Summary
Biz bir insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) - çeviriimmün-onkoloji araştırma için insanlaşmış ksenogreft fare modeli dayalı açıklar. Bu protokol, I-O terapi değerlendirmesi için benzer modellerin oluşturulması ve karakterizasyonu için genel bir kılavuz görevi görebılabilir.
Abstract
Son yıllarda immüno-onkoloji (I-O) tedavisinin keşfi ve geliştirilmesi kanser tedavisinde bir kilometre taşını temsil ediyor. Ancak, tedavi zorlukları devam etmektedir. Sağlam ve hastalıkla ilgili hayvan modelleri, bir dizi ek bağışıklık kontrol noktasını ele almak için klinik öncesi araştırma ve geliştirmenin sürdürülmesi için hayati kaynaklardır. Burada insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) - insanlaşmış ksenogreft modeli tabanlı açıklar. BGB-A317 (Tislelizumab), geç evre klinik gelişimde insanlaşmış bir anti-PD-1 antikor, platform kurulumu, model karakterizasyonu ve ilaç etkinliği değerlendirmelerini tartışmak için örnek olarak kullanılır. Bu insanlaşmış fareler test edilen çoğu insan tümörü büyümesini destekleyerek, i-O terapilerinin hem insan bağışıklığı hem de insan kanserleri bağlamında değerlendirilmesini sağlar. Kurulduktan sonra, bizim model nispeten zaman ve maliyet-etkin, ve genellikle son derece tekrarlanabilir sonuçlar verim. Bu makalede özetlenen protokolün, insan PBMC ve I-O araştırmaları için tümörlerle yeniden oluşturulmuş fare modellerinin oluşturulmasıiçin genel bir kılavuz görevi görebildiğini önermekteyiz.
Introduction
İmmüno-onkoloji (I-O) hızla genişleyen bir kanser tedavisi alanıdır. Araştırmacılar son zamanlarda tümörlere saldırmak için bağışıklık sisteminin fonksiyonlarını modüle terapötik potansiyelini takdir etmeye başladı. Bağışıklık kontrol noktası blokajları melanom, böbrek hücreli karsinom, baş ve boyun, akciğer, mesane ve prostat kanserleri 1 dahil olmak üzere kanser türleri, çeşitli teşvik edici faaliyetleri göstermiştir1,2. Doğrudan kanser hücrelerini öldürmek hedefli tedavilerin aksine, I-O tedaviler tümörler3saldırmak için vücudun bağışıklık sistemini güçlendirmek .
Bugüne kadar, çok sayıda ilgili I-O hayvan modelleri kurulmuştur. Bunlar şunlardır: 1) singenekik farelerde fare tümör hücre hatları veya tümör homogreft; 2) genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) veya kanserojen indüksiyon elde edilen spontan tümörler; Fonksiyonel bir murine bağışıklık sisteminde insan ilaç hedef knock-in ile 3) şeymerik GEMs(ler); ve 4) insan kanser hücreleri veya hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs) ile nakledilen insan bağışıklık yeniden oluşturulan fareler. Bu modellerin her biri açık avantajları yanı sıra sınırlamalar, hangi açıklanan ve kapsamlı başka bir yerde gözden geçirilmiştir4.
İmmün eksik farelerde insan bağışıklığının yeniden yapılandırılması, çevirici I-O araştırmaları için klinik olarak uygun bir yaklaşım olarak giderek daha fazla takdir edilmektedir. Bu genellikle ya yoluyla elde edilir 1) yetişkin bağışıklık hücrelerinin engraftment (örneğin, periferik kan mononükleer hücreler (PMBC))5,6, veya 2) hematopoetik kök hücrelerin ingraftment (HSC) gelen, örneğin, göbek kordon kanı veya fetal karaciğer7,8. Bu insanlaşmış fareler insan tümörlerinin büyümesini destekleyebilir, böylece hem insan bağışıklığı hem de insan kanserleri bağlamında I-O terapilerinin değerlendirilmesini sağlar. Avantajlarına rağmen, I-O araştırmainsanlaşmış farelerin uygulamaları genellikle uzun model geliştirme süresi ve önemli ölçüde yüksek maliyet gibi çeşitli endişeler tarafından engellendi.
Burada, yaygın çeviri I-O çalışmaları için uygulanabilir bir insan PBMC tabanlı modeli açıklar. Bu model, etkinlik çalışmalarında yüksek tekrarlanabilirlik ile nispeten zaman ve maliyet-etkindir. Şu anda preklinik ve klinik gelişim altında olan birçok I-O terapötiklerinin değerlendirilmesi için şirket içinde kullanılmaktadır. BGB-A317 (Tislelizumab), bir araştırma insanlaştırılmış anti-PD-1 antikor9, model gelişimi tartışmak için örnek olarak kullanılır, karakterizasyon, ve anti-tümör etkinliği analizleri için olası uygulamalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan katılımcıların katıldığı çalışmalarda gerçekleştirilen tüm prosedürler, BeiGene ve/veya ulusal araştırma komitesinin etik standartlarına ve 1964 Helsinki bildirgesi ve daha sonraki değişikliklere veya karşılaştırılabilir etik standartlara uygun du. Çalışmaya dahil edilen tüm bireysel katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı. Hayvanlarla ilgili çalışmalarda yapılan tüm işlemler BeiGene'deki İç İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu protokol özellikle insanlaştırılmış NOD/SCID farelerde BGB-A317 (Tislelizumab) değerlendirilmesi için ayarlanmıştır.
1. İnsan PBMC tabanlı modelin kurulması
-
Siklofosfamid kullanan NOD/SCID farelerinin miyeloablasyon: Optimal dozların belirlenmesi
- Satın kadın NOD / SCID fareler (6-8 hafta).
NOT: Bu çalışmaya katılan tüm fareler dişiydi. - Siklofosfamidi (CP) farklı dozlarda (50, 100 ve 150 mg/kg) tuzlu olarak hazırlayın. Disülfür (DS) içinde hazırlayın 0.8% Tween-80 tuzlu 125 mg / kg.
NOT: Farklı dozlarda CP elde eden farelere eşit hacimlerde ilaç çözeltisi uygulanmasını sağlamak için farklı CP konsantrasyonları hazırlanmıştır. - 2 gün boyunca günde bir kez CP (i.p.) ve DS (p.o.) ile hayvanlartedavi. Cp her doz sonra DS (p.o.) 2 saat verin.
NOT: DS farelerde CP'nin ürotoksisitesini azaltır ve CP ile birlikte DS'nin tek başına CP ile tedavi edilen hayvanlara göre daha uzun ömürlü nötropeni olduğu ileri sürüldü10 Cp doz rejiminin gerçek çalışmalardan önce önceden belirlenmesi gerekebilir ve değişikliğe varıldığı saptanmıştır. farklı immünoeksik fare suşları arasında biraz. - Orbital venöz sinüsten kan örnekleri alın ve 0.gün(1 dozdan önce 1 saat), 2. gün (2dozdan 24 saat sonra) ve 4.gün(2 dozdan sonra 72 saat) buz üzerinde EDTA-K kaplı tüplere aktarın.
- CP ve DS tedavisinden sonra FACS ile miyeloablasyon etkisini inceleyin. Kullanın sıçan anti-fare CD11b (M1/70), sıçan anti-fare Ly6C (HK1.4, ) ve sıçan anti-fare Ly6G (1A8) cd11b gating için+ Ly6G nötrofiller olarak yüksek, CD11b+Ly6C monositler11,12.
- Bir hafta boyunca her gün farelerin vücut ağırlığı ve sağlık koşullarını kaydedin. CP ve DS optimal doz fareler için ciddi toksisite neden olmadan nötrofiller ve monositlerin maksimum tükenmesi ile sonuçlanan rejim olarak belirlenir.
- Satın kadın NOD / SCID fareler (6-8 hafta).
-
İnsan PBMC transplantasyonu ve tümör engraftment: model kurulum
- Üreticinin talimatlarına göre yoğunluk gradyan santrifüj tarafından sağlıklı donörlerden insan PBMCs izole.
- Transplantasyon verimliliğini artırmak için 1.1.2 ve 1.1.3 adımlarında belirtildiği gibi CP ve DS ile fareleri önceden tedavi edin.
- 20-24 saat CP ve DS ikinci doz sonra, A431 hücreleri (ATCC, 2.5 x 106) ve 5 x 106 izole PBMCs (toplam karışık 200 μL fosfat-tamponlu salin (PBS)% 50 Matrigel içeren) gibi insan tümör hücre hattı enjekte , veya tümör parçaları (3 x 3 x 3 mm3, toplam hacmi 200 μL PBS içeren 50% Matrigel) ve 200 μL 5 x 106 PBMCs (100 μL her engrafted tümör parçasının sol ve sağ tarafında) (s.c.) deri altı hayvanların sağ kanadında.
- Primer tümör hacmini ölçün ve 4-6 hafta boyunca haftada iki kez kaydedin.
NOT: Vücut ağırlıkları %20'den fazla kaybedince veya tümör hacmi 2.000 mm 3'e ulaştığında veya tümör ülsere olduğunda fareler ötenazi yedirilir. - Karbondioksit ile gaz odalarında fareler ötenazi. Oftalmik makas ile kurban farelerde tüm tümör dokuları toplamak ve histoloji ve immünohistokimya (IHC) analizi için bunları işlemek. Bu dokularda İnsan CD8, PD-1 ve PD-L1 ifadelerini inceleyin. Protokol adım 4'e bakın.
2. PBMC Donör Ekran
- Bireylerden toplanan PBMC'lerden kaynaklanan beklenen varyasyonlar nedeniyle PBMC donörlerinden oluşan bir paneli tarayan. Adım 1.2'de belirtildiği gibi prosedürlere göre farklı donörlerden Gelen PBMC'lerle birlikte enjekte eden A431 hücrelerini kullanın.
NOT: Çalışmada yeterli sayıda uygun donör elde etmek için 50'den fazla sağlıklı PBMC bağışçısı tarandı. Bu protokolü benimsemek isteyen araştırmacılar, planlanan çalışmaların tasarımına dayanarak kaç sağlıklı PBMC bağışçısının taranacağına kendi başlarına karar verebilirler. - Bir kaliper ile ölçerek haftada iki kez tümör hacmini izleyin.
NOT: Tümör büyüme hızı farklı donörlerden PBMC ile değişebilir. - Tümör dokularını ortalama 200-500 mm3 hacimde toplayın ve histoloji ve immünohistokimya (IHC) analizi için işleyin. İnsan CD8, PD-1 ve PD-L1 ifadelerini inceleyin. Ayrıntılı protokol için adım 4'e bakın.
- Orta derecede tümör büyümesi (tümör hacmi > 200 mm3 14 gün sonrası aşılama) ve nispeten yüksek PD-1, PD-L1 ve CD8 ekspresyonlarına (ortalama IHC skorları > 2) neden olan PBMC donörlerini seçin. Ayrıntılı IHC puanlama protokolü için adım 4'e bakın.
3. İnsan Kanser Hücre Hattı ve PDX Ekran
- Ekran hücre hatları ve PDXs adım 1.2 belirtilen prosedürlere göre, tümör büyüme hızı değerlendirmek için, tümörlerin insan PD-L1 ekspresyonu ve bağışıklık hücresi infiltrasyonları.
NOT: 30'dan fazla insan kanser hücresi hattı ve farklı kanser türlerinin 20'den fazla PDX'i yazarlar tarafından tarandı. Seçilen tümör modellerinin verileri sonuç bölümünde gösterilmiştir.
4. İmmünohistokimya (IHC)
- Adım 1.2.5 ile belirtildiği gibi hasat ve formalin daldırma tarafından tümör dokuları düzeltmek. Dehidrat ve parafin sabit dokular gömmek. Sabit dokuları 3 μm'ye bölerek polilizin kaplı kaydıraklar üzerine yerleştirin.
- Ksilenes üç kez 7 dk her deparaffinize. Dereceli alkoller ile bölümleri nemlendirin: 100% etanol iki kez 3 dakika her biri için, 90% 80% ve% 70 etanol sırayla 3 dakika her. Deiyonize H2O ile üç kez durulayın ve fazla sıvıyı slaytlardan çıkarın.
- Slaytları bir kapta ve 10 mM sodyum sitrat tamponu (pH 6.0) veya Tris-EDTA (pH 9.0) ile kaplayarak antijen alma gerçekleştirin. Slaytkabını mikrodalga ile 3 dk. 95 °C'de 30 dk kaynatın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. Deiyonize H2O ile üç kez durulayın ve slaytlardan fazla sıvıaspire edin.
- PBS'de %3 büyükbaş serum albuminini 1 saat ve PBS'de %0,3 H2O2 çözeltisi ile 10 dakika boyunca insan CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) ve PD-L1 (E1L3N) karşı antikorlar tarafından bir gecede 4 °C'de bloke edin ve HRP RT'de 2 antikora konjuge 1 saat. Substrat DAB'ı (3,3'-diaminobenzidin) slaytların üzerine bırakın ve mikroskoptan kahverengi rengi izleyerek reaksiyon süresini (saniyeden dakikaya) kontrol edin.
- Slaytları %0,5 hidroklorik asit alkolve %0,5 amonya suyuna batırdıktan sonra slaytları nötr balsam ile kaplayın, ardından her biri 5 dakika boyunca sırayla %80, %90 ve %100 etanol ve son olarak ksilenes'te 5 dakika boyunca üç değişiklik kullanarak. Mikroskop kullanarak DAB kahverengi rengini gözlemleyerek antikorları tespit edin.
NOT: Tümöre infiltrasyon lökositler üzerinde insan CD8 ve PD-1 ekspresyonu (TIL) yüksek nesnel büyütmede (20x, 40x) 5 puanlık bir ölçekte (IHC skoru, dağılım 0-4) bir ifade skoru atayarak değerlendirildi. 0, yok; 1, zayıf yoğunluk / az% 20 hücreleri; 2, zayıf-orta şiddet/ 20%-50% hücreleri; 3, orta-güçlü yoğunluk/ 50%-80% hücreleri; 4, güçlü yoğunluk / fazla% 80 hücreleri. Tümör hücrelerinde insan PD-L1 boyama nispeten dağınık sinyal nedeniyle 5 puanlık ölçekte (IHC skoru, aralık 0-4) ayarlanmış bir skorlama sistemi kullanılarak puanlandı. 0, yok; 1, zayıf yoğunluk / az% 10 hücreleri; 2, zayıf-orta şiddet/10%-30% hücreleri; 3, orta/ 30%-50% hücreleri; 4, güçlü yoğunluk / fazla% 50 hücreleri.
5. İnsanlaştırılmış PBMC-NOD/SCID Ksenogreft Modellerinde Vivo etkinliği ve Farmakodinamik Çalışmaları
- NOD/SCID fareleri adım 1.1.3'te belirtildiği gibi önceden tedavi edin. Kısaca, fareleri günde bir kez 100 mg/kg CP (i.p.) ve 125 mg/kg DS (p.o.) ile 2 gün boyunca günde bir kez tedavi edin.
- İkinci dozdan 20 ila 24 saat sonra, hayvanların sağ ön kanadına endike sayıda insan kanser hücresi ve 2.5-5 x 106 PBMC (% 50 Matrigel'de toplam 200°L hücre karışımı) ile deri altı (s.c.) enjekte edin.
NOT: Tek bir çalışmada herhangi bir fare için kullanılan PBMC sayısı aynı olmalıdır. Ancak, her çalışma sırasında toplam izole PBMC durumu varyasyonları nedeniyle, yazarlar 2.5 x 106, 4 x 106,veya 5 x 106 PBMC farklı çalışmalarda kullanmayı seçtiniz. PBMCs uygulanan miktarda bu 2 kat fark insanlaşma derecesini etkileyebilir rağmen, yazarlar test immünoterapiler anti-tümör etkinliğini değerlendirilmesinde önemli farklılıklar gözlemlemek yok. - PDXs engraftment için, hayvanların sağ ön kanadına deri altıtümör parçaları (3 x 3 x 3 mm 3) enjekte edin. Engrafted tümör parçasının soluna ve sağına 5 x 106 PBMC'nin (her iki tarafında 100°L) 200 μL'lik deri altı enjekte edin.
NOT: PDX tümör dokuları bir Matrigel çözeltisi uygulandı, hücre hattı modelleri için açıklandığı gibi. - Hücre aşılama gününde, hayvanları rastgele gruplandırın ve planlanan çalışma protokolü olarak ele alın. Aday ilaçların anti-tümör aktivitesini değerlendirin, BGB-A317 (QW, i.p.) Bu durumda, çeşitli tümör modellerinde belirtilen dozlarda.
NOT: Üç insan kanser hücresi hatları (yani, A431 (epidemoid karsinom), SKOV3 (yumurtalık kanseri) ve SK-MES-1 (akciğer kanseri)), yanı sıra iki PDX modelleri (yani, BCLU-054 (akciğer kanseri) ve BCCO-028 (kolon kanseri)), I-O tedavisi için iyi tümör modelleri olarak kabul edilir bu insancıl fare modelinde değerlendirme. - Bir kaliper kullanarak primer tümör hacmini haftada iki kez ölçün.
NOT: Çalışmalarımızda PBMC engraftment sonrası 4-6 hafta civarında gand vücut ağırlıkları kaybı gözlendi ve terapötik etkinlik değerlendirmeleri için 1-2 ay süre verildi. - Tümör emmiş bağışıklık hücrelerinin farmakodinamik analizi için, küçük parçalar halinde tümör dokuları kesmek ve kollajenaz tip I (1 mg / mL) ve DNase I (100 μg / mL) RPMI1640 artı% 5 fetal sığır serum (FBS) ile 37 ° C 30 dakika için sindirmek. Tek hücresüspansiyonları elde etmek için sindirilmiş dokuları 40 μm hücresüzden geçirin.
- Hücreleri yıkayın ve 96 kuyulu yuvarlak alt plakalarda buz gibi facs arabellekte (PBS, %1 FBS) hücre sayısını 1 x 107 hücre/mL konsantrasyonuna ayarlayın. Hücreleri santrifüj ederek yıkayın ve 30 dakika boyunca 20 μg/mL insan IgG ekleyerek engelleyin, ardından insan karşıtı CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) ve PD-1 (MIH4) antikorları ile 30 dakika boyunca 4 °C'de boyanın. Daha sonra lekeli örnekleri sitometri akışına ve guavaSoft 3.1.1 kullanarak analiz etmeye tabi takın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan prosedürlerin ardından PBMC tabanlı insanlaştırılmış ksenogreft modeli başarıyla oluşturulmuştur. Kısaca, NOD/SCID farelerde CP miyeloablasyon etkileri, CP ve DS tedavisi sonrası nötrofil ve monosit popülasyonlarınınakış sitometri analizi ile saptandı (Şekil 1). 100 mg/kg CP artı 125 mg/kg DS optimal doz olarak belirlendi ve daha sonraki çalışmalarda kullanılan rejim, fareleriçin ciddi toksisiteye neden olmadan nötrofillerin ve monositlerin maksimum tükenmesine neden oldu. Daha sonra insan PBMC ve tümör nakli yapıldı. Tümör mikroortamında insan immün hücresi infiltrasyonlarının varlığıIHC tarafından doğrulandı (Şekil 2).
Tümör mikroortamında nispeten yüksek immün hücre infiltrasyonları ve kabul edilebilir tümör büyüme hızı sağlamak için PBMC donörlerinden oluşan bir panel in vivo olarak tarandı (bölüm 2, Şekil 3A). Bu arada, 30'dan fazla insan kanseri hücre hattı nın yanı sıra farklı kanser türlerinin 20 PDX'i tümör büyüme hızı, tümör PD-L1 ekspresyonu ve immün hücre infiltrasyonlarını değerlendirmek için tarandı (bölüm 3). Temsil sonuçları Şekil 3B'de gösterilmiştir.
Bu PBMC engrafted humanized fareler daha sonra BGB-A317 anti-tümör aktivitesini incelemek için kullanılmıştır. Seçilen sağlıklı donörlerin insan PBMC'leri, kanser hastalarından (BCCO-028 ve BCLU-054) elde edilen insan tümör hücreleri (A431, SKOV3 ve SK-MES-1) veya primer tümör dokusu parçaları ile birlikte enjekte edildi. Fareler, Şekil4'te belirtildiği gibi, tümör implantasyonu ndan itibaren haftada bir kez BGB-A317 veya PBS intraperitoneally tedavi edildi. Yukarıda bahsedilen tüm modellerde BGB-A317 önemli anti-tümöraktiviteleri göstermiştir (Şekil 4).
Şekil 1 : Siklofosfamid (CP) ve disülfiram (DS) kullanılarak NOD/SCID farelerinin miyeloablasyon. (A) Nötrofiller ve monositler de dahil olmak üzere miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için kullanılan gating stratejisi. (B) Cp tedavisinin farklı dozlarında miyeloid hücre (CD11b+), nötrofil (CD11b+Ly6G+) ve monosit (CD11b+Ly6C+) numaralarının temsili sonuçları. Kutular değerlerin 75, 50 ve 25. Üst ve alt çizgiler, sırasıyla 1,5 x IQ (üç aylık dönem arası) aralığındaki maksimum ve en az veri noktalarını temsil eder. araç grubu için n = 3 ve CP ve/veya DS tedavi edilen gruplar için n = 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : İnsan PBMC transplantasyonu ve tümör engraftment. (A) PBMC tabanlı insanlaşmış ksenogreft modelinin genel iş akışını gösteren şematik diyagram. (B) A431 hücrelerinin belirtilen koşullarla donör PBMC ile subkutan ko-enjeksiyon üzerine tümör büyümesi (veriler ortalama tümör hacmi ± SEM, n = 6'yı temsil eder). (C) CP+DS ile veya CP+DS'siz tedavi edilen farelerde geliştirilen tümörlerin IHC analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : PBMC donör ve insan kanser hücre hattı ekran. (A) PBMC donör ekranından temsili özet verileri. PBMC A431 hücreleri ile karıştırılarak insanlaştırılmış NOD/SCID farelerde subkutan olarak aşılandı (bkz. adım 2). Her nokta, 1 donörden PBMC'lerle engrafted 3 farelerin ortalama veri değerini temsil eder. (B) İnsan kanser hücresi hattı ekranından temsil sonuçları. Seçilen donörlerin PBMC'si A431, SK-MES-1 veya SKOV3 hücreleri ile birlikte enjekte edildi. Veriler, 3 fareden toplanan ortalama tümör hacmi ± SEM'i, belirtilen hücre hatlarının 14 gün sonrası aşılanmasını temsil eder. Ortalama IHC skoru ± SEM, 3 farenin tümünün insan CD8, PD-1 ve PD-L1 ortalama ifadesini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : PBMC tabanlı insanlaşmış ksenogreft modelinde BGB-A317'nin anti-tümör aktiviteleri ve farmakodinamikanalizi. BGB-A317'nin belirtilen dozlarda (yani, QW) anti-tümör aktivitesi insan kanser hücresihatları (A) A431 (5 x 106 PBMC ile), (C ) SKOV3 (5 x 106 PBMC ile), (D ) SK-MES-1 (5 x 106 PBMC) kullanılarak değerlendirildi ve hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs) (E) BCLU-054 (5 x 106 PBMC ile) ve (F) BCCO-028 (5 x 106 PBMC ile). Seçilen sağlıklı donörlerden ve buna karşılık gelen tümör hücrelerinden PBMC insanlaştırılmış NOD/SCID farelere subkutan olarak enjekte edildi (n = 8-10). (B) BGB-A317'de tümöre infiltrasyon hCD8+ ve hCD8+hPD-1+ hücrelerinin sayısallaştırılması A431 tümörlerini tedavi etti. n = A'da grup başına 8-10, C'den F'ye, n = 4-6 hayvan grup başına B'de; veri ortalama ± SEM'i temsil eder. Önemi eşit olmayan varyans varsayımı altında iki kuyruklu eşleşmemiş Öğrencinin t-testi kullanılarak değerlendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanser gelişimi ve ilerlemesi hakkındaki bilgimiz son yıllarda hem tümör hücrelerinin hem de ilişkili stromanın kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına odaklanarak önemli ölçüde ilerlemiştir. Konak bağışıklık mekanizmaları harnessing kanser hücrelerine karşı daha büyük bir etkiye neden olabilir, umut verici bir tedavi stratejisi temsil eden. Singenik ve GEM modelleri gibi sağlam fare bağışıklık sistemlerine sahip murine modelleri, kontrol noktası aracılı bağışıklığı incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu modelleri kullanarak etkinlik değerlendirmeleri büyük ölçüde vekil anti-fare hedef antikorları bağlıdır13,14. Ancak, insan ve murine bağışıklık sistemleri arasındaki doğal farklılıklar ve murine modellerinde bazı insan hedeflerinin eksikliği I-O anti-tümör etkileri nin preklinik çalışmaları sınırlamak15,16. Bu nedenle, hem insan bağışıklık hücreleri ve insan tümörleri içeren sağlam fare modelleri acilen istenir, hangi önemli ölçüde çeviri ve yeni I-O terapötik gelişimini artıracaktır.
Burada, potansiyel olarak çevirici I-O çalışmaları için kullanılabilecek bir insan PBMC tabanlı ksenogreft fare modelini tanımlıyoruz. PBMC donör yanı sıra kanser hücresi hattı / PDX ekranlar in vivo etkinliği çalışmaları sağlamlık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için önemlidir. Başarılı insan tümörü ve immün hücre engraftment sağlamak için PBMC donörler in vivo tarandı. Bu arada, 50'den fazla hücre hatları ve çeşitli insan kanseri kökenli PDXs tümör büyüme hızı değerlendirmek için tarandı, insan PD-L1 ekspresyonu, ve bağışıklık hücre infiltrasyonları. Analizlerimiz, incelenen kanser hücresi hatlarının ve PDX'lerin yaklaşık %20'sinin kabul edilebilir tümör büyüme oranını gösterdiğini, aynı zamanda i-o etkinlik değerlendirmeleri için iyi modeller olarak kabul edilen nispeten yüksek TIL ve PD-L1 boyama oranına sahip olduğunu göstermektedir.
HLA eşleştirme rutin organ veya ilik nakli için hasta ve donörmaç için klinikte kullanılır17. Yazarlar, ancak, sadece HLA yazma sınırlı karakterizasyon gerçekleştirilmiştir, ve bu gelecekteki çalışmalarda araştırılması gereken ilginç bir konu olmaya devam etmektedir. Yazarlar bir PBMC donör bir kanser hücresi hattı / PDX için uygun olabilir ama diğerleri için ideal olmadığını belirtmek istiyorum. Bu nedenle, PBMC donörler optimal sonuçlar sağlamak için her kanser modeli için taranmış gerekebilir.
NOD / SCID veya NSG fareler içine insan PBMC engraftment her zaman bir ksenojenik greft-vs-host hastalığı (xGvHD), donör T hücreleri tarafından alıcı doku bağışıklık aracılı saldırı sonucu bir post-transplant bozukluğu yol açar18,19. Yaygın olarak xGVHD ile ilişkili klinik gözlemler, eritem, kambur duruş, kilo kaybı ve mortalite (veriler gösterilmedi) gibi insanlaşmış modelimizde gözlenmiştir. Bu fenotipler genellikle çalışmalarımızın sonlarına doğru, genellikle 1-2 ay sonra engraftment, xGVHD hedef organlarında insan T hücrelerinin yayılma ve infiltrasyon gösteren gözlendi. Bu terapötik I-O tedavi değerlendirmeleri için 1-2 ay süre sağlar. Fare doğuştan gelen bağışıklığı azaltmak ve insan bağışıklık hücre engraftment geliştirmek için çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır20,21. Örneğin, MUrine MHC Sınıf I ve Sınıf II ekspresyonunda kusurlu olan NSG fareleri, PBMC22enjeksiyonu sonrasında akut xGvHD yokluğunda fonksiyonel insan T hücrelerinin engraftment'ını destekler.
Bu protokolde NOD/SCID fareler kullanılmıştır. SCID mutasyonu için fareler homozigot T ve B hücreli lenfosit gelişimi bozulmuş ve NOD arka plan ayrıca eksik doğal katil sonuçları (NK) hücre fonksiyonu20. NSG (Jackson Laboratuvarı), NCG (Charles River) ve NOG (CIEA) suşları gibi diğer yüksek immünoyuplu fareler kurulmuştur. PBMCs ile engrafted zaman, bu fareler insan bağışıklık hücreleri geliştirmek ve insan bağışıklık sistemine benzeyen bir ortam oluşturmak gösterilmiştir23,24. Alternatif olarak, bu fareler CD34+ insan hematopoetik atajen hücreleri (HPCs) ile engrafted olabilir ve daha sürekli T hücre farklılaşması ve olgunlaşma 25 görüntülemek . Buna ek olarak, daha fazla genetik modifikasyonlar ile yeni nesil immünoeksik fare modelleri daha iyi insan miyeloid soy gelişimi ve artan engraftment verimliliği desteklemek için kurulmuştur (varyantları portföy web sayfasına bakın Jackson Laboratuvarı ve Taconic Biosciences).
İnsan dokunulmazlığının yeniden yapılandırılması için bu yeni suşları kullanmanın ayrıntıları daha fazla araştırma yapılmasını bekliyor. Bununla birlikte, bu makalede özetlenen protokol, insan PBMC ile yeniden oluşturulan immün eksik fare modelleri kurulması ve karakterizasyonu genel bir kılavuz olarak hizmet verebilir. Üç insan kanser hücresi hatları ve iki insan hasta kaynaklı ksenogreftler, kanser türleri bir dizi kapsayan, bu makalede gösterilmiştir, çeviri I-O çalışmalarda protokolümüzün potansiyel geniş uygulamaları düşündüren. En insanlı PBMC modelleri, bilgimize göre, enjeksiyon 26,27rota olarak IV veya IP seçtik. Modellerimiz bunun yerine, insan PBMC'sinin kanser ksenogreftleri ile deri altı admiksi yoluyla fareleri taşıyan insan tümöründe kısmen yeniden oluşturulmuş insan bağışıklığını sağlar. Bu yaklaşım, tam kök hücre reconstitution (örneğin, CD34+ hematopoietic kök hücre engraftized insanlaşmış fareler) hızlı ve uygun maliyetli, henüz son derece tekrarlanabilir bir alternatif sağlar. Modelimizin T hücre ile ilgili kanser immünoterapilerinin değerlendirilmesinde, özellikle kısa zaman çizelgeleri üzerinde çalışırken veya daha karmaşık bir çoklu soyundan gelen bağışıklık modeline geçmeden önce ajanları seçmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların BeiGene'e olan ilgisi vardır. Tong Zhang ve Kang Li bgb-A317 kapsayan bir patent mucitler bu çalışmada açıklanan vardır.
Acknowledgments
Yardımcı tartışmalar için laboratuvar üyelerimize teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Hibe Anlaşması No altında Pekin Belediye Bilim ve Teknoloji Komisyonu Biyomedikal ve Yaşam Bilimi Yenilik ve Yetiştirme Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Z15110003915070 ("Yeni bir immün onkoloji anti-tümör ilacı BGB-A317 üzerinde klinik öncesi çalışma" projesi) ve aynı zamanda kısmen klinik öncesi araştırmalar için dahili şirket finansmanı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
