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Neuroscience

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Published: August 7, 2019 doi: 10.3791/59680
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Abstract

Der laterale Geniculate-Kern ist die erste Relaisstation für die visuelle Information. Relay-Neuronen dieses thalamischen Kerns integrieren Deninput aus retinalen Ganglienzellen und projizieren sie auf den visuellen Kortex. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen eine Top-Down-Erregung aus dem Kortex. Die beiden wichtigsten erregerten Eingänge zu den Relaisneuronen unterscheiden sich in mehreren Aspekten. Jedes Relaisneuron erhält Deninput von nur wenigen retinogenen Synapsen, die große Terminals mit vielen Freisetzungsstellen sind. Dies spiegelt sich in der vergleichsweise starken Anregung wider, die die Relaisneuronen von retinalen Ganglienzellen erhalten. Corticogeniculate Synapsen, im Gegensatz dazu, sind einfacher mit wenigen Freisetzungsstellen und schwächere synaptische Stärke. Die beiden Synapsen unterscheiden sich auch in ihrer synaptischen kurzfristigen Plastizität. Retinogene Synapsen haben eine hohe Freisetzungswahrscheinlichkeit und zeigen daher eine kurzfristige Depression. Im Gegensatz dazu haben kortizogene Synapsen eine geringe Freisetzungswahrscheinlichkeit. Corticogeniculate Fasern durchqueren die retikulären thalamischen Kerne, bevor sie in den lateralen Geniculate-Kern gelangen. Die verschiedenen Positionen des retikulären thalamischen Kerns (rostral aus dem lateralen Genulatenkern) und des Optiktraktes (ventro-lateral aus dem lateralen Geniculate-Kern) ermöglichen die anregende Kortikogenesulate oder Retinogene Uuplate-Synapsen getrennt mit extrazellulären Stimulationselektroden. Dies macht den lateralen Geniculate-Kern zu einem idealen Hirnbereich, in dem zwei exzitatorische Synapsen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften, die auf denselben Zelltyp einwirken, gleichzeitig untersucht werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Aufzeichnung von Relaisneuronen und zur detaillierten Analyse der Retinogenulate- und Kortikogenen-Synapsenfunktion in akuten Hirnscheiben. Der Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von akuten Hirnscheiben des lateralen Geniculate-Kerns und Schritte zur Aufzeichnung der Aktivität von Relaisneuronen durch separate Stimulierung des Optiktraktes und der kortizogenen Fasern.

Introduction

Relay Neuronen des lateralen Geniculate-Kerns integrieren und leiten visuelle Informationen an den visuellen Kortex weiter. Diese Neuronen erhalten exzitatorische Eingaben von Ganglienzellen über retinogene Synapsen, die den Haupterregerantrieb für Relaisneuronen darstellen. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen exzitatorische Eingaben von kortikalen Neuronen über kortikogene Synapsen. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen hemmende Inputs von lokalen Interneuronen und GABAergen Neuronen des Kerns reticularis thalami1. Der Kern reticularis thalami ist wie ein Schild zwischen Thalamus und Kortex vorhanden, so dass Fasern, die von Kortex zu Thalamus und in die entgegengesetzte Richtung projizieren, durch den Kern reticularis thalami2gehen müssen.

Retinogene in- und kortikogene Inputs weisen unterschiedliche synaptische Eigenschaftenauf 3,4,5,6,7,8. Retinogene Inputs bilden große Terminals mit mehreren Freisetzungsstellen9,10. Im Gegensatz dazu zeigen kortizogene Eingänge kleine Terminals mit Single Release-Sites7an. Darüber hinaus treiben Retinogene Synapsen effizient Aktionspotenziale von Relaisneuronen an, obwohl sie nur 5 bis 10 % aller Synapsen auf Relaisneuronen3,8,11ausmachen. Corticogeniculate Synapsen dienen dagegen als Modulator von Retinogenulatenübertragungen, indem sie das Membranpotenzial der Relaisneuronen12,13steuern.

Diese beiden wichtigsten erregenden Inputs für Relais-Neuronen sind auch funktional unterschiedlich. Ein deutlicher Unterschied ist die kurzfristige Depression von retinogenen Synapsen und die kurzfristige Erleichterung von Kortikogenen Synapsen3,5,8. Kurzfristige Plastizität bezieht sich auf ein Phänomen, bei dem sich die synaptische Stärke ändert, wenn die Synapse innerhalb eines Zeitraums von wenigen Millisekunden bis zu mehreren Sekunden wiederholt aktiv ist. Die synaptische Freisetzungswahrscheinlichkeit ist ein wichtiger Faktor, der der kurzfristigen Plastizität zugrunde liegt. Synapsen, mit einer geringen anfänglichen Freisetzungswahrscheinlichkeit, zeigen kurzfristige Erleichterungen aufgrund des Aufbaus von Ca2+ in der Presynapse und folglich eine Erhöhung der Freisetzungswahrscheinlichkeit wird bei wiederholter Aktivität beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit in der Regel eine kurzfristige Depression aufgrund der Erschöpfung der fertig enveasierbaren Vesikel14. Darüber hinaus trägt die Desensibilisierung postsynaptischer Rezeptoren zur kurzfristigen Plastizität in einigen Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeitbei 8,15. Hohe Freisetzungswahrscheinlichkeit und Desensibilisierung von Rezeptoren für die Freisetzung von N-Amino-3-Hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA) tragen zur prominenten kurzfristigen Depression von Retinogenitätssynapsen bei. Im Gegensatz dazu liegt die geringe Freisetzungswahrscheinlichkeit der kurzfristigen Erleichterung von kortikogenen Synapsen zugrunde.

Bei Mäusen gelangt der Optische Trakt von der caudolateralen Stelle in den dorsalen lateralen Geniculate-Kern (dLGN), während kortizogene Fasern rostroventral in den dLGN eindringen. Der Abstand zwischen den beiden Eingängen ermöglicht die Untersuchung der individuellen Eigenschaften von zwei sehr unterschiedlichen erregerten Eingaben, die auf dieselbe Zelle einschlagen. Hier bauen wir auf einer zuvor beschriebenen Seziermethode auf und verbessern sie, bei der Retinogene und kortikogene Fasern in akuten Hirnscheiben konserviert werden3. Wir beschreiben dann die elektrophysiologische Untersuchung von Relaisneuronen und die Stimulation von Retinogenkulat- und Kortikogenulatefasern mit extrazellulären Stimulationselektroden. Schließlich stellen wir ein Protokoll zur Befüllung von Relaisneuronen mit Biocytin und anschließender anatomischer Analyse zur Verfügung.

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Protocol

Alle Experimente wurden vom Landeskontrollgremium für Tierversuche rheinland-pfalz genehmigt.

1. Lösungen

  1. Dissektionslösung
    1. Um die Exzitotoxizität zu reduzieren, bereiten Sie eine Cholin-basierte Lösung vor, die während der Sezieren verwendet werden soll, wie hier dargestellt (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 Cholinchlorid, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, und 25 Glukose. Bereiten Sie die Sezierlösung weniger als 1 Woche vor dem Experiment vor.
  2. Aufnahmelösung
    1. Bereiten Sie eine künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) Lösung vor, die (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2und 25 Glucose enthält. Fügen Sie 50 M D-APV und 10 M SR 95531 Hydrobromid hinzu, um N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) bzw. GABA-A-Rezeptoren zu blockieren.
  3. Intrazelluläre Lösung
    1. Bereiten Sie eine intrazelluläre Lösung vor, die (in mM) 35 Cs-Gluconat, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA und 0,1 D-600 (Methoxyverapamilhydrochlorid) enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit CsOH auf 7,3 ein. Filtern, aliquot, und lagern Sie die Lagerlösung bei -20 °C bis zur Verwendung.

2. Dissektion

  1. Bereiten Sie zwei Scheibenkammern vor, von denen eine mit 100 ml der Sezierlösung und die andere mit 100 ml Aufnahmelösung gefüllt ist. Die beiden Becher in ein Wasserbad (37 °C) geben und die Lösungen mit Carbogen mindestens 15 min vor der Zerlegung blasen.
  2. Füllen Sie einen Kunststoffbecher mit 250 ml nahezu eiskalter (aber nicht gefrorener) Sezierlösung. Blase mit Carbogen mindestens 15 min vor Gebrauch.
  3. Füllen Sie eine Kunststoff-Petrischale (100 mm x 20 mm), in der die Hirnsektion durchgeführt wird, mit der kalten Dissektionslösung. Legen Sie ein Stück Filterpapier in den Deckel der Petrischale.
  4. Kühlen Sie die Sezierkammer des Vibratome ab.
  5. Anästhetisieren Sie eine Maus mit 2,5% Isofluran, z.B. im Mauskäfig. Sobald die Maus nicht auf eine Schwanzprise reagiert, enthaupten Sie die Maus in der Nähe der Zervix-Medulla und tauchen Sie den Kopf in die eiskalte Dissektionslösung in der Basis der Petrischale ein.
  6. Schneiden Sie die Haut des Kopfes von kaudal zu nasal und halten Sie es seitlich mit den Fingern, um den Schädel zu belichten. Um das Vorhirn herauszunehmen, schneiden Sie zuerst den Schädel zusammen mit der hinteren vorderen Mittellinie, und schneiden Sie dann zwei weitere Male durch die koronare Naht und Lambdoid Naht (Abbildung 1A).
  7. Entfernen Sie den Schädel zwischen der koronalen Naht und der Lambdoid-Naht so, dass das Großhirn freigelegt wird. Schneiden Sie die Olfaktor-Glühbirne und trennen Sie das Vorderhirn vom Mittelhirn mit einer feinen Klinge (Abbildung 1B). Entfernen Sie das Gehirn mit einem dünnen Spachtel aus dem Schädel und legen Sie es auf das Filterpapier im Deckel der Petrischale.
    HINWEIS: Die Schritte 2.6 und 2.7 sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Zelltod zu reduzieren.
  8. Um die Integrität der sensorischen und kortikalen Eingänge in die dLGN in der Hirnscheibe zu erhalten, trennen Sie die beiden Hemisphären mit einem parasagittalen Schnitt mit einem Winkel von 3 bis 5° (Abbildung1C,D). Trocknen Sie die mediolateralen Ebenen der beiden Hemisphären, indem Sie sie auf das Filterpapier legen und dann auf die Schnittstufe mit einem Winkel von 10 bis 25° von der horizontalen Ebene kleben (Abbildung 1E).
  9. Legen Sie die Bühne in die Mitte der Metallpufferschale und gießen Sie den Rest der eiskalten Dissektionslösung vorsichtig in die Pufferschale. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig durch, da ein starker Guss das eingefügte Gehirn entfernen könnte (Abbildung 1F).
  10. Legen Sie die Pufferschale in die eisgefüllte Schale, was hilft, die niedrige Temperatur während der Zerlegung aufrechtzuerhalten. Schneiden Sie 250 m Scheiben mit einer Rasierklinge mit einer Geschwindigkeit von 0,1 mm/s und einer Amplitude von 1 mm.
  11. Die Scheiben in der Haltekammer mit sauerstoffhaltiger Dissektionslösung bei 34 °C ca. 30 min aufbewahren und die Scheiben dann bei 34 °C weitere 30 min in der Aufnahmelösung erholen lassen.
  12. Nach der Bergung die Scheibenhaltekammer aus dem Wasserbad entfernen und Scheiben bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren, bis sie in Experimenten verwendet werden.

3. Elektrophysiologie

  1. Ziehen Sie Pipetten mit Borosilikatglaskapillaren und einem Filamentzieher. Halten Sie den Widerstand der Aufnahmepipetten bei 3 x 4 Mio. € aufrecht. Ziehen Sie stimulierende Pipetten mit dem gleichen Protokoll, aber brechen Sie die Spitze leicht nach dem Ziehen, um den Durchmesser zu erhöhen. Füllen Sie die Aufnahmepipetten mit der intrazellulären Lösung und Biocytin, während Sie stimulierende Pipetten mit der Aufnahmelösung füllen.
  2. Legen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer und durchdringen Sie die Scheiben kontinuierlich mit sauerstoffhaltiger Aufnahmelösung bei RT. Überprüfen Sie alle Scheiben und wählen Sie die Scheiben aus, die einen intakten Optiktrakt aufweisen.
  3. Visualisieren Sie die Scheibe und zellen mit einem aufrechten Mikroskop, das mit Infrarot-Differentialinterferenzkontrast (IR-DIC) Videomikroskopie ausgestattet ist.
    HINWEIS: Relaisneuronen unterscheiden sich von Interneuronen durch ihre größere Somagröße und mehr primäre Dendriten (Zweige, die aus dem Soma hervortreten). Interneurons zeigen bipolare Morphologie mit einem kleineren Soma.
  4. Legen Sie die stimulierende Pipette auf die Scheibe, bevor Sie die Zelle mit der Aufnahmepipette flicken. Um retinogene Synapsen zu untersuchen, legen Sie die stimulierende Pipette direkt auf den Optiktrakt, wo die Axonfasern aus retinalen Ganglienzellen gebündelt werden (Abbildung 2A). Um kortikogene Synapsen zu analysieren, legen Sie die stimulierende Elektrode auf den Nukleus reticularis thalami, der rostroventral an die dLGN angrenzt (Abbildung 2B).
  5. Sobald die Aufnahmepipette in die Aufnahmelösung eingetaucht ist, wenden Sie einen 5 mV Spannungsschritt an, um den Pipettenwiderstand zu überwachen. Stellen Sie das Haltepotential auf 0 mV ein und brechen Sie das Offsetpotential ab, sodass der Haltestrom 0 pA beträgt.
  6. Nähern Sie sich der Zelle mit der Aufnahmepipette, während Sie positiven Druck ausüben. Wenn die Pipette in direktem Kontakt mit der Zellmembran ist, lassen Sie den positiven Druck los und stellen Sie das Haltepotenzial auf -70 mV ein. Wenden Sie einen leichten Unterdruck an, damit sich die Zellmembran an der Glaspipette so anheften kann, dass sich eine Gigaohm-Dichtung bildet (Widerstand >1 G"). Kompensieren Sie die Pipettenkapazität und öffnen Sie die Zelle durch Anwendung von Unterdruckimpulsen.
  7. Um die synaptische Funktion zu untersuchen, wenden Sie 0,1 ms Stromimpulse (ca. 30 A) über die Stimulationspipette an. Wenn keine synaptischen Reaktionen beobachtet werden, müssen die stimulierenden Pipetten möglicherweise ersetzt werden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die stimulierenden Pipetten an eine andere Position bringen, so dass die aufgezeichnete Zelle nicht verloren geht.
    HINWEIS: In den in Abbildung 2gezeigten Beispielaufzeichnungen wurde die synaptische Kurzzeitplastizität untersucht, indem der Optische Trakt oder kortikogene Fasern zweimal mit 30 ms Interstimulus-Intervallen angeregt wurden. Das gepaarte Pulsverhältnis (PPR) wurde berechnet, indem die Amplitude des zweiten exzitatorischen postsynaptischen Stroms (EPSC) durch das des ersten EPSC (EPSC2/EPSC1)dividiert wurde. Jedes Stimulationsprotokoll wurde 20 Mal wiederholt. Die EPSC-Amplitude wurde anhand der Durchschnittsströme der 20 Sweeps gemessen. Das Zeitintervall zwischen jeder Wiederholung betrug mindestens 5 s, um eine kurzfristige Plastizität zu vermeiden, die durch die Wiederholungen induziert wurde.
  8. Überwachen Sie den Serienwiderstand kontinuierlich, indem Sie einen 5-mV-Spannungsschritt anwenden. Verwenden Sie nur die Zellen mit einem Reihenwiderstand von weniger als 20 Mio. € für die Analyse.

4. Biocytin-Etikettierung

  1. Halten Sie die Ganzzellkonfiguration für mindestens 5 min aufrecht, um die Diffusion von Biocytin in die distalen Dendriten zu ermöglichen.
  2. Entfernen Sie nach der Aufnahme vorsichtig die Pipette aus der Zelle, damit das Soma nicht zerstört wird.
    HINWEIS: Wenn mehr als eine Zelle auf einem Segment aufgezeichnet wird, sollten ihre Somas ausreichend von ihren benachbarten Zellen entfernt sein. Stellen Sie sicher, dass die Dendriten aus verschiedenen Zellen sich während der Bildgebung nicht gegenseitig stören.
  3. Bereiten Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte vor. Füllen Sie jeden Brunnen mit 300 l 4% Paraformaldehyd (PFA). Achten Sie darauf, nichts mit PFA zu verunreinigen, das in Kontakt mit den zu erfassenden Scheiben ist.
  4. Die Scheiben aus der Aufnahmekammer mit einer Gummipipette auf die PFA-haltige Platte übertragen und über Nacht fixieren. Stellen Sie sicher, dass die Pipette immer vor einer PFA-Kontamination gehindert wird.
    VORSICHT: Tragen Sie bei der Manipulation von PFA immer Handschuhe und eine chemische Kapuze.
  5. Nachdem Sie die Scheiben über Nacht in PFA fixiert haben, ersetzen Sie PFA durch phosphatgepufferte Saline (PBS). Bewahren Sie die Scheiben in PBS bei 4 °C für die zukünftige Verarbeitung (weniger als 2 Wochen) auf.
  6. Waschen Sie die Scheiben mit frischen PBS 3 mal (10 min jeder Wäsche).
  7. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie die Scheiben in der Blockierlösung (0,2% nichtionisches Tensid und 5% Rinderserumalbumin in PBS) für 2 h bei RT auf einem Orbitalshaker inkubieren.
  8. Verwerfen Sie die Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Scheiben mit Streptavidin-Alexa 568 in die Blockierlösung (1:1.000) bei 4 °C über Nacht auf einem Orbital-Shaker verdünnt.
  9. Entsorgen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie Die Scheiben 3 mal mit PBS für 10 min bei RT auf einem Orbital-Shaker. Waschen Sie die Scheiben vor der Montage mit Leitungswasser.
  10. Legen Sie die Scheiben von einer Maus auf eine Glasrutsche. Stellen Sie sicher, dass sich die gebeizten Zellen auf der Oberseite der Scheiben befinden. Das Wasser um die Scheiben mit Geweben aufnehmen und die Scheiben dann ca. 15 min trocknen lassen.
  11. Tragen Sie zwei Tropfen Montagemedium auf jede Scheibe auf. Montieren Sie einen Deckelschlupf auf der Rutsche, ohne Luftblasen zu erzeugen.
  12. Bewahren Sie die beschrifteten Scheiben nach der Visualisierung mit einem konfokalen Mikroskop bei 4 °C auf.

5. Zelluläre Bildgebung und Rekonstruktion

  1. Scannen Sie Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop und verwenden Sie die zugehörige Software für die Analyse.
  2. Erregen Sie die Fluoreszenz bei 561 nm.
  3. Bild die Scheiben mit 0,7 numerische blende (NA), Öl-Immersion-Objektiv.
  4. Passen Sie die Zielzelle in der Mitte der Ansicht an, und wenden Sie eine 2,5-fache Vergrößerung an.
  5. Rendern Sie die Z-Stack-Datasets, um das gesamte Neuron mit den folgenden Parametern zu scannen: Format = 2.550 x 2.550 Pixel, Scanfrequenz = 400 Hz, z Zahl = 40.Voxel Größe war um 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 m3.
  6. Die Neuronen werden halbautomatisch mit einer neuronalen Rekonstruktionssoftware (z.B. NeuronStudio) nachverfolgt. Ein Beispiel für ein 3D-verfolgtes Relaisneuron ist in Abbildung 3Bdargestellt.

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Representative Results

Die Scheibenzubereitung von dLGN, die die Retinogenkulat- und Kortikogenuspfade enthält, wird unter einem 4x Objektiv gezeigt (Abbildung 2). Axone von retinalen Ganglienzellen bündeln sich im Optiktrakt (Abbildung 2). Die stimulierende Pipette wurde auf den optischen Trakt gelegt, um retinogenes Synapsen-vermittelten Strom zu induzieren (Abbildung 2A) und auf Dennukle reticularis thalami, um kortikozogenen Synapsen-vermittelten Strom zu induzieren (Abbildung 2B), bzw.. Bemerkenswert ist, dass Axone von kortikalen Neuronen bis zu LGN-Neuronen-Projekten vom Kortex bis zum Thalamus den Kern reticularis thalami durchqueren. Corticogenicluate Synapsen können daher durch Stimulation im Nukleus reticularis thalami aktiviert werden.

Das gepaarte Pulsverhältnis von AMPA-Rezeptor-vermittelten EPSCs liegt unter 1, wenn der Optische Trakt mit einem Interstimulus-Intervall von 30 ms stimuliert wird, aber über 1, wenn corticogeniculate Fasern mit dem gleichen Interstimulus-Intervall stimuliert werden (Abbildung 2C,D) . Die gepaarte Pulsdepression von retinogeneulaten Synapsen ist auf eine hohe Vesikelfreisetzungswahrscheinlichkeit und Desensibilisierung postsynaptischer AMPA-Rezeptoren zurückzuführen. Die gepaarte Pulserleichterung von kortikogenen Synapsen entspricht einer geringen Vesikelfreisetzungswahrscheinlichkeit16.

Abbildung 3A zeigt das IR-DIC-Bild, das den Soma eines dLGN-Relais-Neurons zusammen mit der Spitze der Patchpipette zeigt. Biocytin Färbung ermöglicht es uns, einen Blick auf das aufgezeichnete Neuron zu gewinnen. Im Unterscheidet sich von Interneuronen, die eine bipolare Morphologie haben, haben Relaisneuronen multipolare dendritische Lauben (Abbildung 3B) mit mehr als 3 primären Dendriten8,17. Anschließend wurde eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion eines biocytin-markierten Relaisneurons erzeugt, das eine radial symmetrische dendritische Architektur zeigt (Abbildung 3C).

Figure 1
Abbildung 1 : Schemata, die das Sezierprotokoll darstellen. (A) Horizontale Ansicht des Mausschädels, die die Position der ersten Schnitte zeigt. Der erste Schnitt wurde zusammen mit der sagittalen Naht durchgeführt, gefolgt von zwei weiteren Schnitten zusammen mit der koronalen Naht bzw. Lambdoid-Naht. Gestrichelte Linien stellen die Einschnitte dar. (B) Sagittalansicht des gesamten Gehirns. Gestrichelte Linien deuten darauf hin, dass das Großhirn von der Riechbirne und dem Mittelhirn isoliert ist. (C-D) Diese Paneele zeigen den ersten Schnittwinkel, um die beiden Hemisphären von der horizontalen (C) bzw. koronalen (D) Ansicht zu trennen. (E) Koronale Ansicht einer Hemisphäre auf der Schnittstufe. Gestrichelte Linien zeigen die Schnittrichtung an. l, m, d und v stellen die lateralen, medialen, dorsalen bzw. ventralen Aspekte für die Hemisphäre in den Paneelen D bzw. (F) Diagramm der Sezierkammer mit zwei Hemisphären auf der Schnittstufe dar. Der gestrichelte Pfeil zeigt die Bewegungsrichtung des Schneidmessers an. a, p und d stellen die vorderen, hinteren und dorsalen Aspekte der linken Hemisphäre dar. (G) Schema, das eine richtig geschnittene Scheibe mit einem relativ großen Teil des dLGN und einer intakten Erhaltung des Optiktraktes darstellt. dLGN, dorsaler lateraler Genulatekern; vLGN, ventraler Seitenkern; OT, Olfaktor-Lampe; NRT, Nucleus reticularis thalami. Die Panels C, D und G wurden ab Abbildung 1 von Turner und Salt3geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Slice-Vorbereitung von dLGN, das die Retinogenkulat- und Kortikogenulate-Wege und Beispielaufzeichnungen enthält. (A-B) Diese Paneele zeigen eine dLGN-Scheibe mit Konservierung von Retinogenkulat und Kortizogenen Inputs. Die Stimulationselektrode wurde auf den Optischen Trakt gelegt, um retinogene Synapsen (A) und den Nukleus reticularis thalami zu aktivieren, um kortikogene Synapsen zu aktivieren (B). (C) AMPA-Rezeptor-vermittelte EPSCs als Reaktion auf die Stimulation des Optiktraktes zweimal mit 30 ms Interstimulus-Intervall. (D) Corticogeniculate Synapse-vermittelte Ströme mit 30 ms Interstimulus-Intervall. Die Stimulationsartefakte wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Morphologische Analyse eines Relaisneurons. (A) IR-DIC-Bild zeigt das Soma eines dLGN-Relaisneurons mit der Spitze der Patchpipette. (B) Konfokales Bild eines mit Biocytin gekennzeichneten Und mit Streptavidin-Alexa 568 gekennzeichneten Relaisneurons. (C) Dreidimensionale (3D) Rekonstruktion desselben Neurons, die eine radial symmetrische dendritische Architektur zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir beschreiben ein verbessertes Protokoll auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Methode3, die die Untersuchung der hohen Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Retinogenusat synapsen und geringe Wahrscheinlichkeit der Freisetzung corticogeniculate Synapsen aus der gleichen Scheibe ermöglicht. Dies ist von großer Bedeutung, da diese beiden Eingänge miteinander interagieren, um die visuelle Signalübertragung zu modulieren: Retinogene Inputs sind der Haupterregerantrieb von Relaisneuronen, während kortikathalamische Eingänge als Modulator fungieren, der beeinflusst den Gewinn der Retinogenulate-Übertragung, indem sie den Zustand der Relaisneuronen beeinflusst. Wie erwartet, beobachteten wir, dass Retinogeneulate und kortizogene Synapsen aufgrund der unterschiedlichen Freisetzungswahrscheinlichkeiten eine unterschiedliche kurzfristige Plastizität aufweisen. Zusätzlich, AMPA-Rezeptor-Desensibilisierung trägt auch zur starken Depression in Retinogeneulate Synapsen9,15,16. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass kurzfristige Depression durch CKAMP4416moduliert wird, ein AMPA-Rezeptor-Hilfsprotein der CKAMP-Familie, das die Erholung von der Desensibilisierung der AMPA-Rezeptorenverlangsamt 18,19, 20. Darüber hinaus sind retinogene Synapsat-Synapsen-vermittelte Stromamplituden höher als die von kortikogenen Synapsat-Synapsat-vermittelten Strömen unter der gleichen stimulierenden Stärke, im Einklang mit den großen Retinogenulate-Synapten mit mehreren Freisetzungsstellen und relativ kleine kortizogene Synapsen7,21.

Das Slicing-Protokoll ist im Wesentlichen das gleiche wie das von Turner und Salt3entwickelte . Einige Modifikationen, die auf unserer Erfahrung basierten, verbesserten die Slice-Qualität. Ähnlich wie Beisamhauser et al.22verwendeten wir eine Cholin-basierte anstelle einer saccharosebasierten Dissektionslösung. Die Rückgewinnung nach der Zerlegung erfolgte bei 34 °C in der Schneidlösung für 30 min und dann in der Aufnahmelösung für weitere 30 min und nicht bei Raumtemperatur. Die Scheiben waren etwas dünner (250 statt 400 m). Wir sezierten Gehirne mit einem Keil mit einem Winkel von 10 bis 25°, was die Zuverlässigkeit des Schneidverfahrens erleichtert und erhöht.

Aufnahme- und Stimulationsbedingungen für die Untersuchung der Relais-Neuron-Synapsenfunktion sind im Wesentlichen die gleichen wie zuvor von Chen und Regehr8beschrieben. Die Aktivierung von Glasfasern des Optiktraktes löst in der Regel große Ströme aus und kann im Bereich von mehreren nA liegen, wenn alle retinogenen Synapsen auf einem Relais neurons aktiviert sind23. Um Fehler beim Serienwiderstand zu vermeiden, insbesondere bei der Untersuchung des maximalen Stroms durch Aktivierung aller retinogenen Synapsen auf einem Relais-Neuronen, verwendeten Chen und Regehr die Aufzeichnung von Pipetten mit geringem Widerstand (<2 M). Um jedoch die synaptische Kurzzeitplastizität zu untersuchen, genügt es, ein oder wenige retinale Ganglienzellaxone zu aktivieren, die Ströme hervorrufen, die im Bereich von 34-579 pA liegen (unveröffentlichte Ergebnisse, Chen et al.). Kleinere Pipetten mit einem Widerstand zwischen 3 und 4 Mio. m können daher bei der Untersuchung der retinogenen Synapsenfunktion unter Verwendung einer schwachen Stimulation des Optiktraktes verwendet werden. Die Aktivierung von kortizogenen Synapsen entlockt relativ kleine Ströme16. Fehler der Serieresistenz sind daher ein kleineres Problem bei der Untersuchung der Corticogeniculate Synapse-Funktion.

Wir zeigen hier, dass die Stimulation von Retinogeniculate und Kortikogenen Synapsen verwendet werden kann, um die kurzfristige Plastizität von AMPA-Rezeptor-vermittelten Strömen zu untersuchen. Das gleiche Protokoll kann angewendet werden, um NMDA-Rezeptor-vermittelten Strom24aufzuzeichnen. Tatsächlich stammte einer der ersten Anzeichen dafür, dass die DEsensibilisierung des AMPA-Rezeptors zur kurzfristigen Plastizität bei retinogenen Synapsen beiträgt, aus Experimenten, bei denen gepaarte Pulsverhältnisse von AMPA-Rezeptor-vermittelten Strömen mit gepaarte Pulsverhältnisse von NMDA-Rezeptor-vermittelten Strömen. Corticogeniculate Synapsen wurden durch Positionierung der Stimulationspipette im Nukleus reticularis thalami stimuliert, weil Axone kortikaler Neuronen, die dLGN-Relaisneuronen anregen, über diesen thalamischen Kern wandern. Die gleiche Stimulationsposition kann verwendet werden, um hemmende synaptische Ströme in der dLGN zu untersuchen, wie z.B. govindaiah und Cox25zeigen.

Relais Neuronen drücken GABAA und GABA B-Rezeptoren. Die Freisetzung von GABA aktiviert synaptische GABA A-Rezeptoren. GABA-B-Rezeptoren, die extrasynaptisch lokalisiert sind, werden aktiviert, wenn Nucleus reticularis thalami stark aktiviert sind, zum Beispiel während des Burstfeuerns26,27 ,28. Spillover von GABA, die in der Regel aufgrund von GABA-Aufnahme durch Astrozyten eingeschränkt ist, kann während der intensiven Synapse Aktivierung die extrasynaptischen GABA B-Rezeptorenaktivieren 27,28. Wir haben GABA-B-Rezeptoren nicht blockiert, weil Stimulationsintensität und -frequenz vergleichsweise niedrig waren. Jedoch, bei der Untersuchung von corticogeniculate Synapse-Funktion mit intensiven Stimulationsprotokollen könnte es vorzuziehen, GABA-B-Rezeptoren hinzuzufügen.

Aufnahmen von dLGN-Relaisneuronen können leicht durchgeführt werden, wenn Scheiben verwendet werden, die ca. 2 mm medial von der seitlichen Oberfläche des Gehirns entfernt sind (beginnen Sie, während des Schneidvorgangs etwa das 8. der 250-mm-Scheiben zu sammeln). In einigen Slices können nicht beide Eingänge zu einem bestimmten Relaisneuron erkannt werden, da einer der beiden Bahnen in der Nähe des Relais-Neurons durchtrennt wird. In diesem Fall ist es in der Regel noch möglich, Retinogene uantilate und kortikogene Synapsen in der gleichen Scheibe zu untersuchen, indem verschiedene Relaisneuronen für jeden Eingang ausgewählt werden. Um retinogene Synapsen-Vermitteltstrom aufzuzeichnen, werden ventral lokalisierte Relaisneuronen ausgewählt, da die Faserfasern des Optiktraktes zu diesen Zellen eher erhalten sind als in den dorsal gelegenen Relaisneuronen. Im Gegensatz dazu werden kortizogene Inputs eher auf Relaisneuronen erhalten, die sich dorsal in der dLGN befinden.

Die Slice-Qualität bestimmt die Zuverlässigkeit der Daten. Basierend auf unserer Erfahrung sind die folgenden Parameter unerlässlich, um eine gute Slice-Qualität zu gewährleisten. Kühlung und Sauerstoffversorgung sind wichtige Faktoren während des Sezierens. Der Kopf der Maus muss unmittelbar nach der Enthauptung der Maus in kalter Lösung gehalten werden. Wenn das Gehirn aus dem Schädel genommen wird, sollte es alle 3 bis 4 s in eiskalte Lösung getaucht werden, um den Zelltod zu reduzieren. Ebenso sollte das Schneidverfahren bei etwa 4 °C durchgeführt werden. Darüber hinaus müssen Die Sezierlösung und Aufzeichnungslösung vor der Anwendung mindestens 15 min mit Sauerstoff versorgt werden, um eine ausreichende Sauerstoffkonzentration aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann das Blockieren von Natriumkanälen die Neuronenaktivität effizient reduzieren. Daher wurde eine Dissektionslösung mit 37,5 mmol Cholin verwendet.

Relaisneuronen zeigen niedrigschwellige Spitzen, die durch den transienten Ca2+ Strom29erzeugt werden. Um Spannungsgated Ca2+-Kanäle zu blockieren, haben wir d-600 (methoxyverapamil) zur intrazellulären Lösung hinzugefügt. D-600 sollte nicht verwendet werden, wenn der Zweck der Studie darin besteht, niedrigschwellige Spitzen in Relaisneuronen zu untersuchen. Die Präzision von Ganzzellspannungsklemmenaufzeichnungen wird durch Raumklemmfehler beeinflusst. Dieses technische Problem ist relevanter für Eingänge, die weit von der Aufnahmeelektrode entfernt sind (also für distale Synapsen)30,31. Um die Auswirkungen des Space Clamp-Fehlers zu minimieren, haben wir eine Cs+-basierte anstelle einer K+-basierten intrazellulären Lösung verwendet. Kanäle, die K+ durchlässig sind (z.B. Leckkanäle) sind in der Regel Cs+ undurchlässig32. So erhöht die Verwendung einer Cs+-basierten intrazellulären Lösung die Impedanz der Zelle.

Die stabile Patchklemmenaufzeichnung hängt von der Auswahl gesunder Zellen ab. Neuronen mit runder Soma-Form, dunkler Farbe oder geschwollenem Soma sollten vermieden werden. Darüber hinaus unterscheiden sich Relaisneuronen von den lokalen Interneuronen durch ihre größere Somagröße und aufwendigere primäre dendritische Lauben. Daher haben wir Zellen ausgewählt, die eine größere Somagröße (größer als 15 m im Durchmesser) und nicht-bipolare Morphologie haben. Die in Abbildung 3B dargestellte Beispielzelle hat eine symmetrische dendritische Architektur und kann daher als Relaisneuron klassifiziert werden, das Y-Neuronen ähnelt, die z.B. in der Katze LGN17zu finden sind.

Der Serienwiderstand sollte so gering wie möglich sein und konstant gehalten werden. Da die Eingänge aus zwei Richtungen in einer Scheibe erhalten bleiben, ist es außerdem wichtig, die Interferenz zwischen den beiden Eingängen loszuwerden. Um die Aktivierung von kortizogenen Fasern bei der Aufnahme von retinogenem Synapsus-vermittelten Strömen zu vermeiden oder umgekehrt, sollte die stimulierende Pipette nicht in die dLGN gelegt werden, und der Abstand zwischen Stimulation und Aufnahmepipette sollte so weit möglich. Darüber hinaus erfordert der lange Abstand zwischen Stimulierung und Aufnahme von Pipetten eine relativ intakte Axonkonservierung. Daher muss ein richtiger Schnittwinkel für die Zerlegung ausgewählt werden. Im Allgemeinen können nur ein oder zwei Scheiben mit Erhaltung von zwei Eingängen aus jeder Hemisphäre erhalten werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Sonderforschungsbereichs (SFB) 1134 "Functional Ensembles" (J.v.E. und X.C.) und des Forschungsstipendiums EN948/1-2 (J.v.E.) gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

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Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

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