Summary
Aquí, presentamos protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo de geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de sinapsis retinogénica y corticogénica. Este protocolo proporciona una manera eficiente de estudiar las sinapsis con la probabilidad de alta y baja liberación en las mismas rebanadas cerebrales agudas.
Abstract
El núcleo de geniculado lateral es la primera estación de relé para la información visual. Las neuronas de retransmisión de este núcleo talámico integran la entrada de las células ganglionares de la retina y la proyectan a la corteza visual. Además, las neuronas de relé reciben excitación de arriba hacia abajo de la corteza. Las dos entradas principales excitatorias a las neuronas de relé difieren en varios aspectos. Cada neurona de relé recibe la entrada de sólo unas pocas sinapsis retinogénicas, que son terminales grandes con muchos sitios de liberación. Esto se refleja en la excitación comparativamente fuerte, las neuronas de relé reciben, de las células ganglionarias de la retina. Las sinapsis corticogénicas, en cambio, son más simples con pocos sitios de liberación y una fuerza sináptica más débil. Las dos sinapsis también difieren en su plasticidad sináptica a corto plazo. Las sinapsis retinogénicas tienen una alta probabilidad de liberación y, en consecuencia, muestran una depresión a corto plazo. Por el contrario, las sinapsis corticogénicas tienen una baja probabilidad de liberación. Las fibras corticogénicas atraviesan los núcleos talámicos reticulares antes de entrar en el núcleo de geniculado lateral. Las diferentes ubicaciones del núcleo talámico reticular (rostrally del núcleo de geniculado lateral) y del tracto óptico (ventro-lateralmente desde el núcleo de geniculado lateral) permiten estimular las sinapsis corticogénica o retinogénicadas por separado con electrodos de estimulación extracelular. Esto hace que el núcleo de geniculado lateral sea un área cerebral ideal donde dos sinapsis excitatorias con propiedades muy diferentes que afectan al mismo tipo de célula, se pueden estudiar simultáneamente. Aquí, describimos un método para investigar la grabación de las neuronas de relé y para realizar un análisis detallado de la función de la sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato en rodajas cerebrales agudas. El artículo contiene un protocolo paso a paso para la generación de rebanadas cerebrales agudas del núcleo de geniculado lateral y pasos para registrar la actividad de las neuronas de relé estimulando el tracto óptico y las fibras corticogénicas por separado.
Introduction
Las neuronas de retransmisión del núcleo de geniculado lateral integran y transmiten información visual a la corteza visual. Estas neuronas reciben la entrada excitatoria de las células ganglioneras a través de sinapsis retinogénicas, que proporcionan el principal impulso excitatorio para las neuronas de relé. Además, las neuronas de retransmisión reciben entradas excitatorias de las neuronas corticales a través de sinapsis corticogénicas. Además, las neuronas de retransmisión reciben insumos inhibitorios de interneuronas locales y neuronas GABAérgicas del núcleo reticularis thalami1. El núcleo reticularis thalami está presente como un escudo entre el tálamo y la corteza de tal manera que las fibras quese proyectan desde la corteza hasta el tálamo y en la dirección opuesta deben pasar por el núcleo reticularis thalami 2.
Las entradas retinogénicas y las entradas de corticogeniculato muestran propiedades sinápticas distintas3,4,5,6,7,8. Las entradas de retinogeniculato formanterminales grandes con múltiples sitios de liberación 9,10. Por el contrario, las entradas de corticogeniculato muestran terminales pequeños con sitios de liberación única7. Además, las sinapsis retinogénicas impulsan eficientemente los potenciales de acción de las neuronas de relé a pesar de constituir sólo el 5-10% de todas las sinapsis en las neuronas de relé3,8,11. Las sinapsis corticogénicas, por otro lado, sirven como modulador de las transmisiones retinogénicas mediante el control del potencial de membrana de las neuronas de retransmisión12,13.
Estas dos entradas principales excitatorias para transmitir neuronas también son funcionalmente diferentes. Una diferencia prominente es la depresión a corto plazo de las sinapsis retinogénicas y la facilitación a corto plazo de las sinapsis de corticogeniculato3,5,8. La plasticidad a corto plazo se refiere a un fenómeno en el que la fuerza sináptica cambia cuando la sinapsis está repetidamente activa en un período de tiempo de pocos milisegundos a varios segundos. La probabilidad de liberación sináptica es un factor importante que subyace a la plasticidad a corto plazo. Las sinapsis, con una baja probabilidad de liberación inicial, muestran una facilitación a corto plazo debido a la acumulación de Ca2+ en la presinapvez y, en consecuencia, se observa un aumento en la probabilidad de liberación en la actividad repetida. Por el contrario, las sinapsis con alta probabilidad de liberación suelen mostrar depresión a corto plazo debido al agotamiento de las vesículas ya liberables14. Además, la desensibilización de los receptores postsinápticos contribuye a la plasticidad a corto plazo en algunas sinapsis de probabilidad de alta liberación8,15. Alta probabilidad de liberación y desensibilización de los receptores de ácido isozolapropionico (AMPA) de alta liberación contribuyen a la depresión prominente a corto plazo de las sinapsis retinogénicadas. Por el contrario, la probabilidad de baja liberación subyace a la facilitación a corto plazo de las sinapsis corticogénicas.
En ratones, el tracto óptico entra en el núcleo de geniculado lateral dorsal (dLGN) desde el sitio caudolateral, mientras que las fibras corticogénicas entran en el rostro dLGNventrally. La distancia entre las dos entradas permite la investigación de las propiedades individuales de dos entradas excitatorias muy diferentes que afectan a la misma celda. Aquí, nos basamos y mejoramos un método de disección descrito previamente en el que las fibras de retinogeniculato y corticogenicullato se conservan en rebanadas cerebrales agudas3. Nosotros, entonces, describimos la investigación electrofisiológica de las neuronas de relé y la estimulación de las fibras de retinogeniculato y corticogeniculato con electrodos de estimulación extracelular. Finalmente, proporcionamos un protocolo para el llenado de neuronas de relé con biocitetina y posterior análisis anatómico.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por el Panel de Supervisión Gubernamental sobre Experimentos Animales de Renania-Palatinado.
1. Soluciones
- Solución de disección
- Para reducir la excitotoxicidad, preparar una solución a base de colina para ser utilizado durante la disección como se presenta aquí (en mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 cloruro de colina, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, y 25 glucosa. Prepare la solución de disección menos de 1 semana antes del experimento.
- Solución de grabación
- Preparar una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenga (en mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2y 25 glucosa. Añadir 50 M D-APV y 10 M SR 95531 hidrobromuro para bloquear N-metil-D-aspartato (NMDA) y GABAA receptores, respectivamente.
- Solución intracelular
- Preparar una solución intracelular que contenga (en mM): 35 Cs-gluconato, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA y 0.1 D-600 (clorhidrato de metoxiverapamilo). Ajuste el pH a 7.3 con CsOH. Filtrar, alícuota, y almacenar la solución de stock a -20 oC hasta su uso.
2. Disección
- Preparar dos cámaras de corte, de las cuales una está llena con 100 ml de la solución de disección y la otra con 100 ml de solución de grabación. Colocar los dos vasos en un baño de agua (37 oC) y burbujear las soluciones con carbogen durante al menos 15 minutos antes de la disección.
- Llene un vaso de precipitados de plástico con 250 ml de solución de disección casi fría (pero no congelada). Burbuja con carbogen al menos 15 min antes de su uso.
- Llenar una placa de plástico Petri (100 mm x 20 mm), en la que se realizará la disección cerebral, con la solución de disección fría. Coloque un pedazo de papel de filtro en la tapa de la placa Petri.
- Enfríe la cámara de disección del vibratome.
- Anestetizar un ratón con 2,5% de isoflurano, por ejemplo, en la jaula del ratón. Tan pronto como el ratón no responda a un pellizco de cola, descante el ratón cerca de la médula cervical y sumerja la cabeza en la solución de disección helada en la base de la placa Petri.
- Corta la piel de la cabeza de caudal a nasal y mantenla lateralmente con los dedos para exponer el cráneo. Para sacar el antecebra, primero corte el cráneo junto con la línea media posterior-anterior, y luego corte dos veces más a través de la sutura coronal y la sutura lambdoide (Figura1A).
- Retire el cráneo entre la sutura coronal y la sutura lambdoid de tal forma que el cerebrum esté expuesto. Cortar la bombilla olfativa y separar el cerebro de frente del cerebro medio con una cuchilla fina (Figura1B). Retire el cerebro del cráneo con una espátula delgada y colóquelo sobre el papel de filtro en la tapa de la placa Petri.
NOTA: Los pasos 2.6 y 2.7 deben realizarse lo más rápido posible para reducir la muerte celular. - Para preservar la integridad de las entradas sensoriales y corticales a la dLGN en la rebanada cerebral, separe los dos hemisferios con un corte parasagital con un ángulo de 3 x 5o (Figura1C,D). Secar los planos mediolaterales de los dos hemisferios colocándolos en el papel de filtro y luego pegarlos en la etapa de corte con un ángulo de 10 a 25o desde el plano horizontal (Figura1E).
- Coloque el escenario en el centro de la bandeja tampón de metal y vierta suavemente el resto de la solución de disección helada en la bandeja tampón. Realice este paso con cuidado ya que un vertido fuerte podría eliminar el cerebro pegado (Figura1F).
- Coloque la bandeja tampón en la bandeja llena de hielo, lo que ayuda a mantener la baja temperatura durante la disección. Corte las rodajas de 250 m con una cuchilla de afeitar a una velocidad de 0,1 mm/s y una amplitud de 1 mm.
- Mantenga las rodajas en la cámara de retención llenas de solución de disección oxigenada a 34 oC durante unos 30 minutos y, a continuación, permita que las rodajas se recuperen en la solución de grabación a 34 oC durante otros 30 minutos.
- Después de la recuperación, retire la cámara de retención de rodajas del baño de agua y mantenga las rodajas a temperatura ambiente (RT) hasta que se utilicen en experimentos.
3. Electrofisiología
- Tire de pipetas utilizando capilares de vidrio borosilicato y un tirador de filamento. Mantenga la resistencia de las pipetas de grabación a 3 x 4 M. Tire de pipetas estimulantes utilizando el mismo protocolo pero rompa la punta ligeramente después de tirar para aumentar el diámetro. Llene las pipetas de grabación con la solución intracelular y la biocitetina, mientras llena las pipetas estimulantes con la solución de grabación.
- Coloque las rodajas en la cámara de grabación y perfore continuamente las rebanadas con la solución de grabación oxigenada en RT. Compruebe todas las rebanadas y seleccione las que muestran un tracto óptico intacto.
- Visualice la rebanada y las células con un microscopio vertical equipado con microscopía de vídeo de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC).
NOTA: Las neuronas de relé se diferencian de las interneuronas por su mayor tamaño de soma y más dendritas primarias (ramas que emergen del soma). Las interneuronas muestran morfología bipolar con un soma más pequeño. - Coloque la pipeta estimulante en la rebanada antes de parchear la celda con la pipeta de grabación. Para investigar las sinapsis retinogénicas, coloque la pipeta estimulante directamente en el tracto óptico, donde se agrupan las fibras de axón de las células ganglionares retinianas (Figura2A). Para analizar las sinapsis corticogénicas, coloque el electrodo estimulante en el núcleo reticularis thalami, que es rostroventrally adyacente al dLGN (Figura2B).
- Una vez que la pipeta de grabación esté sumergida en la solución de grabación, aplique un paso de voltaje de 5 mV para supervisar la resistencia de la pipeta. Establezca el potencial de retención en 0 mV y cancele el potencial de desplazamiento de modo que la corriente de retención sea 0 pA.
- Acérquese a la celda con la pipeta de grabación mientras aplica presión positiva. Cuando la pipeta esté en contacto directo con la membrana celular, suelte la presión positiva y establezca el potencial de retención en -70 mV. Aplique una ligera presión negativa para permitir que la membrana celular se adhiera a la pipeta de vidrio de tal forma que se forme un sello gigaohm (resistencia >1 G). Compensar la capacitancia de la pipeta y abrir la célula mediante la aplicación de pulsos de presión negativa.
- Para investigar la función sináptica, aplique pulsos de corriente de 0,1 ms (ca. 30 oA) a través de la pipeta de estimulación. Si no se observan respuestas sinápticas, es posible que deban sustituirse las pipetas estimulantes. Tenga cuidado al colocar las pipetas estimulantes en una posición diferente, de modo que la célula registrada no se pierda.
NOTA: En las grabaciones de ejemplo que se muestran en la Figura2, se investigó la plasticidad sináptica a corto plazo estimulando el tracto óptico o las fibras corticogénicas dos veces con intervalos interestímulos de 30 ms. La relación de pulso emparejado (PPR) se calculó dividiendo la amplitud de la segunda corriente postsináptica excitatoria (EPSC) por la del primer EPSC (EPSC2/EPSC1). Cada protocolo de estimulación se repitió 20 veces. La amplitud EPSC se midió a partir de las corrientes medias de los 20 barridos. El intervalo de tiempo entre cada repetición fue de al menos 5 s para evitar la plasticidad a corto plazo inducida por las repeticiones. - Supervise la resistencia de la serie continuamente aplicando un paso de voltaje de 5 mV. Utilice únicamente las células con una resistencia en serie inferior a 20 M para el análisis.
4. Etiquetado de biocitotina
- Mantener la configuración de células enteras durante al menos 5 minutos para permitir la difusión de biocitina en las dendritas distrales.
- Después de la grabación, retire suavemente la pipeta de la célula para que el soma no se destruya.
NOTA: Si se registra más de una celda en un sector, sus somas deben estar lo suficientemente lejos de sus celdas vecinas. Asegúrese de que las dendritas de diferentes células no interfieran entre sí durante la toma de imágenes. - Prepare una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Llene cada pozo con 300 s de 4% de paraformaldehida (PFA). Tenga cuidado de no contaminar nada con PFA que esté en contacto con las rodajas a registrar.
- Transfiera las rodajas de la cámara de grabación a la placa que contiene PFA con una pipeta de goma y fije las rodajas durante la noche. Asegúrese de que la pipeta siempre se previene de la contaminación por PFA.
ADVERTENCIA: Use siempre guantes y una capucha química al manipular PFA. - Después de fijar las rodajas durante la noche en PFA, reemplace el PFA por una solución salina con búfer de fosfato (PBS). Almacene las rebanadas en PBS a 4 oC para su procesamiento futuro (menos de 2 semanas).
- Lave las rodajas con PBS fresco 3 veces (10 min cada lavado).
- Bloquear sitios de unión inespecíficos incubando las rodajas en la solución de bloqueo (0,2% tensioactivo no iónico y albúmina sérica del 5% en PBS) durante 2 h en RT en un agitador orbital.
- Deseche la solución de bloqueo. Incubar las rodajas con streptavidina-Alexa 568 diluida en la solución de bloqueo (1:1.000) a 4oC durante la noche en un agitador orbital.
- Deseche la solución de anticuerpos y lave las rodajas 3 veces con PBS durante 10 minutos a RT en un agitador orbital. Lave las rodajas con agua del grifo antes de montarlas.
- Coloque las rodajas de un ratón en una diapositiva de vidrio. Asegúrese de que las celdas teñidas estén presentes en la superficie superior de las rebanadas. Absorba el agua alrededor de las rodajas con pañuelos de papel y luego deja que las rodajas se sequen durante aproximadamente 15 minutos.
- Aplique dos gotas de medio de montaje en cada rodaja. Monte un cubreobjetos en el portaobjetos sin producir burbujas de aire.
- Almacene las rodajas etiquetadas a 4 oC después de la visualización con un microscopio confocal.
5. Imágenes celulares y reconstrucción
- Escanee los cortes con un microscopio confocal y utilice el software asociado para el análisis.
- Emocione la fluorescencia a 561 nm.
- Imagen de las rebanadas con 0,7 apertura numérica (NA), objetivo de inmersión en aceite.
- Ajuste la celda de destino en el centro de la vista y aplique una ampliación de 2,5 veces.
- Renderice los datasets de la pila Z para escanear toda la neurona con los siguientes parámetros: formato de 2.550 x 2.550 píxeles, frecuencia de escaneado a 400 Hz, número z a 40.Voxel el tamaño era de alrededor de 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 ám3.
- Rastreo semi-automáticamente de las neuronas utilizando un software de reconstrucción neuronal (por ejemplo, NeuronStudio). Un ejemplo de una neurona de relé rastreado 3D se muestra en la Figura 3B.
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Representative Results
La preparación de la rebanada de dLGN que contiene las vías de retinogeniculato y corticogeniculato se muestra bajo un objetivo 4x (Figura2). Los axónes de las células ganglioneras de la retina se agrupan en el tracto óptico (Figura 2). La pipeta estimulante se colocó en el tracto óptico para inducir la corriente mediada por la sinapsis retinogénica (Figura2A)y en el núcleo reticularis thalami para inducir la corriente mediada por las sinapsis corticogénicas (Figura2B),respectivamente. Cabe destacar que los axones de las neuronas corticales a las neuronas LGN se proyectan desde la corteza hasta el tálamo atraviesan el núcleo reticularis thalami. Por lo tanto, las sinapsis corticogénicas pueden activarse mediante la estimulación en el núcleo reticularis thalami.
La relación de pulso emparejado de los EECC mediados por el receptor AMPA es inferior a 1 cuando se estimula el tracto óptico con un intervalo interestímulo de 30 ms, pero por encima de 1 cuando se estimulan las fibras de corticogenicullato con el mismo intervalo de interestímulo (Figura2C,D) . La depresión por pulso sinapsis de retinogeniculato se debe a una alta probabilidad de liberación de vesícula y a la desensibilización de los receptores AMPA postsinápticos. La facilitación de pulsos emparejados de sinapsis de corticogeniculato es consistente con una baja probabilidad de liberación de vesícula16.
La Figura 3A muestra la imagen IR-DIC que muestra el soma de una neurona de relé dLGN junto con la punta de la pipeta de parche. La tinción de biocitos nos permite obtener una vista de la neurona registrada. A diferencia de las interneuronas, que tienen morfología bipolar, las neuronas de retransmisión tienen árboles dendríticos multipolares (Figura3B)que contienen más de 3 dendritas primarias8,17. Luego se generó una reconstrucción tridimensional (3D) de una neurona de relé etiquetada por biocictina que muestra una arquitectura dendrítica radialmente simétrica (Figura3C).
Figura 1 : Esquemas que representan el protocolo de disección. (A) Vista horizontal del cráneo del ratón, que muestra la posición de los cortes iniciales. El primer corte se realizó junto con la sutura sagital, seguido de otros dos cortes junto con la sutura coronal y la sutura lambdoid, respectivamente. Las líneas discontinuas representan las incisiones. (B) Vista sagital de todo el cerebro. Las líneas discontinuas indican que el cerebro está aislado de la bombilla olfativa y el cerebro medio. (C-D) Estos paneles muestran el primer ángulo de corte para separar los dos hemisferios de la vista horizontal (C) y coronal (D), respectivamente. (E) Vista coronal de un hemisferio en la etapa de corte. Las líneas discontinuas indican la dirección de corte. l, m, d y v representan los aspectos laterales, medios, dorsales y ventrales, respectivamente, para el hemisferio en los paneles D y E. (F) Diagrama de la cámara de disección con dos hemisferios en la etapa de corte. La flecha discontinua indica la dirección de movimiento de la hoja de corte. a, p y d representan los aspectos anterior, posterior y dorsal del hemisferio izquierdo, respectivamente. (G) Esquema que representa una rebanada correctamente cortada con una parte relativamente grande de la dLGN y la preservación intacta del tracto óptico. dLGN, núcleo de geniculado lateral dorsal; vLGN, núcleo lateral ventral; OT, bombilla olfativa; NRT, núcleo reticularis thalami. Los paneles C, D y G se han modificado de la Figura 1 de Turner y Salt3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Preparación de rebanadas de dLGN que contiene las vías retinogénicas y corticogénicas y grabaciones de ejemplo. (A-B) Estos paneles muestran una rebanada dLGN con preservación de las entradas de retinogeniculato y corticogeniculato. El electrodo de estimulación se colocó en el tracto óptico para activar las sinapsis retinogénicas (A) y en el núcleo reticularis thalami para activar las sinapsis corticogénicas (B). (C) EPSC mediadas por receptores AMPA en respuesta a la estimulación del tracto óptico dos veces con un intervalo inter-estímulo de 30 ms. (D) Corrientes mediadas por sinapsis corticogénica sinapsis con intervalo interestímulo de 30 ms. Los artefactos de estimulación se eliminaron para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis morfológico de una neurona de relé. (A) Imagen IR-DIC que muestra el soma de una neurona de relé dLGN con la punta de la pipeta de parche. (B) Imagen confocal de una neurona de relé etiquetada con biocitotina y visualizada con streptavidina-Alexa 568. (C) Reconstrucción tridimensional (3D) de la misma neurona, mostrando una arquitectura dendrítica radialmente simétrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Describimos un protocolo mejorado basado en un método publicado previamente3, que permite la investigación de la alta probabilidad de liberación de sinapsis retinogénicados y baja probabilidad de liberación de sinapsis corticogénicas de la misma rebanada. Esto es de gran importancia ya que estas dos entradas interactúan entre sí para modular la transmisión de la señal visual: las entradas retinogénicas son el principal impulsor excitatorio de las neuronas de relé, mientras que las entradas corticotilamáticos funcionan como un modulador, que influye en la ganancia de la transmisión de retinogeniculato al afectar el estado de las neuronas de retransmisión. Como era de esperar, observamos que las sinapsis retinogénica y corticogénica muestran diferentes plasticidades a corto plazo debido a la diferencia en sus probabilidades de liberación. Además, la desensibilización del receptor AMPA también contribuye a la fuerte depresión en las sinapsis de retinogeniculato9,15,16. Recientemente hemos demostrado que la depresión a corto plazo es modulada por CKAMP4416, una proteína auxiliar del receptor AMPA de la familia CKAMP que ralentiza la recuperación de la desensibilización de los receptores AMPA18,19, 20. Además, las amplitudes de corriente mediadas por la retinogeniculación sinapsis son más altas que las de las corrientes mediadas por la sinapsis corticogénica bajo la misma fuerza estimulante, consistentes con las grandes sinapsis retinogénicadas con múltiples sitios de liberación, y sinapsis de corticogenicuto relativamente pequeñas7,21.
El protocolo de corte es esencialmente el mismo queel desarrollado por Turner y Salt 3. Algunas modificaciones que se basaron en nuestra experiencia mejoraron la calidad de las rebanadas. 22 , utilizamosuna solución de disección basada en colina en lugar de una solución de disección basada en sacarosa. La recuperación después de la disección se realizó a 34oC en la solución de corte durante 30 min y luego en la solución de grabación durante otros 30 minutos y no a temperatura ambiente. Las rebanadas eran ligeramente más delgadas (250 m en lugar de 400 m). Diseccionamos cerebros usando una cuña con un ángulo de 10 a 25o, lo que facilita y aumenta la fiabilidad del procedimiento de corte.
Las condiciones de grabación y estimulación para la investigación de la función de sinapsis de la neurona de relé son esencialmente las mismas que las descritas anteriormente por Chen y Regehr8. La activación de las fibras del tracto óptico generalmente provoca grandes corrientes y puede estar en el rango de varios nA cuando todas las sinapsis retinogénicas en una neurona de relé se activan23. Para evitar errores de resistencia en serie, especialmente cuando se investiga la corriente máxima mediante la activación de todas las sinapsis retinogeniculatos en las neuronas de un relé, Chen y Regehr utilizaron la grabación de pipetas de baja resistencia (<2 M). Sin embargo, para investigar la plasticidad sináptica a corto plazo, basta con activar uno o pocos axones de células ganglionares de la retina, que provocan corrientes que están en el rango de 34-579 pA (resultados no publicados, Chen et al.). Por lo tanto, se pueden utilizar pipetas más pequeñas con una resistencia entre 3 x 4 M cuando se investiga la función de sinapsis retinogénica utilizando una estimulación débil del tracto óptico. Activación de las sinapsis corticogénicas provoca corrientes relativamente pequeñas16. Los errores de resistencia de la serie son, por lo tanto, un problema menor al investigar la función de sinapsis corticogénica.
Aquí mostramos que la estimulación de las sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato se puede utilizar para investigar la plasticidad a corto plazo de las corrientes mediadas por receptores AMPA. El mismo protocolo se puede aplicar para registrar la corriente mediada por el receptor NMDA24. De hecho, uno de los primeros indicios de que la desensibilización del receptor AMPA contribuye a la plasticidad a corto plazo en las sinapsis retinogénicas provino de experimentos en los que se compararon las relaciones de pulso sapar de las corrientes mediadas por receptores AMPA con relaciones de pulso sin par de corrientes mediadas por receptores NMDA. Las sinapsis corticogénicas fueron estimuladas mediante la colocación de la pipeta de estimulación en el núcleo reticularis thalami porque los axones de neuronas corticales que excitan las neuronas de relé dLGN viajan a través de este núcleo talámico. La misma posición de estimulación se puede utilizar para estudiar las corrientes sinápticas inhibitorias en el dLGN como lo muestran, por ejemplo, Govindaiah y Cox25.
Las neuronas de relé expresan GABAA y GABAB receptores. La liberación de GABA activa los receptores sinápticos GABA A. Los receptores GABA B, que se localizan extraynaptically, se activan cuando el núcleo reticularis thalami se activan fuertemente, por ejemplo, durante el disparo por ráfaga26,27,28. Derrame de GABA, que generalmente se restringe debido a la aceptación de GABA por astrocitos, puede activar durante la activación de la sinapsis intensa los receptores GABAB extrainápticos27,28. No bloqueamos los receptores GABAB porque la intensidad de estimulación y la frecuencia eran comparativamente bajas. Sin embargo, Al investigar la función de sinapsis corticogeniculato utilizando protocolos de estimulación intensa podría ser preferible agregar receptores GABAB.
Las grabaciones de neuronas de relé dLGN se pueden realizar fácilmente cuando se utilizan rodajas que son aproximadamente 2 mm medial de la superficie lateral del cerebro (comienza a recoger aproximadamente el 8o de las rodajas de 250 m durante el procedimiento de corte). En algunas rebanadas, no se pueden detectar ambas entradas a una neurona de relé dada porque una de las dos vías se cortan cerca de la neurona de relé. En este caso, por lo general todavía es posible investigar sinapsis retinogénica y corticogénica en la misma rebanada mediante la selección de diferentes neuronas de relé para cada entrada. Para registrar la corriente mediada por la sinapsis retinogénica, se seleccionan las neuronas de relé localizadas vlarosamente ya que las fibras del tracto óptico a estas células son más probables que se conservan que en las neuronas de relé ubicadas dorsalmente. Por el contrario, es más probable que las entradas de corticogenicuto se conserven en las neuronas de relé que se encuentran dorsalmente en el dLGN.
La calidad del sector determina la fiabilidad de los datos. En base a nuestra experiencia, los siguientes parámetros son esenciales para garantizar una buena calidad de las rebanadas. El enfriamiento y la oxigenación son factores importantes durante el procedimiento de disección. La cabeza del ratón debe mantenerse en solución fría inmediatamente después de la decapitación del ratón. Al sacar el cerebro del cráneo, se debe sumergir en una solución helada cada 3 a 4 s con el fin de reducir la muerte celular. Del mismo modo, el procedimiento de corte debe realizarse a unos 4oC. Además, la solución de disección y la solución de grabación deben oxigenarse al menos 15 minutos antes de su uso para mantener una concentración suficiente de oxígeno. Además, bloquear los canales de sodio puede reducir eficientemente la actividad de la neurona. Por lo tanto, se utilizó una solución de disección que contiene 37.5 mmol colina.
Las neuronas de relé muestran picos de umbral bajo, que son generados por la corriente transitoria Ca2+ 29. Para bloquear la tensión cerrada Ca2+-canales, añadimos D-600 (methoxyverapamil) a la solución intracelular. D-600 no debe utilizarse si el propósito del estudio es investigar picos de bajo umbral en las neuronas de relé. La precisión de las grabaciones de abrazaderas de voltaje de celda entera se ve afectada por errores de abrazadera de espacio. Este problema técnico es más relevante para las entradas que están lejos del electrodo de grabación (por lo tanto para las sinapsis distales)30,31. Para minimizar el impacto del error de abrazadera espacial, utilizamos una S+basada en lugar de una solución intracelular basada en K+. Los canales que son K+ permeables (por ejemplo, canales de fuga) son generalmente Cs+ impermeable32. Por lo tanto, el uso de una solución intracelular basada en Cs+aumenta la impedancia de la célula.
La grabación estable de la abrazadera de parche depende de la selección de células sanas. Se deben evitar las neuronas con forma de soma redondo, color oscuro o soma hinchado. Además, las neuronas de retransmisión se distinguen de las interneuronas locales por su mayor tamaño de soma y los árboles dendríticos primarios más elaborados. Por lo tanto, seleccionamos células que tienen un tamaño de soma más grande (más grande que 15 m de diámetro) y morfología no bipolar. La célula de ejemplo que se muestra en la Figura 3B tiene una arquitectura dendrítica simétrica y, por lo tanto, puede clasificarse como neurona de relé que se asemeja a las neuronas Y que, por ejemplo, se encuentran en el gato LGN17.
La resistencia de la serie debe ser lo más pequeña posible y mantenerse constante. Además, dado que las entradas de dos direcciones se conservan en un segmento, es importante deshacerse de la interferencia entre las dos entradas. Para evitar activar las fibras corticogénicas al grabar corrientes mediadas por retinogeniculación sinapsis o viceversa, la pipeta estimulante no debe colocarse en la dLGN y la distancia entre la pipeta estimulante y de grabación debe ser tan Posible. Además, la larga distancia entre las pipetas estimulantes y de grabación requiere una preservación relativamente intacta del axón. Por lo tanto, se debe seleccionar un ángulo de corte adecuado para la disección. En general, sólo se pueden obtener uno o dos sectores con la preservación de dos insumos de cada hemisferio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) dentro del Centro de Investigación Colaborativa (SFB) 1134 "Conjuntos Funcionales" (J.v.E. y X.C.) y la Beca de Investigación EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
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