Summary
We beschrijven een humaan perifeer bloed mononucleaire cel (PBMC) — op basis van gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is muismodel voor translationeel immuno-oncologisch onderzoek. Dit protocol kan dienen als een algemene richtlijn voor het vaststellen en karakteriseren van vergelijkbare modellen voor I-O-therapie beoordeling.
Abstract
De ontdekking en ontwikkeling van immuno-oncologie (I-O) therapie in de afgelopen jaren vormt een mijlpaal in de behandeling van kanker. Echter, behandeling uitdagingen blijven bestaan. Robuuste en ziektegerelateerde diermodellen zijn essentiële hulpmiddelen voor voortgezet preklinisch onderzoek en ontwikkeling om een reeks extra immuuncontrolepunten aan te pakken. Hier beschrijven we een humaan perifeer bloed mononucleaire cel (PBMC) — gebaseerd gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is model. BGB-A317 (Tislelizumab), een humaan anti-PD-1 antilichaam in de late fase van de klinische ontwikkeling, wordt gebruikt als een voorbeeld om de opstelling van het platform, de model karakterisatie en evaluaties van de geneesmiddelen werkzaamheid te bespreken. Deze gehumaniseerde muizen ondersteunen de groei van de meeste menselijke tumoren getest, waardoor de beoordeling van I-O therapieën in het kader van zowel menselijke immuniteit en menselijke kankers. Na de oprichting is ons model relatief tijd-en kostenbesparend en levert het meestal zeer reproduceerbare resultaten op. Wij stellen voor dat het protocol beschreven in dit artikel kan dienen als een algemene richtlijn voor het tot stand brengen van Muismodellen die zijn gereconstitueerd met menselijke PBMC en tumoren voor I-O onderzoek.
Introduction
Immuno-oncologie (I-O) is een snel groeiend gebied van kankerbehandeling. Onderzoekers zijn onlangs begonnen te waarderen het therapeutische potentieel van het moduleren van functies van het immuunsysteem om tumoren aan te vallen. Immuun Checkpoint blokkades hebben aangetoond bemoedigende activiteiten in een verscheidenheid van kankersoorten, met inbegrip van melanoom, niercelcarcinoom, hoofd en nek, Long, blaas en prostaatkanker1,2. In tegenstelling tot gerichte therapieën die kankercellen direct doden, potentiëren I-O-therapieën het afweersysteem van het lichaam om tumoren3aan te vallen.
Tot op heden zijn tal van relevante I-O-diermodellen vastgesteld. Deze omvatten: 1) muis tumor cellijnen of tumor homo graft in syngene muizen; 2) spontane tumoren afgeleid van genetisch gemanipuleerde muis (GEM) of kankerverwekkend-inductie; 3) chimerische edelstenen met de knock-in van de drug target (s) in een functionele Murine immuunsysteem; en 4) muizen met gereconstitueerde menselijke immuniteit getransplanteerd met menselijke kankercellen of patiënt-afgeleide xenotransplantaten (pdxs). Elk van deze modellen hebben duidelijke voordelen, evenals beperkingen, die zijn beschreven en uitgebreid elders beoordeeld4.
Reconstitutie van de menselijke immuniteit in immunodeficiënte muizen is gegroend gewaardeerd als een klinisch relevante aanpak voor translationeel I-O-onderzoek. Dit wordt meestal bereikt door 1) engraftment van volwassen immuuncellen (bijv. perifere bloed mononucleaire cellen (pmbc))5,6of 2) engraftment van hematopoietische stamcellen (HSC) van, bijvoorbeeld, navelstreng bloed of foetale lever7,8. Deze gehumaniseerde muizen kunnen de groei van menselijke tumoren ondersteunen, waardoor de beoordeling van I-O-therapieën mogelijk is in het kader van zowel menselijke immuniteit als menselijke kankers. Ondanks de voordelen werden toepassingen van gehumaniseerde muizen in I-O-onderzoek meestal gehinderd door verschillende zorgen, zoals lange model ontwikkelingstijd en aanzienlijk hoge kosten.
Hier beschrijven we een menselijk PBMC-gebaseerd model dat op grote schaal kan worden toegepast voor translationele I-O-studies. Dit model is relatief tijd-en kosteneffectief met een hoge reproduceerbaarheid in werkzaamheidsstudies. Het is in eigen huis gebruikt voor de evaluaties van verschillende I-O-therapieën die momenteel onder preklinisch en klinische ontwikkeling vallen. BGB-A317 (Tislelizumab), een experimenteel gehumaniseerd anti-PD-1 antilichaam9 , wordt gebruikt als voorbeeld om de modelontwikkeling, karakterisering en mogelijke toepassingen voor anti-tumor werkzaamheids analyses te bespreken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die werden uitgevoerd in studies waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, waren in overeenstemming met de ethische normen van BeiGene en/of de nationale onderzoekscommissie en met de 1964 verklaring van Helsinki en latere wijzigingen of vergelijkbare ethische normen. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle individuele deelnemers die deel uitmaken van de studie. Alle procedures die worden uitgevoerd in studies waarbij dieren zijn betrokken, zijn goedgekeurd door de interne toetsings Raad van BeiGene. Dit protocol is specifiek aangepast voor de evaluatie van BGB-A317 (Tislelizumab) in gehumaniseerde NOD/SCID-muizen.
1. oprichting van een op menselijke PBMC gebaseerd model
-
Myeloablatie van NOD/SCID muizen met behulp van cyclofosfamide: bepaling van optimale doses
- Koop vrouwelijke NOD/SCID muizen (6-8 weken).
Opmerking: Alle muizen die bij deze studie betrokken waren, waren vrouwelijk. - Bereid Cyclofosfamide (CP) in verschillende doseringen (50, 100 en 150 mg/kg) in zoutoplossing. Bereid Disulfiram (DS) in 0,8% Tween-80 in zoutoplossing bij 125 mg/kg.
Opmerking: verschillende concentraties van CP waren bereid om het beheer van gelijke hoeveelheden geneesmiddelen oplossing voor muizen krijgen verschillende doses van CP. - Behandel de dieren met CP (i.p.) en DS (p.o.) eenmaal per dag gedurende 2 dagen. Geef DS (p.o.) 2 h na elke dosis CP.
Opmerking: DS vermindert de urotoxiciteit van CP bij muizen, en CP in combinatie met DS is gesuggereerd om langduriger neutropenie te hebben dan dieren die behandeld zijn met CP alleen10 het doseringsschema van CP moet mogelijk vooraf worden bepaald voorafgaand aan de eigenlijke studies en bleek te variëren iets tussen verschillende immunodeficiënte muizenstammen. - Verzamel bloedmonsters van de orbitale veneuze sinus en breng op dag 0 (1 uur voor de dosis van 1St ) een overdracht naar de EDTA-K gecoate buisjes op het ijs, dag 2 (24 uur na de 2ND -dosis) en dag 4 (72 uur na de 2ND -dosis).
- Onderzoek het myeloablatie-effect na CP en DS behandeling door FACS. Gebruik rat anti-Mouse CD11b (M1/70), rat anti-muis Ly6C (HK 1.4,) en rat anti-muis Ly6G (1A8) voor het gating CD11b+ Ly6Ghoog als neutrofielen, CD11b+Ly6Choog als monocyten11,12.
- Registreer lichaamsgewicht en gezondheidsvoorschriften van de muizen dagelijks gedurende één week. De optimale dosis CP en DS wordt bepaald als het regime dat resulteert in een maximale depletie van neutrofielen en monocyten, zonder dat dit ernstige toxiciteit voor muizen veroorzaakt.
- Koop vrouwelijke NOD/SCID muizen (6-8 weken).
-
Humane PBMC transplantatie en tumor engraftment: model set-up
- Isoleer Human PBMCs van gezonde donoren door dichtheidsgradiënt centrifugeren volgens de instructies van de fabrikant.
- Behandel de muizen vooraf met CP en DS zoals aangegeven door stap 1.1.2 en 1.1.3 om de transplantatie-efficiëntie te verhogen.
- 20 tot 24 h na de tweede dosis van CP en DS, Injecteer humane tumor cellijn zoals A431 cellen (ATCC, 2,5 x 106) en 5 x 106 geïsoleerde PBMCs (gemengd in een totaal van 200 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 50% matrigel) , of tumor fragmenten (3 x 3 x 3 mm3, in een totaal volume van 200 μl PBS met 50% matrigel) en 200 μl van 5 x 106 PBMCs (100 μL elk aan de linker-en rechterkant van het geënt tumor fragment) (s.c.) subcutaan in de rechterflank van de dieren.
- Meet de primaire tumor volume en record twee keer per week voor 4-6 weken.
Opmerking: De muizen zullen worden geëvacueerd zodra hun lichaamsgewicht meer dan 20% verliest of als hun tumor volume 2.000 mm3 bereikt of de tumor wordt ulcerated. - Euthaniseer de muizen in gaskamers met koolstofdioxide. Verzamel de hele tumorweefsels in opgeofferde muizen met oogheelkundige schaar en verwerk ze voor histologie en immunohistochemie (IHC) analyse. Onderzoek de humane CD8, PD-1 en PD-L1-expressies in deze weefsels. Zie Protocol stap 4.
2. PBMC donor scherm
- Scherm een panel van PBMC donoren als gevolg van de verwachte variaties als gevolg van PBMCs verzameld van individuen. Gebruik A431 cellen die samen met PBMCs van verschillende donoren worden gebruikt volgens de procedures zoals aangegeven in stap 1,2.
Opmerking: Meer dan 50 gezonde PBMC donoren werden gescreend in de studie om voldoende aantal geschikte donoren te verkrijgen. Onderzoekers die dit protocol willen aannemen, kunnen zelf bepalen hoeveel gezonde PBMC-donoren moeten worden gescreend, op basis van het ontwerp van de geplande studies. - Monitor tumor volume twee keer per week door te meten met een remklauw.
Opmerking: Tumor groeisnelheid kan variëren met PBMC van verschillende donoren. - Verzamel de tumorweefsels met een gemiddeld volume van 200-500 mm3 en verwerk ze voor histologie en immunohistochemie (IHC) analyse. Bestudeer Human CD8-, PD-1-en PD-L1-expressies. Zie stap 4 voor gedetailleerd protocol.
- Selecteer PBMC donoren die resulteren in matige tumorgroei (tumor volume > 200 mm3 14 dagen na inoculatie) en relatief hoge PD-1-, PD-L1-en CD8-expressies (gemiddelde IHC-scores > 2). Zie stap 4 voor gedetailleerd IHC scoring protocol.
3. Human Cancer Cell line en PDX-scherm
- Scherm cellijnen en PDXs volgens de procedures vermeld in stap 1,2, om te evalueren van de tumorgroei snelheid, menselijke PD-L1 expressie van de tumoren en immuuncelinfiltraties.
Opmerking: Meer dan 30 menselijke kanker cellijnen en meer dan 20 PDXs van verschillende soorten kanker werden door de auteurs gescreend. Gegevens van geselecteerde tumor modellen werden getoond in de resultaten sectie.
4. immunohistochemie (IHC)
- Oogst zoals aangegeven door stap 1.2.5 en Fix tumorweefsels door onderdompelen in formalin. Dehydraat en sluit vaste weefsels in paraffine. Sectie de vaste weefsels bij 3 μm en plaats ze op poly lysine gecoate dia's.
- Deparaffiniseren in xylenen driemaal 7 min elk. Hydrateer de secties via gesorteerde alcoholen: 100% ethanol tweemaal voor 3 min elk, gevolgd door 90%, 80% en 70% ethanol op zijn beurt voor 3 min elk. Spoel door middel van gedeïoniseerde H2O driemaal en verwijder overtollige vloeistof uit de glijbanen.
- Het opvraging van antigeen uitvoeren door de glaasjes in een container te plaatsen en te bedekken met een Natriumcitraat buffer van 10 mM (pH 6,0) of tris-EDTA (pH 9,0). Verwarm de slides container voor 3 min. kook in een waterbad van 95 °C gedurende 30 min en koel af op kamertemperatuur. Spoel door middel van gedeïoniseerde H2O driemaal en aspiraat overtollige vloeistof van de dia's.
- Blokkeer de secties met 3% boviene serumalbumine in PBS voor 1 uur en 0,3% H2O2 oplossing in PBS gedurende 10 min. vlek door antilichamen tegen humaan CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) en pd-L1 (E1L3N) bij 4 °c 's nachts, en HRP geconjugeerd 2ND antilichamen bij RT voor 1 h. laat de ondergrond DAB (3, 3 '-diaminobenzidine) op de glijbanen vallen en bedien de reactietijd (seconden tot minuten) door de bruine kleur van de Microscoop te bewaken.
- Bedek de dia's met neutrale Balsam na het onderdompelen van de dia's in 0,5% zoutzuur alcohol en 0,5% ammoniak water op zijn beurt voor 5 s elk, vervolgens in 80%, 90% en 100% ethanol in volgorde voor 3 min elk, en ten slotte in xylenen met behulp van drie veranderingen voor 5 min elk. Detecteer de antilichamen door de bruine kleur van DAB met Microscoop te observeren.
Opmerking: Humane CD8 en PD-1-expressie op tumor-infiltrerende leukocyten (TIL) werden beoordeeld door een expressie Score toe te wijzen op een 5-puntsschaal (IHC-Score, bereik 0-4) bij een hoge objectieve vergroting (20x, 40x). 0, afwezig; 1, zwakke intensiteit/minder dan 20% cellen; 2, zwak tot matig intensiteit/20%-50% cellen; 3, matige tot sterke intensiteit/50%-80% cellen; 4, sterke intensiteit/meer dan 80% cellen. Menselijke PD-L1-kleuring binnen tumorcellen werd gescoord met behulp van een aangepast scoring systeem op een 5-puntsschaal (IHC-Score, bereik 0-4) vanwege zijn relatief diffuus signaal. 0, afwezig; 1, zwakke intensiteit/minder dan 10% cellen; 2, zwak tot matig intensiteit/10%-30% cellen; 3, gemiddeld/30%-50% cellen; 4, sterke intensiteit/meer dan 50% cellen.
5. in vivo werkzaamheid en farmacodynamiek studies in gehumaniseerde PBMC-NOD/SCID xenograft modellen
- Pre-Treat NOD/SCID muizen zoals aangegeven door stap 1.1.3. In het kort, behandel de muizen met 100 mg/kg CP (i.p.) en 125 mg/kg DS (p.o.) eenmaal per dag gedurende 2 dagen.
- 20 tot 24 uur na de tweede dosis injecteert u subcutaan (s.c.) met het aangegeven aantal humane kankercellen en 2,5-5 x 106 PBMCs (in totaal 200 μL celmengsel in 50% matrigel) in de rechter voorste flank van de dieren.
Opmerking: Het aantal PBMC gebruikt voor een individuele muis in één enkele studie moet hetzelfde zijn. Echter, als gevolg van variaties in de beschikbaarheid van totale geïsoleerde PBMC op het moment van elke studie, de auteurs hebben gekozen voor het gebruik van 2,5 x 106, 4 x 106, of 5 x 106 PBMC in verschillende studies. Hoewel dit 2-voudige verschil in de toegediende hoeveelheid PBMCs de mate van humanisering kan beïnvloeden, observeren de auteurs geen significante verschillen in het evalueren van anti-tumor efficaten van de geteste immunotherapieën. - Injecteer voor PDXs engraftment subcutaan tumor fragmenten (3 x 3 x 3 mm3) in de rechter voor flank van de dieren. Injecteer subcutaan 200 μl van 5 x 106 PBMCs (100 μL aan elke kant) links en rechts van het tumor fragment in geënt.
Opmerking: PDX tumorweefsels werden toegediend in een Matrigel oplossing, hetzelfde als beschreven voor de cellijn modellen. - Op de dag van de celinoculatie groeperen willekeurig de dieren en behandelen als het geplande studie protocol. Beoordelen van de anti-tumor activiteit van kandidaat drugs, BGB-A317 (QW, i.p.) in dit geval, bij de aangegeven doses in verschillende tumor modellen.
Opmerking: De drie menselijke kanker cellijnen (d.w.z. A431 (epidemoïde carcinoom), SKOV3 (eierstokkanker) en SK-MES-1 (longkanker)), evenals twee PDX-modellen (d.w.z. BCLU-054 (longkanker) en BCCO-028 (colonkanker)), worden beschouwd als goede tumor modellen voor I-O-therapie evaluatie in dit gehumaniseerde muismodel. - Meet het primaire tumor volume twee keer per week, met behulp van een remklauw.
Opmerking: Gand lichaam gewichten verlies werden waargenomen rond 4-6 weken post PBMC engraftment in onze studies, waardoor een venster 1-2 maanden voor therapeutische evaluaties van de werkzaamheid. - Voor de farmacodynamische analyse van tumor geïnfiltreerde immuuncellen, snijd de tumorweefsels in kleine stukjes en verteren ze met collagenase type I (1 mg/mL) en DNase I (100 μg/mL) in RPMI1640 plus 5% foetaal runderserum (FBS) gedurende 30 min bij 37 °C. Passeren de verteerde weefsels door middel van 40 μm celstrainers om enkelvoudige celsuspensies te verkrijgen.
- Was de cellen en pas het celnummer aan een concentratie van 1 x 107 cellen/ml in IJSKOUDE FACS buffer (PBS, 1% FBS) in 96-goed ronde bodemplaten. Was de cellen door ze te centrifugeren en te blokkeren door 20 μg/mL humaan IgG toe te voegen gedurende 30 minuten, gevolgd door kleuring met anti-humane CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) en PD-1 (MIH4) antilichamen bij 4 °C gedurende 30 minuten. Vervolgens onderwerpen de bevlekte monsters te stromen cytometrie en analyseren met behulp van guavaSoft 3.1.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de hier gepresenteerde procedures werd een op PBMC gebaseerd gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is-model met succes opgericht. Kort gezegd, CP myeloablatie effecten in NOD/SCID muizen werd bepaald door Flowcytometrie analyse van neutrofiele en monocyt populaties post CP en DS behandeling (Figuur 1). 100 mg/kg CP plus 125 mg/kg DS werd bepaald als de optimale dosis en gebruikt in latere studies, aangezien het regime resulteert in een maximale depletie van neutrofielen en monocyten zonder ernstige toxiciteit voor muizen te veroorzaken. Volgende, menselijke PBMC en tumor transplantatie werd uitgevoerd. Aanwezigheid van menselijke immuuncel infiltraten in de tumor micro omgeving werd geverifieerd door IHC (Figuur 2).
Een panel van PBMC donoren werden gescreend in vivo om te zorgen voor relatief hoge immuuncelinfiltraties in de tumor micro omgeving en acceptabele tumorgroei snelheid (sectie 2, Figuur 3A). Ondertussen, meer dan 30 menselijke Cancer cellijnen evenals meer dan 20 PDXs van verschillende kankersoorten werden gescreend om te evalueren van de tumorgroei snelheid, tumor PD-L1 expressie en immuuncelinfiltraties (sectie 3). De representatieve resultaten werden weergegeven in Figuur 3B.
Deze PBMC-engrafted gehumaniseerde muizen werden vervolgens gebruikt om te onderzoeken van de anti-tumor activiteit van BGB-A317. Human PBMCs van geselecteerde gezonde donoren werden samen geïnjecteerd met menselijke tumorcellen (A431, SKOV3 en SK-MES-1) of primaire tumorweefsel fragmenten afgeleid van kankerpatiënten (BCCO-028 en BCLU-054) subcutaan. De muizen werden behandeld, zoals aangegeven in Figuur 4, met BGB-A317 of PBS intraperitoneaal één keer per week vanaf de dag van de implantatie van de tumor. In alle bovengenoemde modellen toonde BGB-A317 significante anti-tumor activiteiten (Figuur 4).
Figuur 1 : Myeloablatie van Nod/SCID muizen met behulp van Cyclofosfamide (CP) en Disulfiram (DS). A) gating-strategie voor de identificatie van subgroepen van myeloïde cellen, waaronder neutrofielen en monocyten. (B) representatieve resultaten van myeloïde cel (CD11b+), neutrofielen (CD11b+Ly6G+) en monocyt (CD11b+Ly6C+) getallen bij verschillende doseringen van CP-behandeling. De vakken vertegenwoordigen het 75e, 50e en 25e percentiel van de waarden. De bovenste en onderste lijnen vertegenwoordigen respectievelijk maximale en minimale gegevenspunten binnen het bereik van 1,5 x IQ (inter kwartaal). n = 3 voor de voertuig groep en n = 6 voor CP-en/of DS-behandelde groepen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Humane PBMC transplantatie en tumor engraftment. (A) schematisch diagram van de algemene workflow van het op PBMC gebaseerde gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is-model. B) tumor groei van A431 cellen bij subcutane co-injectie met donor PBMC met de aangegeven condities (gegevens staan voor het gemiddelde tumor volume ± SEM, n = 6). (C) IHC-analyse van tumoren die zijn ontwikkeld in muizen die met of zonder CP + DS zijn behandeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : PBMC donor en Human Cancer Cell line-scherm. (A) representatieve samenvattingsgegevens van het PBMC-donor scherm. PBMC werden gemengd met A431 cellen en subcutaan geënt in gehumaniseerde NOD/SCID muizen (zie stap 2). Elke stip vertegenwoordigt de gemiddelde gegevenswaarde van 3 muizen die zijn geënt met PBMCs van 1 donor. B) representatieve resultaten van het menselijk kanker cellijn scherm. PBMC van geselecteerde donoren werden samen geïnjecteerd met A431, SK-MES-1 of SKOV3 cellen. Gegevens vertegenwoordigt gemiddelde tumor volume ± SEM verzameld van 3 muizen, 14 dag na inoculatie van de aangegeven cellijnen. Gemiddelde IHC-Score ± SEM vertegenwoordigt de gemiddelde expressie van humane CD8, PD-1 en PD-L1 van alle 3 muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Anti-tumor activiteiten en farmacodynamische analyse van BGB-A317 in op PBMC gebaseerde gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is model. De anti-tumor activiteit van BGB-A317 bij aangegeven doses (i.p., QW) werd beoordeeld met behulp van menselijke kanker cellijnen (A) A431 (met 5 x 106 PBMC), (C) SKOV3 (met 5 x 106 PBMC), (D) SK-mes-1 (met 5 x 106 PBMC), en patiënt-afgeleide xenotransplantaten (pdxs) (E) bclu-054 (met 5 x 106 PBMC) en (F) BCCO-028 (met 5 x 106 PBMC). PBMC van geselecteerde gezonde donoren en bijbehorende tumorcellen werden subcutaan geïnjecteerd in gehumaniseerde NOD/SCID muizen (n = 8 tot 10). B) kwantificering van tumor Infiltrerende hCD8 + en HCD8 + HPD-1 + cellen in BGB-A317 behandeld A431 tumoren. n = 8-10 dieren per groep in A, en C tot F, n = 4-6 dieren per groep in B; gegevens staat voor gemiddelde ± SEM. De significantie werd geëvalueerd met behulp van een tweezijdige ongepaarde student t-toets onder de aanname van ongelijke variantie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze kennis van de ontwikkeling van kanker en progressie is aanzienlijk gevorderd in de afgelopen jaren, met de focus op een uitgebreid begrip van zowel de tumorcellen en de bijbehorende stroma. Het benutten van de immuunmechanismen van de gastheer kan een grotere impact op kankercellen veroorzaken, wat een veelbelovende behandelingsstrategie vertegenwoordigt. Murine modellen met intact muis immuunsysteem, zoals syngene en GEM modellen, zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van Checkpoint-gemedieerde immuniteit. Werkzaamheids beoordelingen met behulp van deze modellen zijn grotendeels afhankelijk van surrogaat anti-muis doelwit antilichamen13,14. Echter, inherente verschillen tussen menselijke en Murine immuun systemen en het ontbreken van sommige menselijke doelen in de Murine modellen beperken Preklinische studies van I-O anti-tumor effecten15,16. Daarom zijn robuuste Muismodellen die zowel menselijke immuuncellen als menselijke tumoren bevatten dringend gewenst, wat de vertaling en ontwikkeling van nieuwe I-O-Therapeutics aanzienlijk zal verbeteren.
Hier beschrijven we een humaan PBMC-gebaseerd xenotransplantaatmodellen is-muismodel dat mogelijk op grote schaal kan worden gebruikt voor translationele I-O-studies. PBMC donor en kanker cellijn/PDX schermen zijn essentieel om de robuustheid en reproduceerbaarheid van in vivo werkzaamheidsstudies te waarborgen. PBMC donoren werden in vivo gescreend om een succesvolle menselijke tumor en immuuncel engraftment te garanderen. Ondertussen, meer dan 50 cellijnen en PDXs van verschillende menselijke kanker oorsprong werden gescreend om te evalueren van de tumorgroei snelheid, menselijke PD-L1 expressie, en immuuncelinfiltraties. Onze analyses suggereren dat ongeveer 20% van de cellijnen van kanker en de PDXs onderzochten aanvaardbare tumorgroei snelheid, terwijl op hetzelfde moment met relatief hoge TILs en PD-L1-kleuring, die worden beschouwd als goede modellen voor I-O-werkzaamheids evaluaties.
HLA matching wordt routinematig gebruikt in de kliniek om patiënten en donoren te matchen voor orgaan-of merg transplantaties17. De auteurs hebben echter slechts een beperkte karakterisering op HLA-type uitgevoerd, en dit blijft een interessant onderwerp dat in toekomstige studies moet worden onderzocht. De auteurs willen graag dat een PBMC donor geschikt is voor één kankercel lijn/PDX, maar niet ideaal voor anderen. Daarom moeten PBMC-donoren mogelijk worden gescreend voor elk kanker model om optimale resultaten te garanderen.
Engraftment van menselijke PBMC in NOD/scid of NSG muizen leidt steevast tot een xenogene Graft-VS-host ziekte (xgvhd), een post-transplantatie stoornis die voortvloeit uit immuungemedieerde aanval van ontvangende weefsel door donor T cellen18,19. Klinische observaties die vaak geassocieerd worden met xGVHD zijn waargenomen in ons gehumaniseerd model, zoals erytheem, opgejakte houding, gewichtsverlies en sterfte (gegevens niet weergegeven). Deze fenotypes werden meestal waargenomen tegen het einde van onze studies, meestal op 1-2 maanden na engraftment, wat de voortplanting en infiltratie van menselijke T-cellen in xGVHD-doelorganen aangeeft. Dit maakt een venster van 1-2 maanden mogelijk voor therapeutische I-O therapie evaluaties. Verschillende benaderingen zijn gebruikt om te verminderen muis aangeboren immuniteit en verbetering van de menselijke immuuncel engraftment20,21. Bijvoorbeeld, NSG muizen defect in Murine MHC klasse I en klasse II expressie ondersteuning engraftment van functionele menselijke T cellen in de afwezigheid van acute xGvHD na injectie van PBMC22.
In dit protocol werden NOD/SCID-muizen gebruikt. Muizen homozygoot voor de SCID-mutatie hebben een verminderde ontwikkeling van T-en B-cellymfocyten en de NOD-achtergrond resulteert bovendien in gebrekkige natuurlijke Killer (NK)-cel functie20. Andere meer sterk immunodeficiënte muizen, zoals de NSG (het Jackson Laboratory), NCG (Charles River) en nog (CIEA) stammen, zijn vastgesteld. Bij het enenten met PBMCs zijn deze muizen aangetoond dat ze menselijke immuuncellen ontwikkelen en een omgeving vormen die lijkt op het menselijke immuunsysteem23,24. Als alternatief kunnen deze muizen worden geënt met CD34+ humane hematopoietische voorlopercellen (hpc's) en vertonen ze meer aanhoudende T-celdifferentiatie en rijping25. Daarnaast zijn de volgende generatie immunodeficiënte Muismodellen met verdere genetische modificaties vastgesteld om een betere menselijke myeloïde Lineage ontwikkeling en een verhoogde engraftment efficiëntie te ondersteunen (Raadpleeg de paginavarianten portfolio van de Jackson Laboratory en Taconic Biosciences).
Meer details over het gebruik van deze nieuwe stammen voor menselijke immuniteit reconstitutie zijn in afwachting van verdere onderzoeken. Niettemin, het protocol beschreven in dit artikel kan dienen als een algemene richtlijn van het vaststellen en karakteriseren van immunodeficiënte muizen modellen gereconstitueerd met menselijke PBMC. Drie menselijke kanker cellijnen en twee menselijke patiënt-afgeleide xenografts, die betrekking hebben op een reeks van kankersoorten, worden in dit artikel aangetoond, wat de potentiële brede toepassingen van ons protocol suggereert in translationele I-O-studies. Meest gehumaniseerde PBMC modellen, naar onze kennis, hebben IV of IP gekozen als de route van de injectie26,27. Onze modellen bieden in plaats daarvan gedeeltelijk gereconstitueerde menselijke immuniteit in humane tumor lager muizen door subcutaan vermenging van menselijke PBMC met kanker xenografts. Deze aanpak biedt een snel en rendabel, maar zeer reproduceerbaar alternatief voor volledige stamcel reconstitutie (bijv. CD34+ hematopoietische stamcel-engrafted muizen). Ons model is bewezen nuttig voor het evalueren van T cel-boeiende kanker immunotherapieën, met name bij het werken op korte tijdlijnen of om agenten te selecteren voordat u verhuist naar een meer complexe multi-Lineage immuniteit model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben eigendomsbelangen in BeiGene. Tong Zhang en Kang Li zijn uitvinders van een patent voor BGB-A317 beschreven in deze studie.
Acknowledgments
Wij danken de leden van onze laboratoria voor de nuttige besprekingen. Dit werk werd deels gesteund door het biomedische en Life Science Innovation and teelt research programma van de Beijing Municipal Science and Technology Commission in het kader van subsidieovereenkomst nr. Z151100003915070 (project "Preklinische studie over een roman immuun oncologie anti-tumor drug BGB-A317"), en het werd ook gedeeltelijk ondersteund door interne bedrijfsfinanciering voor preklinisch onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
