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Neuroscience

रेटिनोलॉजिकल इन्वेस्टीगेशन ऑफ रेटिनोजेनिक्युलेट एंड कोरिटोजेनिक्युलेट सिनेप्स फंक्शन

Published: August 7, 2019 doi: 10.3791/59680
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

यहाँ, हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें पार्श्व जेनुलेट न्यूक्लियस और रेटिनोजेनिक्युलेट और कोरिकजेनिक synapses फ़ंक्शन की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच होती है। इस प्रोटोकॉल एक ही तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में उच्च रिलीज और कम रिलीज संभावना के साथ synapses अध्ययन करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है.

Abstract

पार्श्व जेनुलेट नाभिक दृश्य सूचना के लिए पहला रिले स्टेशन है। इस thalamic नाभिक के रिले न्यूरॉन्स रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं से इनपुट एकीकृत और यह दृश्य प्रांतस्था के लिए परियोजना. इसके अलावा, रिले न्यूरॉन्स प्रांतस्था से ऊपर से नीचे उत्तेजना प्राप्त करते हैं. रिले न्यूरॉन्स के लिए दो मुख्य उत्तेजक आदानों कई पहलुओं में अलग. प्रत्येक रिले न्यूरॉन केवल कुछ रेटिनोजेनिक synapses से इनपुट प्राप्त करता है, जो कई रिलीज साइटों के साथ बड़े टर्मिनलों रहे हैं. यह तुलनात्मक रूप से मजबूत उत्तेजना द्वारा परिलक्षित होता है, रिले न्यूरॉन्स प्राप्त करते हैं, रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं से. Corticogeniculate synapses, इसके विपरीत, कुछ रिलीज साइटों और कमजोर synaptic शक्ति के साथ सरल कर रहे हैं. दो synapses भी उनके synaptic अल्पकालिक प्लास्टिक में अलग हैं. रेटिनोजेनिक synapses एक उच्च रिलीज संभावना है और फलस्वरूप एक अल्पकालिक अवसाद प्रदर्शित करते हैं. इसके विपरीत, corticogeniculate synapses एक कम रिलीज संभावना है. कोरटोजेनिकफाइबर फाइबर पार्श्व जेनियूट नाभिक में प्रवेश करने से पहले रेटिक्युलर थैलेमिक नाभिक को पार करते हैं। रेटिक्युलर थैलेमिक नाभिक के विभिन्न स्थानों (पार्श्व जेनुलेट नाभिक से रोस्टली) और ऑप्टिक पथ (पार्श्व जेनिक न्यूक्लियस से वेंटरो-लैटरली) उत्तेजक corticogeniculate या रेटिनोजेनिक synapses अलग से अनुमति देते हैं के साथ extracellular उत्तेजना इलेक्ट्रोड. यह पार्श्व geniculate नाभिक एक आदर्श मस्तिष्क क्षेत्र है जहां बहुत अलग गुण एक ही सेल प्रकार पर imping के साथ दो उत्तेजक synapses बनाता है, एक साथ अध्ययन किया जा सकता है. यहाँ, हम रिले न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग की जांच करने के लिए और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में रेटिनोजेनिक्युलेट और corticogeniculate synapse समारोह का विस्तृत विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. लेख पार्श्व geniculate नाभिक की तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल और ऑप्टिक पथ और corticogeniculate फाइबर अलग से उत्तेजक द्वारा रिले न्यूरॉन्स से गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए कदम शामिल हैं.

Introduction

पार्श्व जेनुलेट नाभिक के रिले न्यूरॉन्स एकीकृत और दृश्य प्रांतस्था के लिए दृश्य जानकारी रिले. इन न्यूरॉन्स रीटेजनिक synapses के माध्यम से गुच्छिका कोशिकाओं से उत्तेजक इनपुट प्राप्त करते हैं, जो रिले न्यूरॉन्स के लिए मुख्य उत्तेजक ड्राइव प्रदान करते हैं. इसके अलावा, रिले न्यूरॉन्स corticogenic ulate synapses के माध्यम से cortical न्यूरॉन्स से उत्तेजक आदानों प्राप्त करते हैं. इसके अलावा, रिले न्यूरॉन्स स्थानीय interneurons और नाभिक रेटिक्युलेरिस थैलेमी1के GABAergic न्यूरॉन्स से निरोधात्मक आदानों प्राप्त करते हैं। नाभिक रेटिक्युलरिस थैलेमी थैलेमस और कॉर्टेक्स के बीच एक ढाल की तरह मौजूद होता है जिससे कॉर्टेक्स से थैलेमस में और विपरीत दिशा में पेश होने वाले रेशों को नाभिक रेटिक्युलेरिस थैलमी2के माध्यम से जाना चाहिए .

रेटिनोजेनिक इनपुट और कोर्टिजेनिक इनपुट विशिष्ट synaptic गुण3,4,5,6,7,8प्रदर्शित करते हैं . रेटिनोजेनिक आदानों कई रिलीज साइटों9,10के साथ बड़े टर्मिनलों के रूप में . इसके विपरीत, corticogeniculate आदानों एकल रिलीज साइटों7के साथ छोटे टर्मिनलों प्रदर्शित करते हैं. इसके अलावा, रेटिनोजेनिक synapses कुशलता से रिले न्यूरॉन्स की कार्रवाई क्षमता ड्राइव रिले न्यूरॉन्स पर सभी synapses के केवल 5 $10% का गठन होने के बावजूद3,8,11. दूसरी ओर, कोरिकजनिक synapses, रिले न्यूरॉन्स12,13की झिल्ली क्षमता को नियंत्रित करके रेटिनोजेनिक संचरण की एक न्यूनाधिक के रूप में सेवा करते हैं।

इन दो मुख्य उत्तेजक आदानों रिले न्यूरॉन्स के लिए भी कार्यात्मक अलग हैं. एक प्रमुख अंतर यह है कि रेटिनोनिक synapses की अल्पकालिक अवसाद और corticogeniculate synapses 3,5,8की अल्पकालिक सुविधा है. अल्पकालिक प्लास्टिकता एक घटना है जिसमें synaptic शक्ति परिवर्तन जब synapse कई सेकंड के लिए कुछ मिलीसेकंड की एक समय अवधि के भीतर बार-बार सक्रिय है को संदर्भित करता है. Synaptic रिलीज संभावना अल्पकालिक प्लास्टिक के अंतर्निहित एक महत्वपूर्ण कारक है. Synapses, एक कम प्रारंभिक रिलीज संभावना के साथ, प्रदर्शन अल्पकालिक सुविधा के कारण Ca 2 के buildup के कारण2 + presynapse में और इसके परिणामस्वरूप रिलीज संभावना में वृद्धि दोहराया गतिविधि पर मनाया जाता है. इसके विपरीत, उच्च रिलीज संभावना के साथ synapses आमतौर पर तैयार-releasable vesicles14की कमी के कारण अल्पकालिक अवसाद प्रदर्शित करते हैं. इसके अलावा, पदों के desensitization कुछ उच्च रिलीज संभावना synapses8,15में अल्पकालिक प्लास्टिक के लिए योगदान देता है. उच्च रिलीज संभावना और $-एमिनो-3-hydroxy-5-मेथिल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) रिसेप्टर्स के desensitization रेटिनोजेनिक synapses के प्रमुख अल्पकालिक अवसाद में योगदान. इसके विपरीत, कम रिलीज संभावना corticogeniculate synapses की अल्पकालिक सुविधा underlies.

चूहों में, ऑप्टिक पथ पुच्छपार्श् विक साइट से पृष्ठीय पार्श्व जेनियूलेट न्यूक्लियस (dLGN) में प्रवेश करता है, जबकि कोरिकजेनिकेट फाइबर डीएलजीएन रोस्ट्रोवेंराली में प्रवेश करते हैं। दो आदानों के बीच की दूरी एक ही सेल पर imping दो बहुत अलग उत्तेजक आदानों के व्यक्तिगत गुणों की जांच के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम पर निर्माण और एक पहले से वर्णित विच्छेदन विधि में सुधार जिसमें रेटिनोजेनिक और corticogeniculate फाइबर तीव्र मस्तिष्क स्लाइस3में संरक्षित कर रहे हैं. हम, तो, रिले न्यूरॉन्स के electrophysiological जांच और रेटिनोजेनिकऔर्युलेट की उत्तेजना और extracellular उत्तेजना इलेक्ट्रोड के साथ corticogeniculate फाइबर का वर्णन. अंत में, हम biocytin और बाद में शारीरिक विश्लेषण के साथ रिले न्यूरॉन्स के भरने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

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Protocol

सभी प्रयोगों को राइनलैंड-पैलेटिनेट के पशु प्रयोगों पर सरकारी पर्यवेक्षी पैनल द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. समाधान

  1. विच्छेदन समाधान
    1. excitotoxicity को कम करने के लिए, एक choline आधारित समाधान तैयार करने के लिए यहाँ प्रस्तुत के रूप में विच्छेदन के दौरान इस्तेमाल किया जा करने के लिए (एम एम में): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 choline क्लोराइड, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2 , और 25 ग्लूकोज. विच्छेन समाधान प्रयोग से कम 1 सप्ताह पहले तैयार करें।
  2. रिकॉर्डिंग समाधान
    1. (एम एम में) युक्त एक कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ (ACSF) समाधान तैयार करें: 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, और 25 ग्लूकोज. एन-मेथिल-डी-एसपार्टेट (एनएमडीए) और गाबाए रिसेप्टर्स को ब्लॉक करने के लिए 50 डिग्री एम डी-एवीवी और 10 डिग्री एम एसआर 95531 हाइड्रोब्रोमाइड जोड़ें।
  3. अंतरकोशिकीय विलयन
    1. एक intracellular समाधान युक्त तैयार करें (एम में): 35 Cs-gluconate, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, और 0.1 डी-600 (methoxyverapamil हाइड्रोक्लोराइड). CsOH के साथ 7.3 करने के लिए पीएच समायोजित करें। फ़िल्टर, aliquot, और उपयोग जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान की दुकान।

2. विच्छेदन

  1. दो स्लाइस कक्षों को तैयार की, जिनमें से एक विच्छेदन समाधान के 100 एमएल से भरा हुआ है और दूसरा 100 एमएल रिकॉर्डिंग समाधान के साथ। एक पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में दो बीकर रखें और विच्छेदन से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए कार्बोजन के साथ समाधान बुलबुला।
  2. बर्फ ठंडा (लेकिन जमे हुए नहीं) विच्छेदन समाधान के 250 एमएल के साथ एक प्लास्टिक बीकर भरें। उपयोग से पहले कम से कम 15 मिनट carbogen के साथ बुलबुला.
  3. एक प्लास्टिक पेट्री डिश (100 मिमी x 20 मिमी), जिसमें मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन किया जाएगा भरें, ठंड विच्छेदन समाधान के साथ. पेट्री डिश के ढक्कन में फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें।
  4. वाइब्राटोम के विच्छेदन कक्ष को शांत करें।
  5. माउस पिंजरे में 2.5% isoflurane, उदा. के साथ एक माउस Anesthetize. जैसे ही माउस एक पूंछ चुटकी का जवाब नहीं है, गर्भाशय ग्रीवा मेडुला के पास माउस decapitate और पेट्री डिश के आधार में बर्फ ठंडा विच्छेदन समाधान में सिर विसर्जित.
  6. सिर की त्वचा को पुच्छ से नाक तक काटें और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए बाद में उंगलियों के साथ रखें। अग्रमस्तिष्क को बाहर निकालने के लिए, पहले पीछे की ओर-पूर्व मध्य रेखा के साथ खोपड़ी को काटा, और फिर कोरोनल सीवन और लैम्बडोइड सीवन के माध्यम से दो बार काटा (चित्र 1क)।
  7. कोरोनल सीवन और लैम्बडोइड सीवन के बीच खोपड़ी को निकालें ताकि सेरेब्रम उजागर हो। घ्राण बल्ब को काटें और मस्तिष्क को मध्यमस्तिष्क से एक महीन ब्लेड से अलग करें (चित्र 1ख) एक पतली स्पैचुला के साथ खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और पेट्री डिश के ढक्कन में फिल्टर पेपर पर रखें।
    नोट: कदम 2.6 और 2.7 सेल मौत को कम करने के लिए संभव के रूप में तेजी से किया जाना चाहिए.
  8. मस्तिष्क स्लाइस में डीएलजीएन को संवेदी और वल्टिकल आदानों की अखंडता को बनाए रखने के लिए, दोनों गोलार्द्धों को 3 डिग्री 5 के कोण के साथ एक पैरासैसिटल कट से अलग करें (चित्र 1ब्,डी)। दोनों गोलार्द्धों के मध्योकीय समतलों को फिल्टर पेपर पर रखकर सुखाइए और फिर क्षैतिज तल से 10 डिग्री 25 डिग्री के कोण से उन्हें काटने के चरण पर चिपकादें (चित्र 1त्) ।
  9. धातु बफर ट्रे के केंद्र में मंच प्लेस और धीरे बफर ट्रे में बर्फ ठंडा विच्छेदन समाधान के बाकी डालना. इस चरण को सावधानी से करें क्योंकि एक मजबूत डालना चिपकाए गए मस्तिष्क को हटा सकता है (चित्र 1F) ।
  10. बर्फ से भरे ट्रे में बफर ट्रे रखें, जो विच्छेदन के दौरान कम तापमान को बनाए रखने में मदद करता है। 0ण्1 उउउउ उउ की चाल तथा 1 उउम के आयाम पर रेजर ब्लेड से 250 डिग्री मी स्लाइस काटलीजिय।
  11. लगभग 30 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर oxygenated विच्छेदन समाधान से भरा होल्डिंग कक्ष में स्लाइस रखें और फिर स्लाइस एक और 30 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर रिकॉर्डिंग समाधान में ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं।
  12. वसूली के बाद, पानी के स्नान से टुकड़ा पकड़े कक्ष को हटा दें और प्रयोगों में इस्तेमाल किया जब तक कमरे के तापमान (आरटी) पर स्लाइस रखने के लिए।

3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं और एक फिलामेंट खींचने वाले का उपयोग करके पिपपेट को खींचें। 3 "4 M] पर रिकॉर्डिंग pipettes के प्रतिरोध को बनाए रखें। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्तेजक pipettes खींचो, लेकिन व्यास को बढ़ाने के लिए खींच के बाद थोड़ा टिप तोड़। रिकॉर्डिंग समाधान के साथ उत्तेजक pipettes भरते हुए, intracellular समाधान और biocytin के साथ रिकॉर्डिंग pipettes भरें।
  2. रिकॉर्डिंग कक्ष में स्लाइस रखें और आरटी पर ऑक्सीजनयुक्त रिकॉर्डिंग समाधान के साथ स्लाइस को लगातार perfuse. सभी स्लाइस की जाँच करें और एक बरकरार ऑप्टिक पथ प्रदर्शित करने वाले लोगों का चयन करें।
  3. अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर-डीआईसी) वीडियो माइक्रोस्कोपी से लैस एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ टुकड़ा और कोशिकाओं कल्पना।
    नोट: रिले न्यूरॉन्स उनके बड़े सोमा आकार और अधिक प्राथमिक dendrites द्वारा interneurons से विभेदित कर रहे हैं (शाखा सोमा से उभर तेजाब). Interneurons एक छोटे सोमा के साथ द्विध्रुवी आकारिकी प्रदर्शित करते हैं.
  4. रिकॉर्डिंग पिपेट के साथ सेल पैचिंग से पहले टुकड़ा पर उत्तेजक पिपेट रखें। रेटिनोजेनिक synapses की जांच करने के लिए, उत्तेजक पिपेट सीधे ऑप्टिक पथ पर रखें, जहां रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं से एक्सॉन फाइबर बंडल हैं (चित्र 2A)। कोर्टिकोजेनिक synapses का विश्लेषण करने के लिए, नाभिक रेटिक्युलेरिस थैलेमी पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड रखें, जो कि ड्रोस्ट्रोवेंट्रिकल डीएलजीएन से सटे हुए हैं (चित्र 2ख)।
  5. एक बार रिकॉर्डिंग पिपेट रिकॉर्डिंग समाधान में डूब जाता है, पिपेट प्रतिरोध की निगरानी के लिए एक 5 एमवी वोल्टेज कदम लागू होते हैं। होल्डिंग क्षमता 0 mV करने के लिए सेट करें और ऑफ़सेट क्षमता रद्द करें ताकि होल्डिंग वर्तमान 0 pA है।
  6. सकारात्मक दबाव लागू करते समय रिकॉर्डिंग पिपेट के साथ सेल दृष्टिकोण. जब पिपेट कोशिका झिल्ली के सीधे संपर्क में हो, तो धनात्मक दबाव छोड़ें, और धारण क्षमता को -70 एमवी पर सेट करें। कोशिका झिल्ली को कांच के पिपेट से संलग्न करने की अनुमति देने के लिए थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू करें ताकि एक गीगाओम सील रूप (प्रतिरोध एवं 1 ग्राम])। पिपेट समाई को क्षतिपूर्ति और नकारात्मक दबाव दालों के आवेदन के द्वारा सेल खुला.
  7. synaptic समारोह की जांच करने के लिए, लागू 0.1 एमएस वर्तमान दालों (ca. 30 $A) उत्तेजना पाइपेट के माध्यम से. यदि कोई synaptic प्रतिक्रियाओं मनाया जाता है, उत्तेजक pipettes को प्रतिस्थापित किया जा सकता है. एक अलग स्थिति है कि दर्ज सेल खो नहीं है करने के लिए उत्तेजक pipettes रखने के दौरान सावधान रहें।
    नोट: चित्र 2में दिखाए गए उदाहरण रिकॉर्डिंग में, synaptic अल्पकालिक plasticity ऑप्टिक पथ उत्तेजक या corticogeniculate फाइबर दो बार 30 एमएस अंतर उत्तेजना अंतराल के साथ द्वारा जांच की गई थी. युग्मित-पल्स अनुपात (पीपीआर) की गणना प्रथम ईपीएससी (ईपीएससी2/ प्रत्येक उत्तेजना प्रोटोकॉल 20 बार दोहराया गया था. EPSC आयाम 20 sweeps के औसत धाराओं से मापा गया था. प्रत्येक पुनरावृत्ति के बीच समय अंतराल था कम से कम 5 s repetitions द्वारा प्रेरित अल्पकालिक plasticity से बचने के लिए.
  8. एक 5-mV वोल्टेज कदम लागू करने से लगातार श्रृंखला प्रतिरोध की निगरानी करें। केवल विश्लेषण के लिए 20 एमजेड से छोटे श्रृंखला प्रतिरोध के साथ कोशिकाओं का उपयोग करें।

4. बायोसाइटिन लेबलिंग

  1. कम से कम 5 मिनट के लिए पूरे सेल विन्यास बनाए रखने के लिए distal dendrites में biocytin के प्रसार की अनुमति.
  2. रिकॉर्डिंग के बाद, धीरे से कोशिका से पिपेट निकालें ताकि सोमा नष्ट न हो।
    नोट: यदि एक से अधिक सेल एक टुकड़ा पर दर्ज की गई है, उनके somas पर्याप्त रूप से अपने पड़ोसी कोशिकाओं से दूर होना चाहिए. सुनिश्चित करें कि विभिन्न कोशिकाओं से dendrites इमेजिंग के दौरान एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप नहीं करते.
  3. एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट तैयार करें. प्रत्येक को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 300 जेडएल के साथ अच्छी तरह से भरें। पीएफए के साथ कुछ भी दूषित नहीं करने का ध्यान रखें जो रिकॉर्ड किए जाने वाले स्लाइस के संपर्क में होगा।
  4. रिकॉर्डिंग चैम्बर से स्लाइस को एक रबर पिपेट के साथ पीएफए युक्त प्लेट में स्थानांतरित करें और स्लाइस को रात भर ठीक करें। सुनिश्चित करें कि पिपेट को हमेशा पीएफए संदूषण से रोका जाता है।
    चेतावनी: हमेशा दस्ताने पहनते हैं और एक रासायनिक हुड का उपयोग करें जब पीएफए जोड़ तोड़.
  5. पीएफए में रात भर स्लाइस फिक्सिंग के बाद, फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ पीएफए की जगह लें। भविष्य के प्रसंस्करण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्लाइस स्टोर (कम से कम 2 सप्ताह).
  6. ताजा पीबीएस 3 बार (10 मिनट प्रत्येक धोने) के साथ स्लाइस धो लें।
  7. अवरुद्ध समाधान में स्लाइस incubating द्वारा गैर विशिष्ट बाध्यकारी साइटों ब्लॉक (0.2% गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट और PBS में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन) एक कक्षीय शेकर पर आरटी में 2 एच के लिए।
  8. ब्लॉकिंग समाधान छोड़ें। एक कक्षीय शेकर पर रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान (1:1,000) में पतला streptavidin-एलेक्सा 568 के साथ स्लाइस इनक्यूबेट।
  9. एंटीबॉडी समाधान छोड़ें और एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार स्लाइस धोएं। बढ़ते से पहले नल के पानी के साथ स्लाइस धो लें।
  10. एक गिलास स्लाइड पर एक माउस से स्लाइस रखो. सुनिश्चित करें कि दाग कोशिकाओं स्लाइस के शीर्ष सतह पर मौजूद हैं। ऊतकों के साथ स्लाइस के आसपास पानी को अवशोषित और फिर लगभग 15 मिनट के लिए सूखी करने के लिए स्लाइस छोड़ दें।
  11. प्रत्येक टुकड़ा पर बढ़ते माध्यम के दो बूँदें लागू करें. हवा के बुलबुले के उत्पादन के बिना स्लाइड पर एक coverslip माउंट।
  12. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ दृश्य के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर लेबल स्लाइस स्टोर.

5. सेलुलर इमेजिंग और पुनर्निर्माण

  1. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइस स्कैन और विश्लेषण के लिए संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
  2. 561 एनएम पर फ्लोरोसेंट को उत्तेजित करें।
  3. छवि 0.7 संख्यात्मक एपर्चर (एनए), तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ स्लाइस.
  4. दृश्य के बीच में लक्षित सेल समायोजित करें और 2.5 बार आवर्धन लागू करें।
  5. निम्नलिखित मापदंडों के साथ पूरे न्यूरॉन को स्कैन करने के लिए जेड-स्टैक डेटासेट प्रदान करें: प्रारूप $ 2,550 x 2,550 पिक्सेल, स्कैन आवृत्ति $ 400 हर्ट्ज, z संख्या $ 40.Voxel आकार 0.1211 x 1.8463 [m3] के आसपास था।
  6. अर्द्ध स्वचालित रूप से एक न्यूरॉन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग न्यूरॉन्स का पता लगाने (उदा., NeuronStudio). एक 3 डी का पता लगाया रिले न्यूरॉन का एक उदाहरण चित्र 3खमें दिखाया गया है।

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Representative Results

डीएलजीएन की स्लाइस तैयारी जिसमें रेटिनोजेनिक और कोरिकोजेनेरेट पथ होते हैं, को 4x उद्देश्य के अंतर्गत दिखाया गया है (चित्र 2)। दृष्टिपथ में रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं के अक्ष एक साथ बंडल होते हैं (चित्र 2)। उत्तेजक पिपेट को ऑप्टिक ट्रैक्ट पर रेटिनोजेनिक सिनेप्स-मध्यस्थ धारा (चित्र 2क) और नाभिक रेटिक्युलेरिस थालमी को क्रमशः कोरिकोजेनिक्यूलेट synapses-मध्यस्थ धारा (चित्र 2B) प्रेरित करने के लिए रखा गया था। ध्यान दें, कॉर्टिकल न्यूरॉन्स से एल.एन.एन. न्यूरॉन्स परियोजनाओं के लिए कॉर्टेक्स से thalamus के लिए axons नाभिक रेटिक्युलेरिस thalami पार. Corticogenicluate synapses, इसलिए, नाभिक रेटिक्युलेरिस थैलेमी में उत्तेजना से सक्रिय किया जा सकता है।

AMPA रिसेप्टर-मध्यस्थ EPSCs के युग्मित-पल्स अनुपात 1 से नीचे है जब 30 एमएस अंतर-उत्तेजना अंतराल के साथ ऑप्टिक पथ उत्तेजक, लेकिन ऊपर 1 जब एक ही अंतर उत्तेजना अंतराल के साथ corticulate फाइबर उत्तेजक (चित्र 2C,डी) . रेटिनोजेनिक synapses के युग्मित-पल्स अवसाद एक उच्च vesicle रिलीज संभावना और पदों के desensitization के कारण है. कोरिकोजेनिक synapses की युग्मित-पल्स सुविधा कम आशय रिलीज प्रायिकता16के अनुरूप है।

चित्रा 3A पैच पाइपेट की नोक के साथ एक dLGN रिले न्यूरॉन की सोमा दिखा आईआर-डीआईसी छवि से पता चलता है. Biocytin धुंधला हमें दर्ज न्यूरॉन का एक दृश्य हासिल करने के लिए सक्षम बनाता है. अंतर-न्यूरोनों से भिन्न, जिनमें द्विध्रुवी आकृतिविज्ञान होती है, रिले न्यूरॉन्स में बहुध्रुवीय डेन्ड्रिटिक वृक्ष होते हैं (चित्र 3 ख) जिसमें 3 से अधिक प्राथमिक डेन्ड्रिड8,17होते हैं . तीन आयामी (3 डी) एक biocytin लेबल रिले न्यूरॉन के पुनर्निर्माण तो उत्पन्न किया गया था जो एक रेडियल सममित डेन्ड्रिटिक वास्तुकला से पता चलता है (चित्र 3C).

Figure 1
चित्र 1 : विच्छेदन प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करने वाली योजनाएं. (ए) माउस खोपड़ी का क्षैतिज दृश्य, प्रारंभिक कटौती की स्थिति दिखा रहा है। पहली कटौती सैगिटल सीवन के साथ की गई थी, जिसके बाद क्रमशः कोरोनल सीवन और लैम्बडोइड सीवन के साथ एक और दो कटौती की गई थी। डैश्ड रेखाएं चीरों का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) पूरे मस्तिष्क का धनुर्द दृश्य। डैश्ड रेखाएँ दर्शाती हैं कि सेरेब्रम घ्राण बल्ब और मध्यमस्तिष्क से अलग है। (सी-डी) ये पैनल क्रमशः दोनों गोलार्द्धों को क्षैतिज (सी) और कोरोनल (डी) दृश्य से अलग करने के लिए पहला काटने का कोण दिखाते हैं। (ई) काटने के चरण पर एक गोलार्द्ध का कोरोनल दृश्य। डैश्ड रेखाएँ टुकड़ा करने की दिशा दर्शाती हैं। l, m, d, और v पार्श्व, मध्य, पृष्ठीय और अधर पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः, पैनल ों में गोलार्द्ध के लिए D और E. (F) काटने के चरण पर दो गोलार्द्धों के साथ विच्छेदन कक्ष के आरेख. डैश्ड तीर काटने ब्लेड की गति की दिशा को इंगित करता है। ए, च, और घ क्रमशः बाएँ गोलार्द्ध के पूर्वकाल, पश् चीय और पृष्ठीय पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। (जी) योजना डी एलजीएन के अपेक्षाकृत बड़े हिस्से के साथ एक ठीक से कटे हुए स्लाइस का प्रतिनिधित्व करने और ऑप्टिक पथ के बरकरार संरक्षण का प्रतिनिधित्व करता है। dLGN, पृष्ठीय पार्श्व geniculate नाभिक; vLGN, अधर पार्श्व नाभिक; ओटी, घ्राण बल्ब; NRT, नाभिक रेटिक्युलरिस थालमी. पैनल ों सी, डी और जी टर्नर और नमक3के चित्र 1 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : रेटिनोजेनिक और corticogeniculate रास्ते और उदाहरण रिकॉर्डिंग युक्त dLGN के स्लाइस तैयारी. (ए-बी) इन पैनलों रेटिनोजेनिक और corticogeniculate आदानों के संरक्षण के साथ एक dLGN टुकड़ा दिखा. रेटिनोजेनिक synapses को सक्रिय करने के लिए ऑप्टिक पथ पर उत्तेजना इलेक्ट्रोड रखा गया था (ए) और नाभिक रेटिक्युलेरिस थैलमी पर corticogeniculate synapses को सक्रिय करने के लिए (बी) . (ग) ऑप्टिक पथ की उत्तेजना के प्रत्युत्तर में एएमपीए रिसेप्टर-मध्यस्थ ईपीएससी 30 एमएस अंतर-उत्तेजना अंतराल के साथ दो बार। (घ) कोरिटोजेनिक्यूलेट सिनेप्स-मध्यस्थ धाराओं के साथ 30 एमएस अंतर-उत्तेजना अंतराल। उत्तेजना कलाकृतियों स्पष्टता के लिए हटा दिया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक रिले न्यूरॉन के Morphological विश्लेषण. (ए) आईआर-डीआईसी छवि पैच पिपेट की नोक के साथ एक dLGN रिले न्यूरॉन की सोमा दिखा. (बी) बायोसाइटिन के साथ लेबल किए गए रिले न्यूरॉन की कॉनफोकल छवि और स्ट्रेपटाविडिन-एलेक्सा 568 के साथ कल्पना की गई है। (ग) त्रिविम (3डी) एक ही न्यूरॉन का पुनर्निर्माण, एक रेडियल सममित डेन्ड्रिटिक वास्तुकला दिखा रहा है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम एक पहले से प्रकाशित विधि के आधार पर एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन3, जो रिलीज retinogenic synapses और एक ही टुकड़ा से जारी corticogenic synapses की कम संभावना की उच्च संभावना की जांच के लिए अनुमति देता है. यह बहुत महत्व का है क्योंकि इन दो आदानों दृश्य संकेत संचरण को मॉडुलित करने के लिए एक दूसरे के साथ बातचीत: रेटिनोजेनिक आदानों रिले न्यूरॉन्स के मुख्य उत्तेजक ड्राइव कर रहे हैं, जबकि corticothalamic आदानों एक न्यूनाधिक के रूप में कार्य करते हैं, जो रिले न्यूरॉन्स की स्थिति को प्रभावित करके रेटिनोजेनिक संचरण के लाभ को प्रभावित करता है. जैसा कि अपेक्षित था, हमने देखा कि रेटिनोजेनिक्युलेट और कोरिकोजेनुलेट सिनाप्स उनकी रिहाई संभावनाओं में अंतर के कारण विभिन्न अल्पकालिक प्लास्टिक प्रदर्शित करते हैं। इसके अतिरिक्त, AMPA रिसेप्टर desensitization भी रेटिनोजेनिक synapses9,15,16में मजबूत अवसाद के लिए योगदान देता है. हम हाल ही में पता चला है कि अल्पकालिक अवसाद CKAMP4416द्वारा संग्राहक है , एक AMPA रिसेप्टर सहायक प्रोटीन CKAMP परिवार के कि AMPA रिसेप्टर्स के desensitization से वसूली धीमा कर देता है18,19, 20. इसके अलावा, रेटिनोजेनिक सिनैप्स-मध्यस्थ वर्तमान आयाम एक ही उत्तेजक शक्ति के तहत corticogeniculate synapse-मध्यस्थ धाराओं के उन लोगों की तुलना में अधिक हैं, कई के साथ बड़े रेटिनोजेनिक synapses के अनुरूप साइटों को रिहा, और अपेक्षाकृत छोटे corticogenic ulate synapses7,21.

टुकड़ा करने का प्रोटोकॉल अनिवार्य रूप से टर्नर और साल्ट3द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के समान होता है . कुछ संशोधन है कि हमारे अनुभव पर आधारित थे टुकड़ा गुणवत्ता में सुधार. Hauser एट अल22के समान, हम एक sucrose आधारित विच्छेदन समाधान के बजाय एक choline आधारित इस्तेमाल किया. विच्छेदन के बाद वसूली 30 मिनट के लिए काटने के समाधान में 34 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था और फिर एक और 30 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग समाधान में और कमरे के तापमान पर नहीं। स्लाइस थोड़ा पतले थे (250 डिग्री मी के बजाय 400 डिग्री मी). हमने 10 डिग्री 25 डिग्री के कोण के साथ एक वेज का उपयोग करके मस्तिष्क को विच्छेदित किया, जो टुकड़ा करने की प्रक्रिया की विश्वसनीयता को सुविधाजनक और बढ़ाता है।

रिले न्यूरॉन synapse समारोह की जांच के लिए रिकॉर्डिंग और उत्तेजना की स्थिति अनिवार्य रूप से एक ही कर रहे हैं के रूप में पहले चेन और Regehr8द्वारा वर्णित . ऑप्टिक पथ फाइबर के सक्रियण आमतौर पर बड़ी धाराओं को प्रकाश में लाता है और कई एन ए की रेंज में हो सकता है जब एक रिले न्यूरॉन्स पर सभी रेटिनोजेनिक synapses सक्रिय कर रहे हैं23. श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटियों को रोकने के लिए, विशेष रूप से जब एक रिले न्यूरॉन्स पर सभी रेटिनोजेनिक synapses सक्रिय करके अधिकतम वर्तमान की जांच, चेन और Regehr रिकॉर्डिंग कम प्रतिरोध pipettes इस्तेमाल किया (और lt;2 एम ]). हालांकि, synaptic अल्पकालिक plasticity की जांच करने के लिए, यह एक या कुछ रेटिना गुच्छिका सेल axons को सक्रिय करने के लिए suffices, जो धाराओं कि 34 डिग्री 579 पीए की सीमा में हैं प्रकाश में लाता है (अप्रकाशित परिणाम, चेन एट अल.). 3 के बीच एक प्रतिरोध के साथ छोटे pipettes, इसलिए, जब ऑप्टिक पथ की कमजोर उत्तेजना का उपयोग कर रेटिनोजेनिक synapse समारोह की जांच कर सकते हैं. कोरिकोजेनिक सिनैप्स का सक्रियण अपेक्षाकृत छोटी धाराओं को प्राप्त करताहै। श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटियों, इसलिए, एक छोटी समस्या है जब corticogeniculate synapse समारोह की जांच कर रहे हैं.

हम यहाँ बताते हैं कि रेटिनोजेनिक्युलेट और corticogeniculate synapses की उत्तेजना AMPA रिसेप्टर मध्यस्थता धाराओं की अल्पकालिक प्लास्टिक की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ही प्रोटोकॉल NMDA रिसेप्टर मध्यस्थता वर्तमान24रिकॉर्ड करने के लिए लागू किया जा सकता है. वास्तव में, पहले संकेत है कि AMPA रिसेप्टर desensitization retinogeniculate synapses में अल्पकालिक plasticity के लिए योगदान देता है प्रयोगों में जो AMPA रिसेप्टर-मध्यस्थ धाराओं के युग्मित पल्स अनुपात के साथ तुलना में थे से आया NMDA रिसेप्टर-मध्यस्थ धाराओं के युग्मित-पल्स अनुपात. Corticogeniculate synapses नाभिक रेटिक्युलेरिस thalami में उत्तेजना पाइपेट स्थिति से प्रेरित थे क्योंकि cortical न्यूरॉन्स के axons कि उत्तेजित dLGN रिले न्यूरॉन्स इस thalamic नाभिक भर में यात्रा. उसी उत्तेजना स्थिति का उपयोग डीएलजीएन में निरोधात्मक synaptic धाराओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जैसा कि गोविन्दया और कॉक्स25द्वारा उदाहरण के लिए दिखाया गया है .

रिले न्यूरॉन्स गाबाए और गाबाबी रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं. गाबा की रिहाई synaptic गाबाएक रिसेप्टर्स को सक्रिय करता है. गाबाबी रिसेप्टर्स, जो extrasynaptically स्थानीयकृत कर रहे हैं, सक्रिय कर रहे हैं जब नाभिक रेटिक्युलरिस thalami दृढ़ता से विस्फोट फायरिंग के दौरान उदाहरण के लिए सक्रिय कर रहे हैं26,27,28. गाबा के spillover, जो आम तौर पर एस्ट्रोसाइट्स द्वारा गाबा तेज करने के कारण प्रतिबंधित है, तीव्र synapse सक्रियण के दौरान सक्रिय कर सकते हैं extrasynaptic गाबाबी रिसेप्टर्स27,28. उत्तेजना तीव्रता और आवृत्ति तुलनात्मक रूप से कम थे क्योंकि हम गाबाबी रिसेप्टर्स ब्लॉक नहीं किया. हालांकि, जब तीव्र उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग corticogenic synapse समारोह की जांच यह गाबाबी रिसेप्टर्स जोड़ने के लिए बेहतर हो सकता है.

dLGN रिले न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग आसानी से किया जा सकता है जब स्लाइस है कि मस्तिष्क के पार्श्व सतह से लगभग 2 मिमी मध्यस्थ का उपयोग कर रहे हैं (लगभग इकट्ठा शुरू 250 डिग्री स्लाइस काटने के दौरान 250 डिग्री स्लाइस के). कुछ स्लाइस में, नहीं एक दिया रिले न्यूरॉन करने के लिए दोनों आदानों का पता लगाया जा सकता है क्योंकि दो रास्ते में से एक रिले न्यूरॉन के करीब टूट रहे हैं. इस मामले में, यह आमतौर पर अभी भी प्रत्येक इनपुट के लिए अलग रिले न्यूरॉन्स का चयन करके एक ही टुकड़ा में रेटिनोजेनिक और corticogeniculate synapses की जांच करने के लिए संभव है. रेटिनोजेनिक को रिकॉर्ड करने के लिए synapse मध्यस्थता वर्तमान, ventrally स्थित रिले न्यूरॉन्स का चयन कर रहे हैं के बाद से इन कोशिकाओं के लिए ऑप्टिक पथ फाइबर अधिक संभावना dorsally स्थित रिले न्यूरॉन्स में से संरक्षित कर रहे हैं. इसके विपरीत, corticogeniculate आदानों अधिक होने की संभावना रिले न्यूरॉन्स कि dLGN में dorsally स्थित हैं पर संरक्षित कर रहे हैं.

स्लाइस गुणवत्ता डेटा की विश्वसनीयता निर्धारित करता है। हमारे अनुभव के आधार पर, निम्नलिखित मानकों अच्छा टुकड़ा गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं. शीतलक और ऑक्सीजन विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कारक हैं. माउस के सिर को माउस के decapitation के तुरंत बाद ठंडे समाधान में रखा जाना चाहिए। जब मस्तिष्क खोपड़ी से बाहर ले, यह बर्फ ठंडा समाधान में हर 3 से 4 s में डूब जाना चाहिए ताकि सेल मौत को कम करने के लिए. इसी प्रकार, टुकड़ा करने की प्रक्रिया लगभग 4 डिग्री सेल्सियस पर की जानी चाहिए। इसके अलावा, विच्छेदन समाधान और रिकॉर्डिंग समाधान पर्याप्त ऑक्सीजन एकाग्रता बनाए रखने के लिए उपयोग करने से पहले कम से कम 15 मिनट oxygenated किया जाना चाहिए. इसके अलावा, सोडियम चैनलों को अवरुद्ध कुशलतापूर्वक न्यूरॉन गतिविधि को कम कर सकते हैं. इसलिए, 37.5 mmol choline युक्त एक विच्छेदन समाधान का इस्तेमाल किया गया था.

रिले न्यूरॉन्स कम थ्रेसहोल्ड spikes प्रदर्शित करते हैं, जो क्षणिक Ca द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं2 + वर्तमान29. वोल्टेज gated Ca2 +-चैनलों को ब्लॉक करने के लिए, हम d-600 (methoxyverapamil) intracellular समाधान करने के लिए जोड़ा. डी-600 का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए यदि अध्ययन का उद्देश्य रिले न्यूरॉन्स में कम थ्रेसहोल्ड spikes की जांच करना है। पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग की परिशुद्धता अंतरिक्ष दबाना त्रुटियों से प्रभावित है. यह तकनीकी समस्या उन आगतों के लिए अधिक प्रासंगिक है जो रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से बहुत दूर हैं (इस प्रकार दूरस्थ synapses के लिए)30,31. स्थान क्लैम्प त्रुटि के प्रभाव को कम करने के लिए, हमने K+-आधारित intracellular समाधान के बजाय Cs+-आधारित Cs का उपयोग किया. चैनल है कि कश्मीर+ पारगम्य हैं (उदा., लीक चैनल) आमतौर पर सीएस+ अपारगम्य32हैं. इस प्रकार, एक Cs का उपयोग+आधारित intracellular समाधान सेल के प्रतिबाधा बढ़ जाती है.

स्थिर पैच दबाना रिकॉर्डिंग स्वस्थ कोशिकाओं के चयन पर निर्भर करता है. गोल सोमा आकार, गहरे रंग या सूजन सोमा के साथ न्यूरॉन्स से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, रिले न्यूरॉन्स उनके बड़े सोमा आकार और अधिक विस्तृत प्राथमिक डेन्ड्रिटिक arbors द्वारा स्थानीय interneurons से प्रतिष्ठित हैं. इसलिए, हमने उन कोशिकाओं का चयन किया जिनका आकार बड़ा सोमा आकार (व्यास में 15 डिग्री मी से बड़ा) और गैर-द्विध्रुवीय आकारिकी है। चित्र ाााल3ख में दर्शाए गए उदाहरण कोशिका में सममित डेन्ड्रिटिक वास्तुकला है और इसलिए इसे रिले न्यूरॉन के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है जो उदाहरण के लिए बिल्ली एलजीएन17में पाया जाता है।

श्रृंखला प्रतिरोध के रूप में संभव के रूप में छोटे और बनाए रखा स्थिर होना चाहिए. इसके अलावा, चूंकि दो दिशाओं से इनपुट एक टुकड़ा में संरक्षित हैं, यह महत्वपूर्ण है कि दो आदानों के बीच हस्तक्षेप से छुटकारा मिलता है। रेटिनोजेनिकफाइबर फाइबर को सक्रिय करने से बचने के लिए जब रेटिनोजेनिकसियूलेट synapse-मध्यस्थ धाराओं या इसके विपरीत, उत्तेजक पिपेट dLGN में नहीं रखा जाना चाहिए और उत्तेजक और रिकॉर्डिंग पिपेट के बीच की दूरी के रूप में दूर के रूप में होना चाहिए संभव. इसके अलावा, उत्तेजक और रिकॉर्डिंग pipettes के बीच लंबी दूरी अपेक्षाकृत बरकरार एक्सॉन संरक्षण की आवश्यकता है. इसलिए, विच्छेदन के लिए एक उचित काटने कोण का चयन किया जाना चाहिए। सामान्य में, दो आदानों के संरक्षण के साथ केवल एक या दो स्लाइस प्रत्येक गोलार्द्ध से प्राप्त किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र (SFB) 1134 "कार्यात्मक एनसेंबल्स" (J.V.E. और X.C.) और अनुसंधान अनुदान EN948/1-2 (J.V.E.) के भीतर जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

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References

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Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

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