Summary
转录因子(TFs)与RNA聚合酶的相互作用通常使用下拉测定进行研究。我们应用生物层干涉测量(BLI)技术来描述GrgA与衣原RNA聚合酶的相互作用。与下拉检测相比,BLI可检测实时关联和解结,具有更高的灵敏度,并且具有高度定量性。
Abstract
转录因子 (TF) 是一种通过与 RNA 聚合酶、另一个 TF 和/或模板 DNA 相互作用来调节基因表达的蛋白质。GrgA是一种新型转录活化剂,专门存在于细胞内细菌病原体衣原体中。使用亲和珠的蛋白质下拉测定表明,GrgA结合两个β因子,即=66和+28,它们识别不同基因的启动子,其产物在发育阶段需要差异。我们使用 BLI 来确认和进一步描述相互作用。BLI 演示了与下拉之间的几个优点:1) 它揭示了绑定伙伴之间的实时关联和解散;2) 它生成定量动力学参数;3) 它可以检测下拉分析经常无法检测到的绑定。这些特征使我们能够推断出GrgA在衣原体基因表达调节中的生理作用,以及可能的详细相互作用机制。我们设想,这种相对负担得起的技术对于研究转录和其他生物过程非常有用。
Introduction
转录,利用DNA作为模板产生RNA分子,是基因表达的第一步。细菌RNA合成开始结合RNA聚合酶(RNAP)霍洛酶到目标启动子1,2。RNAP全酶(RNAPholo)由多亚单位催化核心(RNAPcore)和+因子组成,这是识别启动子序列所必需的。转录活化剂和抑制剂,统称为TF,通过RNAPcore的结合成分、β因子和/或DNA调节基因表达。根据生物体的不同,其基因组的很大一部分可能用于控制转录的TF,以响应生理需要和环境线索3。
衣原体是一种强制性的细胞内细菌,负责人类和动物的多种疾病4、5、6、7、8。例如,衣原体沙眼可以说是全世界人类头号性传播的病原体,也是一些欠发达国家失明的主要原因。衣原体有一个独特的发育周期,其特征是两种交替的细胞形式,称为基本体(EB)和视网膜体(RB)9。然而,HB能够在细胞外环境中生存,但它们不能扩散。EB通过内分泌进入宿主细胞,并在接种后几小时内在宿主细胞质的真空中分化成较大的RB。不再具有传染性,RB 通过二元裂变扩散。大约20小时,他们开始分化回IB,在30-70小时左右退出宿主细胞。
衣原体发育周期的进展由转录调节。近1000个衣原体基因中,绝大多数是在RB积极复制的中周期中表达的,而只有少量基因在IB进入宿主细胞后立即被转录,从而开始转换BB进入RB,另一组小基因被转录或越来越多地转录,使RB分化为BB10,11。
衣原体基因组编码三个+因子,即+66,+28和+54。*66,相当于大肠杆菌和其他细菌的内务管理+70,负责识别早期和中期基因的启动子以及一些晚期基因,而#28和+54是需要的某些晚期基因的转录。已知几个基因同时携带+66依赖启动子和β28依赖启动子12。
尽管发展周期复杂,但在衣原体13中只发现了少量的TF。GrgA(以前在C.沙眼血清D和CTL0766中被批报为假设蛋白CT504,在C.沙眼L2中)是一种衣原体特异性TF,最初被确认为β66依赖基因14的活化剂。亲和力下拉测定表明,GrgA通过结合+66和DNA来激活其转录。有趣的是,后来发现GrgA也与β28共沉淀,并在体外15号激活来自+28依赖启动子的转录。为了研究GrgA在+66和+28中是否有相似或不同的亲和力,我们采用BLI。BLI 测定表明,GrgA 与 +66的亲和力比 ±28高 30 倍,这表明 GrgA 在+66依赖转录和+28依赖转录中可能发挥不同作用15.
BLI检测从生物传感器尖端的固定蛋白层反射的白光的干扰模式,并将其与内部参考层16进行比较。通过分析这两种干扰模式,BLI可以提供有关与生物传感器尖端结合的蛋白质量的宝贵实时信息。固定在生物传感器尖端的蛋白质称为配体,通常借助与相关粒子(如 NTA 或 NTA 或 NTA 或 NTA)相关的聚物或生物素标记(例如,聚物素标记)帮助固定链球菌)在生物传感器的尖端。二次蛋白(称为Anlyate)与生物传感器尖端的配体结合,会改变生物传感器的不集中度,从而导致干扰模式的变化。当在分析剂的不同浓度上重复时,BLI不仅可以提供定性信息,还可以定量地提供有关配体和分析剂16之间的亲和力的信息。
据我们所知,我们率先使用BLI来描述转录15中的蛋白质-蛋白质相互作用。在本出版物中,我们演示了 GrgA 片段(以前显示需要进行 28-绑定)确实调解了绑定。本手稿侧重于 BLI 测定的步骤,以及结合动力学的 BLI 图形和参数的生成。这里不包括配体和分析物的生产(和纯化)方法。
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Protocol
1. 蛋白质的制备
- 使用透析袋(具有适当的截流大小)对用于 BLI 测定的每个蛋白质(包括他标记的配体和麻醉剂)进行透析,以对 1,000 卷 BLI 缓冲液(25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、10 mM MgCl2)进行透析,0.1 mM DTT,pH 8.0,预冷至4°C),在4°C下4小时。
注:BLI测定要求配体以使生物传感器上的结合位点饱和的浓度存在,并且对麻醉剂进行高度纯化,以便已知与配体发生反应的Anlyan的摩尔浓度。此处不介绍表达和纯化他和链球菌标记蛋白的方法,但可在以前的出版物14、15中找到。虽然此系统不要求配体以高度纯化的形式存在,但必须将未经净化的配体透析到 BLI 缓冲液中,以尽量减少在测定过程中任何缓冲液变化引起的白光干扰模式的变化。 - 切换到新的 BLI 缓冲液,然后继续透析 4 小时。
2. 生物传感器水化和测定设置
- 在开始测定前约 10 分钟,将 BLI 缓冲液的移液器 200 μL 放入 PCR 管中。
- 用戴手套的手握住生物传感器的宽部,从原始包装中取出 Ni-NTA 生物传感器。
- 将生物传感器置于 PCR 管上,以便只有生物传感器的玻璃尖端浸入 BLI 缓冲液中。
- 保持生物传感器尖端浸入至少 10 分钟,以确保完全水化。
- 验证在上述步骤中,Ni-NTA-生物传感器的玻璃尖端没有接触 BLI 缓冲液以外的任何内容。
注:此协议使用 Ni-NTA 生物传感器与带有他标记的配体。如果需要,SA-Streptavidin-生物传感器可与生物素化配体结合使用,而不是:(i) 配体和麻醉剂均带有他的标签,或(ii)它们两者均不携带。
- 验证在上述步骤中,Ni-NTA-生物传感器的玻璃尖端没有接触 BLI 缓冲液以外的任何内容。
- 打开 BLItz 机器。
- 确保通过机器背面的 USB 数据输出端口将计算机连接到计算机。
- 在计算机上,打开关联的软件(例如,BLItz Pro),然后单击屏幕左侧的高级动力学。
- 在软件上,在各自标题下键入有关实验的所有适当信息(包括实验名称、描述、样本 ID 和蛋白质浓度)。
- 单击生物传感器类型并从下拉菜单中选择Ni-NTA。
- 在"运行设置"标题下,验证摇摇器是否设置为"启用"。
- 在"步骤类型列表"标题下,验证列出了 5 项:初始基线、加载、基线、关联和分离。
注: 每个步骤的持续时间可以根据需要从默认值更改。为获得最佳结果,对初始基线和基线至少使用 30 s;和120s的关联和分离。加载步骤的持续时间(从 120 到 240 s)将取决于配体浓度和配体上粘附标记与 Ni-NTA 生物传感器的亲和力。
- 将水合的 Ni-NTA 生物传感器从 PCR 管中取出,并通过将生物传感器的宽部分滑动到底座上将其固定在机器上。
注意:在实验期间,不要让生物传感器变干。 - 将 0.5 mL 黑色微型离心管放入机器的管架中,将 BLI 缓冲液400 μL移液器放入其中。
- 验证机器的滑块是否定位,以便管座位于机器上的黑色箭头前面。
- 关闭机器盖,使生物传感器尖端淹没在微离心管的缓冲液中。
- 单击软件上的"下一步"以开始录制初始基线。
3. 将配体加载到生物传感器上
- 初始基线步骤完成录制后,打开机器盖。
- 将滑块向右移动,使跌落支架(而不是管支架)位于黑色箭头前面。
- 将一个被透析的他标记的配体(从步骤 1.1)移液器 4 μL 放在跌落架上,并关闭机器盖。
注:使用配体的最佳浓度可能因每种蛋白质而异。浓度在1.0至2.0mg/mL之间通常足以使240s生物传感器尖端的NTA饱和。 - 在软件上,单击"下一步"开始加载。
4. 洗去额外的配体
- 装载步骤完成录制后,打开机器盖。
- 将滑块向左移动,使管支架再次位于黑色箭头前面。
- 关闭机器盖并确保生物传感器尖端浸入管架管的 BLI 缓冲液中。
- 再次在软件上单击"下一步"以开始录制基线。
5. 与配体的麻醉剂关联
- 基线步骤完成录制后,打开机器盖。
- 取出滴架,通过移液任何蛋白质进行清洁,用双离子水(ddH2O)共洗去5次。
- 洗涤后,使用纸巾擦拭液擦拭液滴支架的表面。
- 将跌落架重新更换到机器上。
- 将机器上的滑块向右移动,使跌落支架再次位于黑色箭头前面。
- 将透析剂(从步骤 1.1)移液器 4 μL 移液器放在跌落架上,并关闭机器盖。
- 在软件上,单击"下一步"开始关联。
6. 对配体的麻醉剂分离
- 关联步骤完成录制后,打开机器盖。
- 将机器上的滑块向右移动,使管支架再次位于黑色箭头前面。
- 在软件上,单击"下一步"开始解散。
- 分离步骤完成录制后,打开机器盖。
- 拆下跌落架和管架。
- 用ddH2O彻底冲洗,洗去任何蛋白质。
- 拆下生物传感器并安全地丢弃。
7. 重复不同浓度的相互作用
- 对使用不同解毒剂浓度的相同配体-anlyte对重复步骤2-7。
注: 在获得最佳结果之前,可能需要在多次运行中调整 Anlyte 的浓度。根据我们的经验,从75 nM开始的1:5:10的分因量比通常就足够了。
8. 使用软件分析数据
- 完成所有运行后,通过单击"文件",然后将实验另存为屏幕左侧,在软件上保存数据。
- 在"运行数据"标题下,选择"步骤校正和拟合"(1:1),然后单击"分析"以生成动力学数据。
- 要将定量数据提取到工作表并生成图形,请单击"导出到 CSV"并将记录的数据另存为 .csv 文件。使用电子表格软件打开 .csv 文件。
- 为了最有效地显示关联和分离动力学,请删除基线步骤之前的所有绘图点,并从最终基线值规范化所有后续绘图点。
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Representative Results
通过BLI测定,我们以前确定,将GrgA结合到+28取决于GrgA15的28个氨基酸中间区域(残留物138-165)。因此,与 N 端的 His 标记全长 GrgA (NH-GrgA) 相比,缺少此区域的 GrgA 删除构造(NH-GrgA_138-165)的关联率降低,分离率增加,导致整体损失 300 万倍相关性 (表 1)。在这里,我们证明,这个中间区域直接结合+28,在没有其余的GrgA蛋白。在这些实验中,中间区域标有N-端端的He-tag(NH-GrgA138-165)作为配体,它首先被固定到Ni-NTA生物传感器的尖端(图1A)。在将未绑定的NH-GrgA138-165洗脱生物传感器后,在添加+28后,记录与Anlyate+28的实时关联。最后,在洗涤后记录实时解散。图1A显示了在配体结合前30秒开始到洗涤开始后2分钟结束的三种不同分析剂浓度的实验记录。为了更好地可视化配体分析剂相互作用,我们在添加配体之前删除数据,并将基线重置为 0 以得出图 1B。
表1给出了NH-GrgA138-165片段与±28相互作用的动力学参数值。与NH-GrgA X =28相互作用相比,NH-GrgA138-165 X =28相互作用显示趋势统计显著性 60%的 ka减少,在kd 中具有高度统计显著性 64% 的增加,K D的具有高度统计显著性的 3.5 倍。这些变化表明,与NH-GrgA相比,NH-GrgA138-165结合=28更慢,与±28分离速度更快,与±28相比,整体亲和力降低。因此,GrgA 中的残留物 138-165 结合 ±28,但与全长 GrgA 相比,亲和力降低。
图1:GrgA的28个氨基酸中间区域在体外结合+28。
(A) 分四个阶段记录的光干扰模式的实时变化:(一) 将NH-GrgA138-165(利甘)与Ni-NTA生物传感器结合,(ii)洗涤,(三)以不同浓度结合NS-+28(Analyte)与固定器具结合NH-GrgA-138-165(利甘),和(iv)后续洗涤。(B) 在前两个阶段从 (A) 移除值并重置基线后,增强配体分析剂关联和解离的可视化。小组B由Desai等人修改,2018年15日。请点击此处查看此图的较大版本。
| 配 | n | ka a | kd | KD | 引用 | |||||||||||
| 1/Ms | % 控制 | 1/s | % 控制 | M | % 控制 | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1.5 × 1.7) x 104 | 100 | (2.8 × 0.8) x 10-3 | 100 | (2.2 × 0.3) x 10-7 | 100 | 德赛等人,2018 | ||||||||
| NH-GrgA_138-165 | 2 | (5.6 × 0.1) x 103 | 37 | (4.1 × 0.3) x 102 | 1.5 x 107 | (6.9 × 4.5) x 10-2 | 3.1 x 108 | 德赛等人,2018 | ||||||||
| p=0.125 | p<0.002 | p<0.001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6.0 × 1.0) x 103 | 40 | (4.6 × 0.4) x 10-3 | 164 | (7.7 × 0.3) x 10-7 | 350 | 本研究 | ||||||||
| p=0.074 | p=0.006 | p<0.001 | ||||||||||||||
表1:与全长GrgA相比,仅含有氨基酸残留物138-165的GrgA突变体结合+28,尽管亲和力较低。
BLI检测与Ni-NTA生物传感器使用His标记全长GrgA或删除突变体作为配体和纯化链球菌标记+28作为解毒剂。记录图如图1所示。动力学参数值(平均值 = 标准偏差)是使用相关软件17生成的。ka (关联速率常数) 定义为 A 和 B.k d (解散率常数) 中 1 摩尔解中每 s 形成的复合物数定义为每秒衰减的复合物数。KD(分离平衡常数),定义为50%的配体结合位点被分析物占用的浓度,是k d除以k a。n,实验重复次数。p值是使用 2 尾学生t测试计算的。NH-GrgA和NH-GrgA_138-165的动力学参数来自德赛等人,201815。
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Discussion
蛋白质-蛋白质相互作用对于转录和其他生物过程的调节至关重要。它们最常通过下拉检测进行研究。虽然下拉分析相对容易执行,但它们的定量性较差,可能无法检测弱但具有生物学意义的相互作用。相比之下,通过检测配体和解毒物之间的实时关联和解散,BLI 提供关联和解散率常数以及整体亲和力。
与下拉检测相比,BLI测定具有更高的灵敏度。例如,GrgA-+28相互作用通过 BLI 检测出分析物的 nM 浓度较低,但不能通过下拉分析(未发布的数据)检测。与下拉不同,BLI 不依赖于检测抗体,这可能显著影响灵敏度。
更重要的是,BLI分析可以提供蛋白质之间相互作用的机械见解,而下拉分析不能。这从 #28与不同 GrgA 构造的交互性中得到了体现。与NH-GrgA相比,NH-GrgA_138-165和NH-GrgA138-165在k a中仅遭受60%的损耗=28。这些发现与我们之前的BLI数据一致,表明缺乏N端64残留物的GrgA与±28的亲和力降低,表明GrgA的N端序列有助于±28结合。虽然NH-GrgA_138-165和NH-GrgA138-165在绑定=28中具有类似的k值,但前者的k d比后者高91,000倍。这些结果表明,138-165的绑定触发GrgA的结构变化,极大地稳定了复合物。
表面质子共振(SPR)的历史比BLI长,还可以量化实时蛋白质-蛋白质相互作用18,19。虽然BLI的灵敏度被认为低于SPR20,但前者目前在成本效益方面优于后者。例如,SPR生物传感器的成本远远高于BLI生物传感器的成本。
由于SPR基本原理的性质,它深受围绕蛋白质介质的微流体的影响。因此,涉及一些SPR仪器的实验需要研究人员的相当的感知,以确保最佳的缓冲条件21,22,23,24。另一方面,目前的BLI仪器具有非常有限的温度控制范围25,因此,不适合确定给定相互作用的热力学参数(如enthalpy和Gibbs自由能)。
甘油,一种常用的低温保护剂,尽管具有广泛的化学相容性,但与BLI不相容。因此,通过透析从配体和麻醉剂中去除甘油至关重要。由此产生的无甘油蛋白必须储存在4°C,这可能导致不稳定性和不准确的动力学参数增加。我们建议在透析后立即进行BLI测定,特别是如果从不同时间获得不一致的动力学参数。完成BLI测定的确切时间范围因蛋白质而异,并受其浓度影响。
与SPR一样,BLI已用于小分子筛选26。考虑到较新的BLI仪器为筛选提供了高通量选项,我们设想BLI对于识别和表征促进或干扰蛋白质-蛋白质相互作用的小分子非常有用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院(Grants # AI122034 和 AI140167) 和新泽西州健康基金会(Grant = PC 20-18)的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
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