Summary
Vi beskriver et humant perifert blod mononukleære celle (PBMC)-baseret humaniseret xenograft musemodel for Translationel immuno-onkologiske forskning. Denne protokol kan tjene som en generel retningslinje for fastlæggelse og karakterisering af lignende modeller for I-O-terapi vurdering.
Abstract
Opdagelsen og udviklingen af immuno-onkologi (i-O) terapi i de seneste år udgør en milepæl i behandlingen af kræft. Men, behandling udfordringer fortsætter. Robuste og sygdoms relevante dyremodeller er vitale ressourcer til fortsat præklinisk forskning og udvikling med henblik på at imødegå en række yderligere immun kontrolpunkter. Her beskriver vi et humant perifert blod mononukleære celle (PBMC)-baseret humaniseret xenograft model. BGB-A317 (Tislelizumab), et forsøgs humant anti-PD-1-antistof i den sene kliniske udvikling, bruges som et eksempel til at diskutere platforms opsætning, model karakterisering og vurderinger af lægemiddel effektivitet. Disse humaniserede mus støtter væksten af de fleste humane tumorer testet, hvilket gør det muligt at vurdere i-O-terapier i forbindelse med både menneskelig immunitet og menneskelige kræftformer. Når etableret, vores model er forholdsvis tid-og omkostningseffektiv, og normalt give meget reproducerbare resultater. Vi foreslår, at den protokol, der er skitseret i denne artikel kunne tjene som en generel retningslinje for etablering af musemodeller rekonstitueret med human PBMC og tumorer for I-O forskning.
Introduction
Immuno-onkologi (I-O) er et hastigt ekspanderende felt af kræftbehandling. Forskere har for nylig begyndt at sætte pris på det terapeutiske potentiale af moduerende funktioner i immunsystemet til at angribe tumorer. Blokader af immun kontrolpunkt har vist opmuntrende aktiviteter i en række forskellige kræfttyper, herunder melanom, renal celle karcinom, hoved og hals, lunge, blære og prostatakræft1,2. I modsætning til målrettede terapier, der direkte dræber kræftceller, potenerer I-O-terapier kroppens immunsystem til at angribe tumorer3.
Til dato er der etableret talrige relevante I-O-dyremodeller. Disse omfatter: 1) muse tumorcellelinjer eller tumor Homograft i syngeneiske mus; 2) spontane tumorer afledt af genetisk manipuleret mus (perle) eller carcinogen-induktion; 3) chimeriske perler med Knock-in af human Drug Target (s) i en funktionel murine immunsystem; og 4) mus med rekonstitueret menneskelig immunitet transplanteret med humane kræftceller eller patient afledte xenografter (pdxs). Hver af disse modeller har indlysende fordele samt begrænsninger, som er blevet beskrevet og revideret udførligt andetsteds4.
Rekonstitution af menneskelig immunitet i immundefekt mus er blevet så meget mere værdsat som en klinisk relevant tilgang til translationel I-O-forskning. Dette opnås normalt gennem enten 1) engraftment af voksne immunceller (f. eks. perifert blod mononukleære celler (pmbc))5,6eller 2) engraftment af hæmatopoietiske stamceller (HSC) fra, for eksempel, navlestrengen blod eller føtal lever7,8. Disse humaniserede mus kunne støtte væksten af humane tumorer, hvilket gør det muligt at vurdere i-O-terapier i forbindelse med både menneskelig immunitet og menneskelige kræftformer. På trods af fordelene, blev anvendelser af humaniserede mus i i-O forskning normalt hæmmet af flere bekymringer, såsom lang modeludvikling tid og betydeligt høje omkostninger.
Her beskriver vi en human PBMC-baseret model, der kunne anvendes bredt til translationelle I-O-studier. Denne model er forholdsvis tids-og omkostningseffektiv med høj reproducerbarhed i effektundersøgelser. Det har været brugt in-House til evalueringer af flere I-O Therapeutics i øjeblikket under prækliniske og kliniske udvikling. BGB-A317 (Tislelizumab), et testpræparat humaniseret anti-PD-1 antistof9 , bruges som eksempel til at diskutere modeludvikling, karakterisering, og mulige anvendelser for anti-tumor effektanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der blev gennemført i undersøgelser med deltagelse af mennesker, var i overensstemmelse med de etiske standarder for BeiGene og/eller det nationale forskningsudvalg og med 1964 Helsingfors-erklæringen og dens senere ændringer eller tilsvarende etiske standarder. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle individuelle deltagere i undersøgelsen. Alle de procedurer, der blev udført i dyreforsøg, blev godkendt af det interne revisionsudvalg i BeiGene. Denne protokol er blevet specifikt justeret for vurderingen af BGB-A317 (Tislelizumab) i humaniserede NOD/SCID-mus.
1. etablering af human PBMC-baserede model
-
Myeloablation af NOD/SCID-mus ved hjælp af cyclophosphamid: bestemmelse af optimale doser
- Køb kvindelige NOD/SCID mus (6-8 uger).
Bemærk: Alle mus involveret i denne undersøgelse var kvinder. - Cyclophosphamid (CP) forberedes i forskellige doser (50, 100 og 150 mg/kg) i saltvand. Forbered disulfiram (DS) i 0,8% Tween-80 i saltvand ved 125 mg/kg.
Bemærk: forskellige koncentrationer af CP var parat til at muliggøre administration af lige store mængder af stof opløsning til mus, der fik forskellige doser af CP. - Behandl dyrene med CP (IP) og DS (p.o.) en gang dagligt i 2 dage. Giv DS (p.o.) 2 timer efter hver dosis CP.
Bemærk: DS nedsætter den urootoksicitet af CP i mus, og CP kombineret med DS er blevet foreslået at have længerevarende neutropeni end dyr behandlet med CP alene10 dosisregimet for CP skal muligvis forudbestemmes forud for egentlige studier og blev fundet at variere mellem forskellige immunodedygtige muse stammer. - Indsaml blodprøver fra den orbital venøse sinus, og overfør dem til EDTA-K-belagte rør på is på dag 0 (1 time førden 1. dosis), dag 2 (24 timer efter 2nd dosis) og dag 4 (72 h efter den 2nd dosis).
- Undersøge myeloablation-effekten efter behandling med CP og DS fra FACS. Brug rotte anti-Mouse CD11b (M1/70), rotte anti-Mouse Ly6C (HK 1.4,) og rotte anti-mus Ly6G (1a8) for gating CD11b+ Ly6Ghøjt som neutrofiler, CD11b+Ly6Chøjt som monocytter11,12.
- Optag kropsvægt og helbredstilstand af musene dagligt i en uge. Den optimale dosis af CP og DS bestemmes som det regime, der resulterer i maksimal nedbrydning af neutrofiler og monocytter uden at forårsage svær toksicitet for mus.
- Køb kvindelige NOD/SCID mus (6-8 uger).
-
Human PBMC transplantation og tumor engraftment: model set-up
- Isoler humane PBMCs fra raske donorer ved tæthed gradient centrifugering i henhold til producentens anvisninger.
- Forbehandl musene med CP og DS som angivet i trin 1.1.2 og 1.1.3 for at øge transplantations effektiviteten.
- 20 til 24 timer efter den anden dosis af CP og DS, injicere Human tumor cellelinje såsom A431 celler (ATCC, 2,5 x 106) og 5 x 106 isolerede pbmcs (blandet i alt 200 μl fosfat-BUFFERET saltvand (PBS) indeholdende 50% matrigel) , eller tumor fragmenter (3 x 3 x 3 mm3, i et samlet volumen på 200 μl PBS indeholdende 50% Matrigel) og 200 μl af 5 x 106 pbmcs (100 μl hver til venstre og højre side af indpodet tumor fragment) (s.c.) subkutant i højre flanke af dyrene.
- Mål primær tumorvolumen og Optag to gange om ugen i 4-6 uger.
Bemærk: Musene vil blive aflives, når deres kropsvægt taber over 20% eller deres tumorvolumen når 2.000 mm3 eller tumoren er ulcereret. - Euthanize musene i gaskamre med kuldioxid. Saml hele tumor væv i ofrede mus med oftalmisk saks og behandle dem for histologi og Immunhistokemi (IHC) analyse. Undersøge de humane CD8-, PD-1-og PD-L1-udtryk i disse væv. Se protokol trin 4.
2. skærmbilledet PBMC donor
- Skærm et panel af PBMC donorer på grund af de forventede variationer skyldes PBMCs indsamlet fra enkeltpersoner. Brug A431 celler til samtidig injektion med PBMCs fra forskellige donorer i henhold til procedurerne som angivet i trin 1,2.
Bemærk: Over 50 raske PBMC donorer blev screenet i studiet for at opnå nok antal egnede donorer. Forskere, der gerne vil vedtage denne protokol, kan selv bestemme, hvor mange raske PBMC-donorer der skal screenes, baseret på udformningen af de planlagte undersøgelser. - Overvåg tumorvolumen to gange om ugen ved at måle med en kaliber.
Bemærk: Tumor vækstrate kan variere med PBMC fra forskellige donorer. - Indsaml tumorvæv med et gennemsnitligt volumen på 200-500 mm3 og Behandl dem for histologi og Immunhistokemi (IHC) analyse. Undersøg humane CD8-, PD-1-og PD-L1-udtryk. Se trin 4 for detaljeret protokol.
- Vælg PBMC donorer, der resulterer i moderat tumorvækst (tumorvolumen > 200 mm3 14 dage efter inokulering) og relativt høje PD-1, PD-L1 og CD8 udtryk (gennemsnitlige IHC scorer > 2). Se trin 4 for detaljeret IHC scoring protokol.
3. Human Cancer Cell line og PDX Screen
- Skærm cellelinjer og PDXs i henhold til de procedurer, som er angivet i trin 1,2, at evaluere tumorvækst rate, humant PD-L1 udtryk for tumorer og immuncelle infiltrationer.
Bemærk: Over 30 humane kræft cellelinjer og over 20 PDXs af forskellige kræfttyper blev screenet af forfatterne. Data for udvalgte tumormodeller blev vist i resultat sektionen.
4. immun histokemi (IHC)
- Høst som angivet af trin 1.2.5 og Fix tumor væv ved at fordybe i formalin. Dehydrere og indkapsle fast væv i paraffin. Del det faste væv ved 3 μm og Placer dem på polylysinbelagte slides.
- Deparaffinize i xylener tre gange 7 min hver. Fugt afsnittene gennem graderede alkoholer: 100% ethanol to gange for 3 min hver, efterfulgt af 90%, 80% og 70% ethanol til gengæld for 3 min hver. Skyl med deioniseret H2O tre gange, og Fjern overskydende væske fra slidene.
- Udfør antigen hentning ved at placere diasene i en beholder og dække med 10 mM natriumcitrat buffer (pH 6,0) eller Tris-EDTA (pH 9,0). Opvarm dias beholderen med mikrobølger i 3 min. kog i et vandbad ved 95 °C i 30 minutter og afkøles derefter til stuetemperatur. Skyl med deioniseret H2O tre gange, og Aspirer overskydende væske fra slidene.
- Afsnittene med 3% bovint serumalbumin i PBS for 1 t og 0,3% H2O2 opløsning i PBS i 10 min. plet med antistoffer mod human CD8 (EP334), PD-1 (NAT105) og PD-L1 (E1L3N) ved 4 °c natten over og HRP konjugeret 2nd antistoffer ved rt for 1 h. drop substratet DAB (3, 3 '-diaminobenzidin) på slidene og styre reaktionstiden (sekunder til minutter) ved at overvåge den brune farve fra mikroskopet.
- Dæk slides med neutral balsam efter nedsænkes dias i 0,5% saltsyre alkohol og 0,5% ammoniak vand til gengæld for 5 s hver, derefter i 80%, 90% og 100% ethanol i rækkefølge for 3 min hver, og endelig i xylener ved hjælp af tre ændringer for 5 min hver. Detektere antistoffer ved at observere den brune farve af DAB ved hjælp af mikroskop.
Bemærk: Human CD8 og PD-1 udtryk på tumor-infiltrerende leukocytter (TIL) blev vurderet ved at tildele en Expression score på en 5-punkts skala (IHC score, Range 0-4) ved høj objektivforstørrelse (20x, 40x). 0, fraværende; 1, svag intensitet/mindre end 20% celler; 2, svag til moderat intensitet/20%-50% celler; 3, moderat til stærk intensitet/50%-80% celler; 4, stærk intensitet/mere end 80% celler. Humant PD-L1-farvning inden for tumorceller blev scoret ved hjælp af et justeret scoringssystem på en 5-punkts skala (IHC-score, Range 0-4) på grund af dets relativt spredte signal. 0, fraværende; 1, svag intensitet/mindre end 10% celler; 2, svag til moderat intensitet/10%-30% celler; 3, moderat/30%-50% celler; 4, stærk intensitet/mere end 50% celler.
5. in vivo effekt-og farmakodynamiske studier i Humanized PBMC-NOD/SCID xenograft-modeller
- Pre-Treat NOD/SCID mus som angivet af trin 1.1.3. Kort fortalt, behandle mus med 100 mg/kg CP (IP) og 125 mg/kg DS (p.o.) en gang om dagen i 2 dage.
- 20 til 24 timer efter den anden dosis injiceres subkutant (s.c.) med det indikerede antal humane kræftceller og 2,5-5 x 106 pbmcs (i alt 200 μl celle blanding i 50% Matrigel) i højre forreste flanke af dyr.
Bemærk: Antallet af PBMC, der anvendes til enhver individuel mus i en enkelt undersøgelse bør være den samme. Men på grund af variationer i tilgængeligheden af total isoleret PBMC på tidspunktet for hver undersøgelse, forfatterne har valgt at bruge 2,5 x 106, 4 x 106, eller 5 x 106 PBMC i forskellige undersøgelser. Selv om denne 2-fold forskel i den administrerede mængde PBMCs kan påvirke graden af menneskeliggørelse, forfatterne ikke observere væsentlige forskelle i vurderingen af anti-tumor effektivitet af de testede immunotherapies. - For PDXs engraftment injiceres subkutant tumor fragmenter (3 x 3 x 3 mm3) i højre forreste flanke af dyr. Indsprøjtes subkutant 200 μL 5 x 106 pbmcs (100 μl hver side) til venstre og højre for indpodet tumor fragment.
Bemærk: PDX tumor væv blev administreret i en Matrigel løsning, samme som beskrevet for cellelinje modeller. - På dagen for celle inokulation, tilfældigt gruppere dyrene og behandle som den planlagte forsøgsprotokol. Vurder anti-tumor aktivitet af kandidat medicin, BGB-A317 (QW, IP) i dette tilfælde, ved de angivne doser i forskellige tumormodeller.
Bemærk: De tre humane Cancer cellelinjer (dvs. A431 (epidemoid carcinoma), SKOV3 (ovariecancer) og SK-MES-1 (lungekræft)), samt to PDX-modeller (dvs. BCLU-054 (lungekræft) og BCCO-028 (tyktarmskræft)), betragtes som gode tumormodeller for I-O-terapi evaluering i denne humaniseret musemodel. - Mål primær tumorvolumen to gange hver uge, ved hjælp af en caliper.
Bemærk: Gand kropsvægt tab blev observeret omkring 4-6 uger post PBMC engraftment i vores undersøgelser, tillader en 1-2 måneder vindue for terapeutisk effektivitet evalueringer. - For farmakodynamik analyse af tumor infiltrerede immunceller, skær tumorvæv i små stykker og fordøje dem med kollagenase type I (1 mg/mL) og DNase I (100 μg/mL) i RPMI1640 plus 5% føtal kvægserum (FBS) i 30 min ved 37 °C. De Ford øjede væv passerer gennem 40 μm-celle-strainere for at opnå enkelt celle suspensioner.
- Vask cellerne og Juster celle nummeret til en koncentration på 1 x 107 celler/ml i ISKOLD FACS BUFFER (PBS, 1% FBS) i 96-godt rundt Bundplader. Cellerne vaskes ved centrifugering og blokering ved tilsætning af 20 μg/mL humant IgG i 30 minutter efterfulgt af farvning med anti-humane CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) og PD-1 (MIH4) antistoffer ved 4 °C i 30 min. Derefter underkastes de farvede prøver at flyde cytometri og analysere ved hjælp af guavaSoft 3.1.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de procedurer, der blev præsenteret her, blev en PBMC-baseret humaniseret xenograft-model med succes etableret. Kort fortalt blev CP-myeloablation i NOD/SCID-mus bestemt ved flow cytometri-analyse af neutrofile-og monocytpopulationer efter CP-og DS-behandling (figur 1). 100 mg/kg CP plus 125 mg/kg DS blev bestemt som den optimale dosis og anvendes i senere undersøgelser, da regimet resulterer i maksimal nedbrydning af neutrofiler og monocytter uden at forårsage svær toksicitet for mus. Næste, humane PBMC og tumor transplantation blev udført. Tilstedeværelsen af humane immuncelle infiltrater i tumor mikromiljøet blev verificeret af IHC (figur 2).
Et panel af PBMC donorer blev screenet in vivo for at sikre relativt høje immuncelle infiltrationer i tumor mikromiljø og acceptabel tumorvækst rate (punkt 2, figur 3A). I mellemtiden, over 30 humane Cancer cellelinjer samt over 20 PDXs af forskellige kræfttyper blev screenet for at evaluere tumorvækst rate, tumor PD-L1 udtryk og immuncelle infiltrationer (afsnit 3). Repræsentative resultater blev vist i figur 3B.
Disse PBMC-engraferede humaniserede mus blev derefter brugt til at undersøge den anti-tumor aktivitet af BGB-A317. Humane PBMCs fra udvalgte raske donorer blev co-injiceres med humane tumorceller (A431, SKOV3 og SK-MES-1) eller primære tumor vævs fragmenter afledt af cancerpatienter (BCCO-028 og BCLU-054) subkutant. Musene blev behandlet, som angivet i figur 4, med BGB-A317 eller PBS intraperitonealt en gang om ugen fra dagen for tumor implantation. I alle ovennævnte modeller udviste BGB-A317 betydelige antitumor aktiviteter (figur 4).
Figur 1 : Myeloablation af NOD/SCID-mus, som anvender cyclophosphamid (CP) og disulfiram (DS). A) gating-strategi, der anvendes til at identificere myeloid celle undersæt, herunder neutrofiler og monocytter. (B) repræsentative resultater af myeloid celle (CD11b+), neutrofile (CD11b+Ly6G+) og monocyt (CD11b+Ly6C+) tal efter forskellige doser af CP behandling. Kasserne repræsenterer de 75, 50 og 25 fraktil af værdierne. De øverste og nederste linjer repræsenterer de maksimale og minimale datapunkter inden for henholdsvis 1,5 x IQ (inter Quarter)-intervallet. n = 3 for køretøjs gruppen og n = 6 for CP-og/eller DS-behandlede grupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Human PBMC transplantation og tumor engraftment. (A) skematisk diagram, der viser den generelle arbejdsgang for PBMC-baseret humaniseret xenograft-model. (B) tumorvækst af A431 celler ved subkutan Co-injektion med donor PBMC med de angivne betingelser (data repræsenterer middel tumor volumen ± SEM, n = 6). C) IHC-analyse af tumorer, som er udviklet i mus behandlet med eller uden CP + DS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : PBMC donor og human Cancer Cell line skærm. A) repræsentative Sammenfattende data fra skærmen PBMC donor. PBMC blev blandet med A431 celler og inokuleret subkutant i humaniseret NOD/SCID-mus (Se trin 2). Hver prik repræsenterer den gennemsnitlige dataværdi på 3 mus, som er indpodet med Pbm'er fra 1 donor. (B) repræsentative resultater fra Human Cancer Cell line skærm. PBMC fra udvalgte donorer blev co-injiceres med A431, SK-MES-1 eller SKOV3 celler. Data repræsenterer middel tumorvolumen ± SEM indsamlet fra 3 mus, 14 dag post inokulation af de angivne cellelinjer. Mean IHC score ± SEM repræsenterer det gennemsnitlige ekspression af human CD8, PD-1, og PD-L1 af alle 3 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Anti-tumor aktiviteter og farmakodynamik analyse af BGB-A317 i PBMC-baseret humaniseret xenograft model. BGB-A317 antitumoraktivitet ved indikerede doser (IP, QW) blev vurderet ved hjælp af humane Cancer cellelinjer (A) A431 (med 5 x 106 PBMC), (C) SKOV3 (med 5 x 106 PBMC), (D) sk-MES-1 (med 5 x 106 PBMC), og patient afledte xenografter (pdxs) (E) bclu-054 (med 5 x 106 PBMC) og (F) bcco-028 (med 5 x 106 PBMC). PBMC fra udvalgte raske donorer og tilsvarende tumorceller blev co-injiceres subkutant i humaniseret NOD/SCID mus (n = 8 til 10). B) kvantificering af tumor Infiltrerende hCD8 + og HCD8 + HPD-1 + celler i BGB-A317 behandlet A431 tumorer. n = 8-10 dyr pr. gruppe i A og C til F, n = 4-6 dyr pr. gruppe i B; data repræsenterer gennemsnit ± SEM. Betydningen blev evalueret ved hjælp af en to-sidet uparret Student's t-test under antagelse af ulige varians. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores viden om kræft udvikling og progression har udviklet sig markant i de seneste år, med fokus på en omfattende forståelse af både tumorcellerne og dets associerede stroma. Udnyttelse af vært immun mekanismer kan fremkalde en større virkning mod kræftceller, der repræsenterer en lovende behandlingsstrategi. Murine modeller med intakt mus immun systemer, såsom og og Gem modeller, har været almindeligt anvendt til at studere check point-medieret immunitet. Virkningsvurderinger ved hjælp af disse modeller afhænger i høj grad af surrogat anti-mus Target antistoffer13,14. Men, iboende forskelle mellem menneskelige og murine immun systemer og manglen på nogle menneskelige mål i murine modeller begrænse prækliniske undersøgelser af i-O anti-tumor effekter15,16. Derfor, robuste musemodeller, der omfatter både humane immunceller og humane tumorer er presserende ønsket, som vil betydeligt forbedre oversættelsen og udviklingen af nye I-O Therapeutics.
Her beskriver vi en human PBMC-baseret xenograft-musemodel, der potentielt kan anvendes I meget høj grad til translationelle I-O-studier. PBMC donor samt Cancer Cell line/PDX skærme er afgørende for at sikre robusthed og reproducerbarhed af in vivo effektundersøgelser. PBMC donorer blev screenet in vivo for at sikre en vellykket menneskelig tumor og immuncelle engraftment. I mellemtiden, over 50 cellelinjer og PDXs af forskellige menneskelige kræft oprindelser blev screenet for at evaluere tumorvækst rate, humant PD-L1 udtryk, og immuncelle infiltrationer. Vores analyser tyder på, at omkring 20% af Cancer cellelinjer og PDXs undersøgt viser acceptabel tumorvækst rate, mens på samme tid har relativt høje TILs og PD-L1 farvning, som anses for gode modeller for I-O effektivitet evalueringer.
HLA matching bruges rutinemæssigt i klinikken til at matche patienter og donorer til orgel eller marv transplantationer17. Forfatterne, dog, har kun udført begrænset karakterisering på HLA skrive, og dette er stadig et interessant emne, der skal undersøges i fremtidige undersøgelser. Forfatterne vil gerne bemærke, at en PBMC donor kan være egnet til en kræft cellelinje/PDX, men ikke ideel til andre. Derfor skal PBMC donorer muligvis screenes for hver kræft model for at sikre optimale resultater.
Engraftment af human PBMC i NOD/scid eller NSG mus uvægerligt fører til en xenogene graft-vs-Host sygdom (xgvhd), en post-transplantation lidelse, der skyldes immunmedierede angreb af recipient væv af donor T celler18,19. Kliniske observationer, der almindeligvis forbindes med xgvhd, er blevet observeret i vores humaniserede model, såsom erythema, krumrygget kropsholdning, vægttab og dødelighed (data ikke vist). Disse fænotyper blev normalt observeret mod slutningen af vores studier, normalt ved 1-2 måneder efter engraftment, hvilket indikerer udbredelse og infiltration af humane T-celler i xGVHD målorganer. Dette giver mulighed for en 1-2 måneders vindue til terapeutiske I-O terapi evalueringer. Flere tilgange er blevet udnyttet til at mindske mus medfødte immunitet og øge menneskelige immuncelle engraftment20,21. For eksempel understøtter NSG-mus, der er defekte i murine MHC klasse I og klasse II-udtryk, engraftment af funktionelle humane T-celler i fravær af akut xGvHD efter injektion af PBMC22.
NOD/SCID-mus blev brugt i denne protokol. Mus homozygot for SCID-mutationen har svækket T-og B-cellernes lymfocyt udvikling, og NOD-baggrunden resulterer desuden i mangelfuld Natural Killer (NK) celle funktion20. Andre mere højt immundefekt mus, såsom NSG (Jackson Laboratory), NCG (Charles River) og NOG (CIEA) stammer, er blevet etableret. Når de er indpodet med pbm'er, er disse mus blevet vist udvikle humane immunceller og danne et miljø, der ligner det menneskelige immunsystem23,24. Alternativt kan disse mus indpodes med CD34+ humane hæmatopoietiske stamceller (hpcs) og vise mere vedvarende T Celledifferentiering og modning25. Desuden er næste generations immunodedygtige musemodeller med yderligere genetiske modifikationer blevet etableret for at understøtte bedre Human myeloid Lineage udvikling og øget engraftment effektivitet (Se varianterne portefølje webside af Jackson Laboratory og Taconic Biosciences).
Flere detaljer om brug af disse nye stammer for menneskelig immunitet rekonstitution afventer yderligere undersøgelser. Ikke desto mindre, den protokol, der er skitseret i denne artikel kunne tjene som en generel retningslinje for at etablere og kendetegnende immundefekt musemodeller rekonstitueret med human PBMC. Tre humane Cancer cellelinjer og to humane patient afledte xenografts, der dækker en række kræfttyper, er demonstreret i denne artikel, hvilket tyder på de potentielle brede anvendelser af vores protokol i translationelle I-O-undersøgelser. Mest humaniseret PBMC modeller, til vores viden, har valgt IV eller IP som injektions vejen26,27. Vores modeller giver i stedet delvist rekonstitueret menneskelig immunitet i humane tumor bærende mus gennem subkutant beundring af humant PBMC med kræft xenografts. Denne fremgangsmåde giver et hurtigt og omkostningseffektivt, men meget reproducerbart alternativ til fuld stamcelle rekonstitution (f. eks. CD34+ hæmatopoietisk stamcelle-indpodet humaniserede mus). Vores model har vist sig at være nyttig til at evaluere T Cell-engagerende Cancer immunotherapies, især når man arbejder på korte tidslinjer eller til at vælge agenter, før de flytter til en mere kompleks multi-Lineage immunitet model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ejerandel i BeiGene. Tong Zhang og Kang Li er opfindere på et patent, der dækker BGB-A317 beskrevet i denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af vores laboratorier for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev delvist støttet af biomedicin og Life Science innovation og dyrkning forsknings program af Beijing Municipal Science and Technology Commission under tilskudsaftale nr. Z151100003915070 (projekt "præklinisk undersøgelse af et nyt immun onkologiske anti-tumor-lægemiddel BGB-A317"), og det blev også delvist understøttet af intern virksomhedsfinansiering til præklinisk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | -- | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14 G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
References
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 1 Supplement 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
