Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التحقيقات الكهرولوجية من وظائف المشبك وCorticogeniculate

Published: August 7, 2019 doi: 10.3791/59680
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

هنا، نقدم بروتوكولات لإعداد شرائح الدماغ الحادة التي تحتوي على النواة الجينوسيلات الجانبية والتحقيق الكهرولوجيولوجي لوظيفة نقاط الاشتباك العصبي وcortinogeniculate. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي مع احتمال الإفراج العالي والإفراج المنخفض في نفس شرائح الدماغ الحادة.

Abstract

النواة الجانبية هي أول محطة ترحيل للمعلومات البصرية. الخلايا العصبية ترحيل هذه النواة الثلاميك دمج المدخلات من خلايا العقدة الشبكية والمشروع إلى القشرة البصرية. وبالإضافة إلى ذلك، تتلقى الخلايا العصبية التتابع الإثارة من أعلى إلى أسفل من القشرة. يختلف المدخلات المحفزة الرئيسية اثنين إلى الخلايا العصبية التتابع في عدة جوانب. تتلقى كل خلية عصبية ترحيل المدخلات من عدد قليل فقط من نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate، والتي هي محطات كبيرة مع العديد من مواقع الافراج. وينعكس هذا من الإثارة قوية نسبيا، والخلايا العصبية التتابع تلقي، من خلايا العقدة الشبكية. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي الكورسية المثلى هي أبسط مع عدد قليل من مواقع الإطلاق وقوة متشابكة أضعف. كما يختلف الاشتباك ان اثنين من المشابك في اللدونة على المدى القصير متشابك. المشابك retinogeniculate لديها احتمال الإفراج عالية وبالتالي عرض الاكتئاب على المدى القصير. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكولوكية لها احتمال إطلاق منخفض. تجتاز الألياف الكورتيكجينية الشبكية النوى الثالية الشبكية قبل دخول النواة الميكنولية الجانبية. تسمح المواقع المختلفة لنواة الثالاني الشبكية (الرترالي من النواة الجينوسيلات الجانبية) والمسالك البصرية (فينترو-أفقياً من النواة الميكنيوليت الجانبية) بتحفيز نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكانوجينية أو الشبكية على حدة مع أقطاب التحفيز خارج الخلية. وهذا يجعل النواة الجينية الجانبية منطقة الدماغ مثالية حيث اثنين من نقاط الاشتباك العصبي المحفزة مع خصائص مختلفة جدا ً التي تُسطّل على نفس نوع الخلية، يمكن دراستها في وقت واحد. هنا، ونحن نصف طريقة للتحقيق في تسجيل من الخلايا العصبية التتابع وإجراء تحليل مفصل لوظيفة متشابك retinogeniculate وcorticogeniculate في شرائح الدماغ الحادة. تحتوي هذه المقالة على بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد شرائح الدماغ الحادة من النواة جينيولات الجانبية وخطوات لتسجيل النشاط من الخلايا العصبية التتابع عن طريق تحفيز الجهاز البصري والألياف corticogeniculate بشكل منفصل.

Introduction

الخلايا العصبية ترحيل من النواة جينيولات الجانبية دمج ونقل المعلومات البصرية إلى القشرة البصرية. تتلقى هذه الخلايا العصبية مدخلات محفزة من الخلايا العقدية عن طريق نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate، والتي توفر محرك الأقراص المحفزالرئيسي للخلايا العصبية التتابع. وبالإضافة إلى ذلك، تتلقى الخلايا العصبية التتابع المدخلات المحفزة من الخلايا العصبية القشرية عن طريق نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate. وعلاوة على ذلك، تتلقى الخلايا العصبية التتابع المدخلات المثبطة من الخلايا العصبية المحلية والخلايا العصبية GABAergic من النواة reticularis thalami1. النواة reticularis الثالامي موجود ة مثل درع بين المهاد والقشرة بحيث الألياف إسقاط من القشرة إلى المهاد وفي الاتجاه المعاكس يجب أن تذهب من خلال نواة reticularis الثالامي2.

المدخلات retinogeniculate والمدخلات corticogeniculate عرض خصائصمتشابك متميزة 3،4،5،6،7،8. المدخلات Retinogeniculate تشكل محطات كبيرة مع مواقع إطلاق متعددة9،10. وعلى النقيض من ذلك، تعرض المدخلات corticogeniculate محطات صغيرة مع مواقع إطلاق واحدة7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate تدفع بكفاءة إمكانات العمل من الخلايا العصبية التتابع على الرغم من أنها تشكل فقط 5-10٪ من جميع نقاط الاشتباك العصبي على الخلايا العصبية التتابع3،8،11. من ناحية أخرى، تعمل نقاط الاشتباك العصبي Corticogeniculate، كمغير لانتقالات retinogeniculate من خلال التحكم في إمكانات الغشاء من الخلايا العصبية التتابع12،13.

هذه المدخلات المحفزة الرئيسية اثنين لترحيل الخلايا العصبية هي أيضا مختلفة وظيفيا. أحد الاختلافات البارزة هو الاكتئاب على المدى القصير من نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate وتسهيل قصيرة الأجل من نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate3،5،8. اللدونة على المدى القصير يشير إلى ظاهرة التي تتغير قوة متشابك عندما يكون متشابك نشطة مرارا وتكرارا في غضون فترة زمنية من بضعة مللي ثانية إلى عدة ثوان. احتمال إطلاق متشابك هو عامل مهم الكامنة وراء اللدونة على المدى القصير. وتبدي نقاط الاشتباك العصبي، مع احتمال إطلاق أولي منخفض، تيسيراً قصير الأجل بسبب تراكم Ca2+ في الpresynapse، وبالتالي لوحظ حدوث زيادة في احتمال الإطلاق عند تكرار النشاط. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي ذات الاحتمال العالي للإطلاق عادة ما تظهر الاكتئاب على المدى القصير بسبب استنفاد الحويصلات الجاهزة14. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إزالة الحساسية من مستقبلات المشاركات يساهم في اللدونة على المدى القصير في بعض نقاط الاشتباك العصبي احتمال الإفراج العالي8،15. ارتفاع احتمال الإطلاق وإزالة الحساسية من α-أمينو-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيسوكسازولبروبيونيك حمض (AMPA) مستقبلات تسهم في الاكتئاب على المدى القصير بارزة من نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate. وعلى النقيض من ذلك، فإن احتمال الإطلاق المنخفض يكمن وراء التيسير القصير الأجل لنقاط الاشتباك العصبي الكورتيكولوكية.

في الفئران، يدخل الجهاز البصري النواة الجينوليت الجانبية الظهرية (dLGN) من الموقع الكاودولتري، في حين تدخل الألياف الكورتيكوجينيكولات إلى الـ dLGN rostroventrally. وتسمح المسافة بين المدخلات بالتحقيق في الخصائص الفردية لمدخلات مختلفة جدا ً تُشدِّي على نفس الزنزانة. هنا، ونحن نبني على وتحسين طريقة تشريح وصفها سابقا التي يتم الحفاظ على ألياف retinogeniculate وcorticogeniculate في شرائح الدماغ الحاد3. نحن، إذن، نصف التحقيق الكهربائي الفسيولوجي للخلايا العصبية التتابعية وتحفيز ألياف الرطنة والألياف الكورتيكولوكية مع أقطاب التحفيز خارج الخلية. وأخيرا، نحن نقدم بروتوكول لملء الخلايا العصبية التتابع مع biocytin والتحليل التشريحي اللاحقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق الفريق الإشرافي الحكومي المعني بالتجارب الحيوانية في راينلاند بالاتينات على جميع التجارب.

1- الحلول

  1. حل التشريح
    1. للحد من السمية المنفعلة، وإعداد حل يستند إلى الكولين لاستخدامها أثناء تشريح كما هو معروض هنا (في MM): 87 كلوريد كلوريدكلوريد الضوضة، 2.5 كيلو كل، 37.5 كلوريد الكولين، 25 ناهكو 3، 1.25 NaH2PO4،0.5 CaCl 2، 7 MgCl2، و 25 جلوكوز. قم بإعداد حل التشريح قبل أقل من أسبوع واحد من التجربة.
  2. حل التسجيل
    1. إعداد السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) الحل الذي يحتوي على (في MM): 125 NaCl، 25 NaHCO3،1.25 NaH2PO4، 2.5 كيلو كل، 2 CaCl2،1 MgCl2،و 25 الجلوكوز. إضافة 50 ميكرومتر D-APV و 10 ميكرومتر 95531 هيدروبروميد لمنع N-ميثيل-D-أسبارتات (NMDA) وGABAA مستقبلات، على التوالي.
  3. الحل داخل الخلايا
    1. إعداد محلول داخل الخلايا يحتوي على (في MM): 35 Cs-غلوكونات، 100 CsCl، 10 HEPES، 10 EGTA، و 0.1 D-600 (ميثوكسيفيراباميل هيدروكلوريد). ضبط الحموضة إلى 7.3 مع CsOH. تصفية، aliquot، وتخزين حل الأسهم في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تشريح

  1. إعداد اثنين من غرف شريحة، واحدة منها مليئة 100 مل من حل تشريح والآخر مع 100 مل من حل التسجيل. وضع اثنين من الأكواب في حمام مائي (37 درجة مئوية) وفقاعة الحلول مع كاربوجين لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تشريح.
  2. ملء الكأس البلاستيك مع 250 مل من الجليد الباردة القريبة (ولكن ليس المجمدة) حل تشريح. فقاعة مع كاربوجين على الأقل 15 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. ملء طبق بيتري البلاستيك (100 مم × 20 ملم)، والتي سيتم إجراء تشريح الدماغ، مع حل تشريح الباردة. ضع قطعة من ورق الفلتر في غطاء طبق بيتري.
  4. تهدئة غرفة تشريح الاهتزاز.
  5. التخدير الماوس مع 2.5٪ isoflurane، على سبيل المثال، في قفص الماوس. بمجرد أن لا يستجيب الماوس لقرصة الذيل، قطع رأس الماوس بالقرب من medulla عنق الرحم وتزج الرأس في حل تشريح الجليد الباردة في قاعدة طبق بيتري.
  6. قطع جلد الرأس من المشدودإلى الأنف والحفاظ عليه أفقيا مع الأصابع لفضح الجمجمة. لإخراج الدماغ الأمامي، أولا قطع الجمجمة جنبا إلى جنب مع خط الوسط الخلفي الأمامي، ومن ثم قطع مرتين أخرى من خلال خياطة الإكليل وخياطة اللامبويد (الشكل1A).
  7. إزالة الجمجمة بين خياطة الإكليل وخياطة lambdoid بحيث يتم الكشف عن المخ. قطع لمبة الشم وفصل الدماغ الأمامي من الدماغ الأوسط مع شفرة غرامة (الشكل1B). إزالة الدماغ من الجمجمة مع ملعقة رقيقة ووضعها على ورقة فلتر في غطاء طبق بيتري.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 2.6 و2.7 في أسرع وقت ممكن للحد من موت الخلايا.
  8. للحفاظ على سلامة المدخلات الحسية والقشرية إلى dLGN في شريحة الدماغ، افصل نصفي الكرة الأرضية بقصّة طفيلية بزاوية3-5 درجة (الشكل1C,D). تجفيف الطائرات mediolateral من نصفي الكرة الأرضية عن طريق وضعها على ورقة فلتر ومن ثم الغراء لهم على مرحلة القطع بزاوية 10-25 درجة من المستوى الأفقي (الشكل1E).
  9. ضع المسرح في وسط صينية العازل المعدني وصب بلطف بقية محلول تشريح الجليد البارد في علبة العازلة. تنفيذ هذه الخطوة بعناية منذ صب قوي قد إزالة الدماغ لصق (الشكل1F).
  10. ضع صينية المخزن المؤقت في الدرج المملوء بالثلج، مما يساعد على الحفاظ على درجة الحرارة المنخفضة أثناء التشريح. قطع 250 درجة مئوية شرائح مع شفرة الحلاقة بسرعة 0.1 مم / ثانية وسعة 1 ملم.
  11. احتفظ بالشرائح في غرفة الانتظار المملوءة بمحلول تشريح المؤكسج عند درجة حرارة 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم اترك الشرائح تتعافى في محلول التسجيل عند درجة حرارة 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
  12. بعد الانتعاش، قم بإزالة غرفة عقد شريحة من حمام الماء والحفاظ على شرائح في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تستخدم في التجارب.

3. الفيزيولوجيا الكهربائية

  1. سحب الماصات باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات والساحبة خيوط. الحفاظ على مقاومة تسجيل الماصات عند MΩ 3−4. سحب الماصات تحفيز باستخدام نفس البروتوكول ولكن كسر غيض قليلا بعد سحب لزيادة القطر. ملء ماصات التسجيل مع الحل داخل الخلايا وbiocytin، في حين ملء الماصات تحفيز مع حل التسجيل.
  2. ضع الشرائح في غرفة التسجيل واغمر الشرائح باستمرار مع محلول التسجيل المؤكسج في RT. تحقق من جميع الشرائح وحدد تلك التي تعرض جهاز بصري سليم.
  3. تصور شريحة والخلايا مع المجهر تستقيم مجهزة الأشعة تحت الحمراء التباين التداخل التفاضلي (IR-DIC) مجهري الفيديو.
    ملاحظة: يتم تمييز الخلايا العصبية التتابع من الخلايا العصبية البينية من حجم ها أكبر سوما وأكثر dendrites الأولية (فروع الناشئة من سوما). بين الخلايا العصبية عرض مورفولوجيا ثنائي القطب مع سوما أصغر.
  4. ضع الماصة المحفزة على الشريحة قبل تصحيح الخلية باستخدام ماصة التسجيل. للتحقيق في نقاط الاشتباك العصبي الشبكية، ضع الماصة المحفزة مباشرة على الجهاز البصري، حيث يتم تجميع ألياف أكسون من خلايا العقدة الشبكية (الشكل2A). لتحليل نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate، ضع القطب تحفيز على النواة reticularis الثالامي، وهو rostroventrally المتاخمة لdLGN (الشكل2B).
  5. مرة واحدة يتم مغمورة ماصة التسجيل في حل التسجيل، وتطبيق خطوة الجهد 5 مل فولت لمراقبة مقاومة ماصة. تعيين إمكانية الاحتفاظ إلى 0 ملفي وإلغاء إمكانية الإزاحة بحيث يكون تيار الاحتفاظ 0 pA.
  6. الاقتراب من الخلية مع ماصة التسجيل أثناء تطبيق الضغط الإيجابي. عندما تكون الماصة في اتصال مباشر بغشاء الخلية، أطلق الضغط الإيجابي، وحرر إمكانية الاحتفاظ بـ -70 ملفولت. تطبيق ضغط سلبي طفيف للسماح لغشاء الخلية لنعلق على ماصة الزجاج بحيث أشكال ختم gigaohm (المقاومة > 1 GΩ). تعويض سعة ماصة وفتح الخلية عن طريق تطبيق نبضات الضغط السلبي.
  7. للتحقيق في وظيفة متشابك، وتطبيق 0.1 مللي ثانية البقول الحالية (حوالي 30 درجة مئوية) عن طريق ماصة التحفيز. إذا لم يتم ملاحظة أي استجابات متشابكة، قد تحتاج إلى استبدال الماصات تحفيز. كن حذرا أثناء وضع الماصات تحفيز إلى موقف مختلف بحيث لا يتم فقدان الخلية المسجلة.
    ملاحظة: في التسجيلات المثال ية المبينة في الشكل2، تم التحقيق في اللدونة القصيرة الأجل متشابك عن طريق تحفيز المسالك البصرية أو ألياف corticogeniculate مرتين مع 30 مللي ثانية بين الفترات التحفيز. تم حساب نسبة النبض المقترن (PPR) عن طريق تقسيم سعة التيار المحفز الثاني (EPSC) على أساس EPSC الأول (EPSC2/EPSC1). تم تكرار كل بروتوكول تحفيز 20 مرة. تم قياس السعة EPSC من التيارات المتوسطة من الاجتياحات 20. وكان الفاصل الزمني بين كل تكرار أقل 5 ثانية لتجنب اللدونة على المدى القصير الناجمة عن التكرار.
  8. مراقبة المقاومة سلسلة باستمرار عن طريق تطبيق خطوة الجهد 5-mV. استخدم الخلايا فقط مع مقاومة السلسلة أصغر من 20 MΩ للتحليل.

4. وضع العلامات البيوسيتوين

  1. الحفاظ على تكوين الخلية بأكملها لمدة 5 دقائق على الأقل للسماح بنشر السيتوتين في dendrites القاصي.
  2. بعد التسجيل، قم بإزالة الماصة برفق من الخلية بحيث لا يتم تدمير السوما.
    ملاحظة: إذا تم تسجيل أكثر من خلية واحدة على شريحة واحدة، يجب أن يكون somas الخاصة بهم بعيداً بما فيه الكفاية عن الخلايا المجاورة الخاصة بهم. تأكد من أن dendrites من خلايا مختلفة لا تتداخل مع بعضها البعض أثناء التصوير.
  3. إعداد لوحة ثقافة الخلية 24 جيدا. ملء كل بئر مع 300 درجة مئوية من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA). الحرص على عدم تلويث أي شيء مع PFA التي سوف تكون على اتصال مع الشرائح التي سيتم تسجيلها.
  4. نقل شرائح من غرفة التسجيل إلى لوحة تحتوي على PFA مع ماصة مطاطية وإصلاح شرائح بين عشية وضحاها. تأكد من أن يتم منع الماصات دائمًا من تلوث PFA.
    تحذير: دائما ارتداء القفازات واستخدام غطاء محرك السيارة الكيميائية عند التلاعب PFA.
  5. بعد تحديد شرائح بين عشية وضحاها في PFA، استبدال PFA مع محلول ملحي الفوسفات المخزنة (PBS). تخزين الشرائح في PBS في 4 درجة مئوية للمعالجة في المستقبل (أقل من 2 أسابيع).
  6. اغسل الشرائح بـ PBS الطازج 3 مرات (10 دقائق لكل غسل).
  7. منع مواقع ملزمة غير محددة عن طريق احتضان شرائح في حل حظر (0.2٪ غير الأيونية السطحي ة و 5٪ الزلال المصل البقري في PBS) لمدة 2 ساعة في RT على شاكر المداري.
  8. تجاهل حل الحظر. احتضان شرائح مع streptavidin-اليكسا 568 المخففة في حل حظر (1:1000) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر المدارية.
  9. تجاهل محلول الأجسام المضادة وغسل شرائح 3 مرات مع PBS لمدة 10 دقائق في RT على شاكر المدارية. اغسل الشرائح بماء الصنبور قبل التركيب.
  10. وضع شرائح من ماوس واحد على شريحة زجاجية واحدة. تأكد من وجود الخلايا الملونة على السطح العلوي للشرائح. امتصاص الماء حول شرائح مع الأنسجة ثم ترك شرائح لتجف لمدة 15 دقيقة تقريبا.
  11. تطبيق اثنين من قطرات من المتوسطة تصاعد على كل شريحة. جبل غطاء على الشريحة دون إنتاج فقاعات الهواء.
  12. تخزين الشرائح المسمى في 4 درجة مئوية بعد التصور مع المجهر البؤري.

5. التصوير الخلوي وإعادة الإعمار

  1. مسح شرائح مع المجهر البؤري واستخدام البرامج المرتبطة بها للتحليل.
  2. تثير الفلورة في 561 نانومتر.
  3. صورة الشرائح مع 0.7 فتحة رقمية (NA)، هدف الغمر النفط.
  4. اضبط الخلية المستهدفة في منتصف العرض وطبق تكبير2.5 مرة.
  5. تقديم مجموعات البيانات Z-كومة لمسح الخلايا العصبية بأكملها مع المعلمات التالية: تنسيق = 2,550 × 2,550 بكسل, تردد المسح الضوئي = 400 هرتز, z رقم = حجم 40.Voxel كان حول 0.1211 × 0.1211 × 1.8463 μm3.
  6. تتبع الخلايا العصبية شبه تلقائيا باستخدام برنامج إعادة بناء الخلايا العصبية (على سبيل المثال، NeuroStudio). يظهر مثال على الخلايا العصبية ترحيل تتبع 3D في الشكل 3B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر إعداد شريحة dLGN التي تحتوي على مسارات retinogeniculate وcorticogeniculateتحت هدف 4X (الشكل 2). Axons من خلايا العقدة الشبكية حزمةمعا في الجهاز البصري (الشكل 2). تم وضع الماصة المحفزة على الجهاز البصري للحث على إعادة المشبك بوساطة التيار (الشكل2A)وعلى النواة reticularis thalami للحث على الكُرَكة المتشابكة بوساطة الحالية (الشكل2B)،على التوالي. وتجدر الإشارة إلى أن المحاور من الخلايا العصبية القشرية إلى مشاريع الخلايا العصبية LGN من القشرة إلى المهاد تجتاز النواة reticularis thalami. يمكن، لذلك، تنشيط نقاط الاشتباك العصبي Corticogenicluate عن طريق التحفيز في النواة reticularis الثالامي.

نسبة النبض المقترن من ربحية السهم التي تتوسط فيها مستقبلات AMPA أقل من 1 عند تحفيز الجهاز البصري مع فاصل زمني بين التحفيز 30 مللي ثانية، ولكن فوق 1 عند تحفيز الألياف corticogeniculate مع نفس الفاصل الزمني بين التحفيز (الشكل2C،D) . ويرجع الاكتئاب النبض المقترن من نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate إلى احتمال الإفراج عن الحويصلة عالية وإزالة الحساسية من مستقبلات AMPA postsynaptic. إن تيسير النبض المقترن لنقاط الاشتباك العصبي الكورتيكولوكية يتسق مع احتمال إطلاق الحويصلات المنخفضة16.

الشكل 3A يظهر صورة IR-DIC تظهر سوما من الخلايا العصبية ترحيل dLGN جنبا إلى جنب مع غيض من ماصة التصحيح. تلطيخ البيوسيتوين تمكننا من الحصول على وجهة نظر من الخلايا العصبية المسجلة. مختلفة عن الخلايا العصبية البينية، التي لديها مورفولوجيا ثنائي القطب، والخلايا العصبية التتابع لديها الأشجار التقشرية متعددة الأقطاب (الشكل 3B)التي تحتوي على أكثر من 3 dendrites الأولية8،17. ثم تم إنشاء ثلاثي الأبعاد (3D) لإعادة بناء الخلايا العصبية التتابع ية المسمى بالبيوتين مما يظهر بنية dendritic متناظرة شعاعيا (الشكل3C).

Figure 1
الشكل 1 المخططات التي تمثل بروتوكول التشريح. (أ) عرض أفقي لجمجمة الماوس، مما يدل على موضع التخفيضات الأولية. تم إجراء أول قطع جنبا إلى جنب مع خياطة sagittal، تليها قطعتين أخرى جنبا إلى جنب مع خياطة الإكليل وخياطة lambdoid، على التوالي. تمثل الخطوط المتقطعة الشقوق. (ب) عرض المترهل من الدماغ كله. خطوط متقطعة تشير إلى أن المخ معزولة من لمبة الشم ومنتصف الدماغ. (C-D) تُظهر هذه اللوحات زاوية القطع الأولى لفصلنصفي الكرة عن المنظر الأفقي ( C) والإكليل (D) على التوالي. (E) نظرة الإكليل ية لنصف الكرة الأرضية على مرحلة القطع. تشير الخطوط المتقطعة إلى اتجاه التقطيع. ل، م، د، و الخامس تمثل الجوانب الجانبية، الوسيطة، الظهرية والبطنية، على التوالي، لنصف الكرة الأرضية في اللوحتين D و E. (F) رسم بياني لغرفة التشريح مع نصفي الكرة الأرضية على مرحلة القطع. يشير السهم المتقطع إلى الاتجاه المتحرك لشفرة القطع. أ، ع، و د تمثل الجوانب الأمامية، الخلفية، والظهرية من نصف الكرة الأيسر، على التوالي. (ز) مخطط يمثل شريحة قطع بشكل صحيح مع جزء كبير نسبيا من dLGN والحفاظ على سليمة من المسالك البصرية. dLGN، نواة جينيولات جانبية دورسال. vLGN، النواة الجانبية البطنية. OT، لمبة الشم؛ NRT، نواة reticularis الثلامي. تم تعديل الألواح C و D و G من الشكل 1 من تيرنر والملح3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 إعداد شريحة من dLGN تحتوي على مسارات retinogeniculate وcorticogeniculate والتسجيلات سبيل المثال. (A-B) تُظهر هذه اللوحات شريحة dLGN مع الحفاظ على المدخلات الرطنة والكورتيكولوكلات. تم وضع قطب التحفيز على الجهاز البصري لتنشيط نقاط الاشتباك العصبيالشبكية (A) وعلى النواة reticularis الثالامي لتنشيط نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate (B). (C) AMPA مستقبلات بوساطة EPSCs استجابة لتحفيز الجهاز البصري مرتين مع 30 مللي ثانية الفاصل بين التحفيز. (د) التيارات المشبك corticogeniculate بوساطة مع 30 مللي ثانية الفاصل بين التحفيز. تمت إزالة القطع الأثرية التحفيز للوضوح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 تحليل مورفولوجي للخلية العصبية التتابعية. (A) صورة IR-DIC تظهر سوما من الخلايا العصبية ترحيل dLGN مع غيض من ماصة التصحيح. (B) صورة Confocal من الخلايا العصبية التتابع المسمى مع biocytin وتصور مع streptavidin-اليكسا 568. (C) إعادة بناء ثلاثي الأبعاد (3D) من نفس الخلايا العصبية، مما يدل على بنية dendritic متناظرة شعاعيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن نصف بروتوكول محسن ة استنادا ً إلى الطريقة3المنشورة سابقاً ، والذي يسمح بالتحقيق في احتمال كبير لإطلاق نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate وانخفاض احتمال إطلاق نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate من نفس الشريحة. هذا هو ذو أهمية كبيرة لأن هذه المدخلات اثنين تتفاعل مع بعضها البعض لتعديل انتقال الإشارات البصرية: المدخلات retinogeniculate هي الدافع الرئيسي للإثارة من الخلايا العصبية التتابع، في حين أن المدخلات القشرية تعمل كمغير، والتي يؤثر على كسب انتقال retinogeniculate من خلال التأثير على حالة الخلايا العصبية التتابع. كما هو متوقع، لاحظنا أن retinogeniculate ونقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate عرض اللدونة قصيرة الأجل مختلفة بسبب الفرق في احتمالات الإفراج عنهم. بالإضافة إلى ذلك، فإن إزالة الحساسية مستقبلات AMPA يساهم أيضا في الاكتئاب القوي في نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate9،15،16. لقد أظهرنا مؤخرا أن الاكتئاب على المدى القصير هو التضمين من قبل CKAMP4416، وهو بروتين مساعد مستقبلات AMPA من عائلة CKAMP الذي يبطئ الانتعاش من إزالة الحساسية من مستقبلات AMPA18،19، 20.وعلاوة على ذلك، retinogeniculate متشابك بوساطة السعة الحالية هي أعلى من تلك التي من التيارات corticogeniculate متشابك بوساطة تحت نفس قوة تحفيز، بما يتفق مع المشابك retinogeniculate كبيرة مع متعددة مواقع الافراج، وصغيرة نسبيا المشابك corticogeniculate7،21.

بروتوكول التقطيع هو أساسا نفس واحد التي وضعتها تيرنر والملح3. بعض التعديلات التي استندت إلى تجربتنا تحسين نوعية شريحة. على غرار Hauser وآخرون22, استخدمنا على أساس الكولين بدلاً من حل تشريح يستند إلى السكروز. تم الانتعاش بعد تشريح في 34 درجة مئوية في حل القطع لمدة 30 دقيقة ثم في حل التسجيل لمدة 30 دقيقة أخرى وليس في درجة حرارة الغرفة. وكانت الشرائح أرق قليلا (250 ميكرومتر بدلا من 400 ميكرومتر). قمنا بتشريح العقول باستخدام إسفين بزاوية 10-25 درجة، مما يسهل ويزيد من موثوقية إجراء التقطيع.

تسجيل والتحفيز شروط للتحقيق في ترحيل الخلايا العصبية متشابك وظيفة هي أساسا نفس ما سبق وصفه من قبل تشن وRegehr8. تنشيط ألياف المسالك البصرية عادة ما يثير تيارات كبيرة ويمكن أن يكون في نطاق عدة nA عندما يتم تنشيط جميع نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate على الخلايا العصبية ترحيل واحد23. لمنع أخطاء المقاومة سلسلة، وخاصة عند التحقيق في التيار الأقصى عن طريق تفعيل جميع نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate على الخلايا العصبية ترحيل واحد، استخدم تشن وRegehr تسجيل الماصات المقاومة المنخفضة (<2 MΩ). ومع ذلك، للتحقيق في اللدونة القصيرة الأجل متشابك، يكفي لتنشيط واحد أو عدد قليل من محاور الخلايا العقدية الشبكية، مما يثير التيارات التي هي في نطاق 34-579 pA (النتائج غير المنشورة، تشن وآخرون). وبالتالي، يمكن استخدام الماصات الصغيرة التي تتراوح مقاومتها بين 3-4 MΩ عند التحقيق في وظيفة المشبك الرطنبي باستخدام تحفيز ضعيف للجهاز البصري. تفعيل نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate يثير تيارات صغيرة نسبيا16. أخطاء مقاومة سلسلة هي، لذلك، مشكلة أصغر عند التحقيق في وظيفة متشابك corticogeniculate.

نحن هنا نظهر أن تحفيز نقاط الاشتباك العصبي وcorticogeniculate يمكن استخدامها للتحقيق في اللدونة على المدى القصير من التيارات مستقبلات AMPA بوساطة. ويمكن تطبيق نفس البروتوكول لتسجيل NMDA مستقبلات بوساطة الحالية24. في الواقع، واحدة من المؤشرات الأولى التي تسهم إزالة الحساسية مستقبلات AMPA في اللدونة على المدى القصير في نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate جاءت من التجارب التي تم مقارنة نسب النبض المقترن ة من التيارات مستقبلات AMPA بوساطة مع نسب النبض المقترن من التيارات مستقبلات NMDA بوساطة. وقد حفزت نقاط الاشتباك العصبي Corticogeniculate عن طريق تحديد موقع ماصة التحفيز في النواة reticularis الثالامي لأن محاور الخلايا العصبية القشرية التي تثير الخلايا العصبية التتابع dLGN السفر عبر هذه النواة الثالامية. نفس موقف التحفيز يمكن استخدامها لدراسة التيارات المثبطة متشابك في dLGN كما هو مبين على سبيل المثال من قبل Govindaiah وكوكس25.

الخلايا العصبية ترحيل التعبير عن مستقبلات GABAA و GABAB. الافراج عن GABA ينشط مستقبلات GABAA متشابك. يتم تنشيط مستقبلات GABA B، والتي يتم توطينها بشكل خارج المتلازمة، عندما يتم تنشيط نواة reticularis thalami بقوة على سبيل المثال خلال انفجار اطلاقالنار 26،27،28. انتشار GABA, الذي عادة ما يكون مقيدا بسبب تناول GABA من قبل الخلايا النجمية, يمكن تنشيط خلال تنشيط متشابك مكثفمستقبلات GABAB extrasynaptic27,28. لم نمنع مستقبلات GABAB لأن كثافة التحفيز والتردد كانت منخفضة نسبيا. ومع ذلك, عند التحقيق في وظيفة متشابك corticogeniculate باستخدام بروتوكولات التحفيز المكثف قد يكون من الأفضل إضافة مستقبلات GABA B.

يمكن إجراء تسجيلات الخلايا العصبية التتابع dLGN بسهولة عند استخدام الشرائح التي هي ما يقرب من 2 مم الوسائط من السطح الجانبي للدماغ (بدء جمع ما يقرب من 8عشر من شرائح 250 درجة مئوية أثناء إجراء القطع). في بعض الشرائح، لا يمكن الكشف عن كل من المدخلات إلى الخلايا العصبية ترحيل معينة لأن أحد المسارين قطعت قريبة من الخلايا العصبية التتابع. في هذه الحالة، عادة ما يكون من الممكن التحقيق في نقاط الاشتباك العصبي وcorticogeniculate في نفس الشريحة عن طريق اختيار الخلايا العصبية التتابع مختلفة لكل مدخلات. لتسجيل retinogeniculate متشابك بوساطة الحالية، يتم اختيار الخلايا العصبية التتابع تقع فينترالي منذ ألياف المسالك البصرية لهذه الخلايا يتم الحفاظ عليها على الأرجح مما كانت عليه في الخلايا العصبية التتابع تقع الظهري. وعلى النقيض من ذلك، يتم الحفاظ على المدخلات corticogeniculate على الأرجح على الخلايا العصبية التتابع التي تقع dorsally في dLGN.

تحدد جودة الشريحة موثوقية البيانات. استنادا إلى تجربتنا، والمعلمات التالية ضرورية لضمان نوعية شريحة جيدة. التبريد والأوكسجين هما عاملان مهمان أثناء إجراء التشريح. يجب أن يبقى رأس الماوس في حل الباردة مباشرة بعد قطع رأس الماوس. عند إخراج الدماغ من الجمجمة، ينبغي أن تكون مغمورة في محلول الجليد البارد ة كل 3 إلى 4 ثوان من أجل الحد من موت الخلايا. وبالمثل، ينبغي إجراء عملية التقطيع عند حوالي 4 درجات مئوية. وعلاوة على ذلك، يجب أن يكون الأوكسجين حل تشريح وتسجيل ما لا يقل عن 15 دقيقة قبل استخدامها للحفاظ على تركيز الأكسجين كافية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن حجب قنوات الصوديوم بكفاءة الحد من نشاط الخلايا العصبية. ولذلك, تم استخدام حل تشريح تحتوي على 37.5 الكولين مليمول.

الخلايا العصبية ترحيل عرض المسامير عتبة منخفضة، والتي يتم إنشاؤها من قبل العابر ة2 + الحالي29. لمنع الجهد بوابات Ca2 +-channels، أضفنا D-600 (ميثوكسيفيراباميل) إلى الحل داخل الخلايا. لا ينبغي استخدام D-600 إذا كان الغرض من الدراسة هو التحقيق في المسامير عتبة منخفضة في الخلايا العصبية التتابع. وتتأثر دقة التسجيلات المشبك الجهد كامل الخلية من أخطاء المشبك الفضاء. هذه المشكلة التقنية هي أكثر أهمية للمدخلات التي هي بعيدة عن القطب التسجيل (وبالتالي لنقاط الاشتباك العصبي البعيدة)30،31. لتقليل تأثير خطأ المشبك الفضائي، استخدمنا حل ًا داخل الخلايا يستند إلى Cs+بدلاً من حل داخل الخلايا القائم على K+. القنوات التي هي K+ نفاذية (على سبيل المثال، قنوات التسرب) وعادة ما تكون Cs+ غير قابلة للنفاذ32. وهكذا، فإن استخدام محلول داخل الخلايا المستندة إلى Cs+يزيد من مقاومة الخلية.

تسجيل المشبك التصحيح مستقرة يعتمد على اختيار الخلايا السليمة. وينبغي تجنب الخلايا العصبية مع شكل سوما جولة، اللون الداكن أو سوما منتفخة. وعلاوة على ذلك، يتم تمييز الخلايا العصبية التتابع من الخلايا العصبية المحلية من حجم ها أكبر سوما وأكثر تفصيلا الأشجار التقشرية الأولية. لذلك، اخترنا الخلايا التي لديها حجم أكبر سوما (أكبر من 15 ميكرومتر في القطر) ومورفولوجيا غير ثنائي القطب. الخلية المثال هو مبين في الشكل 3B لديه بنية dendritic متناظرة، وبالتالي، يمكن تصنيفها على أنها الخلايا العصبية التتابع تشبه الخلايا العصبية Y التي توجد على سبيل المثال في القط LGN17.

يجب أن تكون مقاومة السلسلة صغيرة قدر الإمكان وتحافظ على ثباتها. وعلاوة على ذلك، وبما أن المدخلات من اتجاهين يتم الاحتفاظ بها في شريحة واحدة، فمن المهم التخلص من التداخل بين المدخلات اثنين. لتجنب تنشيط ألياف corticogeniculate عند تسجيل التيارات retinogeniculate متشابك بوساطة أو العكس بالعكس، لا ينبغي وضع ماصة تحفيز في dLGN والمسافة بين تحفيز وتسجيل ماصة ينبغي أن يكون بقدر ما الممكن. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المسافة الطويلة بين تحفيز وتسجيل الماصات تتطلب الحفاظ على محور عصبي سليم نسبياً. لذلك، يجب تحديد زاوية قطع مناسبة للتشريح. بشكل عام، يمكن الحصول على شريحة واحدة أو قطعتين فقط مع الحفاظ على اثنين من المدخلات من كل نصف الكرة الأرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) في مركز البحوث التعاونية (SFB) 1134 "الفرق الوظيفية" (J.v.E. و X.C.) ومنحة البحوث EN948/1-2 (J.v.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
  2. Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
  3. Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).
  4. Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
  5. Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
  6. Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
  7. Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
  8. Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28, 955-966 (2000).
  9. Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
  10. Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
  11. Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
  12. Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. , (1997).
  13. Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
  14. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).
  15. Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
  16. Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
  17. Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
  18. von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
  19. Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
  20. Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
  21. Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
  22. Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
  23. Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
  24. Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
  25. Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
  26. Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
  27. Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
  28. Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
  29. Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
  30. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  31. White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
  32. Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).

Tags

هذا الشهر في JoVE، العدد 150، نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate، نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate، اللدونة على المدى القصير، التصحيح المشبك، dLGN، علم الأعصاب
التحقيقات الكهرولوجية من وظائف المشبك وCorticogeniculate
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von… More

Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter