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Neuroscience

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

Published: August 7, 2019 doi: 10.3791/59680
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.

Abstract

O núcleo geniculado lateral é a primeira estação de retransmissão para a informação visual. Os neurônios do relé deste núcleo thalamic integram a entrada das pilhas retinal do gânglio e projetam-na ao córtice visual. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem excitação de cima para baixo do córtex. As duas principais entradas excitatórias para os neurônios de retransmissão diferem em vários aspectos. Cada neurônio do relé recebe a entrada de somente algumas sinapses retinogeniculate, que são grandes terminais com muitos locais da liberação. Isto é refletido pela excitação comparativamente forte, os neurônios do relé recebem, das pilhas retinal do gânglio. As sinapses corticogeniculate, ao contrário, são mais simples com poucos locais da liberação e uma força sináptica mais fraca. As duas sinapses também diferem em sua plasticidade sináptica de curto prazo. As sinapses retinogeniculate têm uma probabilidade elevada da liberação e apresentam conseqüentemente uma depressão a curto prazo. Ao contrário, as sinapses corticogeniculate têm uma baixa probabilidade da liberação. As fibras corticogeniculate atravessam os núcleos thalamic reticular antes de incorporar o núcleo geniculado lateral. Os diferentes locais do núcleo talâmico reticular (rostrally do núcleo geniculado lateral) e do trato óptico (ventro-lateralmente do núcleo geniculado lateral) permitem estimular as sinapses corticogeniculados ou retinogeniculados separadamente com eletrodos de estimulação extracelular. Isto faz o núcleo geniculado lateral uma área ideal do cérebro onde duas sinapses excitatórios com propriedades muito diferentes que colide no mesmo tipo da pilha, podem ser estudadas simultaneamente. Aqui, nós descrevemos um método para investigar a gravação dos neurônios do relé e para executar a análise detalhada da função retinogeniculate e corticogeniculate do sinapse em fatias agudas do cérebro. O artigo contém um protocolo passo-a-passo para a geração de fatias cerebrais agudas do núcleo geniculado lateral e etapas para a atividade de gravação de neurônios de retransmissão, estimulando o trato óptico e as fibras corticogeniculate separadamente.

Introduction

Os neurônios do relé do núcleo geniculado lateral integram e retransmitem a informação visual ao córtice visual. Esses neurônios recebem entrada excitatória de células ganglionares via sinapses retinogeniculadas, que fornecem a principal unidade excitatória para os neurônios de retransmissão. Além, os neurônios do relé recebem entradas excitatórios dos neurônios corticais através das sinapses corticogeniculate. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem entradas inibitórias de interneurônios locais e neurônios gabaérgicos do núcleo Livedo reticular thalami1. O núcleo Livedo reticular thalami está presente como um escudo entre o tálamo e o córtex de tal forma que as fibras que projetam do córtex para o tálamo e no sentido oposto devem atravessar o núcleo Livedo reticular thalami2.

As entradas de retinogeniculate e as entradas do corticogeniculate exibem propriedades sinápticasdistintas3,4,5,6,7,8. As entradas do retinogeniculate formam grandes terminais com os locais múltiplos da liberação9,10. Em contrapartida, os insumos corticogeniculados exibem pequenos terminais com locais de liberação única7. Além disso, as sinapses retinogeniculate impulsionam eficientemente potenciais de ação de neurônios de retransmissão, apesar de constituírem apenas 5 − 10% de todas as sinapses nos neurônios de retransmissão3,8,11. As sinapses corticogeniculate, por outro lado, servem como um modulador de transmissões retinogeniculate controlando o potencial de membrana de neurônios de relé12,13.

Estas duas principais entradas excitatórias para retransmissão de neurônios também são funcionalmente diferentes. Uma diferença proeminente é a depressão de curto prazo das sinapses retinogeniculate e a facilitação a curto prazo de sinapses corticogeniculate3,5,8. A plasticidade de curto prazo refere-se a um fenômeno em que a força sináptica muda quando a sinapse é repetidamente ativa dentro de um período de tempo de poucos milissegundos a vários segundos. A probabilidade de liberação sináptica é um fator importante subjacente à plasticidade de curto prazo. As sinapses, com uma baixa probabilidade de liberação inicial, exibem a facilitação a curto prazo devido ao acúmulo de CA2 + na pré-síntese e, consequentemente, um aumento na probabilidade de liberação é observado após a atividade repetida. Em contraste, as sinapses com alta probabilidade de liberação geralmente exibem depressão de curto prazo devido à depleção de vesículas prontas-liberáveis14. Além disso, a dessensibilização dos receptores pós-sinápticos contribui para a plasticidade de curto prazo em algumas sinapses de alta probabilidade de liberação8,15. A probabilidade da liberação elevada e a dessensibilização de receptores do ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) contribuem à depressão a curto prazo proeminente de sinapses retinogeniculate. Por outro lado, a probabilidade de baixa liberação está subjacente à facilitação de curto prazo de sinapses corticogeniculados.

Em camundongos, o trato óptico entra no núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) do local caudolateral, enquanto as fibras corticogeniculate entram no dLGN rostroventrally. A distância entre as duas entradas permite a investigação das propriedades individuais de duas entradas excitatórios muito diferentes que colide na mesma pilha. Aqui, nós construímos sobre e melhoramos um método previamente descrito da dissecção em que as fibras do retinogeniculate e do corticogeniculate são preservadas em fatias agudas do cérebro3. Nós, então, descrevemos a investigação electrofisiológica de neurônios do relé e a estimulação de fibras retinogeniculate e corticogeniculate com os elétrodos extracelular da estimulação. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para o enchimento de neurônios do relé com biocytin e a análise anatômica subseqüente.

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Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo painel governamental de supervisão em experimentos com animais da Renânia-Palatinado.

1. soluções

  1. Solução de dissecção
    1. Para reduzir a excitotoxicidade, prepare uma solução à base de colina para ser usado durante a dissecção como apresentado aqui (em mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 cloreto de colina, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2po4, 0,5 CAcl2, 7 MgCl2, e 25 de glicose. Prepare a solução de dissecção menos de 1 semana antes do experimento.
  2. Solução de gravação
    1. Prepare uma solução de fluido espinhal cerebral artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 2 CAcl2, 1 MgCl2e 25 glicose. Adicione 50 μM D-APV e 10 μM SR 95531 Hydrobromide para bloquear receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) e GABAa , respectivamente.
  3. Solução intracelular
    1. Prepare uma solução intracelular contendo (em mM): 35 cs-gluconato, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA e 0,1 D-600 (cloridrato de metoxiverapamil). Ajuste o pH a 7,3 com CsOH. Filtre, aliquot, e armazene a solução de estoque em-20 ° c até o uso.

2. dissecção

  1. Prepare duas câmaras de corte, das quais uma é preenchida com 100 mL da solução de dissecção e a outra com 100 mL de solução de gravação. Coloc os dois copos em um banho de água (° c 37) e borbulhe as soluções com o Carbogen por pelo menos 15 minutos antes da dissecção.
  2. Encha uma taça de plástico com 250 mL de solução de dissecção gelada (mas não congelada) próxima. Bolha com Carbogen pelo menos 15 min antes do uso.
  3. Encha um prato de Petri plástico (100 milímetros x 20 milímetros), em que a dissecção do cérebro será executada, com a solução fria da dissecção. Coloque um pedaço de papel de filtro na tampa do prato de Petri.
  4. Esfrie a câmara de dissecção do vibratome.
  5. Anestesie um rato com 2,5% de isoflurano, por exemplo, na gaiola do rato. Assim que o mouse não responde a uma pitada de cauda, decapitar o mouse perto da medula cervical e mergulhar a cabeça na solução de dissecção gelada na base do prato de Petri.
  6. Corte a pele da cabeça do caudal ao nasal e mantenha-a lateralmente com os dedos para expor o crânio. Para tirar o forebrain, primeiro corte o crânio junto com a linha média posterior-anterior e, em seguida, corte mais duas vezes através da sutura coronal e sutura lambdóide (Figura 1a).
  7. Retire o crânio entre a sutura coronal e a sutura lambdóide, de forma que o encéfalo esteja exposto. Corte o bulbo olfativo e separe o prosencéfalo do midbrain com uma lâmina fina (Figura 1b). Retire o cérebro do crânio com uma espátula fina e coloque-o sobre o papel de filtro na tampa do prato de Petri.
    Nota: as etapas 2,6 e 2,7 devem ser executadas o mais rápido possível para reduzir a morte celular.
  8. Para preservar a integridade das entradas sensoriais e corticais ao dLGN na fatia do cérebro, separe os dois hemisférios com um corte parasagittal com um ângulo de 3 − 5 ° (Figura 1C,D). Seque os planos mediolateral dos dois hemisférios colocando-os no papel de filtro e cole-os no estágio de corte com um ângulo de 10 − 25 ° do plano horizontal (Figura 1e).
  9. Coloque o palco no centro da bandeja de tampão de metal e despeje suavemente o resto da solução de dissecção gelada na bandeja de buffer. Execute esta etapa com cuidado desde que um derramar forte pôde remover o cérebro colado (Figura 1F).
  10. Coloque a bandeja de tampão na bandeja cheia de gelo, o que ajuda a manter a temperatura baixa durante a dissecção. Cortar 250 μm fatias com uma lâmina de barbear a uma velocidade de 0,1 mm/s e uma amplitude de 1 mm.
  11. Manter as fatias na câmara de retenção preenchidas com solução de dissecção oxigenada a 34 ° c durante cerca de 30 min e, em seguida, permitir que as fatias se recuperem na solução de gravação a 34 ° c por mais 30 min.
  12. Após a recuperação, retire a câmara de retenção da fatia do banho de água e mantenha as fatias à temperatura ambiente (RT) até serem utilizadas em experimentos.

3. eletrofisiologia

  1. Puxe pipetas utilizando capilares de vidro de borosilicato e um extrator de filamento. Manter a resistência das pipetas de gravação a 3 − 4 MΩ. Puxe as pipetas estimulantes utilizando o mesmo protocolo, mas quebre a ponta ligeiramente depois de puxar para aumentar o diâmetro. Encha as pipetas de gravação com a solução intracelular e a biocitina, enquanto preenche as pipetas estimulantes com a solução de gravação.
  2. Coloque as fatias na câmara de gravação e perfuse continuamente as fatias com a solução de gravação oxigenada em RT. Verifique todas as fatias e selecione aquelas que exibem um trato óptico intacto.
  3. Visualize a fatia e as pilhas com um microscópio ereto equipado com a microscopia de vídeo infravermelha do contraste da interferência diferencial (IR-DIC).
    Nota: os neurônios de retransmissão são diferenciados dos interneurônios por seu tamanho maior de soma e mais dendritos primários (ramos emergentes do soma). Os interneurônios exibem a morfologia bipolar com um soma menor.
  4. Coloque a pipeta estimulante sobre a fatia antes de remendar a célula com a pipeta de gravação. Para investigar sinapses retinogeniculate, coloc a pipeta de estimulação diretamente no intervalo ótico, onde as fibras do AXON das pilhas retinal do gânglio são empacotadas (Figura 2a). Para analisar as sinapses corticogeniculados, coloque o eletrodo estimulante no núcleo Livedo reticular thalami, que é rostroventrally adjacente ao dlgn (Figura 2b).
  5. Uma vez que a pipeta de gravação é imersa na solução de gravação, aplique uma etapa de tensão de 5 mV para monitorar a resistência da pipeta. Defina o potencial de retenção para 0 mV e cancele o potencial de deslocamento para que a corrente de retenção seja de 0 pA.
  6. Aproxime a pilha com a pipeta da gravação ao aplicar a pressão positiva. Quando a pipeta está em contato direto com a membrana celular, liberar a pressão positiva, e definir o potencial de retenção para-70 mV. Aplique uma ligeira pressão negativa para permitir que a membrana celular se encaixe na pipeta de vidro de forma que um selo do forme (resistência > 1 gω). Compensar a capacitância da pipeta e abrir a célula por aplicação de pulsos de pressão negativa.
  7. Para investigar a função sináptica, aplique 0,1 MS pulsos atuais (ca. 30 μA) através da pipeta de estimulação. Se não forem observadas Respostas sinápticas, as pipetas estimulantes poderão ter de ser substituídas. Tenha cuidado durante a colocação das pipetas estimulantes para uma posição diferente, de tal forma que a célula gravada não é perdida.
    Nota: nas gravações de exemplo mostradas na Figura 2, a plasticidade de curto prazo sináptica foi investigada estimulando o trato óptico ou as fibras corticogeniculadas duas vezes com intervalos interestímulos de 30 ms. A relação de pulso pareado (PPR) foi calculada dividindo-se a amplitude da segunda corrente pós-sináptica excitatória (EPSC) pela primeira EPSC (EPSC2/EPSC1). Cada protocolo de estimulação foi repetido 20 vezes. A amplitude da EPSC foi medida a partir das correntes médias das 20 varreduras. O intervalo de tempo entre cada repetição foi de pelo menos 5 s para evitar a plasticidade de curto prazo induzida pelas repetições.
  8. Monitore a resistência da série continuamente aplicando um passo de tensão de 5 mV. Use somente as pilhas com a resistência da série menor de 20 MΩ para a análise.

4. rotulagem do biocytin

  1. Manter a configuração de células inteiras por pelo menos 5 min para permitir a difusão de biocitina nos dendritos distais.
  2. Após a gravação, retire suavemente a pipeta da célula para que o soma não seja destruído.
    Observação: se mais de uma célula é gravada em uma fatia, seus somas devem ser suficientemente longe de suas células vizinhas. Certifique-se de que os dendritos de células diferentes não interferem uns com os outros durante a imagem.
  3. Prepare uma placa da cultura da pilha de 24 poços. Encha cada poço com 300 μL de paraformaldeído a 4% (PFA). Tome cuidado para não contaminar qualquer coisa com PFA que estará em contato com as fatias a serem gravadas.
  4. Transfira as fatias da câmara de gravação para a placa contendo PFA com uma pipeta de borracha e fixe as fatias durante a noite. Certifique-se de que a pipeta está sempre impedida de contaminação por PFA.
    PRECAUÇÃO: Use sempre luvas e utilize um capuz químico ao manipular o PFA.
  5. Após a fixação de fatias durante a noite na PFA, substitua a PFA por solução salina com tampão fosfato (PBS). Armazene as fatias em PBS a 4 ° c para processamento futuro (menos de 2 semanas).
  6. Lave as fatias com PBS fresco 3 vezes (10 min cada lavagem).
  7. Bloqueie sítios de ligação não específicos incubando as fatias na solução de bloqueio (0,2% de surfactante não iônico e 5% de albumina sérica bovina em PBS) por 2 h em RT em um agitador orbital.
  8. Descarte a solução de bloqueio. Incubar as fatias com streptavidin-Alexa 568 diluída na solução de bloqueio (1:1000) a 4 ° c durante a noite em um agitador orbital.
  9. Descarte a solução de anticorpos e lave as fatias 3 vezes com PBS por 10 min em RT em um agitador orbital. Lave as fatias com água da torneira antes de montar.
  10. Coloque as fatias de um mouse em um slide de vidro. Assegure-se de que as células manchadas estejam presentes na superfície superior das fatias. Absorva a água ao redor das fatias com os tecidos e, em seguida, deixe as fatias para secar por aproximadamente 15 min.
  11. Aplique duas gotas de meio de montagem em cada fatia. Monte uma lamínula no slide sem produzir bolhas de ar.
  12. Guarde as fatias rotuladas a 4 ° c após a visualização com um microscópio confocal.

5. imagem latente e reconstrução celulares

  1. Escaneie fatias com um microscópio confocal e use o software associado para a análise.
  2. Excitar a fluorescência a 561 nm.
  3. Imagem das fatias com 0,7 de abertura numérica (NA), objetivo de imersão em óleo.
  4. Ajuste a célula de destino no meio da exibição e aplique uma ampliação de 2,5 vezes.
  5. Renderize os conjuntos de dados z-Stack para digitalizar todo o neurônio com os seguintes parâmetros: Format = 2.550 x 2.550 pixels, Scan Frequency = 400 Hz, Z Number = 40. VOXEL tamanho foi em torno de 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
  6. Semi-rastrear automaticamente os neurônios usando um software de reconstrução neuronal (por exemplo, NeuronStudio). Um exemplo de um neurônio de retransmissão rastreado em 3D é mostrado na Figura 3B.

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Representative Results

A preparação da fatia de dLGN contendo as vias retinogeniculada e corticogeniculado é mostrada um objetivo de 4x (Figura 2). Os axônios das células ganglionares retinianas agrupam-se no trato óptico (Figura 2). A pipeta estimulante foi colocada no trato óptico para induzir a corrente mediada por sinapse retinogeniculado (Figura 2a) e no núcleo Livedo reticular thalami para induzir a corrente mediada por sinapses corticogeniculado (Figura 2b), respectivamente. Da nota, os axônios dos neurônios corticais aos neurônios de LGN projeta do córtice ao tálamo atravessar o núcleo Livedo reticular thalami. As sinapses de corticogenicluato podem, portanto, ser ativadas pela estimulação no núcleo Livedo reticular thalami.

A relação de pulso pareado dos EPSCs mediados pelo receptor de AMPA está abaixo de 1 ao estimular o trato óptico com intervalo inter-estímulo de 30 ms, mas acima de 1 ao estimular fibras corticogeniculadas com o mesmo intervalo de interestímulo (Figura 2C,D) . A depressão emparelhada do pulso de sinapses retinogeniculate é devido a uma probabilidade elevada da liberação do vesícula e a dessensibilização de receptores de AMPA pós-sináptica. A facilitação de pulso emparelhado das sinapses corticogeniculadas é consistente com uma probabilidade de liberação de vesículas baixas16.

A Figura 3a mostra a imagem do ir-DIC que mostra o soma de um neurônio do relé dlgn junto com a ponta da pipeta do remendo. A coloração com biocitina nos permite obter uma visão do Neuron gravado. Diferentes dos interneurônios, que possuem morfologia bipolar, os neurônios de retransmissão possuem mandris dendríticos multipolares (Figura 3B) contendo mais de 3 dendritos primários8,17. A reconstrução tridimensional (3D) de um neurônio biocytin-etiquetado do relé foi gerada então que mostra uma arquitetura dendríticas radialmente simétrica (Figura 3C).

Figure 1
Figura 1 : Esquemas que representam o protocolo de dissecção. (A) vista horizontal do crânio do rato, mostrando a posição dos cortes iniciais. O primeiro corte foi realizado juntamente com a sutura sagital, seguido de outros dois cortes, juntamente com a sutura coronal e a sutura lambdóide, respectivamente. Linhas tracejadas representam as incisões. (B) vista sagital de todo o cérebro. Linhas tracejadas indicam que o encéfalo é isolado do bulbo olfativo e do midbrain. (C-D) Estes painéis mostram o primeiro ângulo de corte para separar os dois hemisférios da visão horizontal (C) e coronal (D), respectivamente. (E) visão coronal de um hemisfério na fase de corte. Linhas tracejadas indicam a direção de corte. l, m, d e v representam os aspectos laterais, medial, dorsal e ventral, respectivamente, para o hemisfério nos painéis D e e. (F) diagrama da câmara de dissecção com dois hemisférios na fase de corte. A seta tracejada indica a direção móvel da lâmina de corte. a, p e d representam os aspectos anterior, posterior e dorsal do hemisfério esquerdo, respectivamente. (G) esquema representando uma fatia adequadamente cortada com uma parte relativamente grande do dlgn e preservação intacta do trato óptico. dLGN, núcleo geniculado lateral dorsal; vLGN, núcleo lateral ventral; OT, bulbo olfatório; NRT, núcleo Livedo reticular thalami. Os painéis C, D e G foram modificados a partir da Figura 1 de Turner e Salt3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Preparação da fatia de dLGN que contem as vias do retinogeniculate e do corticogeniculate e as gravações do exemplo. (A-B) Estes painéis mostram uma fatia de dLGN com preservação de entradas do retinogeniculate e do corticogeniculate. O eletrodo de estimulação foi colocado no trato óptico para ativar as sinapses retinogeniculadas (a) e no núcleo Livedo reticular thalami para ativar as sinapses corticogeniculadas (B). (C) epscs mediados pelo receptor de AMPA em resposta à estimulação do trato óptico duas vezes com intervalo inter-estímulo de 30 ms. (D) correntes mediadas por sinapse corticogeniculado com intervalo inter-estímulo de 30 ms. Os artefatos de estimulação foram removidos para maior clareza. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análise morfológica de um Neuron do relé. (A) imagem do ir-DIC que mostra o soma de um neurônio do relé de dlgn com a ponta da pipeta do remendo. (B) imagem confocal de um neurônio de relé rotulado com biocitina e visualizado com streptavidin-Alexa 568. (C) reconstrução tridimensional (3D) do mesmo Neuron, mostrando uma arquitetura dendrítica radialmente simétrica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós descrevemos um protocolo melhorado baseado em um método previamente publicado3, que permita a investigação da probabilidade elevada de sinapses retinogeniculate da liberação e da baixa probabilidade de sinapses corticogeniculate da liberação da mesma fatia. Isto é de grande importância uma vez que estas duas entradas interagem entre si para modular a transmissão do sinal visual: as entradas de retinogeniculate são a movimentação excitatórios principal de neurônios do relé, visto que as entradas corticothalamic funcionam como um modulador, que influencia o ganho da transmissão do retinogeniculate afetando o estado de neurônios do relé. Como esperado, observamos que as sinapses retinogeniculada e corticogeniculada exibem diferentes plasticidade de curto prazo devido à diferença em suas probabilidades de liberação. Adicionalmente, a dessensibilização do receptor GABA também contribui para a forte depressão em sinapses retinogeniculados9,15,16. Nós mostramos recentemente que a depressão a curto prazo é modulada por CKAMP4416, uma proteína auxiliar do receptor de AMPA da família de ckamp que retarda a recuperação da dessensibilização de receptores GABA18,19, 20. Além disso, as amplitudes atuais mediadas por sinapse retinogeniculate são mais elevadas do que aquelas das correntes sinapse-negociadas corticogeniculate a mesma força de estimulação, consistentes com as grandes sinapses retinogeniculate com Múltiplo liberando locais, e relativamente pequenas sinapses corticogeniculate7,21.

O protocolo de fatiamento é essencialmente o mesmo que aquele desenvolvido por Turner e por sal3. Algumas modificações que foram baseadas em nossa experiência melhoraram a qualidade da fatia. Semelhante a Hauser et al.22, utilizamos uma solução de dissecção à base de colina, em vez de uma sacarose. A recuperação após a dissecção foi feita a 34 ° c na solução de corte por 30 min e depois na solução de gravação por mais 30 min e não à temperatura ambiente. As fatias foram ligeiramente mais finas (250 μm em vez de 400 μm). Nós dissecamos cérebros usando uma cunha com um ângulo de 10 − 25 °, o que facilita e aumenta a confiabilidade do procedimento de fatiamento.

As condições de gravação e estimulação para a investigação da função de sinapse do neurônio do relé são essencialmente as mesmas descritas anteriormente por Chen e Regehr8. A ativação das fibras do trato óptico geralmente provoca grandes correntes e pode estar na faixa de vários nA quando todas as sinapses retinogeniculadas em um relé neurônios são ativados23. Para evitar erros de resistência da série, especialmente quando se investiga a corrente máxima ativando todas as sinapses retinogeniculate em um relé neurônios, Chen e Regehr usado registrando pipetas de baixa resistência (< 2 MΩ). No entanto, para investigar a plasticidade sináptica de curto prazo, basta ativar um ou poucos axônios de células ganglionares retinianas, que provocam correntes que estão na faixa de 34 − 579 pA (resultados inéditos, Chen et al.). As pipetas menores com uma resistência entre 3 − 4 MΩ podem, conseqüentemente, ser usadas ao investigar a função retinogeniculate do sinapse usando a estimulação fraca do intervalo ótico. A ativação de sinapses corticogeniculate provoca correntes relativamente pequenas16. Os erros da resistência da série são, conseqüentemente, um problema menor ao investigar a função corticogeniculate do sinapse.

Nós mostramos aqui que a estimulação de sinapses retinogeniculate e corticogeniculate pode ser usada para investigar a plasticidade a curto prazo de correntes receptor-negociadas de AMPA. O mesmo protocolo pode ser aplicado para registrar a corrente mediada pelo receptor NMDA24. Na verdade, uma das primeiras indicações de que a dessensibilização do receptor de AMPA contribui para a plasticidade de curto prazo nas sinapses retinogeniculadas veio de experimentos nos quais as proporções de pulso pareado das correntes mediadas pelo receptor de AMPA foram comparadas com rácios de pulso pareado de correntes mediadas por receptores NMDA. As sinapses de corticogeniculate foram estimuladas posicionando a pipeta da estimulação no thalami dos Livedo reticular do núcleo porque os axônios de neurônios corticais que excitam os neurônios do relé de dlgn viajam através deste núcleo thalamic. A mesma posição de estimulação pode ser usada para estudar as correntes sinápticas inibitórias no dLGN, como mostrado, por exemplo, por Govindaiah e Cox25.

Os neurônios de retransmissão expressam os receptores GABAA e GABAB . A liberação de GABA ativa receptores de GABAA sináptica. Os receptores de GABAB , que são extrasynaptically localizados, são ativados quando o núcleo Livedo reticular thalami é ativado fortemente por exemplo durante disparar do estouro26,27,28. Spillover de GABA, que geralmente é restrito devido à captação de GABA por astrócitos, pode ativar durante a ativação de sinapse intensa os receptores de GABAB extrasynáptica27,28. Nós não bloqueamos os receptores GABAB porque a intensidade e frequência de estimulação foram comparativamente baixas. No entanto, ao investigar a função de sinapse corticogeniculado usando protocolos de estimulação intensa, pode ser preferível adicionar receptores GABAB .

As gravações de neurônios do relé dLGN podem prontamente ser executadas ao usar as fatias que são aproximadamente 2 milímetros medial da superfície lateral do cérebro (Comece coletar aproximadamente o 8th das fatias do μm 250 durante o procedimento do corte). Em algumas fatias, não ambas as entradas a um neurônio dado do relé podem ser detectadas porque um dos dois caminhos é cortado perto do neurônio do relé. Neste caso, geralmente ainda é possível investigar sinapses retinogeniculate e corticogeniculate na mesma fatia selecionando os neurônios diferentes do relé para cada entrada. Para gravar o retinogeniculate o sinapse mediado atual, os neurônios ventralmente situados do relé são selecionados desde que as fibras do intervalo ótico a estas pilhas são preservadas mais provável do que nos neurônios localizados dorsalmente do relé. Em contrapartida, os insumos corticogeniculados são mais prováveis preservados em neurônios de retransmissão que estão localizados dorsalmente no dlgn.

A qualidade da fatia determina a confiabilidade dos dados. Com base em nossa experiência, os seguintes parâmetros são essenciais para garantir a boa qualidade da fatia. O resfriamento e a oxigenação são fatores importantes durante o procedimento de dissecção. A cabeça do mouse deve ser mantida em solução fria imediatamente após a decapitação do mouse. Ao tirar o cérebro do crânio, ele deve ser imerso em solução gelada a cada 3 a 4 s, a fim de reduzir a morte celular. Da mesma forma, o procedimento de fatiamento deve ser realizado em torno de 4 ° c. Além disso, solução de dissecção e solução de gravação deve ser oxigenada pelo menos 15 min antes de usar para manter a concentração de oxigênio suficiente. Além disso, o bloqueio dos canais de sódio pode reduzir eficientemente a atividade do neurônio. Portanto, foi utilizada uma solução de dissecção contendo 37,5 mmol de colina.

Os neurônios de retransmissão exibem picos de baixo limiar, que são gerados pelo CA transitório2 + Current29. Para obstruir a tensão fechado CA2 +-canaletas, nós adicionamos D-600 (methoxyverapamil) à solução intracelular. D-600 não deve ser usado se o objetivo do estudo é investigar picos de baixo limiar em neurônios de retransmissão. A precisão de gravações da braçadeira da tensão da inteiro-pilha é afetada por erros da braçadeira do espaço. Este problema técnico é mais relevante para os insumos que estão longe do eletrodo de gravação (assim, para sinapses distais)30,31. Para minimizar o impacto do erro de grampo de espaço, usamos um cs+-based em vez de uma solução intracelular baseada em K+. Canais que são K+ permeável (por exemplo, canais de vazamento) são geralmente cs+ impermeável32. Assim, o uso de uma solução intracelular baseada em cs+aumenta a impedância da célula.

A gravação estável da braçadeira de remendo depende da seleção de pilhas saudáveis. Neurônios com forma de soma redonda, cor escura ou soma inchada devem ser evitados. Além disso, os neurônios do relé distinguem-se dos interneurônios locais por seu tamanho maior do soma e por mandris dendríticas preliminares mais elaborados. Portanto, selecionamos células com maior tamanho de soma (maior que 15 μm de diâmetro) e morfologia não bipolar. A célula de exemplo mostrada na Figura 3B tem uma arquitetura dendrítica simétrica e pode, portanto, ser classificada como neurônio de retransmissão semelhante a Y-neurônios que são, por exemplo, encontrados no gato LGN17.

A resistência da série deve ser tão pequena como possível e mantida constante. Além disso, uma vez que as entradas de duas direções são preservadas em uma fatia, é importante se livrar da interferência entre as duas entradas. Para evitar a activação de fibras corticogeniculadas durante a gravação de correntes mediados por sinapse retinogeniculado ou vice-versa, a pipeta estimulante não deve ser colocada no dLGN e a distância entre a pipeta de estimulação e de gravação deve ser até Possível. Além disso, a longa distância entre as pipetas estimulantes e de gravação requer a preservação do AXON relativamente intacto. Portanto, um ângulo de corte adequado deve ser selecionado para a dissecção. Em geral, apenas uma ou duas fatias com preservação de duas entradas podem ser obtidas de cada hemisfério.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Fundação alemã de pesquisa (DFG) no centro de pesquisa colaborativa (SFB) 1134 "conjuntos funcionais" (J.v.E. e X.C.) e o subsídio de pesquisa EN948/1-2 (J.v.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

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Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

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