Summary
Descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello murino xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale. Questo protocollo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli simili per la valutazione della terapia I-O.
Abstract
La scoperta e lo sviluppo della terapia immuno-oncologica (I-O) negli ultimi anni rappresenta una pietra miliare nel trattamento del cancro. Tuttavia, le sfide del trattamento persistono. Modelli animali robusti e rilevanti per le malattie sono risorse vitali per la continua ricerca e sviluppo preclinico al fine di affrontare una serie di ulteriori punti di controllo immunitari. Qui, descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello di xenotrapianto umanizzato. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorpo umanosa sperimentale anti-PD-1 nello sviluppo clinico in fase avanzata, viene utilizzato come esempio per discutere la configurazione della piattaforma, la caratterizzazione del modello e le valutazioni di efficacia dei farmaci. Questi topi umanizzati supportano la crescita della maggior parte dei tumori umani testati, consentendo così la valutazione delle terapie I-O nel contesto dell'immunità umana e dei tumori umani. Una volta stabilito, il nostro modello è relativamente conveniente e conveniente, e di solito produce risultati altamente riproducibili. Suggeriamo che il protocollo descritto in questo articolo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire modelli murini ricostituiti con PBMC umano e tumori per la ricerca I-O.
Introduction
L'immuno-oncologia (I-O) è un campo di trattamento del cancro in rapida espansione. I ricercatori hanno recentemente iniziato ad apprezzare il potenziale terapeutico di modulare le funzioni del sistema immunitario per attaccare i tumori. I blocchi dei checkpoint immunitari hanno dimostrato attività incoraggianti in una varietà di tipi di cancro, tra cui melanoma, carcinoma a cellule renali, testa e collo, polmone, vescica e tumori della prostata1,2. Contrariamente alle terapie mirate che uccidono direttamente le cellule tumorali, le terapie I-O potenziano il sistema immunitario del corpo per attaccare i tumori3.
Ad oggi, sono stati istituiti numerosi modelli animali I-O pertinenti. Questi includono: 1) linee cellulari tumorali del topo o tumore ominofotra nei topi sinogenici; 2) tumori spontanei derivati da topo geneticamente ingegnerizzato (GEM) o induzione cancerogena; 3) GEM chimerici con l'abbattimenti di bersagli di droga umana in un sistema immunitario murino funzionale; e 4) topi con immunità umana ricostituita trapiantati con cellule tumorali umane o xenograforiti derivati dal paziente (PDX). Ognuno di questi modelli hanno evidenti vantaggi e limitazioni, che sono stati descritti e rivisti ampiamente altrove4.
La ricostituzione dell'immunità umana nei topi immunodeficienti è stata apprezzata come approccio clinicamente rilevante per la ricerca I-O traslazionale. Questo è di solito ottenuto attraverso 1) innesto di cellule immunitarie adulte (ad esempio, cellule mononucleari del sangue periferico (PMBC))5,6, o 2) innesto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da, ad esempio, sangue cordonale ombelicale o fetale fegato7,8. Questi topi umanizzati potrebbero sostenere la crescita dei tumori umani, consentendo così la valutazione delle terapie I-O nel contesto dell'immunità umana e dei tumori umani. Nonostante i vantaggi, le applicazioni dei topi umanizzati nella ricerca I-O sono state solitamente ostacolate da diverse preoccupazioni, come lunghi tempi di sviluppo del modello e costi notevolmente elevati.
Qui, descriviamo un modello umano basato su PBMC che potrebbe essere ampiamente applicato per gli studi I-O traslazionali. Questo modello è relativamente conveniente e conveniente con un'elevata riproducibilità negli studi di efficacia. È stato utilizzato internamente per le valutazioni di diverse terapie I-O attualmente in fase di sviluppo preclinico e clinico. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorpo umanoso sperimentale anti-PD-19 , viene utilizzato come esempio per discutere lo sviluppo del modello, la caratterizzazione e le possibili applicazioni per le analisi di efficacia anti-tumorale.
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Protocol
Tutte le procedure eseguite negli studi che hanno coinvolto partecipanti umani erano conformi agli standard etici di BeiGene e/o comitato nazionale di ricerca e con la dichiarazione di Helsinki del 1964 e le sue successive modifiche o norme etiche comparabili. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i singoli partecipanti inclusi nello studio. Tutte le procedure eseguite negli studi riguardanti animali sono state approvate dall'Internal Review Board di BeiGene. Questo protocollo è stato specificamente modificato per la valutazione del BGB-A317 (Tislelizumab) in topi UMD/SCID umanizzati.
1. Istituzione del modello umano basato su PBMC
-
Mieloablazione dei topi NOD/SCID che utilizzano ciclofosfamide: determinazione delle dosi ottimali
- Acquista topi femmina NOD/SCID (6-8 settimane).
NOT: Tutti i topi coinvolti in questo studio erano di sesso femminile. - Preparare la ciclofosfore (CP) a dosi diverse (50, 100 e 150 mg/kg) in salina. Preparare il disulfiram (DS) in 0,8% Tween-80 in salina a 125 mg/kg.
NOTA: diverse concentrazioni di CP sono state preparate per consentire la somministrazione di pari volumi di soluzione farmacologica ai topi che ottengono diverse dosi di CP. - Trattare gli animali con CP (i.p.) e DS (p.o.) una volta al giorno per 2 giorni. Dare DS (p.o.) 2 h dopo ogni dose di CP.
NOT: DS diminuisce l'urotossicità della CP nei topi, e CP combinato con DS è stato suggerito di avere neutropenia più duratura rispetto agli animali trattati con CP da solo10 Il regime di dose di CP potrebbe essere necessario pre-determinato prima di studi effettivi e si è scoperto che varia leggermente tra diversi ceppi di topo immunodeficienti. - Raccogliere campioni di sangue dal seno venoso orbitale e trasferire ai tubi rivestiti EDTA-K sul ghiaccio il giorno 0 (1 h prima della dose di 1st), giorno 2 (24 h dopo la dose 2nd) e giorno 4 (72 h dopo la dose di 2nd).
- Esaminare l'effetto di mieloablazione dopo il trattamento CP e DS da parte di FACS. Utilizzare ratto anti-topo CD11b (M1/70), ratto anti-topo Ly6C (HK1.4, ) e ratto anti-topo Ly6G (1A8) per gating CD11b- Ly6Galto come neutrofili, CD11b-Ly6Calto come monociti11,12.
- Registrare il peso corporeo e le condizioni di salute dei topi ogni giorno per una settimana. La dose ottimale di CP e DS è determinata come il regime che si traduce nel massimo esaurimento di neutrofili e monociti senza causare una grave tossicità ai topi.
- Acquista topi femmina NOD/SCID (6-8 settimane).
-
Trapianto di PBMC umano e innesto tumorale: set-up del modello
- Isolare i PBMC salvici umani da donatori sani per centricizione del gradiente di densità secondo le istruzioni del produttore.
- Pretrattare i topi con CP e DS come indicato al punto 1.1.2 e 1.1.3 per aumentare l'efficienza dei trapianti.
- 20 a 24 h dopo la seconda dose di CP e DS, iniettare la linea cellulare tumorale umana come le cellule A431 (ATCC, 2,5 x 106) e 5 x 106 PBMC isolati (mescolato in un totale di 200L -fosfato-buffered saline (PBS) contenente il 50% Matrigel) , o frammenti tumorali (3 x 3 x 3 mm3, in un volume totale di 200 PBS contenenti il 50% di Matrigel) e 200 -L di 5 x 106 PBMC (100 ll'L ciascuno a sinistra e a destra del frammento tumorale innestato) (s.c.) sottocutaneamente nel fianco destro degli animali.
- Misurare il volume primario del tumore e registrare due volte a settimana per 4-6 settimane.
NOT: I topi saranno eutanasia una volta che i loro pesi corporei perdono oltre il 20% o il loro volume tumorale raggiunge 2.000 mm3 o il tumore è ulcerato. - Eutanasia i topi in camere a gas con anidride carbonica. Raccogliere tutti i tessuti tumorali in topi sacrificati con forbici oftalmiche ed elaborarli per l'analisi istologica e immunoistochimica (IHC). Esaminare le espressioni Human CD8, PD-1 e PD-L1 in questi tessuti. Vedere il passaggio 4 del protocollo.
2. Schermo del donatore PBMC
- Visualizzate lo schermo di un gruppo di donatori PBMC a causa delle variazioni previste derivanti dai PBMC raccolti da individui. Utilizzare le cellule A431 in co-iniettamento con PBMC di donatori diversi secondo le procedure indicate dal punto 1.2.
NOT: Oltre 50 donatori PBMC sani sono stati sottoposti a screening nello studio per ottenere un numero sufficiente di donatori idonei. I ricercatori che desiderano adottare questo protocollo potrebbero decidere autonomamente quanti donatori pbMC sani devono essere sottoposti a screening, sulla base della progettazione degli studi pianificati. - Monitorare il volume del tumore due volte a settimana misurando con una pinza.
NOT: Il tasso di crescita del tumore può variare con PBMC da diversi donatori. - Raccogliere i tessuti tumorali ad un volume medio di 200-500 mm3 e elaborarli per l'analisi istituiologia e immunoistochimica (IHC). Esaminare le espressioni umane CD8, PD-1 e PD-L1. Vedere il passaggio 4 per il protocollo dettagliato.
- Selezionare i donatori PBMC che provocano una crescita moderata del tumore (volume tumorale > 200 mm3 14 giorni dopo l'inoculazione) e espressioni PD-1, PD-L1 e CD8 relativamente alte (punteggi iHC significati > 2). Vedere il passaggio 4 per il protocollo di punteggio IHC dettagliato.
3. Linea cellulare del cancro umano e schermo PDX
- Linee cellulari dello schermo e PDX secondo le procedure indicate nel passaggio 1.2, per valutare il tasso di crescita del tumore, espressione umana PD-L1 dei tumori e infiltrazioni di cellule immunitarie.
NOT: Gli autori hanno esaminato oltre 30 linee cellulari di cancro umano e oltre 20 PDX di diversi tipi di cancro. I dati dei modelli tumorali selezionati sono stati mostrati nella sezione dei risultati.
4. Immunoistochimica (IHC)
- Raccogliere come indicato dal punto 1.2.5 e fissare i tessuti tumorali immergendosi nella formalina. Disidratare e incorporare tessuti fissi in paraffina. Sezionare i tessuti fissi a 3 m e metterli su vetrini rivestiti in polilisina.
- Deparaffinizzare negli xileni tre volte 7 min ciascuno. Idratare le sezioni attraverso alcoli graduati: 100% etanolo due volte per 3 min ciascuno, seguito da 90%, 80% e 70% etanolo a sua volta per 3 min ciascuno. Risciacquare da deionizzato H2O tre volte e rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini.
- Eseguire il recupero dell'antigene inserendo i vetrini in un contenitore e coprire con 10 mM di tampone di citrati di sodio (pH 6.0) o Tris-EDTA (pH 9.0). Riscaldare il contenitore dei vetrini a microonde per 3 min. Far bollire in un bagno d'acqua a 95 gradi centigradi per 30 minuti e poi raffreddare a temperatura ambiente. Risciacquare da deionizzato H2O tre volte e aspirare liquido in eccesso dai vetrini.
- Bloccare le sezioni del 3% di albumina di siero bovino in PBS per 1 h e 0,3% H2O2 soluzione in PBS per 10 min. Stain da anticorpi contro l'uomo CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) e PD-L1 (E1L3N) a 4 gradi centigradi, e HRP ha jugated 2nd antibodies a RT per 1 h. Far cadere il DAB del substrato (3,3'-diaminobenzidina) sui vetrini e controllare il tempo di reazione (secondi a minuti) monitorando il colore marrone dal microscopio.
- Coprire i vetrini con balsamo neutro dopo aver immerso i vetrini in alcool acido cloridrico dello 0,5% e 0,5% di acqua ammoniaca a sua volta per 5 s ciascuno, quindi in 80%, 90% e 100% etanolo in sequenza per 3 min ciascuno, e infine in xilene utilizzando tre modifiche per 5 min ciascuno. Rilevare gli anticorpi osservando il colore marrone del DAB al microscopio.
NOT: L'espressione umana CD8 e PD-1 sui leucociti infiltrati da tumori (TIL) è stata valutata assegnando un punteggio di espressione su una scala di 5 punti (punteggio IHC, intervallo 0-4) con un ingrandimento obiettivo elevato (20x, 40x). 0, assente; 1, intensità debole / meno del 20% di cellule; 2, intensità da debole a moderata/ 20%-50% cellule; 3, intensità da moderata a forte/ 50%-80% cellule; 4, forte intensità / più di 80% cellule. La colorazione umana PD-L1 all'interno delle cellule tumorali è stata valutata utilizzando un sistema di punteggio regolato su una scala di 5 punti (punteggio IHC, intervallo 0-4) a causa del suo segnale relativamente diffuso. 0, assente; 1, intensità debole / meno del 10% di cellule; 2, intensità da debole a moderata/10%-30% cellule; 3, moderata/ 30%-50% cellule; 4, forte intensità / più del 50% di cellule.
5. In Vivo efficacia e studi di farmacodinamica in modelli umanizzati PBMC-NOD/SCID Xenograft
- Pre-trattare i topi NOD/SCID come indicato dal punto 1.1.3. In breve, trattare i topi con 100 mg/kg CP (i.p.) e 125 mg/kg DS (p.o.) una volta al giorno per 2 giorni.
- 20 a 24 h dopo la seconda dose, iniettare sottocutaneamente (s.c.) con il numero indicato di cellule tumorali umane e 2,5-5 x 106 PBMC (un totale di 200 - miscela di cellule L nel 50% Matrigel) nel fianco anteriore destro degli animali.
NOT: Il numero di PBMC utilizzati per ogni singolo topo in un singolo studio dovrebbe essere lo stesso. Tuttavia, a causa delle variazioni nella disponibilità di PBMC completamente isolato al momento di ogni studio, gli autori hanno scelto di utilizzare 2,5 x 106, 4 x 106o 5 x 106 PBMC in diversi studi. Anche se questa differenza di due volte nella quantità somministrata di PBC potrebbe influenzare il grado di umanizzazione, gli autori non osservano differenze significative nella valutazione degli effetti anti-tumorali delle immunoterapie testate. - Per l'innesto di PDX, iniettare frammenti tumoralisottocutaneamente (3 x 3 x 3 mm 3) nel fianco anteriore destro degli animali. Iniettare sottocutaneamente 200 luna di 5 x 106 PBMC (100 gradi l per lato) a sinistra ea destra del frammento tumorale innestato.
NOT: I tessuti tumorali PDX sono stati somministrati in una soluzione Matrigel, come descritto per i modelli di linea cellulare. - Il giorno dell'inoculazione cellulare, raggruppare casualmente gli animali e trattare come il protocollo di studio previsto. Valutare l'attività anti-tumorale dei farmaci candidati, BGB-A317 (QW, i.p.) in questo caso, alle dosi indicate in vari modelli tumorali.
NOT: Le tre linee cellulari del cancro umano (ad esempio, A431 (carcinoma epidemoid), SKOV3 (cancro ovarico) e SK-MES-1 (cancro del polmone)), così come due modelli PDX (cioè BCLU-054 (cancro al polmone) e BCCO-028 (cancro del colon)), sono considerati buoni modelli tumorali per la terapia I-O valutazione in questo modello murino umanizzato. - Misurare il volume del tumore primario due volte alla settimana, utilizzando una pinza.
NOT: Perdita di pesi corporei Gand sono stati osservati intorno 4-6 settimane post innesto PBMC nei nostri studi, permettendo una finestra di 1-2 mesi per valutazioni di efficacia terapeutica. - Per l'analisi farmacodinamica delle cellule immunitarie infiltrate da tumore, tagliare i tessuti tumorali in piccoli pezzi e digerirli con tipo di collagenae I (1 mg/mL) e DNase I (100 g/mL) in RPMI1640 più il 5% del siero bovino fetale (FBS) per 30 min a 37 . Passare i tessuti digeriti attraverso ceppi cellulari da 40 m per ottenere sospensioni a cella singola.
- Lavare le cellule e regolare il numero di cellule ad una concentrazione di 1 x 107 celle / mL nel buffer FACS freddo ghiaccio (PBS, 1% FBS) in piastre inferiori rotonde 96-pozzo. Lavare le cellule centrifugiandole e bloccarle aggiungendo 20 G/mL di Ig umano per 30 min, seguito dalla colorazione con anticorpi anti-umani CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) e PD-1 (MIH4) a 4 gradi centigradi per 30 min. Quindi sottomettere i campioni macchiati a flusso di citometria e analizzare utilizzando guavaSoft 3.1.1.
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Representative Results
Seguendo le procedure qui presentate, è stato stabilito con successo un modello di xenotrapianto umanizzato basato su PBMC. In breve, gli effetti di mieloablazione CP nei topi NOD/SCID sono stati determinati dall'analisi della citometria di flusso delle popolazioni di neutrofili e monociti dopo il trattamento cp e DS (Figura 1). 100 mg/kg CP più 125 mg/kg DS è stato determinato come la dose ottimale e utilizzato negli studi successivi come il regime si traduce nel massimo esaurimento di neutrofili e monociti senza causare grave tossicità ai topi. Successivamente, è stato eseguito il trapianto di PBMC e tumore umano. La presenza di infiltrati di cellule immunitarie umane nel microambiente tumorale è stata verificata dall'IHC (Figura 2).
Un gruppo di donatori PBMC è stato sottoposto a screening in vivo per garantire infiltrazioni di cellule immunitarie relativamente elevate nel microambiente tumorale e un tasso di crescita del tumore accettabile (sezione 2, Figura 3A). Nel frattempo, sono state esaminate oltre 30 linee cellulari del cancro umano e oltre 20 PDX di diversi tipi di cancro per valutare il tasso di crescita del tumore, l'espressione del tumore PD-L1 e le infiltrazioni di cellule immunitarie (sezione 3). I risultati rappresentativi sono stati mostrati nella figura 3B.
Questi topi umanizzati innaffiati da PBMC sono stati poi utilizzati per esaminare l'attività anti-tumorale del BGB-A317. I PBMC umani provenienti da donatori sani selezionati sono stati co-iniettati con cellule tumorali umane (A431, SKOV3 e SK-MES-1) o frammenti di tessuto tumorale primario derivati da pazienti oncologici (BCCO-028 e BCLU-054) sottocutaneamente. I topi sono stati trattati, come indicato nella Figura 4, con BGB-A317 o PBS intraperitonealmente una volta alla settimana dal giorno dell'impianto tumorale. In tutti i modelli di cui sopra, BGB-A317 ha dimostrato notevoli attività anti-tumorali (Figura 4).
Figura 1 : mieloablazione dei topi NOD/SCID che utilizzano ciclofosfamide (CP) e disulfiram (DS). (A) Strategia Gating utilizzata per identificare sottoinsiemi di cellule mieloidi, inclusi neutrofili e monociti. (B) Risultati rappresentativi della cellula mieloide (CD11b), deineutrofili (CD11b)e del monocito (CD11b,Ly6C)su diversi dosaggi del trattamento CP. Le caselle rappresentano il 75esimo, il 50esimo e il venticinquesimo percentile dei valori. Le linee superiore e inferiore rappresentano i punti dati massimi e minimi all'interno dell'intervallo di 1,5 x IQ (tra trimestri), rispettivamente. n - 3 per il gruppo di veicoli e n : 6 per i gruppi trattati con CP e/o DS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Trapianto di PBMC umano e innesto tumorale. (A) Diagramma schematico che mostra il flusso di lavoro generale del modello di xenotrapianto umanizzato basato su PBMC. (B) Crescita tumorale delle cellule A431 su coiniezione sottocutanea con il PBMC del donatore con le condizioni indicate (i dati rappresentano il volume medio del tumore - SEM, n (C) Analisi IHC dei tumori sviluppati in topi trattati con o senza CP-DS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : donatore PBMC e schermo della linea cellulare del cancro umano. (A) Dati di riepilogo rappresentativi dalla schermata del donatore PBMC. PBMC sono stati mescolati con cellule A431 e sottocutaneamente in tovero umorizzato in mouse NOD/SCID umanizzati (vedere il punto 2). Ogni punto rappresenta il valore medio dei dati di 3 topi innestati con PBC da 1 donatore. (B) Risultati rappresentativi dello schermo della linea cellulare del cancro umano. Il PBMC di donatori selezionati è stato co-iniettato con cellule A431, SK-MES-1 o SKOV3. I dati rappresentano il volume medio del tumore: SEM raccolto da 3 topi, 14 giorni di inoculazione post delle linee cellulari indicate. Punteggio Medio IHC - SEM rappresenta l'espressione media di UMANO CD8, PD-1, e PD-L1 di tutti e 3 i topi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : attività antitumorali e analisi farmacodinamica di BGB-A317 nel modello di xenotrapianto umanizzato basato su PBMC. L'attività antitumorale di BGB-A317 a dosi indicate (i.p., QW) è stata valutata utilizzando linee cellulari tumorali umane (A) A431 (con 5 x 106 PBMC), (C) SKOV3 (con 5 x 106 PBMC), (D) SK-MES-1 (con 5 x 106 PBMC) e xenografi derivati dal paziente (PDX) (E) BCLU-054 (con 5 x 106 PBMC) e (F) BCCO-028 (con 5 x 106 PBMC). PBMC da donatori sani selezionati e cellule tumorali corrispondenti sono stati co-iniettati sottocutaneamente in topi umil/SCID umanizzati (n da 8 a 10). (B) Quantificazione delle cellule hCD8 e hCD8-hPD-1 nei tumori BGB-A317 trattati con A431. n - 8-10 animali per gruppo in A, e da C a F, n - 4-6 animali per gruppo in B; dati rappresenta media - SEM. Il significato è stato valutato utilizzando un test t di Student non accoppiato a due code, presupponendo una varianza disuguale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La nostra conoscenza dello sviluppo e della progressione del cancro è progredita in modo significativo negli ultimi anni, con particolare attenzione a una comprensione completa sia delle cellule tumorali che del suo stroma associato. Sfruttare i meccanismi immunitari ospiti potrebbe indurre un maggiore impatto sulle cellule tumorali, rappresentando una promettente strategia di trattamento. I modelli Murine con sistema immunitario murino intatto, come i modelli singenici e GEM, sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'immunità mediata dai checkpoint. Le valutazioni di efficacia che utilizzano questi modelli dipendono in gran parte dagli anticorpi bersaglio antito-topi surrogati13,14. Tuttavia, le differenze intrinseche tra il sistema immunitario umano e murino e la mancanza di alcuni bersagli umani nei modelli murini limitano gli studi preclinici degli effetti antitumorali I-O15,16. Pertanto, sono urgentemente desiderati modelli murini robusti che includono sia le cellule immunitarie umane che i tumori umani, il che migliorerà significativamente la traduzione e lo sviluppo di nuove terapie I-O.
Qui, descriviamo un modello di mouse xenotrapianto basato su PBMC umano che potrebbe potenzialmente essere ampiamente utilizzato per gli studi I-O traslazionali. I donatori PBMC e gli schermi della linea cellulare del cancro/PDX sono fondamentali per garantire robustezza e riproducibilità degli studi di efficacia in vivo. I donatori PBMC sono stati sottoposti a screening in vivo per garantire il successo dell'innesto di tumori umani e cellule immunitarie. Nel frattempo, oltre 50 linee cellulari e PDX di varie origini tumorali umane sono state esaminate per valutare il tasso di crescita del tumore, l'espressione di PD-L1 umano e le infiltrazioni di cellule immunitarie. Le nostre analisi suggeriscono che circa il 20% delle linee cellulari del cancro e delle PDX esaminate dimostrano un tasso di crescita accettabile del tumore, pur avendo al tempo stesso TIL e macchie PD-L1 relativamente elevate, che sono considerati modelli buoni per le valutazioni di efficacia I-O.
L'abbinamento HLA è abitualmente usato in clinica per abbinare pazienti e donatori per trapianti di organi o midollo17. Gli autori, tuttavia, hanno eseguito solo una caratterizzazione limitata sulla tipizzazione HLA, e questo rimane un argomento interessante da studiare negli studi futuri. Gli autori desiderano notare che un donatore PBMC potrebbe essere adatto per una linea cellulare del cancro / PDX, ma non è ideale per gli altri. Pertanto, potrebbe essere necessario vagliare i donatori PBMC per ogni modello di cancro per garantire risultati ottimali.
L'innesto di PBMC umano in topi NOD/SCID o NSG porta invariabilmente a una malattia xenogeneica innesto-contro-ospite (xGvHD), un disturbo post-trapianto che deriva dall'attacco immuno-mediato del tessuto ricevente da parte delle cellule T del donatore18,19. Osservazioni cliniche comunemente associate con xGVHD sono state osservate nel nostro modello umanizzato, come l'erithema, postura curvo, perdita di peso e mortalità (dati non mostrati). Questi fenotipi sono stati di solito osservati verso la fine dei nostri studi, di solito a 1-2 mesi dopo l'innesto, indicando la propagazione e l'infiltrazione delle cellule T umane negli organi bersaglio xGVHD. Questo permette una finestra di 1-2 mesi per le valutazioni terapeutiche della terapia I-O. Diversi approcci sono stati utilizzati per diminuire l'immunità innata del topo e migliorare l'innesto delle cellule immunitarie umane20,21. Ad esempio, i topi NSG difettosi nell'espressione murina MHC di classe I e II supportano l'innesto di cellule T umane funzionali in assenza di xGvHD acuto dopo l'iniezione di PBMC22.
In questo protocollo sono stati utilizzati topi NOD/SCID. I topi omozigosi per la mutazione SCID hanno compromesso lo sviluppo dei linfociti delle cellule T e B e lo sfondo NOD si traduce inoltre in una funzione cellulare carente del killer naturale (NK)20. Sono stati istituiti altri topi più altamente immunodeficienti, come i ceppi NSG (The Jackson Laboratory), NCG (Charles River) e NOG (CIEA). Quando sono stati infestati da PMC, questi topi sono stati mostrati sviluppano cellule immunitarie umane e formano un ambiente che assomiglia al sistema immunitario umano23,24. In alternativa, questi topi potrebbero essere innestati con CD34- cellule progenitrici ematopoietiche umane (HMC) e visualizzare una differenziazione e una maturazione delle cellule T più sostenute25. Inoltre, sono stati istituiti modelli murini immunodeficienti di nuova generazione con ulteriori modifiche genetiche per supportare un migliore sviluppo del lignaggio mieloide umano e una maggiore efficienza di innesto (fare riferimento alla pagina web del portafoglio varianti di The Jackson Laboratory e Bioscienze Taconiche).
Ulteriori dettagli sull'utilizzo di questi nuovi ceppi per la ricostituzione dell'immunità umana sono in attesa di ulteriori indagini. Tuttavia, il protocollo descritto in questo articolo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli murini immunodeficienti ricostituiti con PBMC umano. In questo articolo sono dimostrate tre linee cellulari di cancro umano e due xenogratrapforti derivati dal paziente umano, che coprono una serie di tipi di cancro, suggerendo le potenziali applicazioni generali del nostro protocollo negli studi I-O traslazionali. La maggior parte dei modelli PBMC umanizzati, a nostra conoscenza, hanno scelto IV o IP come via di iniezione26,27. I nostri modelli invece forniscono l'immunità umana parzialmente ricostituita nei topi che portano il tumore umano attraverso un mescolamento sottocutaneo di PBMC umano con xenotrapianto tumorale. Questo approccio fornisce un'alternativa rapida ed economica, ma altamente riproducibile, alla ricostituzione completa delle cellule staminali (ad esempio, CD34- topi umanizzati ematopoietici innestati da cellule staminali). Il nostro modello si è dimostrato utile per valutare le immunoterapie contro il cancro che coinvolgono le cellule T, in particolare quando si lavora su brevi tempistiche o per selezionare gli agenti prima di passare a un modello di immunità multi-lineage più complesso.
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Disclosures
Tutti gli autori hanno interesse di proprietà in BeiGene. Tong e Kang Li sono inventori di un brevetto che copre BGB-A317 descritto in questo studio.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri dei nostri laboratori per discussioni utili. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Biomedical and Life Science Innovation and Cultivation Research Program della Commissione Municipale di Scienza e Tecnologia di Pechino nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. -151100003915070 (progetto "Studio clinico su un nuovo farmaco antitumorale oncologico BGB-A317"), ed è stato anche parzialmente supportato da finanziamenti aziendali interni per la ricerca preclinica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
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