Summary
在这里,我们提出了制备含有侧生化核的急性脑切片和视网膜原性和皮质化突触功能的电生理研究方案。该协议提供了一种有效的方法,研究突触与高释放和低释放概率在同一急性脑切片。
Abstract
横向原核是视觉信息的第一个中继站。这个thathamic细胞核的中继神经元整合来自视网膜神经结细胞的输入,并将其投影到视觉皮层。此外,中继神经元从皮层接收自上而下的激发。中继神经元的两个主要兴奋输入在几个方面有所不同。每个中继神经元只接收来自几个视网膜突变突触的输入,这些突触是具有许多释放站点的大型终端。这反映在相对强的激发,中继神经元接收,从视网膜神经结细胞。相比之下,皮质原发性突触更简单,释放位点少,突触强度较弱。两个突触在突触短期可塑性上也有所不同。视网膜突触具有较高的释放概率,因此显示短期抑郁症。相比之下,皮质原化突触的释放概率较低。皮质原性纤维在进入侧生核之前穿过视网膜的丘骨核。视网膜丘脑核(从侧侧原质核旋转)和视道(从侧侧原性核到肠外)的不同位置允许分别刺激皮质原化或视网膜突变突触细胞外刺激电极。这使得侧生核成为理想的大脑区域,可以同时研究两个具有非常不同特性的兴奋突触,以冲击同一细胞类型。在这里,我们描述了一种研究从中继神经元的记录,并执行急性脑切片视网膜原酸和皮质化突触功能的详细分析的方法。本文包含一个分步方案,用于生成侧生核的急性脑切片,以及通过分别刺激视道和皮质化纤维来记录继电器神经元活动的步骤。
Introduction
侧源核的中继神经元整合视觉信息并将其中继到视觉皮层。这些神经元通过视网膜原性突触从神经质化突触接收来自神经细胞的兴奋输入,为中继神经元提供主要的兴奋驱动。此外,中继神经元通过皮质原性突触接收来自皮质神经元的兴奋输入。此外,中继神经元接收来自局部内神经元和GABAergic神经元的细胞内膜1的抑制输入。核视网膜膜像丘拉他和皮层之间的盾牌,使纤维从皮层投射到丘拉他,在相反的方向必须通过核神经膜膜2。
视网膜基质化输入和皮质原产输入显示明显的突触特性3,4,5,6,7,8。视网膜源形成大型终端,具有多个释放站点9、10 。相比之下,皮质基化输入显示具有单释放站点7的小终端。此外,视网膜突触有效驱动继电器神经元的作用电位,尽管仅构成中继神经元3、8、11上所有突触的5-10%。另一方面,皮质原体突触通过控制继电器神经元12、13的膜电位,作为视网膜生成性传输的调节器。
中继神经元的这两个主要兴奋输入在功能上也不同。一个突出的区别是视网膜原性突触的短期抑郁症和皮质原性突触的短期促进3,5,8。短期可塑性是指突触强度在几毫秒到几秒钟的时间段内反复活跃时,突触强度变化的现象。突触释放概率是短期可塑性的重要因素。突触,初始释放概率较低,显示短期便利,由于Ca2+在预突子的积累,因此在重复活动时观察到释放概率的增加。相反,具有高释放概率的突触通常表现为短期抑郁症,因为现成的可释放囊泡的耗竭14。此外,脱敏后受体的脱敏有助于在一些高释放概率突触8,15的短期可塑性。β-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异丙酸(AMPA)受体的高释放概率和脱敏性导致视网膜原性突触的突出短期抑郁。相反,低释放概率是皮质原性突触短期促进的基础。
在小鼠中,视道从牛侧位进入背侧原质核(dLGN),而皮质基化纤维进入dLGN。两个输入之间的距离允许调查两个完全不同的兴奋输入冲击到同一细胞的单个属性。在这里,我们建立和改进了前面描述的解剖方法,其中视网膜和皮质化纤维被保存在急性脑切片3中。然后,我们描述了继电器神经元的电生理学研究,以及用细胞外刺激电极刺激视网膜和皮质化纤维。最后,我们提供了一个方案,用于用生物细胞蛋白填充继电器神经元,并随后进行解剖分析。
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Protocol
所有实验均获得莱茵兰-普法尔茨地区动物实验政府监督小组的批准。
1. 解决方案
- 解剖解决方案
- 为了减少兴奋毒性,准备一种基于胆碱的溶液,在解剖过程中使用(如mM):87 NaCl,2.5 KCl,37.5胆碱氯化物,25 NaHCO3,1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 25葡萄糖。在实验前不到1周准备解剖溶液。
- 录制解决方案
- 制备含有(mM)的人工脑脊髓液(ACSF)溶液:125纳Cl、25 NaHCO 3、1.25 NaH2PO4、2.5 KCl、2 CaCl2、1MgCl2和25葡萄糖。分别加入50μM D-APV和10μM SR 95531氢溴化物,以阻断N-甲基D-阿斯巴酸酯(NMDA)和GABAA受体。
- 细胞内溶液
- 制备含有(以mM计)的细胞内溶液:35克-葡萄糖酸盐、100克葡萄糖、10个环流、10个EGTA和0.1 D-600(盐酸甲氧乙烷)。使用 CsOH 将 pH 调整到 7.3。过滤、等分,并将库存溶液储存在-20°C,直到使用。
2. 解剖
- 准备两个切片室,其中一个填充100 mL的解剖溶液,另一个用100 mL的录音溶液填充。将两个烧杯放入水浴(37°C),在解剖前用卡博根将溶液泡入至少15分钟。
- 用 250 mL 的近冰冷(但不是冷冻)解剖溶液填充塑料烧杯。使用前至少 15 分钟使用卡博根的气泡。
- 填充塑料培养皿(100毫米 x 20毫米),其中进行脑部解剖,用冷解剖溶液。将一张滤纸放入培养皿的盖子中。
- 冷却振动器的解剖室。
- 用2.5%的异常胶麻醉小鼠,例如,在鼠标笼子里。一旦小鼠对尾部捏合不反应,将小鼠斩首到宫颈梅杜拉附近,并将头部浸入培养皿底部的冰冷的解剖溶液中。
- 将头部的皮肤从牛头切到鼻腔,并用手指横向保持,以暴露头骨。要拿出前脑,首先切头骨与后前中线,然后通过冠状缝合线和羔羊疮缝合再切两次(图1A)。
- 去除冠状缝合线和羔羊皮缝合线之间的头骨,使大脑暴露。用细刀片切割嗅球,用细刀片将前脑与中脑分离(图1B)。用细铲子从头骨中取出大脑,并将其放在培养皿盖的滤纸上。
注:应尽快执行步骤 2.6 和 2.7,以减少细胞死亡。 - 为了保持大脑切片中 dLGN 的感官和皮质输入的完整性,使用 3±5° 角的寄生切口将两个半球分开(图1C,D)。将两个半球的平庸平面放在滤纸上,然后从水平面以 10–25° 的角度将其粘附到切割台上(图1E)。
- 将舞台放在金属缓冲盘的中心,将剩下的冷切分液轻轻倒入缓冲盘。仔细执行此步骤,因为强倾可能会去除粘贴的大脑 (图1F)。
- 将缓冲盘放入充满冰块的托盘中,这有助于在解剖过程中保持低温。以 0.1 mm/s 的速度和 1 mm 的振幅使用剃刀刀片切割 250 μm 切片。
- 将切片保存在装有含氧解剖溶液的保持室中,在34°C左右,然后让切片在34°C的录音溶液中再恢复30分钟。
- 回收后,从水浴中取出切片保持室,并将切片保持在室温(RT)下,直到在实验中使用。
3. 电生理学
- 使用硼硅酸盐玻璃毛细管和长丝拉拔器拉移器。将记录移液器的电阻保持在 3~4 MΩ。使用相同的方案拉刺激移液器,但在拉后稍微折断吸头以增加直径。用细胞内溶液和生物细胞内填充记录移液器,同时用记录溶液填充刺激移液器。
- 将切片放入记录室,并在RT处连续注入含氧记录溶液的切片。
- 使用配备红外差分干扰对比度 (IR-DIC) 视频显微镜的直立显微镜可视化切片和细胞。
注: 中继神经元由其较大的体量和更多的原发树突(从体下产生的分支)与内神经元区分开来。内神经元显示双相形态与较小的躯形。 - 在用记录移液器修补细胞之前,将刺激移液器放在切片上。为了研究视网膜突触,将刺激移液器直接放在光片上,其中视网膜神经结节细胞的斧头纤维被捆绑在一起(图2A)。要分析皮质原性突触,将刺激电极放在与 dLGN 相邻的神经内膜上(图 2B)。
- 将记录移液器浸入记录溶液中后,应用 5 mV 电压步骤来监控移液器电阻。将保持电位设置为 0 mV 并取消偏移电位,使保持电流为 0 pA。
- 在施加正压时,用记录移液器接近电池。当移液器直接接触细胞膜时,释放正压,并将保持电位设置为-70 mV。施加轻微的负压,使细胞膜附着在玻璃移液器上,使gigaohm密封形成(电阻>1 GΩ)。补偿移液器电容,并通过应用负压脉冲打开电池。
- 要研究突触功能,请通过刺激移液器应用 0.1 ms 电流脉冲(约 30 μA)。如果未观察到突触反应,则可能需要更换刺激移液器。将刺激移液器置于不同位置时要小心,以便记录的细胞不会丢失。
注:在图2所示的例录音中,通过刺激光道或皮质基化纤维两次,以30 ms的刺激间隔,研究突触短期可塑性。配对脉冲比 (PPR) 的计算方法是将第二个兴奋柱电流 (EPSC) 的振幅除以第一个 EPSC (EPSC2/ EPSC1) 的振幅。每个刺激方案重复20次。EPSC 振幅是从 20 次扫描的平均电流中测量的。每次重复之间的时间间隔至少为 5 秒,以避免重复引起的短期可塑性。 - 通过应用 5 mV 电压步长连续监控串联电阻。仅使用系列电阻小于 20 MΩ 的细胞进行分析。
4. 生物青锡标签
- 保持全细胞配置至少5分钟,使生物细胞素扩散到远端树突中。
- 录音后,轻轻地从细胞中取出移液器,以免破坏索马。
注:如果在一个切片上记录多个细胞,则其索马应充分远离其相邻细胞。确保来自不同细胞的树突在成像过程中不会相互干扰。 - 准备24孔细胞培养板。每口井中填充 300 μL 的 4% 甲醛 (PFA)。小心不要污染任何与要记录的切片接触的 PFA。
- 将切片从记录室转移到含 PFA 的板中,使用橡胶移液器,并整夜固定切片。确保移液器始终远离 PFA 污染。
注意:在操作 PFA 时,务必戴上手套并使用化学罩。 - 在PFA中固定切片过夜后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)替换PFA。将切片储存在 PBS 中,温度为 4°C,以便将来处理(少于 2 周)。
- 用新鲜的PBS清洗切片3次(每次洗10分钟)。
- 通过在阻断溶液中孵育切片(0.2%非离子表面活性剂和PBS中的5%牛血清白蛋白)在轨道摇床的RT上孵育2小时,阻断非特异性结合位点。
- 丢弃阻塞解决方案。在轨道摇床上4°C过夜,用链球菌-Alexa 568稀释的切片孵育到阻断溶液(1:1,000)。
- 在轨道摇床的RT处,丢弃抗体溶液,用PBS清洗切片3次。安装前用自来水清洗切片。
- 将一只鼠标上的切片放在一张玻璃幻灯片上。确保彩色细胞存在于切片的顶部表面。用纸巾吸收切片周围的水,然后让切片干燥约15分钟。
- 在每个切片上涂抹两滴安装介质。在滑轨上安装盖玻片,而不会产生气泡。
- 使用共聚焦显微镜在可视化后将标记切片存储在 4°C。
5. 细胞成像和重建
- 使用共聚焦显微镜扫描切片,并使用相关软件进行分析。
- 在 561 nm 处激发荧光。
- 使用 0.7 数值孔径 (NA)、油浸物目标对切片进行成像。
- 调整视图中间的目标单元格,并应用 2.5 倍的放大倍率。
- 渲染 Z-Stack 数据集以使用以下参数扫描整个神经元:格式 = 2,550 x 2,550 像素,扫描频率 = 400 Hz,z 数 = 40.Voxel 大小约为 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 μm3。
- 使用神经元重建软件(例如,NeuronStudio)半自动跟踪神经元。图3B显示了3D跟踪继电器神经元的示例。
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Representative Results
含有视网膜原性和皮质化通路的dLGN切片制备显示在4x目标下(图2)。视网膜结节细胞的斧头在视道中捆绑在一起(图2)。刺激移液器被放置在视道上,分别诱导视网膜突变性突触介导电流(图2A)和细胞核神经酸酯,分别诱导皮质原化突触介导电流(图2B)。值得注意的是,从皮质神经元到LGN神经元的斧突项目从皮层到丘拉皮穿过细胞核。因此,皮质性突触可以通过在细胞核内膜的刺激而激活。
AMPA受体介导EPSC的配对脉冲比低于1,当刺激视道时具有30 ms的刺激间隔,但在刺激具有相同刺激间隔的皮质化纤维时高于1(图2C,D).视网膜原性突触的配对脉冲抑郁症是由于高囊泡释放概率和脱敏后AMPA受体。皮质原酸突触的配对脉冲促进与低囊泡释放概率16一致。
图 3A显示 IR-DIC 图像,显示 dLGN 继电器神经元的体声以及贴片移液器的尖端。生物青锡染色使我们能够获得记录神经元的视图。与具有双相形态的内神经元不同,中继神经元具有多极树突状树突(图3B),含有3个以上原发树突8,17。然后生成生物细胞素标记继电器神经元的三维(3D)重建,显示径向对称树突状结构(图3C)。
图 1:表示解剖协议的方案。(A) 鼠标头骨的水平视图,显示初始切口的位置。第一次切口与下垂缝合一起进行,接着是另外两次切口以及冠状缝合线和羔羊疮缝合。虚线表示切口。(B) 整个大脑的射手观.虚线表示大脑与嗅球和中脑分离。(C-D)这些面板分别显示将两个半球与水平 (C) 和日冕 (D) 视图分开的第一个切割角度。(E) 切割台上一个半球的冠状视图.虚线指示切片方向。l、m、d 和 v 分别代表半球的横向、中边、背和腹方面,在切割阶段的解剖室的面板 D 和E (F) 图中代表半球。虚线箭头指示切割刀刃的移动方向。a、p 和 d 分别表示左半球的前部、后半球和背面。(G) 方案代表一个适当切割的切片,其dLGN的较大部分和光学片道的完整保存。dLGN,背侧侧原质核;vLGN,腹腔侧核;OT,嗅球;NRT, 核神经膜。面板 C、D 和 G 已由特纳图1和 Salt3进行修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:含有视网膜生成和皮质化途径和示例记录的dLGN切片制备。(A-B)这些面板显示一个dLGN切片,用于保存视网膜基质和皮质化输入。刺激电极被放置在视道上,以激活视网膜突变性突触(A)和细胞核,以激活皮质原化突触(B)。(C) AMPA受体介导的EPSC,以30ms的刺激间隔对视道的刺激两次。(D) 具有 30 ms 的刺激间隔的皮质原发性突触介导电流。刺激伪影被移除为清晰。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:继电器神经元的形态分析。(A) IR-DIC 图像显示 dLGN 继电器神经元的体体,并带有贴片移液器的尖端。(B) 带有生物细胞素标记的继电器神经元的共聚焦图像,并可视化为链球菌-Alexa 568。(C) 同一神经元的三维(3D)重建,显示径向对称树突状结构。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们描述了基于先前发布的方法3的改进协议,它允许研究释放视网膜突变性突触的高概率和从同一切片释放皮质化腺突触的低概率。这是非常重要的,因为这两个输入相互作用,以调节视觉信号传输:视网膜-光化输入是继电器神经元的主要兴奋驱动,而皮质性输入作为调制器,这影响视网膜抗原传输的增益,影响中继神经元的状态。正如所料,我们观察到视网膜增生和皮质原酸突触显示不同的短期可塑性,由于其释放概率的差异。此外,AMPA受体脱敏也有助于视网膜原性突触9、15、16的强烈抑郁。我们最近已经表明,短期抑郁症是由CKAMP4416调节的,CKAMP家族的AMPA受体辅助蛋白,减缓AMPA受体脱敏的恢复18,19, 20. 此外,视网膜诱导的电流振幅高于在相同刺激强度下皮质原酸突触介导电流的振幅,与具有多重的大视网膜原性突触一致释放位点,和相对较小的皮质性突触7,21。
切片协议基本上与特纳和盐3开发的一样。基于我们经验的一些修改提高了切片质量。与Hauser等人22号类似,我们使用基于胆碱的胆碱而不是蔗糖的解剖溶液。解剖后在切割溶液中34°C下进行30分钟的恢复,然后在记录溶液中再恢复30分钟,而不是在室温下。切片略薄(250 μm,而不是400 μm)。我们使用角为10~25°的楔子解剖大脑,这有利于并提高切片程序的可靠性。
研究继电器神经元突触功能的记录和刺激条件与陈和雷格尔8之前描述的基本相同。光道光纤的激活通常引起大电流,当一个继电器神经元上的所有视网膜突触被激活23时,可以在几个nA范围内。为了防止串联电阻误差,特别是在通过激活一个继电器神经元上的所有视网膜突变突触来研究最大电流时,Chen和Regehr使用记录低电阻移液器(<2 MΩ)。)。然而,为了研究突触短期可塑性,只需激活一个或几个视网膜结节细胞斧头,从而产生34~579 pA范围内的电流(未公布的结果,陈等人)。因此,在利用视道的弱刺激研究视网膜增生突触功能时,可以使用电阻在3⁄4 MΩ之间的较小移液器。皮质原酸突触的激活引起相对较小的电流16。因此,在研究皮质原化突触功能时,串联电阻误差是一个较小的问题。
这里表明,刺激视网膜和皮质化酸联乳可用于研究AMPA受体介导电流的短期可塑性。相同的协议可以应用于记录NMDA受体介导电流24。事实上,AMPA受体脱敏有助于视网膜原性突触的短期可塑性的最初迹象之一来自于将AMPA受体介导电流的配对脉冲比与NMDA受体介导电流的配对脉冲比。皮质原酸突触通过将刺激移液器定位在细胞核内,从而刺激性突触,因为激发dLGN中继神经元的皮质神经元的斧头穿过这个大核。相同的刺激位置可用于研究dLGN中的抑制性突触电流,例如戈文达和考克斯25所示。
中继神经元表达 GABAA和 GABAB受体。GABA 的释放激活突触 GABAA受体。GABAB受体,这是外同步局部,被激活时,细胞核神经膜被强烈激活,例如在爆裂发射26,27,28。GABA的溢出,这通常由于星形细胞的GABA摄取而受到限制,可以在强突触激活期间激活外突触GABAB受体27,28。我们没有阻止GABAB受体,因为刺激强度和频率相对较低。然而,当使用强刺激方案研究皮质原性突触功能时,最好添加GABAB受体。
当使用从大脑横向表面大约 2 mm 的切片时,可以轻松进行 dLGN 继电器神经元的录制(在切割过程中开始收集大约 250 μm 切片的 8分之一)。在某些切片中,无法检测到给定中继神经元的两个输入,因为两个通路之一被切断,靠近中继神经元。在这种情况下,通常仍可以通过为每个输入选择不同的中继神经元来研究同一切片中的视网膜增生和皮质酸化突触。为了记录视网膜突触介导电流,选择心室定位的中继神经元,因为这些细胞的光纤比位于背的继电器神经元更可能保留。相反,皮质基化输入更有可能保留到位于 dLGN 中的端端的中继神经元上。
切片质量决定了数据的可靠性。根据我们的经验,以下参数对于确保良好的切片质量至关重要。冷却和氧合是解剖过程中的重要因素。鼠标被斩首后,必须立即将鼠标头保存在冷溶液中。当大脑从头骨中取走时,它应该每3到4小时浸泡在冰冷的溶液中,以减少细胞死亡。同样,切片过程应在4°C左右执行。此外,解剖溶液和记录溶液在使用前必须至少15分钟进行氧化,以保持足够的氧气浓度。此外,阻断钠通道可以有效地减少神经元的活动。因此,使用了含有37.5 mmol胆碱的解剖溶液。
中继神经元显示低阈值尖峰,由瞬态 Ca2+电流29生成。为了阻断电压门控 Ca2+通道,我们在细胞内溶液中添加了 D-600(乙氧基)。如果研究的目的是调查继电器神经元中的低阈值尖峰,则不应使用 D-600。全单元电压夹具记录精度受空间钳位误差的影响。此技术问题与远离记录电极(因此对于远端突触)30、31 的输入更相关。为了将空间钳位误差的影响降至最低,我们使用基于 Cs+的细胞内解决方案,而不是基于 K+的细胞内解决方案。K=渗透通道(例如,泄漏通道)通常是 Cs=不透气32。因此,使用基于Cs+的细胞内溶液会增加细胞的阻抗。
稳定的贴片夹记录取决于健康细胞的选择。应避免有圆形索马形状、深色或肿胀的神经元。此外,中继神经元与局部内神经元的区分,其较大的体量和更精细的初级树突状树干。因此,我们选择了具有较大索马大小(直径大于15μm)和非双相形态的细胞。图3B所示的示例细胞具有对称树突状结构,因此可以归类为类似于Y神经元的中继神经元,例如在猫LGN17中发现的。
系列电阻应尽可能小并保持恒定。此外,由于来自两个方向的输入保留在一个切片中,因此消除两个输入之间的干扰非常重要。为了避免在记录视网膜突变性突触介导电流时激活皮质基化纤维,反之亦然,刺激移液器不应放入dLGN中,刺激移液器和记录移液器之间的距离应尽量可能。此外,刺激移液器和记录移液器之间的长距离需要相对完好的斧头保存。因此,必须选择正确的切割角度进行解剖。通常,每个半球只能获得一个或两个保存两个输入的切片。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由德国研究基金会(DFG)在协作研究中心(SFB)1134"功能组合"(J.v.E.和X.C.)和研究赠款EN948/1-2(J.v.E.)资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
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