Summary
여기에서, 우리는 측방 geniculate 핵을 포함하는 급성 두뇌 조각의 준비를 위한 프로토콜 및 망막 생성 성 및 코르티코겐iculate 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사를 제시합니다. 이 프로토콜은 동일한 급성 뇌 슬라이스에서 높은 방출 및 낮은 방출 확률로 시냅스를 연구하는 효율적인 방법을 제공합니다.
Abstract
측면 지네아루스 핵은 시각적 정보를 위한 첫 번째 릴레이 스테이션입니다. 이 thalamic 핵의 릴레이 뉴런은 망막 신경절 세포에서 입력을 통합하고 시각적 피질에 투영. 또한, 릴레이 뉴런은 피질에서 하향식 여기를 받습니다. 릴레이 뉴런에 대한 두 가지 주요 흥분제 입력은 여러 측면에서 다릅니다. 각 릴레이 뉴런은 많은 방출 부위가있는 큰 말단인 몇 가지 레티노 제니쿠레이트 시냅스로부터 입력을 받습니다. 이것은 비교적 강한 흥분에 의해 반영되고, 중계 뉴런은 망막 신경절 세포로부터 수신한다. 코르티코제닉시냅스는 대조적으로 방출 부위가 거의 없고 시냅스 강도가 약하여 더 간단합니다. 두 시 냅 스는 또한 그들의 시 냅 스 단기 가소성에서 다릅니다. Retinogeniculate 시 냅 스는 높은 릴리스 확률을 가지고 있으며, 결과적으로 단기 우울증을 표시. 대조적으로, 코르티코제닉시냅스는 낮은 방출 확률을 가지고 있다. 코르티코제네레이트 섬유는 측방 지네큘러 핵에 들어가기 전에 망상 탈라믹 핵을 통과합니다. 망상 탈라믹 핵의 다른 위치 (측면 geniculate 핵에서 rostrally) 및 광학 기관 (측면 geniculate 핵에서 벤트로-측면) 자극 코르 티 코 겐 iculate 또는 망막 시 냅 스를 별도로 허용 세포외 자극 전극. 이것은 측방 geniculate 핵을 동일 세포 모형에 충돌하는 아주 다른 속성을 가진 2개의 흥분성 시냅스가 동시에 공부될 수 있는 이상적인 두뇌 지역, 만드는. 여기서, 우리는 중계 뉴런으로부터의 기록을 조사하고 급성 뇌 슬라이스에서 망막생성 및 코르티코겐시냅스 기능에 대한 상세한 분석을 수행하는 방법을 설명한다. 이 문서는 측면 지네큘러 핵의 급성 뇌 슬라이스의 생성을 위한 단계별 프로토콜과 광학 관 및 코르티코겐섬유 섬유를 별도로 자극하여 릴레이 뉴런으로부터의 활성을 기록하는 단계를 포함합니다.
Introduction
측면 지네알 핵의 릴레이 뉴런은 시각적 인 피질에 시각적 정보를 통합하고 중계합니다. 이 뉴런은 중계 뉴런에 대한 주요 흥분 성 드라이브를 제공하는 망막 시냅스를 통해 신경절 세포에서 흥분성 입력을받습니다. 또한, 릴레이 뉴런은 코르티코겐시냅스를 통해 피질 뉴런으로부터 흥분성 입력을 받습니다. 더욱이, 릴레이 뉴런은 핵 망상 증액액의 국소 인터뉴런 및 GABAergic 뉴런으로부터 억제 입력을 수신1. 핵 망상 thalami는 시상과 피질 사이의 방패처럼 존재하여 피질에서 시상으로 투영되는 섬유와 반대 방향으로 는 핵 망상 탈라미 2를통과해야합니다.
망막 생성 입력 및 코르티코 제닉 입력은 뚜렷한 시냅스 속성을 표시3,4,5,6,7,8. 망혈구 입력은 여러 릴리스 사이트9,10큰 단자를 형성한다. 대조적으로, 코르티코제닉산성 입력은 단일 방출 사이트7을 가진 작은 단자를 표시합니다. 또한, 레티노제니쿠레이트 시냅스는 릴레이 뉴런에 대한 모든 시냅스의 5-10%만을 구성하고 있음에도 불구하고 릴레이뉴런의 작용 전위를 효율적으로 구동3,8,11. 코르티코제네레이트 시냅스는, 한편, 릴레이 뉴런의 막 전위를 조절함으로써 망막 광세포 전달의 조절제로서12,13.
뉴런을 릴레이하는 이 두 가지 주요 흥분성 입력도 기능적으로 다릅니다. 한 가지 눈에 띄는 차이점은 망막 광석 시냅스의 단기 우울증과 코르티코 겐 이시 냅 스 3,5,8의단기 촉진입니다. 단기 가소성은 시냅스가 몇 밀리초에서 몇 초 까지의 기간 내에 반복적으로 활성화될 때 시냅스 강도가 변하는 현상을 말합니다. 시냅스 방출 확률은 단기 가소성의 근본적인 중요한 요소입니다. 시냅스는 초기 방출 확률이 낮으며, presynapse에서 Ca2+의 축적으로 인한 단기 촉진을 표시하고 결과적으로 반복된 활성에 따라 방출 확률의 증가가 관찰됩니다. 대조적으로, 높은 방출 확률을 가진 시냅스는 일반적으로 준비-releasable 소포의 고갈때문에 단기 불경기를 표시합니다14. 또한, 후성 내피 수용체의 둔감은 일부 고방출 확률 시냅스8,15에서단기 가소성에 기여한다. α-아미노-3-하이드록시-5-메톡사졸프로피온산(AMPA) 수용체의 높은 방출 확률 및 둔감은 망염성 시냅스의 눈에 띄는 단기 우울증에 기여한다. 대조적으로, 낮은 방출 확률은 코르티코겐산 시냅스의 단기 촉진의 기초가 됩니다.
마우스에서, 광관은 척추 측질 부위로부터 등측 지네알 핵(dLGN)으로 진입하는 반면, 코르티코겐 섬유는 dLGN 로스트로벤터리로 들어간다. 두 입력 사이의 거리를 통해 동일한 셀에 충돌하는 두 개의 매우 다른 흥분성 입력의 개별 속성을 조사할 수 있습니다. 여기서, 우리는 망막 광염 및 코르티코겐산 섬유가 급성 뇌 슬라이스3에보존되는 이전에 설명한 해부 방법을 구축하고 개선합니다. 우리는, 그 때, 세포외 자극 전극을 가진 망막 성 질 및 코르티코겐화 섬유의 릴레이 뉴런및 자극의 전기 생리학 조사를 기술합니다. 마지막으로, 우리는 생체 시틴 및 후속 해부학 적 분석으로 릴레이 뉴런을 채우는 프로토콜을 제공합니다.
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Protocol
모든 실험은 라인란트 팔츠의 동물 실험에 대한 정부 감독 패널에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션
- 해부 솔루션
- 흥분독성을 줄이기 위해, 여기에 제시된 바와 같이 해부 중에 사용되는 콜린 계용액을 준비(mM) : 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 콜린 염화물, 25 NaHCO3,1.25 NaH2PO4,0.5 CaCl2,7 MgCl2, 및 25 포도당. 실험 1주일 전에 해부를 준비한다.
- 레코딩 솔루션
- (mM에서) 포함 된 인공 뇌척수액 (ACSF) 용액을 준비하십시오 :125 NaCl, 25 NaHCO 3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl2,1 MgCl2,및 25 포도당. 각각 50 μM D-APV 및 10 μM SR 95531 하이드로브로마이드를 첨가하여 N-메틸-D-아스파르타(NMDA) 및 GABAA 수용체를 차단합니다.
- 세포내 솔루션
- (mM에서) 함유된 세포내 용액을 준비한다: 35 Cs-글루코네이트, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 및 0.1 D-600 (메톡시베라파밀 염산염). CsOH를 사용하여 pH를 7.3으로 조정합니다. 사용 전까지 재고 용액을 -20°C에서 필터, 알리쿼트 및 보관합니다.
2. 해부
- 두 개의 슬라이스 챔버를 준비하였고, 그 중 하나는 해부 용액의 100 mL로 채워지고 다른 하나는 100 mL의 기록 용액으로 채워져 있습니다. 두 비커를 수조(37°C)에 넣고 해부 되기 전에 적어도 15분 동안 카보겐으로 용액을 거품을 낸다.
- 250 mL의 얼음 -차가운 (그러나 동결되지 않음) 해부 용액으로 플라스틱 비커를 채웁니다. 사용 하기 전에 적어도 15 분 카보겐으로 거품.
- 차가운 해부 용액으로 뇌 해부가 수행되는 플라스틱 페트리 접시 (100mm x 20mm)를 채웁니다. 여과지 한 조각을 페트리 접시 뚜껑에 넣습니다.
- 진동의 해부를 식힙니다.
- 예를 들어 마우스 케이지에서 2.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취시요. 마우스가 꼬리 핀치에 반응하지 않는 즉시, 자궁 경부 수질 근처에 마우스를 참수하고 페트리 접시의 바닥에 얼음 차가운 해부 솔루션에 머리를 담급니다.
- 코에서 코로 머리의 피부를 잘라 두개골을 노출 손가락으로 측면으로 유지. 전뇌를 꺼내려면 먼저 후방 전방 중간선과 함께 두개골을 자른 다음 관상 봉합사와 양두체 봉합사를 통해두 번 더 자른다 (그림 1A).
- 관상 봉합사와 람도이드 봉합사 사이의 두개골을 제거하여 뇌가 노출되도록하십시오. 후각 전구를 자르고 미세 한 블레이드로 중뇌에서전뇌를 분리합니다 (그림 1B). 얇은 주걱으로 두개골에서 뇌를 제거하고 페트리 접시의 뚜껑에 여과지에 놓습니다.
참고: 단계 2.6 및 2.7 세포 죽음을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 수행 해야 합니다. - 뇌 슬라이스의 dLGN에 대한 감각 및 피질 입력의 무결성을 보존하기 위해 두 반구를 3-5 ° 각도로 마비 컷으로분리하십시오 (그림1C, D). 두 반구의 절경면을 필터 용지에 놓고 말린 다음 수평 평면에서 10-25°의 각도로 절단 단계에 붙입니다(그림1E).
- 금속 완충트레이중앙에 스테이지를 놓고 나머지 얼음 냉해 해액을 완충트레이에 부드럽게 붓습니다. 강한 부어 붙여 넣은 뇌를 제거 할수 있기 때문에신중하게이 단계를 수행 (그림 1F).
- 완충트레이를 얼음으로 채워진 트레이에 놓아 해부 하는 동안 저온을 유지하는 데 도움이됩니다. 0.1mm/s의 속도와 1mm의 진폭으로 면도날로 250 μm 슬라이스를 잘라냅니다.
- 34°C에서 산소처리용액으로 채워진 홀딩 챔버에 슬라이스를 약 30분 동안 보관한 다음, 34°C에서 34°C에서 다른 30분 동안 조각이 기록 용액에서 회수되도록 합니다.
- 회수 후, 수조에서 슬라이스 홀딩 챔버를 제거하고 실험에 사용될 때까지 실온(RT)에서 슬라이스를 유지합니다.
3. 전기 생리학
- 보로실리케이트 유리 모세혈관과 필라멘트 풀러를 사용하여 파이펫을 당깁니다. 3-4 MΩ에서 파이펫 기록의 저항을 유지합니다. 동일한 프로토콜을 사용하여 자극 파이펫을 당기고 직경을 높이기 위해 당긴 후 팁을 약간 부수십시오. 셀룰러 내 용액과 바이오시틴으로 기록 파이펫을 채우고 자극하는 파이펫을 녹음 용액으로 채웁니다.
- 슬라이스를 녹음 실에 넣고 RT에서 산소 가산 된 녹음 용액으로 조각을 지속적으로 관할하십시오.
- 적외선 차동 간섭 콘트라스트(IR-DIC) 비디오 현미경이 장착된 직립 현미경으로 슬라이스와 셀을 시각화합니다.
참고 : 릴레이 뉴런은 더 큰 소마 크기와 더 많은 기본 모수석 (소마에서 나오는 가지)에 의해 인터 뉴런과 구별됩니다. 인터뉴런은 더 작은 소마를 가진 양극성 형태를 표시합니다. - 자극피펫을 슬라이스에 놓고 기록 피펫으로 셀을 패치합니다. 망막 광석 시냅스를 조사하기 위해, 망막 신경절 세포에서 축사 섬유가 번들로 제공되는 광관에 직접 자극 파이펫을놓습니다 (그림 2A). 코르티코겐 시냅스를 분석하기 위해, dLGN에 인접한 핵 망상 증액에 자극 전극을 놓는다(도2B).
- 기록 파이펫이 레코딩 솔루션에 침지되면 5mV 전압 단계를 적용하여 파이펫 저항을 모니터링합니다. 유지 전위를 0mV로 설정하고 유지 전류가 0 pA가 되도록 오프셋 전위를 취소합니다.
- 양압을 가하면서 기록 파이펫으로 셀에 접근하십시오. 파이펫이 세포막에 직접 접촉할 때, 양압을 방출하고, 유지 전위를 -70 mV로 설정한다. 세포막이 유리 파이펫에 부착되어 기가옴 씰이 형성되도록 약간의 음압을 가합니다(저항 >1 GΩ). 피펫 정전 용량을 보정하고 음압 펄스를 적용하여 셀을 엽니다.
- 시냅스 기능을 조사하려면 자극 피펫을 통해 0.1 ms 전류 펄스 (약 30 μA)를 적용하십시오. 시 냅 스 응답 관찰 하는 경우, 자극 파이펫 교체 해야 할 수 있습니다. 자극 피펫을 다른 위치에 배치할 때 기록된 셀이 손실되지 않도록 주의하십시오.
참고: 도2에 나타낸 예에서, 시냅스 단기 가소성은 30 ms 간 자극 간격으로 2회 광관또는 코르티코제닉섬유를 두 번 자극함으로써 조사되었다. 페어링-펄스 비(PPR)는 제2 흥분성 후근 전류(EPSC)의 진폭을 제1 EPSC(EPSC 2/EPSC 1)의진폭으로 나누어 계산하였다. 각 자극 프로토콜을 20회 반복하였다. EPSC 진폭은 20스윕의 평균 전류로부터 측정되었습니다. 각 반복 사이의 시간 간격은 반복에 의해 유도된 단기 가소성을 피하기 위해 최소 5s였다. - 5mV 전압 단계를 적용하여 계열 저항을 지속적으로 모니터링합니다. 분석에는 20MΩ보다 작은 계열 저항이 있는 셀만 사용하십시오.
4. 바이오시틴 라벨링
- 비석산 모수석내로 바이오시틴이 확산될 수 있도록 적어도 5분 동안 전체 세포 구성을 유지한다.
- 기록 후 소마가 파괴되지 않도록 셀에서 피펫을 부드럽게 제거하십시오.
참고: 한 조각에 하나 이상의 셀이 기록되면 소마는 인접한 세포에서 충분히 멀리 떨어져 있어야 합니다. 다른 세포의 모수석이 이미징 중에 서로 간섭하지 않도록 하십시오. - 24웰 세포 배양 플레이트를 준비한다. 4% 파라포름알데히드(PFA)의 300 μL로 각 우물을 채웁니다. 기록할 슬라이스와 접촉할 PFA로 아무것도 오염시키지 않도록 주의하십시오.
- 레코딩 챔버에서 고무 피펫으로 PFA 함유 플레이트로 슬라이스를 옮기고 슬라이스를 밤새 고정합니다. 파이펫이 항상 PFA 오염을 방지해야 합니다.
주의: PFA를 조작할 때는 항상 장갑을 착용하고 화학 후드를 사용하십시오. - PFA에서 하룻밤 동안 슬라이스를 고정한 후 PFA를 인산염 완충 식염수(PBS)로 교체합니다. 향후 처리를 위해 PBS에 슬라이스를 4°C(2주 미만)로 보관하십시오.
- 신선한 PBS로 슬라이스를 3 회 (각 세척 10 분)로 씻으하십시오.
- 비특이적 결합 부위를 차단 용액내의 슬라이스(0.2% 비이온 계면활성제 및 PBS에서 5% 소 혈청 알부민)를 궤도 셰이커상에서 RT에서 2시간 동안 배양하여 차단한다.
- 차단 솔루션을 폐기합니다. 스트렙타비딘-알렉사 568로 슬라이스를 인큐베이션하여 궤도 셰이커상에서 밤새 4°C에서 차단 용액(1:1,000)으로 희석하였다.
- 항체 용액을 버리고 궤도 셰이커에서 RT에서 10 분 동안 PBS로 슬라이스를 3 회 씻으십시오. 장착하기 전에 수돗물로 슬라이스를 씻으하십시오.
- 한 마우스에서 슬라이스를 한 개의 유리 슬라이드에 놓습니다. 염색된 세포가 슬라이스의 상단 표면에 있는지 확인합니다. 티슈로 슬라이스 주변의 물을 흡수한 다음 슬라이스를 약 15분 간 건조시도록 둡니다.
- 각 슬라이스에 마운팅 매체 2방울을 바치게 합니다. 기포를 생성하지 않고 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.
- 공초점 현미경으로 시각화 한 후 표지 된 조각을 4 °C에서 저장하십시오.
5. 세포 화상 진찰 및 재건
- 공초점 현미경으로 슬라이스를 스캔하고 관련 소프트웨어를 사용하여 분석을 합니다.
- 561 nm에서 형광을 흥분시킵니다.
- 0.7 수치 조리개(NA), 오일 침지 대물렌즈로 슬라이스를 이미지화합니다.
- 뷰 중간에 대상 셀을 조정하고 2.5배 배율을 적용합니다.
- Z 스택 데이터 세트를 렌더링하여 형식 = 2,550 x 2,550 픽셀, 스캔 빈도 = 400 Hz, z 번호 = 40.Voxel 크기는 약 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 μm3입니다.
- 뉴런 재구성 소프트웨어(예: NeuronStudio)를 사용하여 뉴런을 반자동으로 추적합니다. 3D 추적 릴레이 뉴런의 예는 도 3B에도시되어 있다.
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Representative Results
망막 생성 및 코르티코겐화 경로를 함유하는 dLGN의 슬라이스 제제는 4x 목표 하에도시된다(도 2). 망막 신경절 세포의 축세포는 광학 관에서 함께번들 (그림 2). 자극피펫을 광관에 위치하여 레티노젠산 시냅스 매개 전류(도2A)및 핵 망상 염골에 각각 코르티코겐 화 시냅스 매개 전류를 유도하기 위해 광학 관상에 위치하였다(도2B). 참고로, 피질 뉴런에서 LGN 뉴런에 이르는 축산은 피질에서 시상까지 핵 망상 증액을 통과합니다. 코르티코제니클로레이트 시냅스는, 따라서, 핵 망상증 탈라미에서 자극에 의해 활성화될 수 있다.
AMPA 수용체 매개 EPSCs의 쌍 펄스 비율은 30 ms 간 자극 간격으로 광학 관을 자극할 때 1 이하이지만, 동일한 상호 자극 간격으로 코르티코겐 섬유를 자극할때 1 이상입니다 (그림2C,D) . 망막 맥박 시냅스의 쌍 펄스 우울증은 높은 소포 방출 확률과 후배산 AMPA 수용체의 둔감에 기인한다. 코르티코제네레이트 시냅스의 쌍-펄스 촉진은 낮은 소포 방출 확률16과일치한다.
도 3A는 패치 파이펫의 팁과 함께 dLGN 릴레이 뉴런의 소마를 나타내는 IR-DIC 이미지를 나타낸다. 생체 세포틴 염색은 우리가 기록 된 뉴런의 보기를 얻을 수 있습니다. 양극성 형태학을 가지는 인터뉴런과 는 달리, 릴레이 뉴런은 3가지 이상의 1차 모수석 8,17을함유하는 다극성 수지상 아버(도3B)를가지고 있다. 바이오시틴 표지된 릴레이 뉴런의 3차원(3D) 재구성은 방사형 수지상 구조를 나타내는 생성된 후(도3C).
그림 1 : 해부 프로토콜을 나타내는 구성표입니다. (A) 마우스 두개골의 수평 보기로, 초기 컷의 위치를 표시합니다. 첫 번째 컷은 시상 봉합사와 함께 수행되었으며, 관상 봉합사 및 람도이드 봉합사와 함께 또 다른 두 컷이 뒤따랐습니다. 파선은 절개를 나타냅니다. (B) 전체 뇌의 시상보기. 파선은 대뇌가 후각 전구 및 중뇌로부터 분리되었음을 나타냅니다. (C-D) 이러한 패널은 두 반구를 각각 수평(C)과관상(D)뷰로부터 분리하는 제1 절삭각을 보여준다. (E) 절단 단계에서 한 반구의 코로나 뷰. 파선은 슬라이싱 방향을 나타냅니다. l, m, d, 및 v는 각각 패널 D 및 E. (F) 절삭 스테이지상에 2개의반구를 가진 해부챔버의 도면에 대한 측면, 내측, 등도 및 복부 양상을 나타낸다. 파선 화살표는 절단 블레이드의 이동 방향을 나타냅니다. a, p 및 d는 각각 좌반구의 전방, 후방 및 등측을 나타낸다. (G) dLGN의 비교적 큰 부분을 가진 제대로 절단 된 슬라이스를 나타내는 방식과 광학 관의 그대로 보존. dLGN, 등쪽 측면 비네이클로트 핵; vLGN, 복부 측측 핵; OT, 후각 전구; NRT, 핵 망상 thalami. 패널 C, D 및 G는 터너 와 소금3의 그림 1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 망막생성 및 코르티코제네틸레이트 경로 및 예시 기록을 포함하는 dLGN의 슬라이스 제제. (A-B) 이 패널은 망막 생성 및 코르티코겐산 입력을 보존하는 dLGN 슬라이스를 보여줍니다. 자극 전극은 망염 성 회란시냅스를 활성화하기 위해 광학 관상에 위치하였다 (A) 및 핵 망상 thalami에 코르티코겐 시냅스를 활성화 (B). (C) AMPA 수용체 매개 EPSCs는 30 ms 간 자극 간격으로 2회 광학 관의 자극에 반응한다. (D) 코르티코제네클레아제 시냅스 매개 전류를 30 ms 간 자극 간격으로. 명확성을 위해 자극 아티팩트를 제거하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 릴레이 뉴런의 형태학적 분석. (A) 패치 피펫의 끝이 있는 dLGN 릴레이 뉴런의 소마를 나타내는 IR-DIC 이미지. (B) 생체 시틴으로 표지된 릴레이 뉴런의 공초점 이미지및 스트렙타비딘-알렉사 568로 시각화하였다. (C) 동일한 뉴런의 3차원(3D) 재구성, 방사형 치수성 구조를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 이전에 발표된 방법 3에기초하여 개선된 프로토콜을 설명하며, 이는 동일한 슬라이스로부터 의 회망생내가 나는 시냅스를 방출할 확률이 높고 낮은 확률을 조사할 수 있게 한다. 이 두 입력이 시각적 신호 전송을 조절하기 위해 서로 상호 작용하기 때문에 이것은 매우 중요합니다 : 망혈구 입력은 릴레이 뉴런의 주요 흥분성 드라이브인 반면 코르티코탈라믹 입력은 변조기로 기능합니다. 릴레이 뉴런의 상태에 영향을 줌으로써 망혈전 전달의 이득에 영향을 미칩니다. 예상대로, 우리는 망막 생성 및 코르티코제겐 시냅스가 방출 확률의 차이로 인해 다른 단기 가소성을 표시하는 것을 관찰했습니다. 또한, AMPA 수용체 탈감작 또한 망혈구 시냅스9,15,16에서강한 우울증에 기여한다. 우리는 최근에 단기 불경기가 CKAMP4416에의해 변조된다는 것을 보여주었습니다, AMPA 수용체의 탈감작에서 회복을 감속시키는 CKAMP 가족의 AMPA 수용체 보조 단백질18,19, 20. 또한, 망막 시냅스 매개 전류 진폭은 동일한 자극 강도하에서 코르티코 제네시 내 종화 시냅스 매개 전류보다 높으며, 다중과 큰 망막 생성 시냅스와 일치합니다. 방출 사이트, 상대적으로 작은 코르티코 제네시시냅스 7,21.
슬라이스 프로토콜은 본질적으로 터너와 솔트 3에 의해개발 된 것과 동일합니다. 우리의 경험을 기반으로 한 일부 수정은 슬라이스 품질을 향상시고 있습니다. Hauser 등22와유사하게, 우리는 자당 기반 의 해부 용액 대신 콜린 기반의 솔루션을 사용했다. 해부 후 회수는 30분 동안 절삭 용액에서 34°C에서 수행한 다음, 상온이 아닌 다른 30분 동안 기록 용액에서 이루어졌다. 슬라이스는 약간 얇아졌습니다 (400 μm 대신 250 μm). 우리는 10-25 °의 각도로 쐐기를 사용하여 뇌를 해부하여 슬라이스 절차의 신뢰성을 용이하게하고 향상시킵니다.
릴레이 뉴런 시냅스 기능의 조사를 위한 기록 및 자극 조건은 본질적으로 첸 및레게르 8에 의해 설명된 것과 동일하다. 광관지 섬유의 활성화는 일반적으로 큰 전류를 유도하고 하나의 릴레이 뉴런에 대한 모든 망막 광세포 시냅스가 활성화될 때 여러 nA의 범위에 있을 수 있다23. 특히 하나의 릴레이 뉴런에서 모든 레티노제니큐어 시냅스를 활성화하여 최대 전류를 조사할 때 직렬 저항 오류를 방지하기 위해 첸과 Regehr는 저저항 파이펫(&2 MΩ)을 기록하는 데 사용했습니다. 그러나, 시 냅 스 단기 가소성을 조사 하기 위해, 그것은 하나 또는 몇 개의 망막 신경 절 세포 축 을 활성화 하는 충분, 34-579 pA의 범위에 있는 전류를 유도 하는 (게시 되지 않은 결과, 첸 등). 3-4 MΩ 사이의 저항을 가진 작은 파이펫은, 따라서, 광관의 약한 자극을 사용하여 망막 광석 시냅스 기능을 조사 할 때 사용할 수 있습니다. 코르티코제겐 시냅스의 활성화는 상대적으로 작은 전류를 유도16. 따라서 계열 저항 오차는 코르티코제네레이트 시냅스 기능을 조사할 때 더 작은 문제이다.
우리는 여기에서 망막 광도산및 코르티코겐산시냅스의 자극이 AMPA 수용체 매개 전류의 단기 가소성을 조사하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 동일한 프로토콜을 NMDA 수용체 매개전류(24)를기록하기 위해 적용될 수 있다. 사실, AMPA 수용체 탈감작이 망혈구 시냅스의 단기 가소성에 기여한다는 첫 번째 징후 중 하나는 AMPA 수용체 매개 전류의 쌍 펄스 비율을 비교한 실험에서 나온 것입니다. NMDA 수용체 매개 전류의 쌍-펄스 비율. 코르티코제네레이트 시냅스는 dLGN 릴레이 뉴런을 자극하는 피질 뉴런의 축삭이 이 탈라믹 핵을 가로질러 이동하기 때문에 핵 망상 증액에 자극 피펫을 위치시킴으로써 자극되었다. 동일한 자극 위치는 고빈다이아 및 콕스25에의해 예를 들면 dLGN에서 억제 시냅스 전류를 연구하는데 사용될 수 있다.
릴레이 뉴런 GABAA와 GABAB 수용 체를 표현. GABA의 릴리스 시 냅 스 GABAA 수용 체를 활성화. GABAB 수용체는, 외적으로 국한되고, 핵 망상증 이강하게 파열 발사 하는 동안 예를 들어 활성화 될 때 활성화26,27,28. GABA의 유출, 일반적으로 성상 세포에 의해 GABA 섭취로 인해 제한, 강렬한 시 냅 스 활성화 하는 동안 활성화 할 수 있습니다 외 GABAB 수용 체27,28. 자극 강도와 주파수가 비교적 낮았기 때문에 GABAB 수용체를 차단하지 않았습니다. 그러나, 강렬한 자극 프로토콜을 사용 하 여 코르 티 코 겐 시 냅 스 기능을 조사 하는 경우 GABAB 수용 체를 추가 하는 것이 바람직 할 수 있습니다.
dLGN 릴레이 뉴런의 기록은 뇌의 측면 표면으로부터 약 2 mm 내측인 슬라이스를 사용할 때 쉽게 수행될 수 있다(절단 절차 동안 250 μm 슬라이스의 약8분의 1을 수집하기 시작). 일부 슬라이스에서는 두 경로 중 하나가 릴레이 뉴런에 가깝게 절단되기 때문에 주어진 릴레이 뉴런에 대한 두 입력을 모두 감지할 수 없습니다. 이 경우, 일반적으로 각 입력에 대해 다른 릴레이 뉴런을 선택하여 동일한 슬라이스에서 망막 생성 및 코르티코제닉시냅스를 조사하는 것이 여전히 가능하다. 망막 시냅스 매개 전류를 기록하기 위해, 이러한 세포에 대한 광관섬유가 등쪽으로 위치한 릴레이 뉴런보다 더 잘 보존되기 때문에 환구 에 위치한 릴레이 뉴런이 선택된다. 대조적으로, 코르티코제닉산성 입력은 dLGN에서 등쪽에 위치한 릴레이 뉴런에 더 많이 보존된다.
슬라이스 품질은 데이터의 안정성을 결정합니다. 우리의 경험을 바탕으로, 다음 매개 변수는 좋은 슬라이스 품질을 보장하기 위해 필수적이다. 냉각 및 산소화는 해부 절차 동안 중요한 요소입니다. 마우스의 머리는 마우스의 참수 직후 차가운 용액에 보관해야합니다. 두개골에서 뇌를 복용 할 때, 세포 사멸을 줄이기 위해 3 ~ 4 초마다 얼음 차가운 용액에 잠기어야합니다. 유사하게, 슬라이스 절차는 약 4°C에서 수행되어야 한다. 또한, 해부 용액 및 기록 용액은 충분한 산소 농도를 유지하기 위해 사용하기 전에 적어도 15 분 산소화되어야한다. 또한, 나트륨 채널을 차단하는 것은 효율적으로 신경 활동을 감소시킬 수 있다. 따라서, 37.5 mmol 콜린을 포함하는 해부 용액을 사용했습니다.
릴레이 뉴런은 과도Ca2+ 전류29에의해 생성되는 낮은 임계값 스파이크를 표시합니다. 전압 게이트 Ca2+-채널을 차단하기 위해, 우리는 D-600 (메톡시베라파밀)을 세포 내 용액에 추가했습니다. 연구의 목적이 릴레이 뉴런에서 낮은 임계값 스파이크를 조사하는 경우 D-600을 사용해서는 안됩니다. 전체 셀 전압 클램프 기록의 정밀도는 공간 클램프 오류의 영향을 받습니다. 이 기술적 문제는 기록 전극(따라서 말단 시냅스의 경우)에서 멀리 떨어진 입력(30,31)에더 관련이 있다. 공간 클램프 오류의 영향을 최소화하기 위해K+ 기반 세포 내 솔루션 대신 Cs+기반 솔루션을 사용했습니다. K+ 투과성 채널(예: 누출 채널)인 채널은 일반적으로 Cs+ 불투과성32입니다. 따라서, Cs+기반 세포 내 용액의 사용은 세포의 임피던스를 증가시킨다.
안정적인 패치 클램프 기록은 건강한 세포의 선택에 따라 달라집니다. 둥근 소마 모양, 어두운 색깔 또는 부은 soma를 가진 신경은 피해야 합니다. 게다가, 릴레이 뉴런은 그들의 더 큰 소마 크기와 더 정교한 1 차 수지상 아버에 의해 국소 인터뉴런에서 구별됩니다. 따라서, 우리는 더 큰 소마 크기 (직경 15 μm 보다 큰) 및 비 양극성 형태를 가진 세포를 선택했습니다. 도 3B에 도시된 실시예 셀은 대칭적인 수지상 구조를 가지며, 따라서, 예를 들어 고양이 LGN17에서발견되는 Y-뉴런과 유사한 릴레이 뉴런으로 분류될 수 있다.
직렬 저항은 가능한 한 작아야 하며 일정하게 유지되어야 합니다. 또한 두 방향의 입력이 한 조각에 보존되므로 두 입력 간의 간섭을 제거하는 것이 중요합니다. 망막 광석 섬유를 활성화하지 않으려면 망막 시냅스 매개 전류를 기록하거나 그 반대로 자극 피펫을 dLGN에 배치해서는 안되며 자극 과 기록 파이펫 사이의 거리는 멀리 있어야합니다. 가능한. 또한, 자극과 기록 파이펫 사이의 긴 거리는 상대적으로 손상되지 않은 축전 보존을 필요로한다. 따라서 해부를 위해 적절한 절삭 각도를 선택해야 합니다. 일반적으로 두 개의 입력을 보존하는 하나 또는 두 개의 조각만 각 반구에서 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 연구 재단 (DFG) 공동 연구 센터 내에서 (SFB) 1134 "기능 앙상블"(J.v.E. 및 X.C.) 및 연구 보조금 EN948/1-2 (J.v.E.)에 의해 투자되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
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