Summary
Interacties van transcriptiefactoren (TFs) met de RNA-polymerase worden meestal bestudeerd met behulp van keuze assays. We passen een Biolayer interferometrie (BLI) technologie toe om de interactie van GrgA met de chlamydiale RNA-polymerase te karakteriseren. Vergeleken met keuze assays, bli detecteert real-time associatie en dissociatie, biedt een hogere gevoeligheid, en is zeer kwantitatief.
Abstract
Een transcriptiefactor (TF) is een eiwit dat de genexpressie reguleert door interactie met de RNA-polymerase, een andere TF-en/of template-DNA. Grga is een roman transcriptie Activator die specifiek is gevonden in de verplicht intracellulaire bacteriële pathogeen chlamydia. Eiwit keuze assays met behulp van affiniteits kralen hebben aangetoond dat grga bindt twee σ factoren, namelijk σ66 en σ28, die verschillende sets van promoters voor genen waarvan de producten zijn differentieel vereist in ontwikkelingsstadia te erkennen. We hebben BLI gebruikt om de interacties te bevestigen en verder te karakteriseren. Bli toont verschillende voordelen ten opzichte van keuze: 1) het onthult real-time associatie en dissociatie tussen bindende partners, 2) het genereert kwantitatieve kinetische parameters, en 3) het kan bindingen detecteren die keuze assays vaak niet detecteren. Deze kenmerken hebben ons in staat gemaakt om de fysiologische rollen van GrgA in genexpressie regulering in Chlamydiaen mogelijke gedetailleerde interactie mechanismen te afleiden. We voor ogen dat deze relatief betaalbare technologie kan zeer nuttig zijn voor het bestuderen van transcriptie en andere biologische processen.
Introduction
Transcriptie, die RNA moleculen produceert met behulp van DNA als template, is de allereerste stap van genexpressie. Bacteriële RNA-synthese begint na de binding van het RNA polymerase (rnap) holoenzym aan een doel promotor1,2. Het RNAP-holoenzym (RNAPholo) bestaat uit een katalytische kern met meerdere subeenheden (RNAPcore) en een σ-factor, die nodig is voor het herkennen van de volgorde van de organisator. Transcriptie Activators en repressors, gezamenlijk genoemd TFs, reguleren de genexpressie door de bindende componenten van de RNAPcore, σ factoren, en/of DNA. Afhankelijk van het organisme kan een aanzienlijk deel van het genoom worden gewijd aan TFs die transcriptie reguleren in reactie op fysiologische behoeften en omgevings aanwijzingen3.
Chlamydia is een verplicht intracellulaire bacterie die verantwoordelijk is voor een verscheidenheid aan ziekten bij mensen en dieren4,5,6,7,8. Chlamydia trachomatis is bijvoorbeeld aantoonbaar het nummer één seksueel overdraagbare pathogeen bij mensenwereld wijd, en een leidende oorzaak van blindheid in sommige onderontwikkelde landen4,5. Chlamydia heeft een unieke ontwikkelingscyclus die wordt gekenmerkt door twee alternerende cellulaire vormen die het elementaire lichaam (EB) en Reticulate Body (RB)9worden genoemd. Terwijl EBs in een extracellulaire omgeving kan overleven, zijn ze niet in staat tot proliferatie. EBs Voer cellen in door middel van endocytose en differentiëren in grotere RBs in een vacuole in het host cytoplasma binnen uur na inoculatie. Niet langer infectieuze, RBs prolifereren door binaire splijting. Rond 20 h, ze beginnen te differentiëren terug naar de EBs, die de gastheer cellen rond 30-70 h verlaten.
Progressie van de chlamydiale ontwikkelingscyclus wordt gereguleerd door transcriptie. Overwegende dat een overgrote meerderheid van de bijna 1.000 chlamydiale genen wordt uitgedrukt tijdens de midcyclus waarin RBs actief repliceert, slechts een klein aantal genen wordt direct na de invoer van EBs in de gastheer cellen getranscribeerd om de omzetting van EBs in RBs, en een andere kleine reeks genen worden getranscribeerd of steeds getranscribeerd om de differentiatie van RBs in EBs10,11mogelijk te maken.
Het chlamydiale genoom codeert drie σ-factoren, namelijk σ66, σ28 en σ54. σ66, die gelijkwaardig is aan de huishoudservice σ70 van E. coli en andere bacteriën, is verantwoordelijk voor het herkennen van promotors van vroege en mid-Cycle genen en sommige late genen, terwijl σ28 en σ54 nodig zijn voor de transcriptie van bepaalde late genen. Er zijn verschillende genen waarvan bekend is dat ze zowel een σ66-afhankelijke promotor als een σ28-afhankelijke promotor12dragen.
Ondanks een ingewikkelde ontwikkelingscyclus is er slechts een klein aantal TFs gevonden in Chlamydiae13. GrgA (eerder geannoleerd als een hypothetisch proteïne CT504 in c. trachomatis Serovar D en CTL0766 in c. trachomatis L2) is een Chlamydia-specifieke TF die aanvankelijk wordt herkend als een activator van σ66-afhankelijke genen14. Affiniteit keuze assays hebben aangetoond dat grga hun transcriptie activeert door zowel σ66 als DNA te binden. Interessant is dat het later werd gevonden met die GrgA ook co-precipiteert met σ28, en activeert transcriptie van σ28-afhankelijke promotors in vitro15. Om te onderzoeken of GrgA vergelijkbare of verschillende affiniteiten heeft voor σ66 en σ28, hebben we gebruik gemaakt van bli. BLI assays hebben aangetoond dat GrgA samenwerkt met σ66 met een 30-voudige hogere affiniteit dan met σ28, wat suggereert dat grga differentiële rollen kan spelen in σ66-afhankelijke transcriptie en σ28-afhankelijke transcriptie 15.
BLI detecteert het interferentiepatroon van wit licht dat reflecteert van een laag geïmmobiliseerd eiwit op de punt van een biosensor en vergelijkt het met die van een interne referentielaag16. Door de analyse van deze twee interferentie patronen kan BLI waardevolle en real-time informatie verschaffen over de hoeveelheid eiwit gebonden aan de punt van de biosensor. Het eiwit dat wordt geïmmobiliseerd tot de punt van de biosensor wordt aangeduid als de ligand, en is over het algemeen geïmmobiliseerd met behulp van een gemeenschappelijk antilichaam of epitoop tag (bijvoorbeeld, een poly-his-of Biotine-tag) die affiniteit heeft voor een bijbehorend deeltje (zoals NTA of Streptavidine) op de punt van de biosensor. De binding van een secundair eiwit, aangeduid als de analyt, met de ligand aan de punt van de biosensor creëert veranderingen in de ondoorzichtigheid van de biosensor en resulteert daarom in veranderingen in interferentie patronen. Indien herhaald over verschillende concentraties van de analyt, kan BLI niet alleen kwalitatieve, maar ook kwantitatieve informatie verschaffen over de affiniteit tussen de ligand en de analyt16.
Naar het beste van onze kennis, waren we de eersten die BLI gebruiken om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren in transcriptie15. In deze publicatie tonen we aan dat een GrgA-fragment, dat voorheen vereist was voor σ28-binding, inderdaad de binding bemiddelt. Dit manuscript richt zich op stappen van de BLI-assays en het genereren van BLI-grafieken en parameters van bindende kinetiek. Methoden voor de productie (en zuivering) van liganden en analyten worden hier niet behandeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van eiwitten
- Gebruik een dialyse zakje (met een passende cut-off maat) om elk eiwit te gebruiken dat moet worden gebruikt voor BLI-assays (inclusief de zijn-gelabelde ligand en de analyt) tegen 1.000 volumes van de BLI-buffer (25 mM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, voorgekoeld tot 4 °C) bij 4 °C gedurende 4 uur.
Opmerking: BLI assays vereisen dat de ligand aanwezig is bij concentraties die de bindingsplaatsen op de biosensor en de analyt verzachtend zijn om zeer gezuiverd te worden, zodat de molaire concentraties van de analyt die met de ligand reageren bekend zijn. Methodologieën voor de expressie en zuivering van zijn-en STREP-gelabelde eiwitten worden hier niet behandeld, maar zijn te vinden in eerdere publicaties14,15. Hoewel dit systeem niet vereist dat de ligand zich in zeer gezuiverde vorm bevindt, is het essentieel om zelfs ongezuiverde liganden naar de BLI-buffer te dialyseren om verschuivingen in witte-licht interferentie patronen te minimaliseren die worden veroorzaakt door buffer veranderingen tijdens de test. - Schakel over naar de verse BLI-buffer en ga verder met de dialyse voor nog eens 4 uur.
2. biosensor hydratatie en testopstelling
- Pipetteer ongeveer 10 minuten vóór het begin van een test de BLI-buffer met 200 μL in een PCR-buis.
- Verwijder een ni-NTA-biosensor uit de originele verpakking door het brede deel van de biosensor met een hand gehandschoven te houden.
- Plaats de biosensor over de PCR-buis zodanig dat alleen het glazen uiteinde van de biosensor wordt ondergedompeld in de BLI-buffer.
- Houd de biosensortip ten minste 10 minuten ondergedompeld om volledige hydratatie te garanderen.
- Controleer of de glazen punt van de ni-NTA-biosensor tijdens de bovenstaande stap niets anders dan de BLI-buffer raakt.
Opmerking: dit protocol maakt gebruik van een ni-NTA-biosensor in combinatie met een ligand met zijn tags. Indien nodig kan een SA-streptavidin-biosensor worden gebruikt in combinatie met een biotinyleerd ligand in plaats daarvan als: (i) zowel de ligand als de analyt dragen een zijn tag of (II) geen van beide doet.
- Controleer of de glazen punt van de ni-NTA-biosensor tijdens de bovenstaande stap niets anders dan de BLI-buffer raakt.
- Schakel de BLItz-machine in.
- Zorg ervoor dat het apparaat is aangesloten op de computer via een USB-poort voor gegevensuitvoer aan de achterzijde van het apparaat.
- Open de bijbehorende software (bijvoorbeeld BLItz Pro) op de computer en klik op Geavanceerde kinetiek aan de linkerkant van het scherm.
- Op de software, typt u alle relevante informatie over het experiment (met inbegrip van de naam van het experiment, beschrijving, monster-ID en eiwitconcentratie) onder elke respectieve kop.
- Klik op type biosensor en kies ni-NTA in het vervolgkeuzemenu.
- Controleer onder de kop instellingen uitvoeren of de Shaker is ingesteld op inschakelen.
- Onder de kop van de stap type , controleert u of er 5 items in de lijst: initiële basislijn, laden, basislijn, koppeling en dissociatie.
Opmerking: de duur van elke stap kan worden gewijzigd van standaard indien nodig. Gebruik voor optimale resultaten minimaal 30 sec. voor initiële baseline en Baseline; en 120 s voor vereniging en dissociatie. De duur van de laad stap (variërend van 120 tot 240 s) zal afhangen van de concentratie van de ligand en affiniteit van de his-epitope tag op de ligand aan de ni-NTA-biosensor.
- Verwijder de gehydrateerde ni-NTA-biosensor uit de PCR-buis en bevestig deze aan de biosensor-bevestiging op de machine door het brede gedeelte van de biosensor op de steun te schuiven.
Opmerking: laat de biosensor niet uitdrogen tijdens het experiment. - Plaats een zwarte microcentrifuge buis van 0,5 mL in de buis houder van de machine en Pipetteer 400 μL van de BLI-buffer erin.
- Controleer of de schuifregelaar van de machine zodanig is geplaatst dat de buis houder zich voor de zwarte pijl op het apparaat bevindt.
- Sluit de afdekking van de machine zodanig dat de punt van de biosensor in de buffer in de microcentrifuge buis wordt ondergedompeld.
- Klik op volgende op de software om te beginnen met het opnemen van de initiële basislijn.
3. laden van ligand op biosensor
- Nadat de eerste basislijn stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
- Verplaats de schuifregelaar naar rechts zodat de druppel houder (in plaats van de buis houder) zich voor de zwarte pijl bevindt.
- Pipetteer 4 μL van een gedialyseerde ligand (vanaf stap 1,1) op de druppel houder en sluit de afdekking van de machine.
Opmerking: de optimale concentratie van de te gebruiken ligand kan per eiwit verschillen. Een concentratie tussen 1,0 en 2,0 mg/mL is meestal voldoende om de NTA te verzaderen bij de punt van de biosensor in 240 s. - Klik op de software op volgende om te beginnen met laden.
4. extra ligand wegspoelen
- Nadat de laad stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
- Verplaats de schuifregelaar naar links zodat de buis houder opnieuw voor de zwarte pijl ligt.
- Sluit de deksel van de machine en zorg ervoor dat de punt van de biosensor wordt ondergedompeld in de BLI-buffer van de buis in de buis houder.
- Klik nogmaals op volgende op de software om te beginnen met het opnemen van de basislijn.
5. vereniging van analyt aan ligand
- Nadat de basislijn stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
- Verwijder de druppel houder en reinig deze door elk eiwit te pipetteren en te spoelen met dubbel gedeïoniseerd water (ddH2O) voor een totaal van 5 keer.
- Reinig het oppervlak van de druppel houder na het wassen met een tissue doekje.
- Plaats de druppel houder terug op de machine.
- Verplaats de schuifregelaar op de machine naar rechts, zodat de druppel houder zich weer voor de zwarte pijl bevindt.
- Pipetteer 4 μL van een gedialyseerde analyt (vanaf stap 1,1) op de druppel houder en sluit de afdekking van de machine.
- Klik op de software op volgende om de koppeling te starten.
6. dissociatie van de analyt van ligand
- Nadat de koppelings stap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.
- Beweeg de schuifregelaar op de machine naar rechts, zodat de buis houder zich weer voor de zwarte pijl bevindt.
- Klik op de software op volgende om te beginnen met dissociatie.
- Nadat de dissociatie stap is voltooid, opent u de cover van de machine.
- Verwijder de druppel houder en de buis houder.
- Spoel beide met ddH2O grondig af om elk eiwit weg te spoelen.
- Verwijder de biosensor en gooi deze veilig weg.
7. herhaalde interacties met verschillende concentraties
- Herhaal stap 2-7 voor hetzelfde ligand-analyt paar met verschillende analyt concentraties.
Opmerking: de concentratie van de analyt moet mogelijk worden aangepast over verschillende runs voordat het verkrijgen van optimale resultaten. In onze ervaring is een ratio van 1:5:10 analyt concentraties, beginnend met 75 nM, meestal voldoende.
8. analyseren van de gegevens met behulp van de software
- Zodra alle uitvoeringen zijn voltooid, slaat u de gegevens op de software op door te klikken op bestand en vervolgens experiment opslaan als aan de linkerkant van het scherm.
- Selecteer stap correctie en fitting (1:1) onder de kop gegevens uitvoeren en klik op analyseren om kinetische gegevens te genereren.
- Als u de kwantitatieve gegevens in een werkblad wilt uitpakken en grafieken wilt genereren, klikt u op exporteren naar CSV en slaat u de opgenomen gegevens op als CSV-bestand. Open het CSV-bestand met spreadsheet software.
- Om de associatie-en dissociatie kinetiek op de meest effectieve wijze weer te geven, verwijdert u alle plot punten vóór de basislijn stap en normaliseert u alle volgende plot punten van de uiteindelijke basislijnwaarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Via BLI assays hebben we eerder vastgesteld dat binding van GrgA aan σ28 afhankelijk is van een middelste regio met 28 aminozuren (residuen 138-165) van grga15. Dienovereenkomstig, in vergelijking met N-terminaal zijn-Tagged volledige lengte GrgA (NH-GrgA), een GrgA verwijdering constructie ontbreekt deze regio (NH-GrgAΔ 138-165) had een verminderde associatie rate en een verhoogde dissociatie percentage, wat leidde tot een 3.000.000-fold verlies van de totale affiniteit (tabel 1). Hier tonen we aan dat dit middengebied σ28 rechtstreeks bindt bij afwezigheid van de rest van het grga-eiwit. In deze experimenten werd de middelste regio gelabeld met een N-terminaal zijn-tag (NH-GrgA138-165) gebruikt als de ligand, die voor het eerst werd geïmmobiliseerd tot de punt van een ni-NTA biosensor (Figuur 1a). Na het wassen van ongebonden NH-GrgA138-165 uit de biosensor, werd Real-time associatie met de analyt σ28 opgenomen na de toevoeging van σ28. Tot slot werd de real-time dissociatie opgenomen na de Wash. Opnames van experimenten met drie verschillende analyt concentraties vanaf 30 s voorafgaand aan ligand binding en eindigend 2 minuten na het begin van de wasbeurt worden weergegeven in Figuur 1a. Om de ligand-analyt-interactie beter te visualiseren, verwijderen we gegevens voorafgaand aan de toevoeging van de ligand en resetten we de baseline naar 0 om Figuur 1baf te leiden.
Waarden van kinetische parameters voor interactie van het NH-GrgA138-165 fragment met σ28 worden weergegeven in tabel 1. In vergelijking met de interactie tussen NH-GrgA X σ28 , de NH-GrgA138-165 x σ28 interactie weergegeven een trending statistisch significante 60% reductie in ka, een zeer statistisch significante 64% toename in kd en een zeer statistisch significante 3,5-voudige toename in KD. Deze veranderingen tonen aan dat in vergelijking met NH-GrgA, NH-GrgA138-165 σ28 langzamer bindt, van σ28 sneller dissocieert en een verminderde algehele affiniteit heeft met σ28. Daarom, residuen 138-165 in GrgA bindt σ28 maar met verminderde affiniteit in vergelijking met volledige lengte grga.
Figuur 1: een 28 aminozuur middelste regio van GrgA bindt σ28 in vitro.
A) real-time veranderingen in licht interferentie patronen die zijn vastgelegd in vier fasen: (i) binding van NH-GrgA138-165 (ligand) aan een ni-NTA-biosensor, (II) Wash, (III) binding van NS-σ28 (analyt) bij verschillende concentraties aan de geïmmobiliseerde NH-GrgA-138-165 (ligand), en (IV) daaropvolgende wassing. B) Verbeterde visualisatie van de ligand-analyte-associatie en dissociatie na verwijdering van de waarden in de eerste twee stadia van (A) en reset van de baseline. Panel B wordt gewijzigd van Desai et al., 201815. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Ligand | N | ka | kd | KD | Verwijzingen | |||||||||||
| 1/MS | % controle | 1/s | % controle | M | % controle | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1,5 ± 1,7) x 104 | 100 | (2,8 ± 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 ± 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ 138-165 | 2 | (5,6 ± 0,1) x 103 | 37 | (4,1 ± 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 ± 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| p = 0,125 | p < 0.002 | p < 0,001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 ± 1,0) x 103 | 40 | (4,6 ± 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 ± 0,3) x 10-7 | 350 | Deze studie | ||||||||
| p = 0.074 | p = 0.006 | p < 0,001 | ||||||||||||||
Tabel 1: een mutant van GrgA, met alleen aminozuurresiduen 138-165, bindt σ28 ondanks een lagere affiniteit in vergelijking met de volledige grga.
BLI assays werden uitgevoerd met ni-NTA biosensoren met behulp van zijn-Tagged GrgA of deletie mutanten als liganden en gezuiverde STREP-Tagged σ28 als een analyt. Grafieken van opnames worden weergegeven in Figuur 1. De waarden van kinetische parameters (gemiddelden ± standaarddeviaties) werden gegenereerd met de bijbehorende software17. k een (associatie tarief constante) wordt gedefinieerd als het aantal complexen gevormd per s in een 1 molaire oplossing van a en B. kd (dissociatie percentage constante) wordt gedefinieerd als het aantal complexen dat verval per seconde. K D (dissociatie evenwichtsconstante), gedefinieerd als de concentratie waarbij 50% van de ligand bindingsplaatsen door de analyten wordt ingenomen, is kD gedeeld door ka. n, aantal experimentele herhalingen. p -waarden werden berekend met behulp van 2-tailed student t -tests. Kinetische parameters voor NH-GrgA en NH-GrgAΔ 138-165 waren van Desai et al., 201815.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwit-eiwit interacties zijn cruciaal voor de regulering van transcriptie en andere biologische processen. Ze worden meestal bestudeerd via keuze assays. Hoewel keuze assays relatief eenvoudig uit te voeren zijn, zijn ze slecht kwantitatief en kunnen ze zwakke maar biologisch zinvolle interacties niet detecteren. In vergelijking, door het detecteren van real-time associatie en dissociatie tussen een ligand en een analyt, biedt BLI associatie-en dissociatie percentage constanten, evenals, algemene affiniteit.
In vergelijking met keuze testen, bli assays bieden een hogere gevoeligheid. Bijvoorbeeld, grga-σ28 interacties worden gedetecteerd met lagere nm concentraties van analyten door Bli, maar niet door keuze assays (niet-gepubliceerde gegevens). In tegenstelling tot pulldown, vertrouwt BLI niet op een detectie-antilichaam, wat de gevoeligheid significant kan beïnvloeden.
Wat nog belangrijker is, bli-analyses kunnen mechanistische inzichten geven in de interactie tussen eiwitten, terwijl keuze-assays dat niet kunnen. Dit wordt geïllustreerd door de interacties van σ28 met verschillende grga constructies. In vergelijking met NH-GrgA hebben NH-GrgAΔ 138-165 en NH-GrgA138-165 slechts 60% verlies in ka in binding σ28. Deze bevindingen zijn consistent met onze eerdere BLI-gegevens waaruit blijkt dat GrgA geen N-Terminal 64 residuen heeft een verminderde affiniteit met σ28, wat suggereert dat de n-terminale sequentie van grga bijdraagt aan σ28 binding. Hoewel NH-GrgAΔ 138-165 en NH-GrgA138-165 vergelijkbare k -waarden hebben in de binding σ28, heeft de eerstgenoemde een 91.000-voudige hogere kd dan de laatste. Deze resultaten wijzen erop dat binding van 138-165 structurele veranderingen in GrgA activeert, waardoor het complex sterk stabiliseert.
Met een langere geschiedenis dan bli kan de Surface Plasmon Resonance (SPR) ook de real-time proteïne-eiwit interacties18,19kwantificeren. Hoewel de gevoeligheid van BLI wordt verondersteld lager te zijn dan die van SPR20, presteert de eerstgenoemde momenteel beter dan de laatste in kosteneffectiviteit. De kosten van SPR biosensoren zijn bijvoorbeeld veel hoger dan die van BLI biosensoren.
Vanwege de aard van het onderliggende principe van SPR, wordt het sterk beïnvloed door de microfluïdica van de media rond het eiwit. Daarom, experimenten met sommige SPR-instrumenten vereisen een aanzienlijke perceptie van de kant van de onderzoeker om te zorgen voor optimale buffer omstandigheden21,22,23,24. Aan de andere kant beschikken de huidige BLI-instrumenten over een zeer beperkt temperatuur regelbereik25 en zijn ze als zodanig niet geschikt voor het bepalen van thermodynamische parameters (zoals enthalpie en Gibbs-vrije energie) voor een bepaalde interactie.
Glycerol, een algemeen gebruikte cryoprotectant, is onverenigbaar met BLI, ondanks de brede chemische compatibiliteit. Daarom is het essentieel om glycerol uit de ligand en analyt te verwijderen door dialyse. De resulterende glycerolvrije eiwitten moeten worden bewaard bij 4 °C, wat kan leiden tot verhoogde instabiliteit en onnauwkeurige kinetische parameters. Wij raden aan dat BLI assays kort na dialyse worden uitgevoerd, vooral als inconsistente kinetische parameters worden verkregen van op verschillende tijdstippen. Het precieze tijdsbestek waarbinnen BLI-assays moeten worden voltooid, zal variëren tussen eiwitten en worden beïnvloed door hun concentraties.
Net als bij SPR, is BLI gebruikt voor de screening van kleine moleculen26. Gezien het feit dat nieuwere BLI-instrumenten hoge doorvoer opties bieden voor screening, denken we dat BLI zeer nuttig kan zijn voor de identificatie en karakterisering van kleine moleculen die eiwit-eiwit interacties faciliteren of verstoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (subsidies # AI122034 en AI140167) en New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
