Summary
Мы описываем человеческую периферическую одну из мононуклеалистических клеток крови (PBMC) - гуманизированную модель мыши ксенотранспланта для трансляционных иммуноонкологических исследований. Этот протокол мог бы служить общим ориентиром для установления и характеристики аналогичных моделей для оценки I-O терапии.
Abstract
Открытие и развитие иммуноонкологии (I-O) терапии в последние годы представляет собой веху в лечении рака. Тем не менее, проблемы с лечением сохраняются. Надежные и болезненные модели животных являются жизненно важными ресурсами для продолжения доклинических исследований и разработок в целях решения ряда дополнительных иммунных контрольно-пропускных пунктов. Здесь мы описываем мононуклеаклеальную клетку периферической крови человека (PBMC) - гуманизированную модель ксенотранспланта. BGB-A317 (Tislelizumab), исследуемое гуманизированное анти-PD-1 антитела в поздней стадии клинического развития, используется в качестве примера для обсуждения настройки платформы, характеристики модели и оценки эффективности лекарств. Эти гуманизированные мыши поддерживают рост большинства проверенных опухолей человека, что позволяет оценить I-O терапии в контексте как человеческого иммунитета и рака человека. После создания наша модель сравнительно эффективна во времени и с точки зрения затрат и, как правило, дает высокую воспроизводимую выгоду. Мы предполагаем, что протокол, изложенный в этой статье, может послужить общим ориентиром для создания моделей мышей, восстановленных с помощью человеческих PBMC и опухолей для исследования I-O.
Introduction
Иммуноонкология (I-O) является быстро расширяющейся областью лечения рака. Исследователи в последнее время начали ценить терапевтический потенциал модулирования функций иммунной системы для атаки опухолей. Иммунные блокпосты контрольно-пропускного пункта продемонстрировали обнадеживающую деятельность в различных типах рака, включая меланому, карциному почек, голову и шею, легких, мочевого пузыря и рака предстательной железы1,2. В отличие от целевых методов лечения, которые непосредственно убивают раковые клетки, I-O терапии потенцирует иммунную систему организма атаковать опухоли3.
На сегодняшний день создано множество актуальных моделей для животных I-O. К ним относятся: 1) линии опухолевых клеток мыши или опухоли гомотрансплантата в сингенных мышей; 2) спонтанные опухоли, полученные из генетически модифицированной мыши (GEM) или канцерогенной индукции; 3) химерные GEM с стук-в человека целевой наркотиков (ы) в функциональной иммунной системы мурин; и 4) мышей с восстановленным иммунитетом человека, пересаженный раковыми клетками человека или ксенотрансплантатами, полученными пациентом (PDX). Каждая из этих моделей имеет очевидные преимущества, а также ограничения, которые были описаны и рассмотрены широко в другом месте4.
Восстановление иммунитета человека у иммунодефицитных мышей все больше ценится как клинически значимый подход к трансляционным исследованиям I-O. Это обычно достигается через либо 1) прививки взрослых иммунных клеток (например, периферических клеток мононуклеарных клеток крови (PMBC))5,6, или 2) прививки гематопогетических стволовых клеток (HSC) от, например, пуповинной крови или плода печень7,8. Эти гуманизированные мыши могут поддерживать рост опухолей человека, что позволяет оценку I-O терапии в контексте как человеческого иммунитета и рака человека. Несмотря на преимущества, применение гуманизированных мышей в исследованиях I-O, как правило, было затруднено несколькими проблемами, такими как длительное время разработки модели и значительно высокая стоимость.
Здесь мы описываем модель на основе PBMC, которая может быть широко применена для трансляционных исследований I-O. Эта модель сравнительно временно йенсуманна и экономически эффективна с высокой воспроизводимостью в исследованиях эффективности. Он был использован в доме для оценки нескольких I-O терапии в настоящее время в доклинических и клинических развития. BGB-A317 (Tislelizumab), исследуемое гуманизированное анти-PD-1 антитело9 , используется в качестве примера для обсуждения разработки модели, характеристики и возможных применений для анализа противоопухолевой эффективности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, проводимые в исследованиях с участием участников из числа людей, соответствовали этическим стандартам BeiGene и/или национального исследовательского комитета и Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздним поправкам или сопоставимым этическим стандартам. Информированное согласие было получено от всех отдельных участников, включенных в исследование. Все процедуры, проведенные в исследованиях с участием животных, были одобрены Внутренним наблюдательным советом в BeiGene. Этот протокол был специально скорректирован для оценки BGB-A317 (Tislelizumab) у гуманизированных мышей NOD/SCID.
1. Создание модели на основе ПБМК человека
-
Миелоабляция мышей NOD/SCID с использованием циклофосфамида: определение оптимальных доз
- Покупка самок НОД/SCID мышей (6-8 недель).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши, участвовавшие в этом исследовании, были женщинами. - Приготовьте циклофосфамид (CP) в различных дозах (50, 100 и 150 мг/кг) в сольном. Подготовка дисульфирама (DS) в 0,8% Tween-80 в солин на 125 мг/кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные концентрации CP были подготовлены, чтобы позволить введение равных объемов лекарственного раствора для мышей получать различные дозы CP. - Лечить животных с CP (т.п.) и DS (p.o.) один раз в день в течение 2 дней. Дайте DS (p.o.) 2 ч после каждой дозы CP.
ПРИМЕЧАНИЕ: DS снижает уротоксичность CP у мышей, и CP в сочетании с DS было предложено иметь более длительные нейтропения, чем животные, обработанные CP только10 Доза режим CP, возможно, потребуется предопределена до фактических исследований и было установлено, варьироваться немного между различными иммунодефицитными штаммами мыши. - Собирайте образцы крови из орбитальной венозной синуса и перенесите в edTA-K покрытые трубки на льду на день 0 (1 ч до1-й дозы), день 2 (24 ч после2-й дозы) и день 4 (72 ч после2-й дозы).
- Изучите эффект миелоаблирования после лечения CP и DS FACS. Используйте крысиную антимышь CD11b (M1/70), крысиную антимышь Ly6C (HK1.4, ) и крысиную антимышь Ly6G (1A8) для gating CD11bи Ly6G высокой, как нейтрофилы, CD11bиLy6Cвысоко, как моноциты 11,12.
- Запись веса тела и состояния здоровья мышей ежедневно в течение одной недели. Оптимальная доза CP и DS определяется как режим, который приводит к максимальному истощению нейтрофилов и моноцитов, не вызывая тяжелой токсичности для мышей.
- Покупка самок НОД/SCID мышей (6-8 недель).
-
Трансплантация и прививка опухолей человека: настройка модели
- Изолировать человеческие ПБМК от здоровых доноров по градиентной центрифугации плотности в соответствии с инструкциями производителя.
- Предварительное лечение мышей CP и DS, как указано в шаге 1.1.2 и 1.1.3 для повышения эффективности трансплантации.
- 20 до 24 ч после второй дозы CP и DS, вводить человека опухолевых клеток линии, такие как A431 клеток (ATCC, 2,5 х 106) и 5 х 106 изолированных ПБМК (смешанные в общей сложности 200 Л л фосфат-буферных солен (PBS), содержащий 50% Matrigel) , или фрагменты опухоли (3 х 3 х 3мм, в общем объеме 200 Л ПБС, содержащих 50% Matrigel) и 200 Зл 5 х 106 PBMCs (100 л каждый в левую и правую сторону привясленного фрагмента опухоли) (s.c.) подкожно в правом фланге животных.
- Измеряйте первичный объем опухоли и записывайте два раза в неделю в течение 4-6 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей усыпчат, как только их веса тела теряют более 20% или их объем опухоли достигает 2000 мм3 или опухоль язвится. - Эвтаназия мышей в газовых камерах с углекислым газом. Соберите целые опухолевые ткани у жертвенных мышей с помощью офтальмологических ножниц и обработайте их для анализа гистологии и иммуногистохимии (IHC). Изучите выражения человека CD8, PD-1 и PD-L1 в этих тканях. Смотрите протокол шаг 4.
2. PBMC Донор экран
- Экран панели доноров PBMC в связи с ожидаемыми изменениями в результате PBMCs собраны из частных лиц. Используйте клетки A431 совместно инъекционных с PBMCs от различных доноров в соответствии с процедурами, как указано в шаге 1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более 50 здоровых доноров PBMC были обследованы в ходе исследования, с тем чтобы получить достаточное количество подходящих доноров. Исследователи, которые хотели бы принять этот протокол, могли бы сами решать, сколько здоровых доноров PBMC будет проверено, на основе дизайна запланированных исследований. - Мониторинг объема опухоли два раза в неделю путем измерения с каципером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Темпы роста опухоли могут варьироваться в зависимости от PBMC от различных доноров. - Соберите опухолевые ткани в среднем объеме 200-500 мм3 и обработайте их для анализа гистологии и иммуногистохимии (IHC). Изучите человеческие выражения CD8, PD-1 и PD-L1. Подробный протокол см.
- Выберите PBMC доноров, которые приводят к умеренному росту опухоли (объем опухоли ,gt; 200 мм3 14 дней после прививки) и относительно высокий PD-1, PD-L1 и CD8 выражений (средний IHC оценки Подробный протокол оценки IHC см.
3. Линия клетки рака человека и экран PDX
- Экран клеточных линий и PDXs в соответствии с процедурами, изложенными в шаге 1.2, для оценки темпов роста опухоли, человека PD-L1 выражение опухолей и инфильтрации иммунных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более 30 человеческих раковых клеток линий и более 20 PDXs различных типов рака были проверены авторами. Данные отдельных моделей опухолей были показаны в разделе результатов.
4. Иммуногистохимия (IHC)
- Урожай, как указано шагом 1.2.5 и исправить опухолевые ткани, погружаясь в формалин. Обезвоживание и встраивание фиксированных тканей в парафин. Раздел фиксированной ткани на 3 мкм и поместите их на полилизин покрытием слайдов.
- Депарафинизацию в ксиленах три раза по 7 мин каждый. Гидрат секций с помощью градуированных спиртов: 100% этанола дважды в течение 3 мин каждый, а затем 90%, 80% и 70% этанола в свою очередь, по 3 мин каждый. Промыть деионизированным H2O три раза и удалить лишнюю жидкость со слайдов.
- Выполните поиск антигена, поместив слайды в контейнер и накройте буфером цитрата цитрата натрия 10 мМ (pH 6.0), или Tris-EDTA (pH 9.0). Нагрейте контейнер слайдов микроволновой печи в течение 3 мин. Отварить в водяной бане при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем охладить до комнатной температуры. Промыть деионизированным H2O три раза и аспирировать лишнюю жидкость со слайдов.
- Блок разделов на 3% бычьей сыворотки альбумина в PBS для 1 ч и 0,3% H2O2 решение в PBS в течение 10 мин. Пятно антителами против человека CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) и PD-L1 (E1L3N) на 4 КС ночь, и HRP conjugated 2nd antibodies в течение 1 ч. Опустите субстрат DAB (3,3'-диаминобензидин) на слайды и контролируйте время реакции (секунды до минут), отслеживая коричневый цвет с микроскопа.
- Обложка слайды с нейтральным бальзамом после погружения слайдов в 0,5% соляной кислоты алкоголя и 0,5% аммиачной воды в свою очередь, для 5 с каждый, то в 80%, 90% и 100% этанола в последовательности в течение 3 минут каждый, и, наконец, в ксиленах с использованием трех изменений на 5 мин каждый. Обнаружить антитела, наблюдая коричневый цвет DAB с помощью микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение ЧЕЛОВЕКА CD8 и PD-1 на опухолевых леукокитах (TIL) оценивалось путем присвоения оценки экспрессии по 5-балльной шкале (оценка IHC, диапазон 0-4) при высоком объективном увеличении (20x, 40x). 0, отсутствует; 1, слабая интенсивность / менее 20% клеток; 2, слабая к умеренной интенсивности / 20%-50% клеток; 3, умеренно-сильная интенсивность/ 50%-80% клеток; 4, сильная интенсивность/ более 80% клеток. Окрашивание PD-L1 в опухолевых клетках было забито с помощью скорректированной системы скоринга по 5-балльной шкале (оценка IHC, диапазон 0-4) из-за его относительно рассеянного сигнала. 0, отсутствует; 1, слабая интенсивность / менее 10% клеток; 2, слабая к-умеренная интенсивность/10%-30% клетки; 3, умеренные/ 30%-50% клеток; 4, сильная интенсивность/ более 50% клеток.
5. В Vivo эффективности и фармакодинамики исследований в гуманизированных PBMC-NOD / SCID Ксенотрансплантат Модели
- Предварительное лечение НОД/SCID мышей, как указано в шаге 1.1.3. Вкратце, лечить мышей с 100 мг/кг CP (i.p.) и 125 мг/кг DS (p.o.) один раз в день в течение 2 дней.
- 20 до 24 ч после второй дозы, вводить подкожно (s.c.) с указанным числом раковых клеток человека и 2,5-5 х 106 PbMCs (в общей сложности 200 Л клеточной смеси в 50% Matrigel) в правом переднем фланге животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество PBMC, используемого для любой отдельной мыши в одном исследовании, должно быть одинаковым. Однако, из-за различий в доступности общего изолированного PBMC на момент каждого исследования, авторы решили использовать 2,5 х 106, 4 х 106, или 5 х 106 PBMC в различных исследованиях. Хотя это 2-кратное различие в введенном количестве ПБМК может повлиять на степень гуманизации, авторы не наблюдают существенных различий в оценке противоопухолевой эффективности протестированных иммунотерапии. - Для PDXs привить, вводят подкожно фрагменты опухоли (3 х 3 х 3 мм3) в правом переднем фланге животных. Вводят подкожно 200 л 5 х 106 ПБМК (по 100 л с каждой стороны) влево и вправо от привязанного фрагмента опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани опухоли PDX вводились в растворе Matrigel, так же, как описано для моделей клеточной линии. - В день клеточной прививки случайным образом группируют животных и лечат как запланированный протокол исследования. Оцените противоопухолевую активность кандидатских препаратов, BGB-A317 (ЗВ, т.п.) в данном случае, при указанных дозах в различных опухолевых моделях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три линии раковых клеток человека (т.е., A431 (эпидемидная карцинома), SKOV3 (рак яичников) и SK-MES-1 (рак легких),), а также две модели PDX (т.е., BCLU-054 (рак легких) и BCCO-028 (рак толстой кишки)), считаются хорошими моделями опухолей для I-O терапии оценки в этой гуманизированной модели мыши. - Измерьте первичный объем опухоли два раза в неделю, используя каципер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Gand потеря веса тела наблюдались около 4-6 недель после PBMC прививок в наших исследованиях, что позволяет 1-2 месяцев окно для терапевтической оценки эффективности. - Для фармакодинамики анализа опухоли проникли иммунные клетки, разрезать ткани опухоли на мелкие кусочки и переварить их с коллагеназы типа I (1 мг/мл) и DNase I (100 мкг/мл) в RPMI1640 плюс 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия. Передайте переваренные ткани через 40 мкм клеточных ситектов для получения одноклеточных суспензий.
- Вымойте клетки и настроить число клеток до концентрации 1 х 107 клеток / мл в ледяной FACS Buffer (PBS, 1% FBS) в 96-хорошо круглые нижние пластины. Вымойте клетки центрифугированием и блокировать их, добавив 20 мкг/мл человека IgG в течение 30 минут, а затем окрашивание с анти-человеческой CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) и PD-1 (MIH4) антитела при 4 кК в течение 30 мин. Затем подвергните окрашенные образцы потокциометрии и анализировать с помощью guavaSoft 3.1.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После процедур, представленных здесь, pbMC основе гуманизированной модели ксенотрансплантата была успешно создана. Короче говоря, CP myeloablation эффекты в NOD / SCID мышей была определена циклометрический анализ потока нейтрофилов и моноцитов населения после CP и DS лечения(Рисунок 1). 100 мг/кг CP плюс 125 мг/кг DS был определен в качестве оптимальной дозы и используется в более поздних исследованиях, как режим приводит к максимальному истощению нейтрофилов и моноцитов, не вызывая тяжелой токсичности для мышей. Затем была проведена пересадка ПБМС человека и опухоли. Наличие иммунных клеток человека проникает в микроокружение опухоли было проверено IHC(Рисунок 2).
Группа доноров PBMC были проверены in vivo для обеспечения относительно высокой инфильтрации иммунных клеток в микроокружение опухоли и приемлемые темпы роста опухоли (раздел 2, рисунок 3A). Между тем, более 30 человеческих раковых клеток линий, а также более 20 PDXs различных типов рака были проверены для оценки темпов роста опухоли, экспрессии опухоли PD-L1 и инфильтрации иммунных клеток (раздел 3). Представительные результаты были показаны на рисунке 3B.
Эти пБМК-привитые гуманизированные мыши были затем использованы для изучения противоопухолевой активности BGB-A317. ПБМК человека от отдельных здоровых доноров были совместно введены с человеческими опухолевыми клетками (A431, SKOV3 и SK-MES-1) или первичных фрагментов опухолевых тканей, полученных от онкологических больных (BCCO-028 и BCLU-054) подкожно. Мышей лечили, как указано на рисунке 4, с BGB-A317 или PBS интраперитонело раз в неделю со дня имплантации опухоли. Во всех вышеупомянутых моделях BGB-A317 продемонстрировал значительную противоопухолевую активность(рисунок 4).
Рисунок 1 : Миелоабляция мышей NOD/SCID с использованием циклофосфамид (CP) и дисульфирама (DS). (A) Стратегия Gating, используемая для идентификации подмножества миелоидных клеток, включая нейтрофилы и моноциты. (B) Представитель результаты миелоидной клетки (CD11b), нейтрофил (CD11bиLy6G)и моноцитов (CD11bиLy6C ) номера на различных дозах лечения CP. Коробки представляют 75-й, 50-й и 25-й процентиль значений. Верхняя и нижняя линии представляют максимальные и минимальные точки данных в диапазоне 1,5x I (межкварталья) соответственно. n No 3 для группы транспортных средств и n No 6 для CP и/или DS обработанных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Трансплантация человека PBMC и прививание опухоли. (A) Схема, показывающая общий рабочий процесс гуманизированной модели ксенотранспланта на основе PBMC. (B) Рост опухоли клеток A431 при подкожной совместной инъекции с донором PBMC с указанными условиями (данные представляют средний объем опухоли , SEM, n No 6). (C) IHC анализ опухолей, разработанных у мышей, обработанных с или без CP-DS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : PBMC донора и человека раковой клетки линии экрана. (A) Представитель сводные данные с экрана доноров PBMC. PBMC смешивались с клетками A431 и привиты подкожно в гуманизированных мышах NOD/SCID (см. шаг 2). Каждая точка представляет собой среднее значение данных 3 мышей, привитых ПБМК от 1 донора. (B) Представитель результаты от человеческого экрана линии рака. ПБМК от отдельных доноров были совместно введены с A431, SK-MES-1 или SKOV3 клеток. Данные представляют средний объем опухоли и SEM, собранные у 3 мышей, 14-дневная после прививка указанных клеточных линий. Средняя оценка IHC - SEM представляет собой среднее выражение человеческого CD8, PD-1 и PD-L1 всех 3 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Противоопухолевая деятельность и фармакодинамика анализа BGB-A317 в PBMC основе гуманизированной модели ксенотранспланта. Противоопухолевая активность BGB-A317 в указанных дозах (т.п., ЗВ) оценивалась с использованием раковых клеток человека (A) A431 (с 5 х 106 PBMC), (C) SKOV3 (с 5 х 106 PBMC), (D) SK-MES-1 (с 5 х 106 PBMC), пациент производные ксенотрансплантаты (PDXs) (E) BCLU-054 (с 5 х 106 PBMC) и ( (F) BCCO-028 (с 5 х 106 PBMC). PBMC от выбранных здоровых доноров и соответствующих опухолевых клеток были совместно введены подкожно в гуманизированных НОД / SCID мышей (n No 8 до 10). (B) Количественная оценка опухолевых hCD8 и hCD8-hPD-1 "клеток в BGB-A317 лечение опухолей A431. n - 8-10 животных в группе А и от От до Ф,. 4-6 животных на группу В; данные представляют собой среднее и среднего SEM. Значение оценивалось с помощью двуххвостого неспаренного студенчества, основанного на предположении о неравной дисперсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наши знания о развитии рака и прогрессии значительно продвинулись в последние годы, с акцентом на всестороннее понимание как опухолевых клеток и связанных с ним стромы. Использование механизмов иммунной системы хозяина может вызвать большее воздействие на раковые клетки, что представляет собой перспективную стратегию лечения. Модели Murine с неповрежденной иммунной системой мыши, такие как сингенные и GEM модели, были широко использованы для изучения контрольно-опосредованного иммунитета. Оценка эффективности с использованием этих моделей в значительной степени зависит от суррогатных анти-мышь целевых антител13,14. Однако, присущие различия между иммунной системой человека и мурин и отсутствие некоторых человеческих целей в моделях мурина ограничить доклинические исследования I-O противоопухолевых эффектов15,16. Поэтому срочно желают надежные мышиные модели, включающие как иммунные клетки человека, так и опухоли человека, что значительно улучшит перевод и развитие новых i-O терапевтических препаратов.
Здесь мы описываем человеческую модель мыши на основе PBMC, которая потенциально может быть широко использована для трансляционных исследований I-O. Донор PBMC, а также раковые клетки линии / PDX экраны имеют решающее значение для обеспечения надежности и воспроизводимости in vivo эффективности исследований. Доноры PBMC были проверены in vivo для обеспечения успешной опухоли человека и прививок иммунных клеток. Между тем, более 50 клеточных линий и PDX различных человеческих происхождения рака были проверены для оценки темпов роста опухоли, человека PD-L1 выражение, и иммунных инфильтраций клеток. Наши анализы показывают, что около 20% раковых клеток линий и PDXs рассмотрены продемонстрировать приемлемые темпы роста опухоли в то же время с относительно высоким TILs и PD-L1 окрашивания, которые считаются хорошими моделями для I-O оценки эффективности.
HLA соответствия обычно используется в клинике, чтобы соответствовать пациентам и донорам для трансплантации органов или костного мозга17. Авторы, однако, только выполнили ограниченную характеристику на вводе HLA, и это остается интересной темой, которая будет исследована в будущих исследованиях. Авторы хотели бы отметить, что донор PBMC может быть подходящим для одной линии раковых клеток / PDX, но не идеально подходит для других. Поэтому донорам PBMC, возможно, потребуется пройти обследование для каждой модели рака, чтобы обеспечить оптимальные результаты.
Прививка человека PBMC в NOD / SCID или NSG мышей неизменно приводит к ксеногенной трансплантата против хозяина болезни (xGvHD), пост-трансплантации расстройства, что результаты от иммунной опосредованной атаки ткани реципиента донором Т-клеток18,19. Клинические наблюдения, обычно связанные с xGVHD, наблюдались в нашей гуманизированной модели, таких как эритема, сгорбленная осанка, потеря веса и смертность (данные не показаны). Эти фенотипы, как правило, наблюдались в конце наших исследований, как правило, в 1-2 месяца после трансплантации, что свидетельствует о распространении и проникновении человеческих Т-клеток в органах-мишенях xGVHD. Это позволяет 1-2 месяца окно для терапевтических I-O оценки терапии. Несколько подходов были использованы для уменьшения мыши врожденный иммунитет и повышения иммунной клетки человека прививок20,21. Например, NSG мышей дефектных в murine MHC класса I и класса II выражение поддержки прививки функциональных человеческих Т-клеток в отсутствие острого xGvHD после инъекции PBMC22.
В этом протоколе использовались мыши NOD/SCID. Мыши гомозиготные для мутации SCID имеют нарушения T и B развития лимфоцитов клеток и NOD фон дополнительно приводит к дефициту естественного убийцы (NK) функции клеток20. Были установлены другие, более иммунодефицитные мыши, такие как NSG (Лаборатория Джексона), NCG (Charles River) и NOG (CIEA). При привяжении с ПБМК, эти мыши были показаны развивать иммунные клетки человека и образуют среду, которая напоминает иммунную систему человека23,24. Кроме того, эти мыши могут быть привиты cd34и человеческих гематопоиетических клеток-прародителей (HPCs) и отображать более устойчивой дифференциации Т-клеток и созревания25. Кроме того, следующее поколение иммунодефицитных моделей мыши с дальнейшими генетическими модификациями были созданы для поддержки лучшего развития миелоидной линии человека и повышения эффективности прививок (обратите сью местью портфолио веб-страницы The Лаборатория Джексона и Таконические бионауки).
Более подробная информация об использовании этих новых штаммов для восстановления иммунитета человека еще не завершена. Тем не менее, протокол, изложенный в этой статье, может служить общим ориентиром для установления и характеристики иммунодефицитных моделей мыши, восстановленных с помощью человеческих ПБМК. Три линии раковых клеток человека и два человека, полученных ксенотрансплантатов, охватывающих целый ряд типов рака, продемонстрированы в этой статье, предлагая потенциальное широкое применение нашего протокола в переводческих I-O исследований. Большинство гуманизированных моделей PBMC, насколько нам известно, выбрали IV или IP в качестве маршрута инъекции26,27. Наши модели вместо этого обеспечивают частично восстановленный иммунитет человека в опухоли человека подшипников мышей через подкожно пристыковка человека PBMC с раком ксенотрансплантатов. Этот подход обеспечивает быструю и экономически эффективную, но высоко воспроизводимую альтернативу полной реконституции стволовых клеток (например, CD34и гематопоитическая стволовые клетки, привитые гуманизированными мышами). Наша модель оказалась полезной для оценки Т-клеточного лечения рака, особенно при работе на коротких временных линиях или для выбора агентов, прежде чем перейти к более сложной модели многолинейного иммунитета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы имеют право собственности на BeiGene. Тонг Чжан и Кан Ли являются изобретателями патента, охватывающего BGB-A317, описанного в этом исследовании.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудников наших лабораторий за полезные обсуждения. Эта работа была частично поддержана биомедицинской и медико-биологической инновационной и культивирования научно-исследовательской программы Пекинской муниципальной комиссии по науке и технике в соответствии с соглашением о грантах No. No151100003915070 (проект "Доклиническое исследование по роману иммунной онкологии противоопухолевого препарата BGB-A317"), а также частично поддерживается внутренним финансированием компании для доклинических исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
