PBMC에서 발생할 것으로 예상되는 변화로 인해 PBMC 기증자패널을 심사합니다. 1.2단계로 표시된 절차에 따라 다른 공여자로부터 PBMC와 공동 주입하는 A431 세포를 사용한다.
참고: 50명 이상의 건강한 PBMC 기증자가 충분한 수의 적당한 기증자를 얻기 위해 연구에서 선별되었습니다. 이 프로토콜을 채택하고자하는 연구원은 계획된 연구의 디자인에 따라 얼마나 많은 건강한 PBMC 기증자가 선별 될 지 스스로 결정할 수 있습니다. - 캘리퍼스로 측정하여 일주일에 두 번 종양 볼륨을 모니터링하십시오.
참고: 종양 성장 속도는 상이한 공여자로부터의 PBMC와 다를 수 있다. - 200-500 mm 3의 평균 부피에서 종양 조직을 수집하고 조직학 및 면역 조직 화학 (IHC) 분석을 위해 처리합니다. 인간 CD8, PD-1 및 PD-L1 식을 검사합니다. 자세한 프로토콜은 4단계를 참조하십시오.
- 적당한 종양 성장 (종양 부피 > 200 mm3 14 일 접종 후) 및 상대적으로 높은 PD-1, PD-L1 및 CD8 발현 (평균 IHC 점수 > 2)을 초래하는 PBMC 공여체를 선택합니다. 자세한 IHC 채점 프로토콜은 4단계를 참조하십시오.
3. 인간 암 세포주 및 PDX 스크린
- 1.2단계에서 기재된 절차에 따라 스크린 세포주 및 PDXs는 종양 성장 속도, 인간 PD-L1 발현 종양 및 면역 세포 침투를 평가한다.
참고: 30개 이상의 인간 암 세포주와 20개 이상의 다른 암 유형의 PDX가 저자에 의해 선별되었습니다. 선택된 종양 모델의 데이터는 결과 섹션에 나타내어졌다.
4. 면역 화학 (IHC)
- 단계 1.2.5에 의해 표시된 대로 수확하고 포르말린에 침지하여 종양 조직을 수정합니다. 파라핀에 고정 된 조직을 탈수하고 포함시킴. 고정 된 조직을 3 μm에서 섹션과 폴리 리신 코팅 슬라이드에 놓습니다.
- 자일렌에서 각각 7분씩 3회 탈파합니다. 등급이 매겨진 알코올을 통해 섹션에 수화: 100% 에탄올 각 3 분 동안 두 번, 다음 90%, 80% 그리고 70% 에탄올 차례로 3 분 동안. 탈이온화한 H2O로3회 헹구고 슬라이드에서 여분의 액체를 제거합니다.
- 10 mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH 6.0) 또는 Tris-EDTA (pH 9.0)로 커버 용기에 슬라이드를 배치하여 항원 검색을 수행합니다. 슬라이드 용기를 전자레인지로 3분간 가열합니다. 95°C에서 수조에서 30분간 끓인 다음 실온으로 식힙니다. 탈이온화H2O로 3회 헹구고 슬라이드에서 과량의 액체를 흡인한다.
- PBS에서 3% 소 혈청 알부민을 10분 동안 PBS에서 0.3% H2O2 용액으로 차단. 인간 CD8(EP334), PD-1(NAT105), PD-L1(E1L3N)에 대한 항체에 의한 얼룩에 의한 얼룩은 4°C에서 하룻밤 사이에, HRP 는 2nd 항체에서 RT에서 2nd 항체를 컨쥬게이트화하였다. 1 시간 동안 기판 DAB (3,3'diaminobenzidine)를 슬라이드에 떨어 뜨리고 현미경에서 갈색을 모니터링하여 반응 시간 (초에서 분)을 제어합니다.
- 슬라이드를 0.5% 염산 알코올과 0.5% 암모니아 물에 각각 5s씩 침지한 후 중성 발삼으로 슬라이드를 덮은 다음, 각각 80%, 90%, 100% 에탄올을 순차적으로 3분동안, 그리고 마지막으로 5분 동안 3가지 변화를 사용하여 자일렌에 가십시오. 현미경을 사용하여 DAB의 갈색을 관찰하여 항체를 검출합니다.
참고: 인간 CD8 및 PD-1 발현종양 침투 백혈구(TIL)에 대한 발현 점수는 5점 척도(IHC 점수, 범위 0-4)를 높은 객관적인 배율(20x, 40x)에서 할당하여 평가하였다. 0, 결석; 1, 약한 강도 / 미만 20 % 세포; 2, 약한 중간 강도 / 20 %-50 % 세포; 3, 중간 강도 / 50 %-80 % 세포; 4, 강한 강도 / 80 % 이상의 세포. 종양 세포 내의 인간 PD-L1 염색은 상대적으로 확산된 신호 때문에 5점 척도(IHC 점수, 범위 0-4)에 조정된 스코어링 시스템을 사용하여 채점되었다. 0, 결석; 1, 약한 강도 / 미만 10 % 세포; 2, 약한 중간 강도 /10%-30% 세포; 3, 중간 / 30 %-50 % 세포; 4, 강한 강도 / 50 % 이상의 세포.
5. 인간화 된 PBMC-NOD / SCID 이종이식 모델에서 생체 내 효능 및 약력 학 연구
- 단계 1.1.3에 의해 지시된 대로 NOD/SCID 마우스를 전처리하십시오. 간단히 말해서, 생쥐를 100 mg/kg CP(i.p.) 및 125 mg/kg DS(p.o.)로 2일 동안 하루에 한 번 치료하십시오.
- 2회 투여 후 20 내지 24시간, 동물의 오른쪽 전면 측면에 인간 암세포의 지시된 수와 2.5-5 x 106개의 PBMC(총 200 μL 세포 혼합물 50% 마모리겔)를 피하(s.c.)로 주입한다.
참고: 단일 연구에서 개별 마우스에 사용되는 PBMC의 수는 동일해야 합니다. 그러나, 각 연구의 시간에 총 격리 된 PBMC의 가용성의 변화로 인해, 저자는 다른 연구에서 2.5 x 106,4 x 106,또는 5 x 106 PBMC를 사용하기로 결정했습니다. PBMC의 관리 된 금액에 이 2 배 차이 인간화의 정도에 영향을 미칠 수 있지만, 저자는 테스트 된 면역 요법의 항 종양 효능평가에 상당한 차이를 관찰하지 않습니다. - PDXs 생착의 경우, 동물의 오른쪽 전면 측면에 피하 종양 조각(3 x 3 x 3mm 3)을 주입하십시오. 이식된 종양 단편의 왼쪽과 오른쪽에 피하 200 μL의 5 x 106 PBMC (각 면 100 μL)를 주입합니다.
참고: PDX 종양 조직은 세포주 모델에 대해 기재된 바와 동일하게 마트리겔 용액으로 투여되었다. - 세포 접종당일, 동물을 무작위로 그룹화하고 계획된 연구 프로토콜로 치료한다. 후보 약물의 항 종양 활성을 평가, BGB-A317 (QW, i.p.) 이 경우, 다양한 종양 모델에서 표시된 투여량.
참고: 3개의 인간 암 세포주(즉, A431(epidemoid 암), SKOV3(난소암) 및 SK-MES-1(폐암)과 2개의 PDX 모델(즉, BCLU-054(폐암) 및 BCCO-028(결장암))은 I-O 치료에 좋은 종양 모델로 간주됩니다. 이 인간화 마우스 모델에서 평가. - 캘리퍼를 사용하여 매주 두 번 원발성 종양 량을 측정합니다.
참고: 간 몸 무게 손실 주위 관찰 되었다 4-6 우리의 연구에서 PBMC 생착 후 주, 허용 하는 1-2 치료 효능 평가 대 한 개월 창. - 종양 침투 면역 세포의 약력 역학 분석을 위해, 작은 조각으로 종양 조직을 잘라 와 콜라게 나아제 유형으로 소화 (1 mg / mL) 및 DNase I (100 μg / mL) RPMI1640 플러스 5 % 태아 소 혈청 (FBS) 37 °C에서 30 분. 40 μm 세포 스트레이너를 통해 소화된 조직을 통과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
- 세포를 세척하고 96 웰 라운드 바닥 판에서 얼음 차가운 FACS 버퍼 (PBS, 1 % FBS)에서 1 x 107 세포 / mL의 농도로 세포 수를 조정합니다. 세포를 원심분리하여 세척하고 30 분 동안 20 μg / mL 인간 IgG를 추가하여 세포를 차단한 다음 4 °C에서 항 인간 CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) 및 PD-1 (MIH4) 항체로 염색한 다음 30 분 동안. 그런 다음 스테인드 샘플을 세포 분석 방식으로 유동시키고 guavaSoft 3.1.1을 사용하여 분석합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 절차에 따라 PBMC 기반의 인간화 이종이식 모델이 성공적으로 확립되었습니다. 간단히 말해서, NOD/SCID 마우스에서의 CP 골수제 효과는 CP 및 DS 치료 후 호중구 및 단핵구집단의 유세포 분석 분석에 의해 결정되었다(도 1). 100 mg/kg CP 플러스 125 mg/kg DS 최적의 복용량으로 결정 하 고 처방으로 후면 연구에 사용 하 여 호중구와 단핵구의 최대 고갈 쥐에 심각한 독성을 유발 하지 않고. 다음으로, 인간 PBMC 및 종양 이식을 수행하였다. 종양 미세환경 내의 인간 면역 세포의 존재는 IHC에의해 확인되었다(도 2).
PBMC 공여자의 패널은 종양 미세 환경 및 허용 가능한 종양 성장 속도에서 상대적으로 높은 면역 세포 침윤을 보장하기 위해 생체 내에서 스크리브되었다(섹션 2, 도 3A). 한편, 30개 이상의 인간 암 세포주뿐만 아니라 20개 이상의 상이한 암 유형의 PDXs를 스크리마싱하여 종양 성장 속도, 종양 PD-L1 발현 및 면역 세포 침윤을 평가하였다(섹션 3). 대표적인 결과는 도 3B에나타났다.
이러한 PBMC-이식된 인간화된 마우스는 BGB-A317의 항종양 활성을 검사하기 위해 사용되었다. 선택된 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC는 암 환자(BCCO-028 및 BCLU-054)로부터 유래된 인간 종양 세포(A431, SKOV3 및 SK-MES-1) 또는 원발성 종양 조직 단편을 피하적으로 공동 으로 주입하였다. 마우스를 도4에 나타낸 바와 같이, BGB-A317 또는 PBS를 종양 이식일로부터 일주일에 한 번 복강 내로 처리하였다. 전술한 모든 모델에서, BGB-A317은 유의한 항종양 활동을 입증하였다(그림 4).
그림 1 : 시클로포스파미드(CP)와 이설피람(DS)을 이용한 NOD/SCID 마우스의 골수성화. (A) 호중구 및 단핵구를 포함한 골수성 세포 서브세트를 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략. (B) 골수성 세포의 대표적인 결과 (CD11b+), 호중구 (CD11b+Ly6G+) 및 단핵구 (CD11b+Ly6C+)CP 치료의 상이한 투여량에 따라 숫자. 상자는 값의 75번째, 50번째 및 25번째 백분위수입니다. 상단 및 하단 선은 각각 1.5x IQ(분기 간) 범위 내에서 최대 및 최소 데이터 포인트를 나타냅니다. n = 비기 그룹에 대해 3, CP 및/또는 DS 처리 그룹에 대한 n = 6입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 인간 PBMC 이식 및 종양 생착. (a) PBMC 기반 인간화 이종이식 모델의 일반적인 워크플로우를 보여주는 회로도 도면. (b) A431 세포의 종양 성장은 표시된 조건으로 공여자 PBMC와 피하 공동 주사시 (데이터는 평균 종양 부피 ± SEM, n = 6를 나타낸다). (C) CP+DS 유무에 관계없이 처리된 마우스에서 개발된 종양의 IHC 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : PBMC 공여자 및 인간암 세포주 화면. (A) PBMC 기증자 화면에서 대표적인 요약 데이터. PBMC를 A431 세포와 혼합하고 인간화된 NOD/SCID 마우스에서 피하로 접종하였다(2단계 참조). 각 점은 1개의 기증자로부터 PBMC로 이식된 3개의 마우스의 평균 데이터 값을 나타낸다. (B) 대표적인 인간 암 세포주 화면에서 결과. 선택된 공여자로부터의 PBMC를 A431, SK-MES-1 또는 SKOV3 세포와 함께 주입하였다. 데이터는 3개의 마우스로부터 수집된 평균 종양 부피 ±SEM을 나타내며, 14일 후 지시된 세포주의 접종을 나타낸다. 평균 IHC 점수 ±SEM은 3개의 마우스 모두의 인간 CD8, PD-1 및 PD-L1의 평균 발현을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : PBMC 기반 인간화 이종이식 모델에서 BGB-A317의 항종양 활동 및 약력분석. 지시된 투여량에서 BGB-A317의 항종양 활성(i.p., QW)은 인간암 세포주(A) A431(5 x 10 6 PBMC), (C) SKOV3(5 x 106 PBMC), (D) SK-MES-1(5 x 106 PBMC 있음) 및 환자 유래 이종이식(PDX) (E)BCLU-054 (5 x 106 PBMC) 및 (F) BCCO-028 (5 x 106 PBMC). 선택된 건강한 공여자 및 상응하는 종양 세포로부터의 PBMC를 인간화된 NOD/SCID 마우스내로 피하적으로 공동 주사하였다(n=8 내지 10). (B) BGB-A317에서 종양 침투 hCD8+ 및 hCD8+hPD-1+ 세포의 정량화는 A431 종양을 치료하였다. n = 그룹당 8-10마리의 동물A, C에서 F, n=B군당 4-6마리의 동물; 데이터는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 중요성은 불평등한 차이를 가정하여 두 꼬리가 없는 학생의 t-test를 사용하여 평가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
암 발달과 진행에 대한 우리의 지식은 종양 세포와 관련 기질 모두에 대한 포괄적 인 이해에 초점을 맞추어 최근 몇 년 동안 크게 발전했습니다. 숙주 면역 기계장치를 이용하는 것은 유망한 처리 전략을 나타내는 암세포에 대하여 더 중대한 충격을 유도할 수 있었습니다. 합성 및 GEM 모델과 같은 손상되지 않은 마우스 면역 체계를 가진 Murine 모델은 체크포인트 매개 면역을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이러한 모델을 이용한 효능 평가는 주로 대리 항마우스 표적 항체13,14에의존한다. 그러나, 인간과 뮤린 면역 계통 사이의 내재적인 차이와 뮤린 모델에서 일부 인간 표적의 부족은 I-O 항종양 효과15,16의전임상 연구를 제한한다. 따라서, 인간 면역 세포와 인간 종양을 모두 포함하는 견고한 마우스 모델이 시급히 요구되고, 이는 새로운 I-O 치료제의 번역 및 개발을 현저히 향상시킬 것이다.
여기서, 우리는 잠재적으로 번역 I-O 연구에 널리 사용될 수 있는 인간 PBMC 기반 이종이식 마우스 모델을 설명한다. PBMC 기증자뿐만 아니라 암 세포주/PDX 스크린은 생체 내 효능 연구의 견고성과 재현성을 보장하는 데 매우 중요합니다. PBMC 공여체는 성공적인 인간 종양 및 면역 세포 생착을 보장하기 위해 생체 내에서 스크리프를 받았다. 한편, 다양한 인간암 기원의 50개 이상의 세포주 및 PDX를 선별하여 종양 성장 속도, 인간 PD-L1 발현, 및 면역 세포 침투를 평가하였습니다. 우리의 분석은 암 세포주 및 PDXs의 대략 20%가 I-O 효험 평가를 위한 좋은 모형으로 여겨지는 상대적으로 높은 환과 PD-L1 염색을 갖는 동시에 허용되는 종양 성장 속도를 설명하는 것을 건의합니다.
HLA 매칭은 장기 또는 골수 이식에 대한 환자 및 기증자와 일치시키기 위해 클리닉에서 일상적으로 사용된다17. 저자는, 그러나, HLA 입력에 제한된 특성화를 수행했습니다, 이것은 미래 연구 결과에서 조사될 흥미로운 주제남아 있습니다. 저자는 PBMC 기증자가 1개의 암 세포주/PDX를 위해 적당할지도 모르지만 그 외를 위해 이상적이지 않다는 것을 주의하고 싶습니다. 그러므로, PBMC 기증자는 최적 결과를 지키기 위하여 각 암 모형을 위해 가려질 필요가 있을 지도 모릅니다.
NOD/SCID 또는 NSG 마우스로 인간 PBMC의 생착은 변함없이 xenogeneic 이식-대 숙주 질환(xGvHD)을 유도하며, 이식 후 장애는 기증자 T 세포에 의한 수용자 조직의 면역 매개 공격으로부터 발생한다18,19. 일반적으로 xGVHD와 관련된 임상 관찰은 홍반, 구부러진 자세, 체중 감소 및 사망률 (데이터가 표시되지 않음)과 같은 인간화 모델에서 관찰되었습니다. 이 표현형은 일반적으로 xGVHD 표적 기관에 있는 인간 T 세포의 전파 그리고 침투를 나타내는, 일반적으로 1-2 달 포스트 생착에서, 우리의 연구 결과의 끝으로 관찰되었습니다. 이것은 치료 I-O 치료 평가를 위한 1-2 달 창을 허용합니다. 몇몇 접근법은 마우스 타고난 면역을 감소시키고 인간 면역 세포 생착을 강화하기 위하여 이용되었습니다20,21. 예를 들어, NSG 마우스는 PBMC22의주입 후 급성 xGvHD가 없는 상태에서 기능성 인간 T 세포의 기능성 인간 T 세포의 이식을 지원하며 MC 클래스 I 및 Class II 발현에 결함이 있다.
NOD/SCID 마우스를 이 프로토콜에 사용하였다. SCID 돌연변이에 대한 마우스 동형접합체는 T 및 B 세포 림프구 발달을 손상시켰으며 NOD 배경은또한 결핍된 자연살인자(NK) 세포 기능(20)을 초래한다. NSG (잭슨 연구소), NCG (찰스 강) 및 NOG (CIEA) 균주와 같은 다른 더 높은 면역 결핍 마우스가 설립되었습니다. PBMC로 이식하면, 이들 마우스는 인간 면역세포를 개발하고 인간 면역체계를 닮은 환경을 형성하는 것으로나타났다(23,24). 대안적으로, 이들 마우스는 CD34+ 인간 조혈 전구 세포(HC)로 이식하고 보다 지속적인 T 세포 분화 및성숙(25)을디스플레이할 수 있었다. 또한, 추가 유전자 변형을 가진 차세대 면역 결핍 마우스 모델은 더 나은 인간 골수성 혈통 개발 및 증가 된 생착 효율을 지원하기 위해 설립되었습니다 (의 변종 포트폴리오 웹 페이지를 참조하십시오. 잭슨 연구소 및 타코닉 생명 과학).
인간의 면역 재구성에 대 한 이러한 새로운 긴장을 사용 하 여의 자세한 내용은 추가 조사를 보류 하 고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 문서에 설명된 프로토콜은 인간 PBMC로 재구성된 면역 결핍 마우스 모델을 확립하고 특성화하는 일반적인 지침으로 작용할 수 있다. 세 가지 인간 암 세포주와 다양한 암 유형을 포함하는 2 개의 인간 환자 유래 이종이식은 이 기사에서 입증되어 번역 I-O 연구에서 프로토콜의 잠재적 광범위한 적용을 시사합니다. 대부분의 인간화 PBMC 모델, 우리의 지식에, 주입의 경로로 IV 또는 IP를 선택했다26,27. 우리의 모형은 대신 암 이종이식을 가진 인간 PBMC의 피하 혼합을 통해 인간 종양 방위 마우스에 있는 부분적으로 재구성한 인간 적인 면제를 제공합니다. 이 접근법은 전체 줄기 세포 재구성에 대한 신속하고 비용 효율적이면서도 매우 재현 가능한 대안을 제공합니다(예를 들어, CD34+ 조혈 줄기 세포-이식된 인간화 마우스). 우리의 모형은 T 세포 관련시키는 암 면역 요법을 평가하기 위하여, 특히 짧은 타임라인에서 일할 때 또는 더 복잡한 다중 계보 면제 모형으로 이동하기 전에 에이전트를 선택하는 것이 유용할 것을 입증되었습니다.
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Disclosures
모든 저자는 베이진에 대한 소유권을 가지고 있습니다. 통장과 강리는 본 연구에서 기술된 BGB-A317을 포함하는 특허에 대한 발명자이다.
Acknowledgments
우리는 도움이 토론에 대한 우리의 실험실의 구성원에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 보조금 협정 번호에 따라 베이징 시 과학 기술위원회의 생물 의학 및 생명 과학 혁신 및 재배 연구 프로그램에 의해 지원되었다. Z151100000039915070 (프로젝트 "새로운 면역 종양학 항종양 약물 BGB-A317에 대한 전임상 연구"), 또한 전임상 연구를위한 내부 회사 자금 조달에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
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