Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59687
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Department of Pharmacology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University, 2Graduate Program in Physiology and Integrative Biology, School of Graduate Studies, Rutgers University, 3Department of Plant Biology, School of Environmental and Biological, Rutgers University

Summary

אינטראקציות של גורמי שעתוק (TFs) עם RNA פולימראז הם בדרך כלל לומדים באמצעות הנפתח assays. אנו מיישמים טכנולוגיה של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) כדי לאפיין את האינטראקציה של GrgA עם לא RNA פולימראז. בהשוואה למטה מוסר, בלי מזהה בזמן אמת שיוך ודיסוציאציה, מציע רגישות גבוהה יותר, והוא כמותי מאוד.

Abstract

שעתוק מקדם (TF) הוא חלבון המסדיר ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם RNA פולימראז, אחר TF, ו/או DNA תבנית. GrgA הוא שעתוק הרומן activator נמצא במיוחד ב כלמידיה הפתוגן בקטריאלי תאיים . חלבון מתגלה באמצעות חרוזי אהדה חשפו כי GrgA נקשר שני גורמים σ, כלומר σ66 ו σ28, אשר מזהים קבוצות שונות של היזמים עבור גנים שהמוצרים שלהם נדרשים בשלבים התפתחותיים. השתמשנו בלי לאשר ולאפיין עוד את האינטראקציות. בלי מראה מספר יתרונות על פני הנפתח: 1) הוא חושף שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין שותפי איגוד, 2) הוא מייצר פרמטרים קינטי כמותיים, ו 3) זה יכול לזהות איגודי כי לעתים קרובות נכשל לזהות. מאפיינים אלה אפשרו לנו להסיק את התפקידים הפיזיולוגיים של GrgA ברגולציה ביטוי גנטי בכלמידיה, ומנגנוני אינטראקציה מפורטים אפשריים. אנו מסוגלים לדמיין כי הטכנולוגיה הזולה יחסית יכולה להועיל מאוד ללימוד תמלול ותהליכים ביולוגיים אחרים.

Introduction

תמלול, אשר מייצרת מולקולות RNA באמצעות דנ א כתבנית, הוא השלב הראשון של ביטוי הגנים. סינתזה rna חיידקי מתחיל בעקבות איגוד של rna פולימראז (rnap) הולואנזים מיזם היעד1,2. ההאנזים RNAP (RNAPholo) מורכב הליבה קטליטי רב subunit (RNAPcore) וגורם σ, אשר נדרש לזיהוי רצף היזם. שעתוק מפעילים וrepressors, כינה באופן קולקטיבי TFs, לווסת את ביטוי הגנים באמצעות רכיבי הכריכה של RNAPcore, σ גורמים, ו/או DNA. בהתאם האורגניזם, חלק משמעותי של הגנום שלה עשוי להיות מוקדש TFs המסדירים תמלול בתגובה לצרכים פיסיולוגיים ורמזים סביבתיים3.

כלמידיה היא חיידק מחייב תאיים האחראי על מגוון מחלות בבני אדם ובעלי חיים4,5,6,7,8. לדוגמה, כלמידיה trachomatis היא ללא ספק הפתוגן מספר אחד המועבר באופן מיני בבני אדם ברחבי העולם, והגורם המוביל של עיוורון במספר מדינות לא מפותחות4,5. לכלמידיה יש מחזור התפתחותי ייחודי המאופיין בשני טפסים סלולאריים מתחלפים הנקראת הגוף היסודי (EB) והגוף הפורש (RB)9. בעוד, בס מסוגלים לשרוד בסביבה מתוך מסחטות, הם אינם מסוגלים לשגשוג. בס להזין תאים מארחים באמצעות האנדוציטוזה ולהבדיל ל-RBs גדול יותר בתוך ולבן בציטופלסמה המארח בתוך שעות שלאחר החיסון. כבר לא מדבקת, ה-RBs מתרבים באמצעות ביקוע בינארי. בסביבות 20 h, הם מתחילים להבדיל בחזרה ל-בס, אשר יוצאים מתאי המארח סביב 30-70 h.

ההתקדמות של המחזור ההתפתחותי לא מוסדר על ידי תמלול. ואילו מרבית הגנים הלא כמעט 1,000 מבוטאים במהלך מחזור האמצע שבמהלכו משכפלים את ה-RBs באופן פעיל, רק מספר קטן של גנים מועתק מיד לאחר כניסת בס לתאי המחשב המארח כדי ליזום את ההמרה של בס לתוך ה-RBs, ועוד קבוצה קטנה של גנים משועתק או יותר ויותר משועתק כדי לאפשר את הבידול של ה-RBs לתוך הבס10,11.

הגנום לא מקודד שלושה גורמים σ, כלומר σ66, σ28 ו σ54. σ66, אשר שווה ערך למשק הבית σ70 של E. coli וחיידקים אחרים, הוא אחראי לזיהוי היזמים של מוקדם באמצע מחזור גנים, כמו גם כמה גנים מאוחרים, בעוד σ28 ו σ54 נדרשים עבור שעתוק הגנים המאוחרים מסוימים. כמה גנים ידועים לשאת הן מקדם σ66התלוי ומקדם σ28התלוי.

למרות מחזור התפתחותי מסובך, רק מספר קטן של TFs נמצאו ב chlamydiae13. GrgA (בעבר מסומן כחלבון היפותטי CT504 ב c. trachomatis serovar D ו CTL0766 בתוך c. trachomatis L2 ) הוא TF כלמידיה ספציפי מזוהה בתחילה כactivator של σ66-גנים תלויים14. אהדה הנפתח בחני הוכיחו כי grga מפעיל את תמלול שלהם על ידי קשירה הן σ66 ו-DNA. מעניין, מאוחר יותר נמצא עם זה GrgA גם מדגיש עם σ28, ומפעיל תמלול מ σ28-היזמים תלויי מבחנה15. כדי לחקור אם GrgA יש האפידוקשרים דומים או שונים עבור σ66 ו-σ28, אנו נקטו להשתמש בלי. בלי לספר הראו כי GrgA אינטראקציה עם σ66 בזיקה גבוה 30-קיפול יותר מאשר עם σ28, הרומז כי grga עשוי לשחק תפקידים דיפרנציאליות σ66-תלוי שעתוק ו σ28-שעתוק תלוי . חמש עשרה

בלי מזהה את תבנית ההפרעה של אור לבן המשקף מתוך שכבה של כריכת שכבות חלבון על קצה של ביוסנסור ומשווה אותו לזה של שכבת התייחסות פנימית16. באמצעות ניתוח של שתי דפוסי הפרעה אלה, לא ניתן לספק מידע חשוב ובזמן אמת על כמות החלבון המאוגד לקצה הביוסנסור. החלבון שאינו מתואם לקצה הביו-חיישן מכונה הליגים, והוא בדרך כלל מקובל בעזרת נוגדן משותף או תג אפיפי (לדוגמה, פולי-או ביוטין-תג) שיש לו זיקה לחלקיק משויך (כגון נ. ת. ע או Streptavidin) על קצה הביוסנסור. הכריכה של חלבון משני, המכונה האנליטה, עם הליגובקצה הביוסנסור יוצרת שינויים באטימות הביוסנסור ולכן גורמת לשינויים בדפוסי ההפרעות. כאשר חוזר על ריכוזים שונים של האנליטה, בלי לספק מידע איכותי אך גם כמותי על הזיקה בין ליגל ואנליטה16.

למיטב ידיעתנו, אנחנו היינו הראשונים להעסיק בלי לאפיין את האינטראקציות חלבון חלבון בתמלול15. בפרסום זה, אנו מדגימים כי רסיס GrgA, אשר הוצגה בעבר כדי להיות נדרש עבור σ28-כריכה, אכן מדיה הכריכה. כתב היד הזה מתמקד בצעדים של "בלי הוראות", וביצירת גרפים ופרמטרים של הקינטיקה המחייבים. שיטות הייצור (וטיהור) של ליגטים ומנתחי מוצרים אינם מכוסים כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חלבונים

  1. השתמש שקית דיאליזה (עם גודל לגזור מתאים) כדי dialyze כל חלבון לשמש ללא מוסר (כולל גם את שלו-מתויג ליגנד האנליטה) נגד 1,000 כרכים של מאגר בלי (25 מ"מ Tris-HCl, 150 mm הנאליט, 0.1 mm edta, 10 מ"מ mgcl2 , 0.1 מ"מ DTT, pH 8.0, מקורר עד 4 ° צ') ב 4 ° צ' עבור 4 h.
    הערה: ללא מוסר דורשים את ליגייט להיות נוכח בריכוזים כי לרוויה אתרי הכריכה על ביוסנסור ואת האנליטה להיות מטוהר מאוד כך הריכוזים הטוחנת של האנליטה הגיבו עם ליגאט ידוע. מתודולוגיות לביטוי ולטיהור של החלבונים שלו-ו-דלקת מתויג אינם מכוסים כאן, אבל ניתן למצוא בפרסומים הקודמים14,15. למרות שמערכת זו אינה מחייבת את הליגולהיות בצורה מאוד מטוהרים, זה חיוני dialyze אפילו לא מטוהרים לפני המאגר כדי למזער את המשמרות בדפוסי הפרעות אור לבן הנגרמים על ידי שינויי מאגר במהלך העיבוד.
  2. החליפו את הדיאליזה למאגר טרי והמשיכו ב-4 שעות.

2. הגדרת לחות ושיטת ביוסנסור

  1. כ 10 דקות לפני תחילת התשובה, פיפטה 200 μL של מאגר בלי להיכנס לתוך צינור PCR.
  2. הסירו את החלק הרחב של הביוסנסור בעזרת יד כדורית בעזרת האריזה המקורית של Ni-נ-ת-ביוסנסור.
  3. מניחים את הביו-חיישן מעל ה-PCR-tube כך שרק קצה הזכוכית של הביוסנסור מתחת למאגר הבלי.
  4. שמור את הקצה הביוסנסור שקוע לפחות 10 דקות כדי להבטיח הידרציה מלאה.
    1. ודא כי קצה הזכוכית של Ni-נ. א. ו-biosensor אינו נוגע בשום דבר אחר מאשר מאגר בלי הפרעה בשלב הנ ל.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש בחיישן Ni-נ-ע-biosensor בשילוב עם ליגו-מתויג שלו. במקרה הצורך, ניתן להשתמש ב-SA-Streptavidin-biosensor בשילוב עם ligtinylated ובמקום זאת אם: (i) הן הליגוהן והאנליטה נושאות את התגית שלו או (ii) אף לא אחת מהן.
  5. . תדליק את מכונת הבליץ
  6. ודא שהמחשב מחובר למחשב באמצעות יציאת פלט נתונים מסוג USB בחלק האחורי של המחשב.
  7. במחשב, לפתוח את התוכנה המשויכת (למשל, בליץ Pro), ולחץ על קינטיקה מתקדמת בצד שמאל של המסך.
  8. בתוכנה, הקלד את כל המידע המתאים אודות הניסוי (כולל שם הניסוי, תיאור, מזהה המדגם וריכוז החלבון) תחת כל כותרת בהתאמה.
  9. לחץ על סוג biosensor ולבחור Ni-נ. ת. ע מהתפריט הנפתח.
    1. תחת הכותרת הפעל הגדרות , ודא ששייקר מוגדר להפעלה.
    2. תחת הכותרת רשימת סוג שלב , ודא שקיימים 5 פריטים: תוכנית בסיסית ראשונית, טעינה, בסיסית, שיוך ודיסוציאציה.
      הערה: ניתן לשנות את משך כל שלב מברירת המחדל לפי הצורך. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש במינימום של 30 עבור תוכנית בסיסית ראשונית ותוכנית בסיסית; ו-120 s עבור האגודה והדיסוציאציה. משך שלב הטעינה (החל מ-120 עד 240 s) יהיה תלוי בריכוז הליפיגים והאהדה של התגית האפיליפית על ה ליגאס ולני-נ-ע-ביוסנסור.
  10. הסר את הנוזלים Ni-נ. ו-ביוסנסור מן הצינור ה-PCR ולצרף אותו להר ביוסנסור על המכונה על ידי הזזת החלק הרחב של ביוסנסור על ההר.
    הערה: אל תתנו לביוסנסור להתייבש במהלך הניסוי.
  11. מניחים שפופרת מיקרוצנטריפוגה שחורה 0.5 mL לתוך מחזיק הצינור של המכונה ופיפטה 400 μL של מאגר בלי להיכנס לתוכו.
  12. ודא שמחוון המחשב ממוקם כך שמחזיק הצינור נמצא מול החץ השחור במחשב.
  13. סגור את המכסה של המכונה כך הטיפ ביוסנסור הופך שקוע במאגר בצינור המיקרוצנטריפוגה.
  14. לחץ על הבא בתוכנה כדי להתחיל בהקלטת תוכנית הבסיס ההתחלתית.

3. העמסה של ליגאל על ביוסנסור

  1. לאחר שהשלב ההתחלתי של התוכנית הבסיסית סיים להקליט, פתח את המכסה של המחשב.
  2. הזז את המחוון ימינה כך שמחזיק הפתיח (במקום בעל הצינור) ממוקם לפני החץ השחור.
  3. פיפטה 4 μl של דיאליזה שלו-מתויג ליגנד (משלב 1.1) אל מחזיק המסירה ולסגור את המכסה של המכונה.
    הערה: הריכוז האופטימלי של הליגונים לשימוש עשוי להשתנות לכל חלבון. ריכוז בין 1.0 ל 2.0 mg/mL הוא בדרך כלל מספיק כדי לרוויה של נ. ת. ע בקצה של ביוסנסור ב 240 s.
  4. בתוכנה, לחץ על הבא כדי להתחיל בטעינה.

4. שטיפת הליטרים נוספים

  1. לאחר ששלב הטעינה סיים את ההקלטה, פתח את המכסה של המחשב.
  2. הזז את המחוון שמאלה כך שמחזיק הצינורית שוב ממוקם לפני החץ השחור.
  3. סגור את המכסה של המכונה וודא שהקצה הביוסנסור מחולק למאגר של הצינורית בתוך מחזיק הצינורית.
  4. לחץ על הבא שוב בתוכנה כדי להתחיל בהקלטת התוכנית הבסיסית.

5. איגוד האנליטה ללידון

  1. לאחר שהשלב הבסיסי סיים להקליט, פתח את המכסה של המחשב.
  2. להסיר את מחזיק השחרור ולנקות אותו על ידי ליטוף כל חלבון ושטיפה אותו עם מים כפולים מיותר (ddH2O) במשך סך של 5 פעמים.
    1. השתמש בניגוב רקמות כדי לנקות את פני השטח של מחזיק השחרור לאחר השטיפה.
  3. הברג חזרה את מחזיק הפתיח למחשב.
  4. הזז את המחוון במחשב לימין, כך שמחזיק השחרור ממוקם שוב מול החץ השחור.
  5. פיפטה 4 μl של אנליטה דיאליזה (משלב 1.1) אל מחזיק הפתיח וסגור את המכסה של המכונה.
  6. בתוכנה, לחץ על הבא לתחילת השיוך.

6. דיסוציאציה של אנליטה מ-ליגנד

  1. לאחר ששלב השיוך סיים את ההקלטה, פתח את המכסה של המחשב.
  2. הזז את המחוון במחשב לימין, כך שמחזיק הצינורית שוב ממוקם מול החץ השחור.
  3. בתוכנה, לחץ על הבא כדי להתחיל את הניתוק.
  4. לאחר שהשלב של הדיסוציאציה סיים את ההקלטה, פתח את המכסה של המכונה.
  5. הסר את מחזיק הפתיח ואת מחזיק הצינור.
  6. לשטוף את שניהם עם ddH2ביסודיות כדי לשטוף את כל החלבון.
  7. הסר את הביו-חיישן והשמט אותו בבטחה.

7. אינטראקציות חוזרות עם ריכוזים שונים

  1. חזור על שלבים 2-7 עבור אותו זוג ליגו-אנליטה באמצעות ריכוזי אנליטה שונים.
    הערה: הריכוז של האנליטה עשוי להיות צורך לכוונן על פני מספר רצפים לפני קבלת תוצאות אופטימליות. בניסיון שלנו, יחס של 1:5:10 של ריכוזי אנליט, החל עם 75 nM, הוא בדרך כלל מספיק.

8. ניתוח הנתונים באמצעות התוכנה

  1. לאחר סיום כל הרצפים, לשמור את הנתונים על התוכנה על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן לשמור את הניסוי כמו בצד שמאל של המסך.
  2. תחת הכותרת הפעל נתונים, בחר תיקון שלב והתאמה (1:1) ולחץ על ' נתח ' כדי ליצור נתונים קינטית.
  3. כדי לחלץ את הנתונים הכמותיים לתוך גליון עבודה וליצור גרפים, לחץ על ייצוא ל-CSV ושמור את הנתונים המוקלטת כקובץ csv. פתח את קובץ ה-. csv באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני.
    1. כדי להציג בצורה האפקטיבית ביותר את הקינטיקה ' התאגדות ' ו'דיסוציאציה ', הסר את כל נקודות ההתוויה לפני השלב ' בסיסי ', ונרמל את כל נקודות ההתוויה העוקבות מהערך הבסיסי הסופי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות בלי לספר, הקמנו בעבר כי איגוד של GrgA ל σ28 תלוי 28 האזור האמצעי של חומצת אמינו (שאריות 138-165) של grga15. לפיכך, לעומת N-סופני שלו-מתויג באורך מלא GrgA (NH-GrgA), מחיקה GrgA לבנות חסר אזור זה (NH-GrgAΔ 138-165) היה שיעור השיוך ירד ושיעור הדיסוציאציה מוגברת, המוביל אובדן 3,000,000 מתקפל של הכולל אהדה (טבלה 1). כאן, אנו להדגים כי האזור האמצעי הזה מאגד ישירות σ28 בהעדר שאר חלבון grga. בניסויים אלה, האזור האמצעי המתויג עם N-סופני שלו-tag (NH-GrgA138-165) שימש את ליגו, אשר היה לראשונה מקיבוע לקצה של ביוסנסור Ni-נ. ת. ע (איור 1A). לאחר שטיפת לא מאוגד NH-GrgA138-165 את biosensor, בזמן אמת הקשר עם הσ של האנליטה הוקלט בעקבות תוספת של σ28. בסופו של דבר, הדיסוציאציה בזמן אמת הוקלטה בעקבות השטיפה. הקלטות של ניסויים עם שלושה ריכוזי אנליט שונים החל 30 s לפני ליגנד הכריכה והסיום 2 דקות לאחר תחילת הכביסה מוצגים באיור 1a. כדי להמחיש בצורה טובה יותר את האינטראקציה של ליגנד-אנליטה, אנו מסירים נתונים לפני הוספת הליפס ומאפסים את קו הבסיס ל -0 כדי לגזור את האיור 1b.

ערכים של פרמטרים קינטי עבור אינטראקציה של NH-GrgA138-165 קטע עם σ28 מוצגים בטבלה 1. בהשוואה NH-GrgA X σ28 אינטראקציה, Nh-GrgA138-165 x σ28 אינטראקציה הציג מגמות סטטיסטית משמעותית 60% הפחתה ka, משמעותית מבחינה סטטיסטית 64% להגדיל kd , ועליה משמעותית מבחינה סטטיסטית 3.5-לקפל ב- KD. שינויים אלה מדגימים כי בהשוואה NH-GrgA, NH-GrgA138-165 נקשר σ28 יותר לאט, הנתק מ σ28 מהר יותר, ויש לו זיקה הכוללת ירד עם σ28. לכן, שאריות 138-165 GrgA נקשר σ28 אבל עם אהדה מופחתת לעומת grga באורך מלא.

Figure 1
איור 1:28 האזור האמצעי של חומצה אמינית של GrgA נקשר σ28 ב מבחנה.
(א) שינויים בזמן אמת בדפוסי הפרעות אור שנרשמו על ידי ארבעה שלבים: (i) איגוד של NH-GrgA138-165 (ligand) כדי Biosensor NI-נ. ע., (ii) לשטוף, (iii) איגוד של NS-σ28 (אנליטה) בריכוזים שונים כדי ללא קיבוע NH-GrgA-138-165 (Ligand) ו (iv) הבאים לשטוף. (ב) הדמיה משופרת של שיוך ליגאל-אנליט והדיסוציאציה בעקבות הסרת ערכים בשני השלבים הראשונים מ-(א) ואיפוס של התוכנית הבסיסית. פאנל ב' משתנה מדסאי ואח ', 201815. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ליגנד n ka kd KD פניות
1/Ms % בקרה 1/s % בקרה M % בקרה
NH-GrgA 8 (1.5 ± 1.7) x 104 100 (2.8 ± 0.8) x 10-3 100 (2.2 ± 0.3) x 10-7 100 דסאי ואח ', 2018
NH-GrgAΔ 138-165 2 (5.6 ± 0.1) x 103 37 (4.1 ± 0.3) x 102 1.5 x 107 (6.9 ± 4.5) x 10-2 3.1 x 108 דסאי ואח ', 2018
p = 0.125 p < 0.002 p < 0.001
NH-GrgA138-165 3 (6.0 ± 1.0) x 103 40 (4.6 ± 0.4) x 10-3 164 (7.7 ± 0.3) x 10-7 350 מחקר זה
p = 0.074 p = 0.006 p < 0.001

טבלה 1: מוטציה של GrgA, המכיל רק שאריות חומצות אמינו 138-165, נקשר σ28 למרות זיקה נמוכה לעומת grga באורך מלא.
בלי לספר בוצעו עם ביולוגי Ni-נ. ת. ע באמצעות מתויג באורך מלא GrgA או מחיקה מוטציות כמו ליגנדס וטוהר דלקת-מתויג σ28 כמו אנליטה. גרפים של הקלטות מוצגים באיור 1. ערכים של פרמטרים קינטית (ממוצעים ± סטיות סטנדרטיות) נוצרו עם התוכנה המשויכת17. ק a (קבוע שיעור שיוך) מוגדר כמספר התסביכים שנוצרו ב-1 בתמיסה טוחנת של a ו-B. k (קבוע קצב הדיסוציאציה) מוגדר כמספר התסביכים הדעיכה לשניה. ק ד (קבוע שיווי משקל של דיסוציאציה), המוגדר כריכוז שבו 50% מאתרי הקשירה תפוסים על ידי האנליטים, הוא kD חצוי על ידי k. n, מספר החזרות הנסיוניות. ערכי p חושבו באמצעות בדיקות t של סטודנט בשני זנב. הפרמטרים הקינטית עבור NH-GrgA ו-NH-GrgAΔ 138-165 היו מ Desai ואח ', 201815.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אינטראקציות חלבונים בחלבון הן חיוניות להסדרת התמלול ולתהליכים ביולוגיים אחרים. הם למדו בדרך כלל באמצעות מוסר. למרות מוסר היורד קל יחסית לבצע, הם כמותיים גרוע ועלול להיכשל לזהות משמעות חלשה אך ביולוגית אינטראקציות. לעומת זאת, על ידי גילוי שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין ליגט לבין האנליטה, מספק הקשר וקבועים של שיעור הדיסוציאציה, כמו גם הזיקה הכוללת.

, בהשוואה לדבר הטוב ביותר. בלי הספק רגישות גבוהה יותר לדוגמה, grga-σ28 אינטראקציות מזוהים עם ריכוזי nM נמוכה יותר של האנליטים על-ידי בלי אבל לא על ידי הנפתח בחני (נתונים שלא פורסמו). בניגוד למטה, בלי להסתמך על נוגדן זיהוי, אשר עשוי להשפיע באופן משמעותי על רגישות.

וחשוב מכך, ניתוח בלי מענה יכול לספק תובנות מכניסטיות לאינטראקציה בין החלבונים, ואילו הדבר אינו יכול להיות מקובע. זה לידי ביטוי על ידי אינטראקציות של σ28 עם בנייה grga שונים. לעומת NH-GrgA, NH-GrgAΔ 138-165 ו-NH-GrgA138-165 סובלים רק 60% הפסד ב kכריכה σ28. ממצאים אלה עקביים עם הנתונים הקודמים שלנו בלי מראה כי GrgA חסר שלה N-טרמינל 64 שאריות יש זיקה ירידה עם σ28, המעיד כי רצף N-טרמינל של grga תורמת σ28 הכריכה. למרות NH-GrgAΔ 138-165 ו-NH-GrgA138-165 יש k ערכים דומים ב כריכה σ28, לשעבר יש מתקפל 91,000- k גבוה יותר מאשר האחרון. תוצאות אלו מצביעות על כך שאיגוד של 138-165 מפעיל שינויים מבניים ב-GrgA, מייצב מאוד את הקומפלקס.

עם היסטוריה ארוכה יותר מבלי להיות, המשטח התהודה של פני השטח (spr) יכול גם לכמת את אינטראקציות חלבון-חלבון בזמן אמת18,19. בעוד הרגישות של בלי מחשבה להיות נמוך יותר מזה של SPR20, הקודם למעלה מבצע את האחרון בעלות האפקטיביות. לדוגמה, עלויות של חיישנים אנלייזרים גבוהים הרבה יותר מאשר אלה של ביוביוחיישנים בלי.

בשל אופיו של העיקרון הבסיסי של SPR, הוא מושפע בכבדות על ידי מיקרופלואידיקה של התקשורת המקיפה את החלבון. לפיכך, ניסויים הכרוכים בכלי מדידה מסוימים דורשים תפיסה ניכרת מצד החוקר להבטיח תנאי מאגר אופטימליים21,22,23,24. מצד שני, מכשירים הנוכחיים ללא מוצרים מסוג בקרת טמפרטורה מוגבלת מאוד בטווח25 , וככאלה, אינם מצוידים לקביעת פרמטרים תרמודינמיים (כגון: אנתלפיית ואנרגיה חופשית של גיבס) לאינטראקציה נתונה.

גליצרול, הכימיות בשימוש נפוץ, אינו תואם לבלי הרבה, למרות ההתאמה הכימית הנרחבת שלה. לכן, זה קריטי להסיר גליצרול מהליטול והאנליטה על ידי דיאליזה. יש לאחסן את החלבונים שנוצרו בגליצרול ללא התראה ב -4 ° c, דבר שעלול לגרום לחוסר יציבות מוגבר ולפרמטרים מדויקים של קינטי. אנו ממליצים לבצע את הביצוע בזמן קצר לאחר הדיאליזה, במיוחד אם הפרמטרים הקינטית שאינם עקביים מתקבלים בזמנים שונים. מסגרת הזמן המדויקת בה יש להשלים את האמור להסתיים, תשתנה בין החלבונים ויושפעו מריכוזי הארגון.

כמו עם SPR, בלי השתמשו במולקולה קטנה הקרנת26. בהתחשב בכך שהכלים החדשים יותר של בלי מציעים אפשרויות תפוקה גבוהות להקרנה, אנו מחשיבים כי בלי להפוך לשימושי מאוד לזיהוי ואפיון של מולקולות קטנות המקלות או מפריעות לאינטראקציות חלבונים בחלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (מענקים AI122034 ו AI140167) ו ניו ג'רזי קרן הבריאות (גרנט PC 20-18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BLItz machine ForteBio 45-5000
Dialysis tubing cellulose membrane MilliporeSigma D9652
Dip and Read Ni-NTA biosensor tray ForteBio 18-5101 Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins
Drop holder ForteBio 45-5004
PCR tubes (0.2 mL) Thomas Scientific CLS6571
Microcentrifuge tubes (black) Thermo Fisher Scientific 03-391-166
Kimwipes Thermo Fisher Scientific 06-666A
DTT Thermo Fisher Scientific R0861
EDTA MilliporeSigma E6758
MgCl2 MilliporeSigma M8266
NaCl MilliporeSigma S9888
Tris-HCl GoldBio T095100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
  2. Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
  3. Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
  4. Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
  5. WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
  6. Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
  7. De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
  8. Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
  9. Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
  10. Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  11. Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
  12. Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
  13. Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
  14. Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
  15. Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
  16. Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  17. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
  18. Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
  19. Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
  21. Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
  22. Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
  23. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
  24. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
  25. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
  26. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).

Tags

החודש ביופיטר גיליון 149 ביואולייר אינטרפרומטריה כלמידיה CT504 TC0791 GrgA אינטראקציית חלבונים-חלבון גורמי שעתוק רגולציה-תמלול
יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Desai, M., Di, R., Fan, H.… More

Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription. J. Vis. Exp. (149), e59687, doi:10.3791/59687 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter