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Biochemistry

ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59687
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Department of Pharmacology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University, 2Graduate Program in Physiology and Integrative Biology, School of Graduate Studies, Rutgers University, 3Department of Plant Biology, School of Environmental and Biological, Rutgers University

Summary

आरएनए पॉलिमरेज के साथ प्रतिलेखन कारकों (टीएफएस) की बातचीत आमतौर पर पुलडाउन परख का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। हम क्लैमिडियल आरएनए पॉलिमरेज के साथ GrgA की बातचीत की विशेषता के लिए एक Biolayer इंटरफेरोमेट्री (BLI) प्रौद्योगिकी लागू होते हैं। pulldown assays की तुलना में, BLI वास्तविक समय संघ और वियोजन का पता लगाता है, उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है, और अत्यधिक मात्रात्मक है.

Abstract

एक प्रतिलेखन कारक (TF) एक प्रोटीन है कि आरएनए polymerase, एक और TF, और / GrgA एक उपन्यास प्रतिलेखन उत्प्रेरक है जो विशेष रूप से अविकल्पी इंट्रासेल्यूलर जीवाणु रोगज़नक़ क्लैमिडिया में पाया जाता है। एफ़िनिटी मोतियों का उपयोग करके प्रोटीन पुलडाउन परखसे गए हैं कि GrgA दो कारकों को बांधता है, अर्थात्66 और $28,जो जीनों के लिए प्रमोटरों के विभिन्न सेटों को पहचानते हैं जिनके उत्पादों की विकासात्मक अवस्थाओं में अंतर की आवश्यकता होती है। हम की पुष्टि करने के लिए और आगे बातचीत की विशेषता BLI का इस्तेमाल किया है. BLI pulldown पर कई फायदे दर्शाता है: 1) यह बाध्यकारी भागीदारों के बीच वास्तविक समय संघ और वियोजन से पता चलता है, 2) यह मात्रात्मक गतिज पैरामीटर उत्पन्न करता है, और 3) यह बाइंडिंग कि pulldown परख अक्सर पता लगाने में विफल का पता लगा सकते हैं. इन विशेषताओं ने क्लैमिडिया में जीन अभिव्यक्ति विनियमन में ग्राम की शारीरिक भूमिकाओं और संभावित विस्तृत अन्योन्यक्रिया तंत्रों को कम करने में सक्षम बना दिया है. हम कल्पना है कि यह अपेक्षाकृत सस्ती प्रौद्योगिकी प्रतिलेखन और अन्य जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अत्यंत उपयोगी हो सकता है.

Introduction

ट्रांसक्रिप्शन, जो डीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके आरएनए अणुओं का उत्पादन करता है, जीन अभिव्यक्ति का पहला कदम है। जीवाणु आरएनए संश्लेषण आरएनए पॉलिमरेज (आरएनएपी) होलोएंजाइम के साथ लक्ष्य प्रवर्तक1,2 के लिए बंधन के बाद शुरू होताहै। आरएनएपी होलोएंजाइम (RNAPholo) में एक बहु-सबयूनिट उत्प्रेरक कोर (RNAPcore) और एक $ कारक शामिल है, जो प्रमोटर अनुक्रम को पहचानने के लिए आवश्यक है। ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर और दमनकारी, जिन्हें सामूहिक रूप से टीएफ कहा जाता है, आरएएनपीकोर के बाध्यकारी घटकों के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं, - कारक, और/या डीएनए। जीव पर निर्भर करता है, इसके जीनोम का एक महत्वपूर्ण हिस्सा TFs के लिए समर्पित किया जा सकता है कि शारीरिक जरूरतों और पर्यावरण संकेतों3के जवाब में प्रतिलेखन को विनियमित.

क्लैमिडिया एक अविकल्पी इंट्रासेल्यूलर जीवाणु है जो मनुष्यों और जानवरों में विभिन्न प्रकार के रोगों के लिए जिम्मेदारहै 4,5,6,7,8. उदाहरण के लिए, क्लैमिडिया ट्रैकोमैटिस यकीनन दुनिया भर में मनुष्यों में यौन संचारित रोगजनक संख्या है, और कुछ अविकसित देशों में अंधापन का एक प्रमुख कारण4,5. क्लैमिडिया में एक अद्वितीय विकास चक्र होता है जिसमें दो वैकल्पिक कोशिकीय रूप होते हैं जिन्हें प्राथमिक शरीर (ईबी) और रेटिकुलेट बॉडी (आरबी)9कहा जाता है। जबकि, ईबी एक extracellular वातावरण में जीवित रहने में सक्षम हैं, वे प्रसार में असमर्थ हैं. ईबीएस एंडोसाइटोसिस के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं और संरोपण के बाद घंटों के भीतर मेजबान कोशिका द्रव्य में एक धानी में बड़े आरबी में अंतर करते हैं। अब संक्रामक, RBs द्विआधारी विखंडन के माध्यम से फैल. लगभग 20 एच, वे EBs, जो 30-70 एच के आसपास मेजबान कोशिकाओं से बाहर निकलने के लिए वापस अंतर करने के लिए शुरू करते हैं।

क्लैमिडियल विकास चक्र की प्रगति प्रतिलेखन द्वारा विनियमित की जाती है। जबकि लगभग 1,000 क्लैमिडियल जीनों का एक अति बहुमत मध्यचक्र के दौरान व्यक्त किया जाता है जिसके दौरान आरबीएस सक्रिय रूप से नकल कर रहे हैं, केवल एक छोटी संख्या में जीनों को मेजबान कोशिकाओं में ईबी के प्रवेश के तुरंत बाद टाइप किया जाता है ताकि रूपांतरण शुरू किया जा सके। आरबी में ईबी , और जीनों का एक अन्य छोटा सा सेट, आर बीएस 10,11में आरबी के विभेद को सक्षम करने के लिए प्रतिलेखन या तेजी से प्रतिलेखन किया जाता है .

क्लैमिडियल जीनोम तीन कारकों को एन्कोड करता है, अर्थात्र् 66, र्28 और र्54। ख्66, जो ई. कोलाई और अन्य बैक्टीरिया के 70 घर की रखवाली के बराबर है, प्रारंभिक और मध्य चक्र जीनों के प्रमोटरों के साथ-साथ कुछ देर से जीनों को पहचानने के लिए जिम्मेदार है, जबकि $28 और ख् 54 के लिए आवश्यक हैं कुछ देर जीन ों का प्रतिलेखन. अनेक जीनों में66पर निर्भर प्रवर्तक तथा28- निर्भर प्रवर्तक12दोनों को ले जाने के लिए जाना जाता है ।

एक जटिल विकास चक्र के बावजूद, क्लैमिडिया13में केवल कुछ ही संख्या में टीएफ पाए गए हैं। GrgA (पहले एक काल्पनिक प्रोटीन CT504 के रूप में सी trachomatis serovar डी और C. trachomatis L2 में CTL0766) एक क्लैमिडिया-विशिष्ट TF शुरू में66-निर्भर जीन14के एक उत्प्रेरक के रूप में मान्यता प्राप्त है . आत्मीयता pulldown परख का प्रदर्शन किया है कि GrgA दोनों बाध्यकारी द्वारा उनके प्रतिलेखन को सक्रिय करता है -66 और डीएनए. दिलचस्प है, यह बाद में पाया गया कि GrgA भी सह के साथ precipitates $28, और से प्रतिलेखन सक्रिय करता है -28- vitro मेंनिर्भर प्रमोटरों15. यह जाँचने के लिए कि क्या GrgA के समान या भिन्न सजातीयताएँ66 और $28के लिए हैं, हमने BLI का उपयोग करने का सहारा लिया। BLI परख से पता चला है कि GrgA के साथ सूचना का आदान-प्राप्त $66 एक 30 गुना अधिक आत्मीयता के साथ $28की तुलना में , सुझाव है कि GrgA में अंतर भूमिका निभा सकते हैं -66- निर्भर प्रतिलेखन और $28- निर्भर प्रतिलेखन 15.

बी एल आई सफेद प्रकाश के हस्तक्षेप पैटर्न का पता लगाता है जो बायोसेंसर की नोक पर स्थिर प्रोटीन की परत से प्रतिबिंबित होता है और इसकी तुलना आंतरिक संदर्भ परत16से करता है . इन दो हस्तक्षेप पैटर्न के विश्लेषण के माध्यम से, BLI biosensor की नोक करने के लिए बाध्य प्रोटीन की मात्रा के बारे में मूल्यवान और वास्तविक समय जानकारी प्रदान कर सकते हैं. प्रोटीन है कि biosensor की नोक करने के लिए स्थिर है ligand के रूप में जाना जाता है, और आम तौर पर एक आम एंटीबॉडी या epitope टैग की मदद से स्थिर है (उदाहरण के लिए, एक पाली-His- या biotin-टैग) है कि एक संबद्ध कण के लिए एक संबंध है (जैसे NTA या के रूप में Streptavidin) biosensor की नोक पर. एक माध्यमिक प्रोटीन की बाइंडिंग, analyte के रूप में जाना जाता है, biosensor की नोक पर ligand के साथ biosensor की अस्पष्टता में परिवर्तन बनाता है और इसलिए हस्तक्षेप पैटर्न में परिवर्तन में परिणाम. जब एनालाइट की विभिन्न सांद्रताओं पर दोहराया जाता है, तो बीएलआई न केवल गुणात्मक बल्कि लिगन्ड और एनालाइट16के बीच संबंध के बारे में मात्रात्मक जानकारी भी प्रदान कर सकता है।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हम पहली बार BLI को रोजगार के लिए प्रतिलेखन15में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की विशेषता थे. इस प्रकाशन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक GrgA टुकड़ा, जो पहले के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था $28-बाध्यकारी, वास्तव में बाइंडिंग मध्यस्थता. इस पांडुलिपि BLI assays के कदम पर केंद्रित है, और BLI रेखांकन और बाध्यकारी गतिज के मापदंडों के उत्पादन. लिगन्ड्स और एनालाइट्स के उत्पादन (और शुद्धिकरण) के लिए विधियाँ यहाँ शामिल नहीं हैं।

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Protocol

1. प्रोटीन की तैयारी

  1. एक डायलिसिस बैग का प्रयोग करें (एक उचित कट-ऑफ आकार के साथ) प्रत्येक प्रोटीन डायलिश करने के लिए BLI assays के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए (दोनों अपने टैग ligand और analyte सहित) BLI बफर के 1,000 संस्करणों के खिलाफ (25 एमएम Tris-HCl, 150 एमएम NaCl, 0.1 m EDTA, 10 MMgCl2 , 0.1 एमएम डीटीटी, पीएच 8.0, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा 4 एच.
    नोट: BLI परख ligand सांद्रता है कि biosensor और analyte पर बाध्यकारी साइटों को तर अत्यधिक शुद्ध किया जा करने के लिए इतना है कि लिगंड के साथ प्रतिक्रिया है कि analyte के मोलर सांद्रता जाना जाता है पर मौजूद होने की आवश्यकता है. उनकी अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए पद्धति - और स्ट्रेप-टैग प्रोटीन यहाँ शामिल नहीं हैं, लेकिन पिछले प्रकाशनों में पाया जा सकताहै 14,15. यद्यपि इस प्रणाली के लिए लिगन्ड को अत्यधिक शुद्ध रूप में होने की आवश्यकता नहीं है, फिर भी परख के दौरान किसी भी बफर परिवर्तन के कारण सफेद प्रकाश हस्तक्षेप पैटर्न में बदलाव को कम करने के लिए BLI बफर में भी unpurified ligands डायलीज करने के लिए आवश्यक है।
  2. ताजा BLI बफर करने के लिए स्विच और एक और 4 ज के लिए डायलिसिस जारी है।

2. Biosensor जलयोजन और परख सेट अप

  1. लगभग 10 मिनट एक परख की शुरुआत करने से पहले, एक पीसीआर ट्यूब में BLI बफर के pipette 200 $L.
  2. एक दस्ताने हाथ का उपयोग कर biosensor के विस्तृत हिस्से को पकड़े हुए मूल पैकेजिंग से एक Ni-NTA-बायोसेंसर निकालें.
  3. पीसीआर-ट्यूब पर बायोसेंसर को इस तरह रखें कि केवल बायोसेंसर का कांच का टिप बीएलआई बफर में डूबा हुआ है।
  4. बायोसेंसर टिप को पूर्ण जलयोजन सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए जलमग्न रखें।
    1. सत्यापित करें कि Ni-NTA-बायोसेंसर के कांच टिप ऊपर चरण के दौरान BLI बफ़र के अलावा अन्य कुछ भी स्पर्श नहीं करता है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल एक उसके टैग ligand के साथ संयोजन के रूप में एक Ni-NTA-बायोसेंसर का उपयोग करता है. यदि आवश्यक हो, एक एसए-Streptavidin-बायोसेंसर एक biotinylated ligand के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है बजाय अगर: (i) दोनों ligand और analyte एक उसका टैग ले या (ii) उनमें से कोई नहीं करता है.
  5. BLItz मशीन चालू करें।
  6. सुनिश्चित करें कि मशीन मशीन के पीछे USB डेटा आउटपुट पोर्ट के माध्यम से कंप्यूटर से कनेक्टेड है।
  7. कंप्यूटर पर, संबद्ध सॉफ़्टवेयर (उदा., BLItz Pro) खोलें, और स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर उन्नत कीनेटिक्स पर क्लिक करें।
  8. सॉफ़्टवेयर पर, प्रत्येक संबंधित शीर्षक के अंतर्गत प्रयोग (प्रयोग नाम, वर्णन, नमूना आईडी और प्रोटीन एकाग्रता सहित) के बारे में सभी उपयुक्त जानकारी लिखें.
  9. Biosensor प्रकार पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से Ni-NTA चुनें.
    1. रन सेटिंग्स शीर्षक के अंतर्गत, सत्यापित करें कि शकर सक्षमकरने के लिए सेट किया गया है।
    2. चरण प्रकार सूची शीर्षक के अंतर्गत, सत्यापित करें कि 5 आइटम सूचीबद्ध हैं: प्रारंभिक आधार रेखा, लोड हो रहा है, आधार रेखा, संबद्धता, और dissociation।
      नोट: प्रत्येक चरण की अवधि की आवश्यकता के रूप में डिफ़ॉल्ट से बदला जा सकता है। इष्टतम परिणामों के लिए, प्रारंभिक आधार रेखा और आधार रेखा के लिए 30 s की एक न्यूनतम का उपयोग करें; और एसोसिएशन और अलगाव के लिए 120 एस. लोडिंग चरण की अवधि (120 से 240 तक) नि-एनटीए-बायोसेंसर के लिए लिगन्ड पर लिगन्ड और उसकी-एपिटोप टैग की एकाग्रता पर निर्भर करेगी।
  10. पीसीआर ट्यूब से हाइड्रेटेड नी-एनटीए-बायोसेंसर निकालें और माउंट पर बायोसेंसर के चौड़े हिस्से को फिसलने से मशीन पर बायोसेंसर माउंट करने के लिए चिपकाएं।
    नोट: प्रयोग के दौरान बायोसेंसर को सूखने न दें।
  11. मशीन के ट्यूब धारक में 0.5 एमएल काले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें और इसे बीआई बफर के पिपेट 400 $L।
  12. सत्यापित करें कि मशीन का स्लाइडर ऐसी स्थिति में है कि ट्यूब धारक मशीन पर काले तीर के सामने स्थित है।
  13. मशीन के कवर को बंद करें ताकि बायोसेंसर टिप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बफर में डूब न जा सके।
  14. प्रारंभिक आधार रेखा रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए सॉफ़्टवेयर पर अगला क्लिक करें।

3. बायोसेंसर पर लिगन्ड का लोड हो रहा है

  1. प्रारंभिक आधार रेखा चरण रिकॉर्डिंग समाप्त करने के बाद, मशीन का कवर खोलें।
  2. सही करने के लिए स्लाइडर ले जाएँ इस तरह है कि ड्रॉप धारक (ट्यूब धारक के बजाय) काले तीर के सामने स्थित है.
  3. पिपेट 4 डिग्री सेल्सियस की एक डायलिग्ड उसकी-टैग ्ड लिगन्ड (चरण 1.1 से) ड्रॉप होल्डर पर और मशीन के कवर को बंद करें।
    नोट: Ligand के इष्टतम एकाग्रता का इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन के लिए भिन्न हो सकते हैं. 1.0 से 2.0 mg/mL के बीच एक एकाग्रता आमतौर पर 240 s में biosensor की नोक पर NTA तर करने के लिए पर्याप्त है.
  4. सॉफ़्टवेयर पर, लोड करना प्रारंभ करने के लिए अगला क्लिक करें.

4. अतिरिक्त लिगन्ड दूर धोना

  1. लोडिंग चरण रिकॉर्डिंग समाप्त करने के बाद, मशीन का कवर खोलें।
  2. स्लाइडर को बाईं ओर ले जाएँ ताकि ट्यूब धारक एक बार फिर काले तीर के सामने स्थित हो।
  3. मशीन का ढक्कन बंद करें और सुनिश्चित करें कि बायोसेंसर टिप ट्यूब धारक में ट्यूब के BLI बफर में डूब गया है।
  4. आधार रेखा रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए सॉफ़्टवेयर पर एक बार फिर अगला क्लिक करें.

5. एनेलाइट के एसोसिएशन लिगन्ड करने के लिए

  1. आधार रेखा चरण रिकॉर्डिंग समाप्त करने के बाद, मशीन का कवर खोलें।
  2. ड्रॉप धारक निकालें और किसी भी प्रोटीन बाहर pipeting द्वारा इसे साफ और यह डबल deionized पानी के साथ rinsing (ddH2हे) की कुल के लिए 5 बार.
    1. धोने के बाद ड्रॉप होल्डर की सतह को साफ करने के लिए टिशू पोंछे का उपयोग करें।
  3. ड्रॉप होल्डर को वापस मशीन पर बदलें।
  4. सही करने के लिए मशीन पर स्लाइडर ले जाएँ इस तरह है कि ड्रॉप धारक एक बार फिर काले तीर के सामने स्थित है.
  5. ड्रॉप होल्डर पर एक डायलीज़्ड एनालाइट (चरण 1.1 से) के पिपेट 4 डिग्री एल और मशीन के कवर को बंद करें।
  6. सॉफ़्टवेयर पर, संबद्धता प्रारंभ करने के लिए अगला क्लिक करें.

6. लिगन्ड से एनालाइट का विघटन

  1. एसोसिएशन चरण रिकॉर्डिंग समाप्त करने के बाद, मशीन का कवर खोलें।
  2. सही करने के लिए मशीन पर स्लाइडर ले जाएँ इस तरह है कि ट्यूब धारक एक बार फिर काले तीर के सामने स्थित है.
  3. सॉफ़्टवेयर पर, वियोजन प्रारंभ करने के लिए अगला क्लिक करें.
  4. वियोजन चरण रिकॉर्डिंग समाप्त करने के बाद, मशीन का कवर खोलें।
  5. ड्रॉप धारक और ट्यूब धारक निकालें.
  6. किसी भी प्रोटीन को धोने के लिए दोनों को डीडीएच2हे के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें।
  7. बायोसेंसर निकालें और इसे सुरक्षित रूप से छोड़ दें।

7. विभिन्न सांद्रता के साथ बातचीत को दोहराना

  1. अलग-अलग एनालाइट सांद्रता का उपयोग करते हुए एक ही लिगन्ड-एनालाइट युग्म के लिए चरण 2-7 दोहराएँ।
    नोट: analyte की एकाग्रता इष्टतम परिणाम प्राप्त करने से पहले कई रन भर में समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. हमारे अनुभव में, analyte सांद्रता के 1:5:10 का अनुपात, 75 एनएम के साथ शुरू, आमतौर पर पर्याप्त है.

8. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण

  1. एक बार सभी रन समाप्त हो गया है, फ़ाइल पर क्लिक करके सॉफ्टवेयर पर डेटा को बचाने के लिए और फिर स्क्रीन के बाईं ओर के रूप में प्रयोग सहेजें.
  2. डेटा चलाएँ शीर्षक के अंतर्गत, चरण सुधार और फ़िट (1:1) का चयन करें और गतिज डेटा जनरेट करने के लिए विश्लेषण करें क्लिक करें.
  3. मात्रात्मक डेटा को कार्यपत्रक में निकालने और ग्राफ़ जनरेट करने के लिए, CSV में निर्यात करें पर क्लिक करें और रिकॉर्ड किए गए डेटा को .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके .csv फ़ाइल खोलें.
    1. सबसे प्रभावी ढंग से एसोसिएशन और वियोजन गतिकी दिखाने के लिए, आधार रेखा चरण से पहले सभी प्लॉट बिंदुओं को निकालें, और अंतिम आधार रेखा मान से सभी बाद प्लॉट बिंदुओं को सामान्य करें।

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Representative Results

BLI assays के माध्यम से, हम पहले से स्थापित है कि GrgA के बंधन $28 के लिए एक 28 एमिनो एसिड मध्य क्षेत्र पर निर्भर है (अवशेष 138-165) GrgA15के. तदनुसार, एन-टर्मिनल लीज-टैग्ड पूर्ण लंबाई GrgA (एनएच-GrgA) के साथ तुलना में, एक GrgA विलोपन निर्माण इस क्षेत्र की कमी (एनएच-GrgA $138-165) एक कम संघ दर और एक वृद्धि हुई वियोजन दर थी, समग्र के एक 3 लाख गुना नुकसान के लिए अग्रणी आत्मीयता (तालिका 1)। यहाँ हम यह प्रदर्शित करते हैं कि शेष ग्राम प्रोटीन के अभाव में यह मध्य क्षेत्र सीधे28 को बांधता है। इन प्रयोगों में, मध्य क्षेत्र एक N-terminally हि-टैग के साथ टैग (NH-GrgA138-165) लिगन्ड के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जो पहले एक Ni-NTA biosensor की नोक के लिए immobilized था (चित्र 1A). बायोसेंसर से अनबाउंड एनएच-GrgA138-165 धोने के बाद, एनालाइट जेड28 के साथ वास्तविक समय सहयोग 28 $28के अतिरिक्त के बाद दर्ज किया गया था। अंत में, वास्तविक समय वियोजन धोने के बाद दर्ज किया गया था. तीन अलग-अलग एनेलाइट सांद्रता ओंकारों के साथ प्रयोगों की रिकॉर्डिंग, जो लिगंड बाइंडिंग से पहले 30 से शुरू होती हैं और धोने की शुरुआत के 2 मिनट बाद समाप्त होती हैं , चित्र 1कमें दिखाई जाती हैं . लिगन्ड-एनालाइट इंटरैक्शन को बेहतर ढंग से विज़ुअलाइज़ करने के लिए, हम लिगन्ड के योग से पहले डेटा को निकाल देते हैं और चित्र 1Bप्राप्त करने के लिए आधार रेखा को 0 पर रीसेट करदे होते हैं।

एनएच-GrgA138-165 खंड के साथ $28 के अन्योन्यक्रिया के लिए गतिज पैरामीटरों के मान तालिका 1में प्रस्तुत किए गए हैं। एनएच-GrgA X -28 इंटरैक्शन की तुलना में, एनएच-GrgA138-165 X -28 इंटरैक्शन ने kaमें एक ट्रेंडिंग सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण 60% कमी प्रदर्शित की, जो kd में एक अत्यधिक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण 64% वृद्धि है , और केडीमें एक अत्यधिक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण 3.5 गुना वृद्धि हुई है . इन परिवर्तनों से यह प्रदर्शित होता है कि एनएच-GrgA, NH-GrgA138-165 की तुलना में ,28 को धीरे-धीरे बांधता है, $28 से अधिक तेज़ी से अलग हो जाता है, और इसमें $28के साथ समग्र संबंध में कमी आई है। अतः, अवशेष 138-165 GrgA में बांधता है -28 लेकिन पूर्ण लंबाई GrgA की तुलना में कम आत्मीयता के साथ.

Figure 1
चित्र 1: ग्रामका 28 अमीनो अम्ल मध्य क्षेत्र इन विट्रो में 28 बांधता है।
(क) चार चरणों में दर्ज प्रकाश हस्तक्षेप पैटर्न में वास्तविक समय परिवर्तन: (i) एक नी-एनटीए बायोसेंसर के लिए एनएच-GrgA138-165 (लिगांड) का बंधन, (ii) धोने, (iii) एन एस-जेड28 (एनालाइट) की बाइंडिंग विभिन्न सांद्रताओं पर स्थिर एनएच-GrgA-138-165 (लिगंड), और (iv) बाद में धोने. (ख) लिगन्ड-एनालाइट एसोसिएशन का उन्नत दृश्यावलोकन और पहले दो चरणों में मानों को हटाने के बाद वियोजन (क) और आधार रेखा का पुन: निर्धारण करना. पैनल बी देसाई एट अल से संशोधित किया गया है, 201815| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लिगेन्ड एन केए केडी केडी संदर्भ
1/एम एस % नियंत्रण 1/s % नियंत्रण एम % नियंत्रण
एनएच-जीआरजीए 8 (1.5 ] 1.7) x 104 100 (2.8 ] 0.8) x 10-3 100 (2.2 ] 0.3) x 10-7 100 देसाई एट अल, 2018
एनएच-GrgA$138-165 २ (5.6 ] 0.1) x 103 37 (4.1 ] 0.3) x 102 1.5 x 107 (6.9 ] 4.5) x 10-2 3.1 x 108 देसाई एट अल, 2018
पी$0.125 पी एंड एल टी;0.002 पी एंड एल टी;0.001
एनएच-GrgA138-165 3 (6.0 ] 1.0) x 103 40 (4.6 ] 0.4) x 10-3 164 (7.7 ] 0.3) x 10-7 350 यह अध्ययन
पीजेड 0.074 पीजेड 0.006 पी एंड एल टी;0.001

तालिका 1: GrgA के उत्परिवर्ती, केवल एमिनो एसिड अवशेषों युक्त 138-165, पूर्ण लंबाई GrgA की तुलना में कम आत्मीयता के बावजूद28 बांध.
BLI परख Ni-NTA biosensors के साथ प्रदर्शन किया गया उसका टैग पूर्ण लंबाई GrgA या हटाने म्यूटेंट ligands के रूप में और शुद्ध Strep-tagged का उपयोग कर $28 एक analyte के रूप में. अभिलेखों के ग्राफ चित्र 1में दर्शाए गए हैं। गतिज पैरामीटरों (औसत ] मानक विचलन के मान संबद्ध सॉफ्टवेयर17के साथ उत्पन्न किए गए थे। के एक (सहयोग दर स्थिरांक) A और B. kd (वियोजन दर स्थिरांक) के 1 मोलर समाधान में प्रति s गठित परिसरों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है कि प्रति सेकंड क्षय परिसरों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है. कश्मीर घ (वियोजन संतुलन स्थिरांक), सांद्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर 50% लिगन्ड बाइंडिंग स्थल ों का कब्जा है, का डी kसे विभाजितहै। द, प्रयोगात्मक दोहराता की संख्या. p मान 2-पुच्छ छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर गणना की गई. NH-GrgA और NH-GrgA के लिए काइनेटिक पैरामीटर 138-165 देसाई एट अल से थे, 201815.

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Discussion

प्रोटीन प्रोटीन बातचीत प्रतिलेखन और अन्य जैविक प्रक्रियाओं के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं. वे सबसे अधिक pulldown परख के माध्यम से अध्ययन कर रहे हैं. हालांकि pulldown परख अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, वे खराब मात्रात्मक हैं और कमजोर लेकिन जैविक रूप से सार्थक बातचीत का पता लगाने में विफल हो सकता है. तुलना में, एक ligand और एक analyte के बीच वास्तविक समय संघ और वियोजन का पता लगाने के द्वारा, BLI संघ और वियोजन दर स्थिरांक प्रदान करता है, साथ ही, समग्र संबंध.

pulldown परख की तुलना में, BLI assays उच्च संवेदनशीलता प्रदान करते हैं. उदाहरण के लिए, GrgA--28 इंटरैक्शन BLI द्वारा analytes के कम nM सांद्रता के साथ पाए जाते हैं, लेकिन पुलडाउन परख (अप्रकाशित डेटा) द्वारा नहीं। pulldown के विपरीत, BLI एक पता लगाने एंटीबॉडी पर निर्भर नहीं करता है, जो काफी संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकते हैं.

इससे भी महत्वपूर्ण बात, BLI विश्लेषण प्रोटीन के बीच बातचीत में मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, जबकि pulldown assays नहीं कर सकते. यह विभिन्न GrgA constructs के साथ $28 की बातचीत द्वारा उदाहरण है. NH-GrgA के साथ तुलना में, एनएच-GrgA $138-165 और एनएच-GrgA138-165 में केवलएक 60% नुकसान का सामना करना पड़ता है kएक में एक में बाध्यकारी $28. इन निष्कर्षों को दिखाने के लिए हमारे पिछले BLI डेटा के अनुरूप हैं कि GrgA अपने एन-टर्मिनल 64 अवशेषों की कमी $28के साथ एक कमी आत्मीयता है, सुझाव है कि GrgA के एन-टर्मिनल अनुक्रम $28 बाइंडिंग के लिए योगदान देता है. हालांकि एनएच-GrgA $138-165 और एनएच-GrgA138-165 के समान k एक मान है बाध्यकारी में $28, पूर्व एक 91,000 गुना बाद की तुलना में उच्च kघ है. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि 138-165 की बाध्यकारी GrgA में संरचनात्मक परिवर्तन से चलाता है, बहुत जटिल स्थिर.

BLI की तुलना में एक लंबे इतिहास के साथ, सतह प्लाज्मन अनुनाद (एसपीआर) भी वास्तविक समय प्रोटीन प्रोटीन बातचीत18,19मात्रा निर्धारित कर सकते हैं. जबकि BLI की संवेदनशीलता एसपीआर20की तुलना में कम माना जाता है, पूर्व वर्तमान में लागत प्रभावशीलता में बाद outperforms. उदाहरण के लिए, एसपीआर बायोसेंसर की लागत BLI biosensors की तुलना में बहुत अधिक हैं.

एसपीआर के अंतर्निहित सिद्धांत की प्रकृति के कारण, यह प्रोटीन के आसपास के मीडिया के माइक्रोफ्लूइडिक्स से भारी प्रभावित होता है। इसलिए , कुछ एसपीआर यंत्रों से संबंधित प्रयोगों के लिए अनुसंधानकर्ता की ओर से काफी धारणा की आवश्यकता होती है ताकि इष्टतम बफर स्थिति21,22,23,24सुनिश्चित की जा सके . दूसरी ओर, वर्तमान BLI उपकरणों एक बहुत ही सीमित तापमान नियंत्रण रेंज25 की सुविधा है और, इस तरह के रूप में, एक दिया बातचीत के लिए ऊष्मागतिक मानकों (जैसे enthalpy और गिब्स मुक्त ऊर्जा के रूप में) का निर्धारण करने के लिए बीमार फिट हैं.

ग्लिसरोल, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया cryoprotectant, BLI के साथ असंगत है, इसके व्यापक रासायनिक संगतता के बावजूद. इसलिए, डायलिसिस द्वारा ग्लिसरोल को लिगंड और एनालाइट से हटाना महत्वपूर्ण है। परिणामस्वरूप ग्लिसरोल मुक्त प्रोटीन पर संग्रहीत किया जाना चाहिए 4 डिग्री सेल्सियस, जो वृद्धि हुई अस्थिरता और गलत गतिज मापदंडों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हम अनुशंसा करते हैं कि BLI assays डायलिसिस के बाद जल्द ही प्रदर्शन किया, विशेष रूप से अगर असंगत गतिज पैरामीटर अलग अलग समय पर से प्राप्त कर रहे हैं. सटीक समय सीमा जिसके भीतर BLI परख पूरा किया जाना चाहिए प्रोटीन के बीच भिन्न होगा और उनकी सांद्रता से प्रभावित हो.

एसपीआर के साथ के रूप में, BLI छोटे अणु स्क्रीनिंग26के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह देखते हुए कि नए BLI उपकरणों स्क्रीनिंग के लिए उच्च थ्रूपुट विकल्प प्रदान करते हैं, हम कल्पना करते हैं कि BLI पहचान और छोटे अणुओं है कि सुविधा या प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के साथ हस्तक्षेप की विशेषता के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान ] AI122034 और AI140167) और न्यू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन (ग्रेंट ] पीसी 20-18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BLItz machine ForteBio 45-5000
Dialysis tubing cellulose membrane MilliporeSigma D9652
Dip and Read Ni-NTA biosensor tray ForteBio 18-5101 Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins
Drop holder ForteBio 45-5004
PCR tubes (0.2 mL) Thomas Scientific CLS6571
Microcentrifuge tubes (black) Thermo Fisher Scientific 03-391-166
Kimwipes Thermo Fisher Scientific 06-666A
DTT Thermo Fisher Scientific R0861
EDTA MilliporeSigma E6758
MgCl2 MilliporeSigma M8266
NaCl MilliporeSigma S9888
Tris-HCl GoldBio T095100

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References

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JoVE में इस महीने अंक 149 Biolayer interfermetry क्लैमिडिया CT504 TC0791 GrgA प्रोटीन प्रोटीन बातचीत प्रतिलेखन कारक प्रतिलेखन विनियमन
ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग
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Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription. J. Vis. Exp. (149), e59687, doi:10.3791/59687 (2019).

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