Summary
Interaktioner af transkriptionsfaktorer (TFS) med RNA-polymerase er normalt undersøgt ved hjælp af rulle assays. Vi anvender en biolayer interferometri (bli) teknologi til at karakterisere samspillet mellem GRGA med Chlamydia RNA polymerase. Sammenlignet med rulle assays, registrerer bli real-time Association og dissociation, giver højere følsomhed, og er meget kvantitativ.
Abstract
En transkriptionsfaktor (TF) er et protein, der regulerer genekspression ved at interagere med RNA-polymerase, en anden TF og/eller skabelon-DNA. GRGA er en roman transskription aktivator findes specifikt i forpligte intracellulære bakterielle patogen klamydia. Protein rulle assays ved hjælp af affinitets perler har afsløret, at GRGA binder to σ-faktorer, nemlig σ66 og σ28, som genkender forskellige sæt af promotorer for gener, hvis produkter differentielt kræves på udviklingsmæssige stadier. Vi har brugt BLI til at bekræfte og yderligere karakterisere samspillet. BLI demonstrerer flere fordele i forhold til rulle: 1) det afslører real-time Association og dissociation mellem bindende partnere, 2) det genererer kvantitative kinetiske parametre, og 3) det kan detektere bindinger, som rulle assays ofte undlader at opdage. Disse egenskaber har gjort det muligt for os at udlede de fysiologiske roller af GrgA i forordningen om genekspression i klamydiaog mulige detaljerede interaktions mekanismer. Vi forestiller mig, at denne relativt overkommelige teknologi kan være yderst nyttig til at studere transskription og andre biologiske processer.
Introduction
Transskription, som producerer RNA-molekyler ved hjælp af DNA som skabelon, er det allerførste trin i genekspression. Bakteriel RNA syntese begynder efter binding af RNA polymerase (rnap) holoenzym til en Target Promoter1,2. Det RNAP holoenzym (RNAPholo) består af en multi-subunit katalytisk kerne (RNAPcore) og en σ faktor, som er nødvendig for at genkende arrangøren sekvens. Transskriptions aktivatorer og repressorer, kollektivt betegnet TFs, regulerer genekspression gennem bindings komponenterne i RNAPcore, σ-faktorerne og/eller DNA. Afhængig af organismen, en betydelig del af dens genom kan afsættes til TFs, der regulerer transkriptionen som reaktion på fysiologiske behov og miljømæssige signaler3.
Klamydia er en forpligte intracellulær bakterie, der er ansvarlig for en række sygdomme hos mennesker og dyr4,5,6,7,8. For eksempel, Chlamydia trachomatis er formentlig den nummer et seksuelt overført patogen hos mennesker over hele verden, og en førende årsag til blindhed i nogle underudviklede lande4,5. Klamydia har en unik udviklingsmæssige cyklus karakteriseret ved to vekslende cellulære former kaldes den elementære krop (EB) og reticulate krop (RB)9. Der henviser til, at EBs er i stand til at overleve i et ekstracellulært miljø, men at det er ude af stand til spredning. EBs indtaster værtsceller gennem endokytose og skelner i større RBs i en vakuole i værts cytoplasmaet inden for timer efter inokulation. Ikke længere smitsomt, RBs prolifererer gennem binær fission. Omkring 20 timer begynder de at skelne tilbage til EBs, som forlader værtscellerne omkring 30-70 h.
Progression af Chlamydia udviklingsmæssige cyklus reguleres af transkriptionen. Der henviser til, at et over flertal af de næsten 1.000 klamydial gener udtrykkes under den midt cyklus, hvor RBs aktivt replikaerer, men at kun et lille antal gener transskriberes umiddelbart efter, at EBs er indsat i værtscellerne for at påbegynde omdannelsen af EBs i RBs, og et andet lille sæt af gener er transskriberet eller i stigende grad transskriberet til at muliggøre differentiering af RBs i EBs10,11.
Chlamydia-genomet koder tre σ-faktorer, nemlig σ66, σ28 og σ54. σ66, som svarer til husholdning σ70 af E. coli og andre bakterier, er ansvarlig for at anerkende initiativtagere til tidlige og midt-cyklus gener samt nogle sene gener, hvorimod σ28 og σ54 er nødvendige for transkriptionen af visse sene gener. Flere gener er kendt for at bære både en σ66-afhængig promotor og en σ28-afhængig promotor12.
På trods af en kompliceret udviklingscyklus er der kun fundet et lille antal TFs i Chlamydiae13. GRGA (tidligere kommenteret som en hypotetisk protein CT504 i c. trachomatis blev D og CTL0766 i c. trachomatis L2) er en Chlamydia-specifikke TF oprindeligt anerkendt som en aktivator af σ66-afhængige gener14. Affinitets rulle assays har vist, at GRGA aktiverer deres transskription ved at binde både σ66 og DNA. Interessant nok blev det senere fundet med, at GrgA også co-udfældelse med σ28, og aktiverer transskription fra σ28-afhængige promotorer in vitro15. For at undersøge om GrgA har lignende eller forskellige tilhørsforhold til σ66 og σ28, tydede vi på at bruge bli. BLI assays har vist, at GrgA interagerer med σ66 ved en 30 gange højere affinitet end med σ28, hvilket tyder på, at GRGA kan spille differentialroller i σ66-afhængig transkription og σ28-afhængig transkription 15.
BLI detekterer interferens mønsteret af hvidt lys, der reflekterer fra et lag af immobiliseret protein på spidsen af en biosensor og sammenligner det med et internt reference lag16. Gennem analysen af disse to interferens mønstre kan BLI give værdifulde oplysninger i realtid om mængden af protein, som er bundet til spidsen af biosensoren. Proteinet, der er immobiliseret til spidsen af biosensoren kaldes ligand, og er generelt immobiliseret ved hjælp af en fælles antistof eller epitop tag (f. eks en poly-His-eller biotin-tag), der har en affinitet for en associeret partikel (såsom NTA eller Streptavidin) på spidsen af biosensoren. Bindingen af et sekundært protein, benævnt analysand, med ligand ved spidsen af biosensoren skaber ændringer i biosensorens opacitet og resulterer derfor i ændringer i interferens mønstre. Når BLI gentages over forskellige koncentrationer af analytten, kan den ikke blot levere kvalitative, men også kvantitative oplysninger om affiniteten mellem ligand og analysand16.
Vi var de første til at ansætte BLI til at karakterisere protein-protein interaktioner i transkriptionen15. I denne publikation viser vi, at et GrgA-fragment, der tidligere har vist sig at være nødvendigt for σ28-binding, faktisk formidler bindingen. Dette manuskript fokuserer på trin i BLI-assays, og generering af BLI grafer og parametre for bindende kinetik. Metoder til fremstilling (og rensning) af ligander og analytter er ikke dækket her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fremstilling af proteiner
- Brug en dialysepose (med en passende cut-off-størrelse) til at dialysere hvert protein, der skal anvendes til BLI assays (herunder både hans-mærkede ligand og analysand) mod 1.000 bind af BLI buffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, forkølet til 4 °C) ved 4 °C i 4 timer.
Bemærk: BLI-assays kræver, at ligand er til stede ved koncentrationer, der mægle bindings stederne på biosensoren og analytten, så de er meget rensede, således at de molære koncentrationer af den analysand, der reagerer med ligand, er kendt. Metoder til ekspression og rensning af hans-og STREP-mærkede proteiner er ikke dækket her, men kan findes i tidligere publikationer14,15. Selv om dette system ikke kræver ligand at være i meget renset form, er det vigtigt at dialysere selv urenset ligander til bli buffer for at minimere forskydninger i hvidt lys interferens mønstre forårsaget af eventuelle buffer ændringer under analysen. - Skift til Fresh BLI buffer, og Fortsæt med dialyse i yderligere 4 timer.
2. opsætning af biosensor hydrering og assay
- Ca. 10 min. før en analyse påbegyndes, afpipetteres 200 μL af BLI-bufferen i et PCR-rør.
- Fjern en ni-NTA-biosensor fra den originale emballage ved at holde den brede del af biosensoren med en dykket hånd.
- Placer biosensoren over PCR-røret, således at kun glas spidsen af biosensoren er nedsænket i BLI-bufferen.
- Hold biosensor spidsen nedsænket i mindst 10 minutter for at sikre fuld hydrering.
- Kontrollér, at ni-NTA-biosensors glasspids ikke rører ved andet end BLI-bufferen under ovenstående trin.
Bemærk: denne protokol bruger en ni-NTA-biosensor i forbindelse med en hans-Tagged ligand. Hvis det er nødvendigt, kan en SA-Streptavidin-biosensor anvendes sammen med en biotinyleret ligand i stedet, hvis: (i) både ligand og analysand bære en hans tag eller (II) ingen af dem gør.
- Kontrollér, at ni-NTA-biosensors glasspids ikke rører ved andet end BLI-bufferen under ovenstående trin.
- Drej BLItz maskinen på.
- Sørg for, at maskinen er sluttet til computeren via en USB-data udgangsport bag på maskinen.
- Åbn den tilhørende software (f. eks. BLItz Pro) på computeren, og klik på Avanceret kinetik i venstre side af skærmen.
- På softwaren, skrive alle relevante oplysninger om forsøget (herunder Eksperimentnavn, beskrivelse, prøve-ID, og protein koncentration) under hver respektive overskrift.
- Klik på biosensor type , og vælg ni-NTA i rullemenuen.
- Under overskriften Kør indstillinger skal du kontrollere, at rysteapparatet er indstillet til Aktivér.
- Under overskriften trin type liste skal du kontrollere, at der er angivet 5 elementer: oprindelig Oprindelig plan, indlæsning, Oprindelig plan, tilknytning og dissociation.
Bemærk: varigheden af hvert trin kan ændres fra standard efter behov. For at opnå optimale resultater skal du bruge mindst 30 s til Initial baseline og baseline. og 120 s for forening og dissociation. Varigheden af læsse trinnet (fra 120 til 240 s) vil afhænge af koncentrationen af ligand og affinitet af hans-epitope tag på ligand til ni-NTA-biosensor.
- Fjern den hydrerede ni-NTA-biosensor fra PCR-røret og fastgør den til biosensor holderen på maskinen ved at skubbe den brede del af biosensoren på holderen.
Bemærk: Lad ikke biosensoren tørre ud under eksperimentet. - Anbring et 0,5 mL sort mikrocentrifuge glas i maskinens slangeholder, og afpipettér 400 μL af BLI-bufferen i den.
- Kontroller, at skyderen på maskinen er anbragt således, at rørholderen er placeret foran den sorte pil på maskinen.
- Luk maskinens dæksel, således at biosensor spidsen bliver nedsænket i bufferen i mikrocentrifuge røret.
- Klik på næste på softwaren for at starte optagelsen af den oprindelige baseline.
3. indlæsning af ligand på biosensor
- Når det første trin i grundlinjen er færdig med optagelsen, skal du åbne dækslet på maskinen.
- Flyt skyderen til højre, så fald holderen (i stedet for Slangeholderen) er placeret foran den sorte pil.
- Der afpipetteres 4 μL af en dialyseret hans-mærkede ligand (fra trin 1,1) på dråbe holderen, og lukke dækslet på maskinen.
Bemærk: den optimale koncentration af ligand, der skal anvendes, kan variere for hvert protein. En koncentration mellem 1,0 til 2,0 mg/mL er normalt tilstrækkelig til at mægle NTA ved spidsen af biosensoren i 240 s. - På softwaren skal du klikke på næste for at starte indlæsning.
4. vask væk yderligere ligand
- Når indlæsnings trinnet er færdig med optagelsen, skal du åbne dækslet på maskinen.
- Flyt skyderen til venstre sådan, at rørholderen igen er placeret foran den sorte pil.
- Luk låget på maskinen og sørg for, at biosensor spidsen er nedsænket ind i BLI-bufferen på røret i Slangeholderen.
- Klik på næste igen på softwaren for at begynde at optage baseline.
5. sammenslutning af analysand til ligand
- Når det oprindelige trin er færdig med optagelsen, skal du åbne dækslet på maskinen.
- Fjern dråbe holderen, og Rengør den ved at afpipettere et hvilket som helst protein og skylle det med dobbelt deioniseret vand (ddH2O) i alt 5 gange.
- Brug en serviet til at rengøre overfladen af dråbe holderen efter vask.
- Sæt dråbe holderen tilbage på maskinen.
- Flyt skyderen på maskinen til højre, så fald holderen igen er placeret foran den sorte pil.
- Der afpipetteres 4 μL af en dialyseret analysand (fra trin 1,1) på dråbe holderen, og maskinens dæksel lukkes.
- Klik på næste i softwaren for at begynde tilknytningen.
6. dissociation af analysand fra ligand
- Når tilknytnings trinnet er færdig med optagelsen, skal du åbne dækslet på maskinen.
- Flyt skyderen på maskinen til højre, således at rørholderen igen er placeret foran den sorte pil.
- På softwaren skal du klikke på næste for at starte dissociation.
- Når Dissociations trinnet er færdig med optagelsen, skal du åbne dækslet på maskinen.
- Fjern dråbe holderen og Slangeholderen.
- Skyl begge med ddH2O grundigt for at vaske alle proteiner væk.
- Fjern biosensoren, og kassér den sikkert.
7. gentagelse af interaktioner med forskellige koncentrationer
- Gentag trin 2-7 for det samme ligand-analysand-par ved hjælp af forskellige analysand-koncentrationer.
Bemærk: koncentrationen af analytten skal muligvis justeres på tværs af flere kørsler, før der opnås optimale resultater. I vores erfaring, et forhold på 1:5:10 af analysand koncentrationer, begyndende med 75 nM, er normalt tilstrækkelig.
8. analyse af data ved hjælp af softwaren
- Når alle kørsler er færdige, skal du gemme dataene på softwaren ved at klikke på filer og derefter gemme eksperimentet som i venstre side af skærmen.
- Under overskriften Kør data skal du vælge trin rettelse og tilpasning (1:1) og klikke på Analysér for at generere kinetiske data.
- Hvis du vil udtrække de kvantitative data til et regneark og generere grafer, skal du klikke på Eksporter til CSV og gemme de optagede data som en. csv-fil. Åbn. csv-filen ved hjælp af regnearkssoftware.
- Hvis du vil vise tilknytningen og Dissociations kinetikken mest effektivt, skal du fjerne alle afbildnings punkter før det oprindelige trin og normalisere alle efterfølgende afbildnings punkter fra den endelige oprindelige værdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gennem BLI assays har vi tidligere fastslået, at binding af GrgA til σ28 er afhængig af en 28 aminosyre middelregion (rester 138-165) af GRGA15. Sammenlignet med N-terminalt hans-Tagged fuld længde GrgA (NH-GrgA), en GrgA sletning konstruktion mangler denne region (NH-GrgAΔ 138-165) havde en nedsat Association rate og en øget dissociation sats, hvilket førte til en 3.000.000-fold tab af samlede affinitet (tabel 1). Her viser vi, at denne midterste region binder σ28 direkte i fraværet af resten af GRGA-proteinet. I disse eksperimenter blev den midterste region mærket med en N-terminalt hans-tag (NH-GrgA138-165) blev brugt som ligand, som først blev immobiliseret til spidsen af en ni-NTA biosensor (figur 1a). Efter skylning af ubundet NH-GrgA138-165 fra biosensoren blev realtids tilknytningen til analysand σ28 indspillet efter tilføjelsen af σ28. Endelig blev realtids dissociationen indspillet efter vask. Optagelser af eksperimenter med tre forskellige analysand koncentrationer, der starter 30 s før ligand binding og slutter 2 minutter efter begyndelsen af vask, er vist i figur 1a. For bedre at visualisere ligand-analyte-interaktionen fjerner vi data før tilføjelsen af ligand og nulstiller baseline til 0 for at udlede figur 1b.
Værdier for kinetiske parametre for interaktion mellem NH-GrgA138-165-fragmentet og σ28 er vist i tabel 1. Sammenlignet med interaktionen med NH-GrgA X σ28 viste NH-GrgA138-165 x σ28 interaktion en trendende statistisk signifikant 60% reduktion i ka, en meget statistisk signifikant stigning på 64% i kd , og en meget statistisk signifikant 3,5-fold stigning i KD. Disse ændringer viser, at NH-GrgA138-165 sammenlignet med NH-GrgA binder σ28 langsommere, dissocierer fra σ28 hurtigere og har en reduceret samlet affinitet med σ28. Derfor binder rester 138-165 i GrgA σ28 , men med reduceret affinitet sammenlignet med fuld længde GRGA.
Figur 1: en 28 aminosyre midterste region GrgA binder σ28 in vitro.
A) ændringer i de lette interferens mønstre i realtid i fire faser: (i) BINDING af NH-GrgA138-165 (ligand) til en ni-NTA-biosensor, (II) vask, (III) BINDING af NS-σ28 (analysand) ved forskellige koncentrationer til den immobiliserede NH-GrgA-138-165 (ligand), og (IV) efterfølgende vask. B) øget visualisering af ligand-analyte Association og dissociation efter fjernelse af værdier i de første to etaper fra (A) og reset af baseline. Panel B er modificeret fra Desai et al., 201815. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Ligand | N | ka | kd | KD | Referencer | |||||||||||
| 1/MS | % kontrol | 1/s | % kontrol | M | % kontrol | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1,5 ± 1,7) x 104 | 100 | (2,8 ± 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 ± 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ 138-165 | 2 | (5,6 ± 0,1) x 103 | 37 | (4,1 ± 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 ± 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| p = 0,125 | p < 0,002 | p < 0,001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 ± 1,0) x 103 | 40 | (4,6 ± 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 ± 0,3) x 10-7 | 350 | Denne undersøgelse | ||||||||
| p = 0.074 | p = 0.006 | p < 0,001 | ||||||||||||||
Tabel 1: en mutant af GrgA, der kun indeholder aminosyrerester 138-165, binder σ28 til trods for lavere affinitet sammenlignet med GRGA i fuld længde.
BLI-assays blev udført med ni-NTA-biosensorer ved hjælp af hans-mærkede GRGA-eller sletnings mutanter i fuld længde som ligander og renset STREP-Tagged σ28 som analysand. Grafer af optagelser er vist i figur 1. Værdier af kinetiske parametre (gennemsnit ± standardafvigelser) blev genereret med den tilhørende software17. k a (Association rate Constant) er defineret som antallet af komplekser dannet per s i en 1 molær opløsning af a og B. kd (dissociation rate konstant) er defineret som antallet af komplekser, der henfald per sekund. K D (dissociations ligevægts konstant), defineret som den koncentration, hvormed 50% af ligand bindings stederne er besat af analytterne, er kD divideret med ka. n, antal eksperimentelle gentagelser. p -værdier blev beregnet ved hjælp af 2-sidet elevens t -test. Kinetic parametre for NH-GrgA og NH-GrgAΔ 138-165 var fra Desai et al., 201815.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein interaktioner er afgørende for reguleringen af transkriptionen og andre biologiske processer. De er mest almindeligt undersøgt gennem rulle assays. Selv om rulle assays er relativt let at udføre, de er dårligt kvantitative og kan undlade at opdage svage, men biologisk meningsfulde interaktioner. Til sammenligning, ved at registrere real-time Association og dissociation mellem en ligand og en analysand, giver BLI sammenslutning og dissociation rate konstanter, samt, samlede affinitet.
Sammenlignet med rulle-assays giver bli assays større følsomhed. For eksempel detekteres GRGA-σ28 interaktioner med lavere nm-koncentrationer af analytter af bli, men ikke ved rulle assays (ikke-offentliggjorte data). I modsætning til pulldown er BLI ikke afhængig af et detektionsanti stof, som kan påvirke følsomheden betydeligt.
Endnu vigtigere er det, at bli-analyser kan give mekanistisk indsigt i samspillet mellem proteiner, hvorimod rulle-assays ikke kan. Dette er eksemplificeret ved samspillet mellem σ28 og forskellige GRGA konstruktioner. Sammenlignet med NH-GrgA lider NH-GrgAΔ 138-165 og NH-GrgA138-165 kun et tab på 60% i ka i binding σ28. Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere BLI data, der viser, at GrgA mangler sine N-terminal 64 rester har en nedsat affinitet med σ28, hvilket tyder på, at N-terminalen sekvens af GRGA bidrager til σ28 binding. Selvom NH-GrgAΔ 138-165 og NH-GrgA138-165 har lignende ka -værdier i binding σ28, har førstnævnte en 91.000 gange højere kd end sidstnævnte. Disse resultater indikerer, at binding af 138-165 udløser strukturelle ændringer i GrgA, i høj grad at stabilisere komplekset.
Med en længere historie end bli kan overflade Plasmon resonans (spr) også kvantificere realtids protein-protein interaktioner18,19. Mens BLI'S følsomhed menes at være lavere end SPR20's, er den førstnævnte i øjeblikket mere omkostningseffektiv end den sidstnævnte. F. eks. er omkostningerne til spr biosensorer meget højere end for bli biosensorer.
På grund af karakteren af det underliggende princip i SPR, er det stærkt påvirket af mikrofluidics af medierne omkring proteinet. Derfor kræver eksperimenter, der involverer nogle spr-instrumenter, en betydelig opfattelse af forskeren for at sikre optimale buffer betingelser21,22,23,24. På den anden side har de nuværende bli-instrumenter et meget begrænset temperatur reguleringsområde25 og er som sådan dårligt monterede til bestemmelse af termodynamiske parametre (såsom enthalpi og Gibbs-fri energi) for en given interaktion.
Glycerol, et almindeligt anvendt cryoprotectant, er uforenelig med BLI, på trods af dets brede kemiske kompatibilitet. Derfor er det vigtigt at fjerne glycerol fra ligand og analysand ved dialyse. De resulterende glycerolfri proteiner skal opbevares ved 4 °C, hvilket kan føre til øget ustabilitet og unøjagtige kinetiske parametre. Vi anbefaler, at BLI-assays udføres hurtigt efter dialyse, især hvis der opnås inkonsekvente kinetiske parametre fra forskellige tidspunkter. Den nøjagtige tidsramme, inden for hvilken BLI-assays skal være afsluttet, vil variere mellem proteiner og påvirkes af deres koncentrationer.
Som med SPR er BLI blevet brugt til screening af små molekyler26. I betragtning af at nyere BLI-instrumenter giver mulighed for høj gennemløbskapacitet til screening, forestiller vi os, at BLI kan blive meget nyttig til identifikation og karakterisering af små molekyler, der letter eller forstyrrer protein-protein interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed (Grants # AI122034 og AI140167) og New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
